Mire tud választ adni ma az élelmiszer-anaitika?

Átírás

1 Mire tud választ adni ma az élelmiszer-anaitika? Gluténmentes termékek vizsgálatának nemzetközi tapasztalati, tények, megoldandó feladatok, fejlesztési irányok Tömösközi Sándor, Bugyi Zsuzsanna, Török Kitti Gluténmentes élelmiszerek jogi szabályozása és vizsgálata Munkaértekezlet Vidékfejlesztési Minisztérium november 8. 1

2 A probléma 1. A fogalmak tisztázása Gabona/búzafogyasztással kapcsolatos rendellenességek - lisztérzékenység/cöliákia - gabona /búza / glutén allergia 2. A kiváltó okok tisztázása - Mely fehérjék miért felelősek? - Tudunk-e mindent? 3. Milyen válaszokat tud adni ma az analitika? 2

3 A lisztérzékenység / cöliákia * Rendellenesség leírása : felszívódási zavar autoimmun betegség * Patofiziológia: Többfaktoros rendellenesség * Felelős komponensek - fehérjék - többségében prolaminok (prolin és glutamin aminosavakban gazdag fehérjék) - gliadin a búzában - hordein az árpában - szekalin a rozsban - alkohol oldhatóak és ellenállnak a fehérjebontó enzimeknek 3

4 A lisztérzékenység / cöliákia * Felelős komponensek transz-glutamináz - antitestjei a cöliákiás esetek többségénél megtalálható - a gliadin glutamát csoportja és az enzim lizin-oldallánca között alakít ki kovalens kötéseket - új epitóp (az eredeti fehérjében nem található) epitóp jön létre - megindítja az elsődleges immunválaszt 4

5 A búza / glutén allergia * Rendellenesség leírása: - Élelmiszer-allergia jellemző tünet együttes * Patofiziologia: - IgE mediált immunválasz * Felelős komponensek - magvak tartalékfehérjéi - csak egy része köthető a búza sikérfehérjéihez - jelenleg 27 potenciális búza allergént azonosítottak (Sotkovský P et al,clin Exp Allergy Jul) - prolamin allergének (Ω-5 gliadinok, γ-gliadinok) - glutenin allergének (9 kis moltömegű (LMW) alegység) - albumin és globulin allergének (biológiailag aktív fehérjék, amiláz, lipid transzferáz, tripszin inhibítor) - keresztreakciók is ismertek 5

6 A probléma Prolamin szupercsalád gliadinok glutelinek Nem-specifikus lipidtranszfer proteinek α-amiláz- és/vagy tripszin-inhibitorok Allergiát vagy intoleranciát kiváltó gabonafehérjék 6

7 EU szabályozás: A Big Eight /89/EC,2006/142/EC Gabonák (glutén) Rákfélék Hal Tej Tojás Mogyoró Dió Szója Jelölési kötelezettség Puhatestűek Zeller Mustár Szezám Csillagfürt Kén-dioxid 7

8 Codex szabályozás: Codex stan Gluténmentes: 20 mg/kg glutén koncentráció alatt Alacsony gluténszint: mg/kg glutén koncentráció 8

9 Szabályozás Ellenőrzés IPAR Termékgyártás Felelősség Jelölési kötelezettség Gazdasági szempontok HATÓSÁG Támogató tevékenység: klinika diagnosztika analitikai FOGYASZTÓ Betegség (rendellenesség) Speciális termékigény Ellenőrzés igénye KUTATÁS LABOROK Saját vagy külső Megbízható analitikai apparátus biztosítása (akkreditálás) Validált módszerek 9

10 Milyen mértékben teljesíthető a jelölési kötelezettség? Milyen komponenst mérünk (minőségi vagy mennyiségi meghatározás?) Epitópokat tartalmazó molekulák? Egyéb molekulák? Előfordulásuk és arányuk változó Analitikai, élelmiszerbiztonság Melyik fehérjemolekula okozza a rendellenességet? A kérdéses epitóp meghatározása Klinika Miben mérjük a meghatározandó komponenst? Egyszerű mátrix? Feldolgozott élelmiszer? Technológia, fehérjekémia, analitikai, klinika 10

11 A gabona/búzafehérjékkel kapcsolatos analitika specifikus problémái Klasszikus analitika Pl. Cu-meghatározás Pontosan ismert az analit? Allergén-analitika Pl. gliadin-meghatározás - HOGYAN JÁRULHAT HOZZÁ A Immunanalitika Epitóp? Milyen módszert Ellenanyag? RENDELLENESSÉGGEL ÉLŐK ÉLETMINŐSÉGÉHEZ alkalmazzunk? AZ ÉLELMISZERANALITIKA?? Homogenizálás? Lehetséges megbízható mennyiségi meghatározás? Extrakciós módszer? -HOGYAN ADHATUNK ELFOGADHATÓ VÁLASZT A FOGYASZTÓ, AZ IPAR ÉS A HATÓSÁG RÉSZÉRE? MÓDSZEREK - ÉRVÉNYESÍTÉSE? Feldolgozási folyamatok hatása? 11

12 A gliadin mennyiségi meghatározásának néhány specifikus kérdése Van allergénmentes búza? Melyik epitópot tartalmazó fehérje milyen mennyiségben van jelen? Van különbség a búzafajták fehérjealegységeinek eloszlása között? Vagyis mi az elérhető cél? A búza jelenlétének kimutatása vagy az egészségügyi kockázatot jelentő egyes komponensek - vagyis a toxicitás mértékének meghatározása? 12

13 A sikér (gliadin) kimutatására alkalmas analitikai módszerek érvényesítésének nehézségei Oldékonyságuk eltérő (hidrofób és hidrofil fehérjék) Referencia anyagok hiányoznak Referencia módszerek hiányoznak Az analitikai és validálási fogalmak és folyamatok átgondolása szükséges. 13

14 33 partner, 20 ország / 4 kontinens Jelenleg: 92 regisztrált intézmény 35 országból 155 kutató, ezen belül 40 PhD hallgató Időtartam: 5 év kezdet 2007 február 1. EU támogatás: 12.3 M Koordinátor: Roland Ernest Poms, ICC International Association for Cereal Science and Technology, Vienna, Austria 1 Microbiological Contaminants 2 Biotoxins/Phycotoxins 3 Chemical Contaminants 4 Food Allergens 5 Food Authenticity 6 Food Additives Future Issues 7 Qualitative Method Validation 8 Socio-Economic Impact Method Performance Quality Assurance and Control Sampling Measurement Uncertainty Legislation Socio-Economic Impact Traceability Harmonisation 14

15 Problémamegoldás referenciaanyag fejlesztése 1. Feldolgozott modelltermék előállítása módosított recept alapján* 2. Az analitikai módszer vizsgálata 3. A feldolgozási folyamat hatásának vizsgálata *Scaravelli E, Brohée M, Marchelli R, van Hengel, A J. Development of three real-time PCR assays to detect peanut allergen in processed food products. Eur. Food Res. Technol. 2008; 227:

16 Kísérletterv Porkeverékek készítése Tésztakészítés 0, 10 és 100 ppm gliadin ELISA 3 minta/sütés Süteménykészítés 3 sütés/koncentrációszint 3 sütemény/sütés 16

17 Gliadin koncentráció (ppm) Gliadin koncentráció (ppm) Első kísérleti eredmények Homogenitás problémák Homogenitási kísérletek 10 ppm gliadin-tartalmú sütemények ppm gliadin-tartalmú sütemények 17

18 BOKU 60 % ethanol BOKU 60 % ethanol BOKU 60 % ethanol BOKU 70 % ethanol BOKU 70 % ethanol BOKU 70 % ethanol BOKU 80 % ethanol BOKU 80 % ethanol BOKU 80 % ethanol Sigma 60 % Sigma 60 % Sigma 60 % Sigma 70 % Sigma 70 % Sigma 70 % Sigma 80 % Sigma 80 % Sigma 80 % Sigma 60 % Sigma 60 % Sigma 60 % Sigma 70 % Sigma 70 % Sigma 70 % Sigma 80 % Sigma 80 % Sigma 80 % Gliadin koncentráció, ppm BOKU 60 % BOKU 60 % BOKU 60 % BOKU 70 % BOKU 70 % BOKU 70 % BOKU 80 % BOKU 80 % BOKU 80 % Gliadin koncentráció, ppm Oldási kísérlet új fehérjeizolátum alkalmazása Oldási kísérlet, Sigma Oldási kísérlet, BOKU 18

19 Gliadin concentration (ppm) Gliadin concentration (ppm) Új típusú mintamátrix készítése 10 ppm sütemény Gliadinforrás: Referencia liszt ppm sütemény

20 A feldolgozási folyamat hatása Denaturáció? Extrahálhatóság? Immunaffinitás? Szerkezetmódosulás? Detektálhatóság? Klinikai hatás? 20

21 Módszerek összehasonlítása sikér (glutén) tartalom mérése esetén Gyártó Kit neve LoD LoQ Standard sor ELISA Systems Gliadin 2,5 ppm gliadin 2,5 ppm gliadin 0, 2,5, 5, 10, 20, 25 ppm gliadin Haven Gluten-Check ELISA 1 ppm glutén 7,5 ppm glutén 37,5, 75, 150, 300, 600 ng/ml glutén Morinaga Wheat Protein ELISA kit 0,3 μg/kg fehérje 0,78 ng/ml fehérje 0,78, 1,56, 3,12, 6,25, 12,5, 25 ng/ml búza fehérje R-Biopharm RIDASCREEN Gliadin 1,5 ppm gliadin 2,5 ppm gliadin 0, 5, 10, 20, 40, 80 ppb gliadin Romerlabs AgraQuant Gluten Assay 0,6 ppm 4 ppm glutén 0, 4, 12, 40, 120 ppm glutén Tepnel BIOKITS Gluten Assay Kit 1 ppm glutén 3 ppm glutén 0, 3, 5, 10, 20, 50 ppm glutén Veratox Quantitative Gliadin Test Nincs adat 5 ppm gliadin 0, 5, 10, 20, 50 ppm gliadin 21

22 sszehasonlító vizsgálatok ELISA tesztek eredményeinek összehasonlító elemzése FONTOS ANALITIKAI ÉS ÉLELMISZERBIZTONSÁGI KÉRDÉS Ellenanyag? Epitóp Extrakció? Kalibráló anyag? 22

23 Stabilitás vizsgálatok A referenciaanyag jelölt modelltermék sütemény stabilitása megfelelő 23

24 Felmerülő problémák Glutelin : Gliadin 1 : 1 Irodalmi adatok? Valóság? Genetikai variabilitás Környezeti tényezők hatása Genetikailag különböző búzafajták keveréke 1 fajtazonos búza Mintamátrixok készítése Elválasztástechnikai vizsgálatok 24

25 Összegzés A validálás egyik feltétele teljesíthető Referenciaanyag laborszintű előállítása megoldható A feldolgozási folyamatoknak jelentős hatása van a rendellenességeket kiváltó komponensek mérhető koncentrációjára Az okok és a hatások magyarázatával a tudomány részben adós A jelenleg forgalomban lévő kittekkel kapott eredmények eltérnek Összemérés, analitikai módszerfejlesztés szükséges Első az élelmiszerbiztonság, a fogyasztók biztonsága, de A szabályozást harmonizálni kell(ene) a lehetőségekkel!!! 25

26 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS MoniQA Kiválóság-hálózat (FOOD-CT ) BME Allergén Munkacsoport Dr. Gelencsér Éva és Valentin Éva, KÉKI Dr. Bert Pöpping és Dr. Sandra Kerbach, Eurofins Analytik GmbH, Hamburg, Németország Prof. Emmerich Berghofer, BOKU, Bécs, Ausztria 26

27 Köszönjük megtisztelő figyelmüket! 27

28 Gliandin koncentráció (ppm) Elsődleges eredmények 2. Visszanyerési problémák Oldási kísérletek Gliadin visszanyerés a porkeverékből Névleges koncentráció Mért átlagos koncentráció

29 Gliadin koncentráció, ppm Homogenizálási kísérlet Új homogenizálási módszer kidolgozása Gliadin homogenizálás oldatban 29