TUDOMÁNY, INNOVÁCIÓ, VERSENYKÉPESSÉG

Átírás

1 MAGYAR TUDOMÁNYOS AKADÉMIA TUDOMÁNY, INNOVÁCIÓ, VERSENYKÉPESSÉG A Miniszterelnöki Hivatal és a Magyar Tudományos Akadémia együttműködési megállapodása alapján végzett kutatások főbb eredményei ( ) I. kötet Természettudományok Budapest, 2004

2 MAGYAR TUDOMÁNYOS AKADÉMIA TUDOMÁNY, INNOVÁCIÓ, VERSENYKÉPESSÉG A Miniszterelnöki Hivatal és a Magyar Tudományos Akadémia együttműködési megállapodása alapján végzett kutatások főbb eredményei ( ) I. kötet Természettudományok Budapest,

3 A Miniszterelnöki Hivatal és a Magyar Tudományos Akadémia együttműködési megállapodása alapján végzett kutatások főbb eredményei ( ) A kutatási záróbeszámolók alapján összeállították a Természettudományi Főosztály munkatársai Szegő Károly főosztályvezető Banczerowski Januszné főosztályvezető-helyettes Fekete Márton Szekeresné Czuczor Zsuzsa Magyar Tudományos Akadémia, Budapest, 2004 ISSN X Felelős kiadó: Meskó Attila Készült 300 példányban, B/5 formátumban Fotókész anyagról a nyomdai kivitelezést végezte: AMULETT 98 Nyomdaipari és Szolgáltató Kft. Felelős vezető: Lajtai Ferenc 3

4 Tartalom Előszó (MESKÓ ATTILA)...5 I. ÉLETTUDOMÁNYOK AZ EGÉSZSÉGÜGY SZOLGÁLATÁBAN SZABÓ GÁBOR: Neuro-pszichiátriai genomika: a genetikailag módosított kannabinoid jelátviteli rendszer, mint szorongásmodell...7 DUDITS DÉNES PUSKÁS LÁSZLÓ HARRACH BALÁZS: Gyógyászati és diagnosztikai célú genomikai kutatások II. A MEZŐGAZDASÁGI TERMÉKSZERKEZET JAVÍTÁSA, ÚJ TERMELÉSI MÓDOK BEVEZETÉSE BEDŐ ZOLTÁN: A növénytermesztési szerkezet javítása, a biológiai alapok fejlesztése NÉMETH TAMÁS: A fenntartható gazdálkodást megalapozó talajvédelmi beavatkozások vizsgálata KŐMÍVES TAMÁS: Környezetkímélő, a természet védelmét és a táj megőrzését szolgáló, valamint a vidék fenntartását célzó növényvédelmi módszerek kutatása III. NANOTECHNOLÓGIA ÉS NANOTUDOMÁNYOK GYULAI JÓZSEF: A nanogas projekt

5 5

6 ELŐSZÓ A Miniszterelnök és a Magyar Tudományos Akadémia (MTA) Elnöke május 5-én megállapodást kötött stratégiai kutatások megvalósítására, figyelembe véve az Európai Közösség 6. Kutatási, technológiafejlesztési és demonstrációs Keretprogram tematikus prioritásait. A megállapodásban rögzítették a támogatandó kutatási irányokat. Ennek megfelelően írták alá a részletes feladatokat rögzítő szerződést a Miniszterelnöki Hivatal (MEH) és az MTA képviselői. A támogatások odaítélésekor fontos szempont volt, hogy a természettudományi kutatóintézetekben azokat a témákat részesítsük előnyben, melyek gazdasági haszna rövid távon remélhető, vagy például a kutatások a népbetegségek megelőzését, a széleskörű életminőség-javulást szolgálják. Így került sor eddig nem ismert új támadáspontú gyógyszerek kutatási módszereinek vizsgálatára, amelyek stressz, szorongás, depresszió kezelésében nyújtanak célszerűbb és hatékonyabb kezelési eljárásokat. Hasonló fontosságú a géntechnika diagnosztikus felhasználása. Magyarországon különleges fontosságú a mezőgazdaság korszerűsítését előmozdító kutatások támogatása. A modern elektronika a mindennapi életben alkalmazott műszerek működésének alapja. Mind az elektronikai eszközök, mind a műszerfejlesztés egyik fő célja a miniatürizálás. Speciális szerkezetű mikrokristályok a levegő összetételének igen érzékeny érzékelői lehetnek. Jelentős hazai tapasztalat és tudás ipari felhasználását szolgálja ezen a területen a nanogáz-projekt. A társadalomtudományok területén három fő kérdéscsoportot vizsgáltak. A magyar gazdaság versenyképességének meghatározó tényezőinek elemzésekor megállapították, hogy az elmúlt másfél évtizedben Magyarország a leginkább transznacionalizált nemzetgazdaságok közé került: világviszonylatban a nyolcadik, Európában Írország mögött a második helyen áll. A legutóbbi években azonban sok jel szerint versenyképességünk csökkent, pedig csak ennek erősítése tudja garantálni a gyors és fenntartható fejlődést, a sikeres EU-tagságot. A tudás- és technológiatranszfer lehetőségeinek jobb kihasználása a regionális különbségek csökkentésére nagymértékben attól függ, hogy mekkora a regionális szereplők tudás generáló és hasznosító kapacitása, milyen mértékben képesek innovációvá fejleszteni a megszerzett tudást, illetve a nemzetközi piacokon exportsikereket elérni a régióban kifejlesztett új termékekkel és szolgáltatásokkal. Napjaink magyar társadalma és fejlődési irányai vizsgálatakor bebizonyosodott, hogy a rendszerváltás óta eltelt időszak a társadalmi rétegződés szempontjából három jól elkülönülő szakaszra osztható. A kilencvenes évek fordulóján a kapun 6

7 belüli munkanélküliség valódi munkanélküliséggé változott, a rendszerváltás mély gazdasági válsággal kapcsolódott egybe. A kilencvenes években meginduló gazdasági növekedés lényegében stabilizálta az egyenlőtlenségeket, valamint kialakulni látszik egy stabilizálódó osztályszerkezet. A munkaerőpiacnak meghatározó szerepe van a társadalmi rétegződésben. Az elvégzett munkákról összegző jelentések készültek, melyek rövidített, szerkesztett változatát jelen kiadványban adjuk közre. A beszámolók teljes szövege az MTA honlapján ( A tudomány világából című rovatban olvasható. Budapest, október 7

8 I. ÉLETTUDOMÁNYOK AZ EGÉSZSÉGÜGY SZOLGÁLATÁBAN SZABÓ GÁBOR MTA Kísérleti Orvostudományi Kutatóintézet Neuro-pszichiátriai genomika: a genetikailag módosított kannabinoid jelátviteli rendszer, mint szorongásmodell Specifikus idegrendszeri jelátviteli rendszerek és jól körülhatárolt neuronális hálózatok célzott genetikai módszerekkel történő megváltoztatása sok új és eddig még teljesen kiaknázatlan lehetőséget nyújt a magasabbrendű idegi tevékenység strukturális, neurokémiai, molekuláris- és sejtszintű alapjainak a megértéséhez, továbbá az idegrendszert érintő súlyos betegségek okainak kiderítéséhez és új hatásos gyógyszerek kifejlesztéséhez. A MEH-MTA együttműködés keretében elkezdett stratégiai kutatásoknak az alapvető célkitűzése olyan technológiák és DNS vektorrendszerek kidolgozása, amelyek segítségével a jövőben létrehozandó transzgenikus egerek modellként szolgálhatnak neuro-pszichiátriai megbetegedések molekuláris alapjainak megismeréséhez, új terápiás lehetőségek kidolgozásához és hatékony gyógyszerek kifejlesztéséhez. A cél elérése érdekében olyan transzgenikus vektorrendszereket és módszereket kívántunk kidolgozni, amelyek segítségével az idegrendszeri betegségekben érintett gátló GABAerg idegsejtek és azoknak parvalbulmumin kalciumkötő fehérjét expresszáló csoportja, valamint a principális, serkentő glutamáterg idegsejtek genetikai célzására alkalmasak. Továbbá be kívántuk vezetni az indukálható transzgenikus technológiát is azért, hogy a genetikai módosítást időben is szabályozni tudjuk. Az ehhez szükséges vektorrendszereket szintén a GABAerg idegrendszer időben szabályozható módosítására terveztük kidolgozni. Modellként a kannabinoid szignáltranszdukciós rendszert választottuk, amely a G-fehérjékhez kapcsolt CB1 receptoron keresztül az idegrendszer legfontosabb neurotranszmitter-rendszereit modulálva (GABAerg, glutamaterg, dopaminerg, kolinerg, opioid stb) számos magasabbrendű idegi tevékenység, többek között a memória, tanulás, pszichés reakciók, érzelmek, magatartás, és a motoros rendszer agyi kontrolljának a szabályozásában vesz részt. A modellválasztást az is indokolja, hogy a rendszer érintettsége oki tényezőként szerepelhet olyan súlyos neuropszichiátriai betegségek 8

9 kialakulásában, amelyeknek a szelektív és hatásos gyógyszeres terápiája még nem megoldott. Ezért a kannabinoid jelátviteli rendszer több komponense: a kannabinoid transzporter és a lebontó enzimek, de mindenek előtt a CB1 receptor - új típusú gyógyszercélpontként jöhetnek szóba: különböző eredetű kognitív diszfunkciók és memóriazavarok (pl Alzheimer kór), a motoros rendszert érintő neurodegeneratív kórképek (Parkizon kór, Huntington chorea), magatartási rendellenességek: pszichózisok és szorongás, neuropátiás és perifériás fájdalmak, drogabúzus stb. kezelésében. Ehhez azonban még nem ismerjük kellően a kannabinoid hatás pontos mechanizmusát, az ürülés helyét, a receptorok megoszlását és sajátosságait, a kannabinoid szabályozás alatt álló neuronális hálózatokat, neurotranszmitterrendszereket és azok kölcsönhatásait, továbbá az érintett élettani- és idegi funkciók teljes skáláját sem. Tehát a kannabinoid szignáltranszdukció struktúrális és funkcionális alapjainak megismerése elengedhetetlen a cannabionoid rendszert célzó új gyógyszerek kifejlesztésében. Ezeknek a kérdéseknek az eredményes megválaszolását nagymértékben elősegíti a genetikailag módosított kannabinoid rendszerrel rendelkező modellállatok komplex funkcionális anatómiai, elektrofiziológiai és magatartásvizsgálata. Ezek a részletesen jellemzett genetikailag módosított egerek a jövőben felhasználhatók lesznek a CB1 receptoron ható potenciális gyógyszerek fejlesztéséhez szükséges vizsgálatokra is. Ezért terveztük az endokannabinoid rendszer komplex, strukturális és funkcionális vizsgálatát és olyan vektorok elkészítését, amelyek felhasználásával a CB1 receptorok expressziója célzottan megváltoztatható A jövőben létrehozandó genetikailag módosított kannabinoid CB1 receptorrendszerrel rendelkező transzgenikus egerek alkalmasak lesznek a szorongás patomechanizmusának vizsgálatára és a CB1 receptoron ható potenciális gyógyszerek fejlesztésére is. Specifikus idegsejtcsoportok célzott és indukálható módosítására szolgáló transzgenikus technológiák kidolgozása A GABAerg idegsejtek célzott genetikai módosítására alkalmas DNS vektor elkészítése 9

10 A GABAerg rendszer célzásához kiválóan alkalmas egy olyan gén regulációs régiója, amely az egész GABAerg idegrendszerben kifejeződik. Erre a célra a GABA-szintetizáló enzim, a glutaminsav dekarboxiláz 65 kda formáját kódoló gént választottuk, mert az minden GABAerg idegsejtben kifejeződik. Az általunk korábban klónozott egér GAD65 gén GABAerg specificitásáért felelős regulációs régióját úgy választottuk ki, hogy gén 5 -régiójának különböző hosszúságú darabjait és az autofluoreszcenciával rendelkező zöld fluoreszkáló fehérje (GFP) génjét tartalmazó transzgéneket hordozó traszgenikus egereket állítottunk elő. Az így létrehozott vonalakban, az agyi GFP expresszió vizsgálatával meghatároztuk a GAD65 gén különböző hosszúságú regulációs régióinak a specificitását. Megállapítottuk, hogy egy 5.5 kb hosszúságú 5 -regulációs régió az elő három exonnal és a köztük lévő két intronnal együtt nagyfokú GABAerg specificitást mutat. Tehát a GAD 65 gén általunk jellemzett régiója alkalmas a GABAerg rendszer célzására. konzervált régió GAD65 BAC klón 1. ábra. Az egér GAD65 gén 5 -régiójának szerkezete és a GAD65-GFP transzgenikus konstrukció. 10

11 Elemzéseink azt mutatták, hogy az általunk izolált és jellemzett GAD65 génszakasz alkalmas tetszőleges transzgén GABAerg specifikus expressziójának irányítására. A GFP markert a GABAerg sejtekben expresszáló transzgenikus egérmodelleket széleskörű hazai és nemzetközi együttműködésekben használtuk, többek között agykérgi, hippocampalis, bulbaris, hypothalamikus és gerincvelői GABAerg idegsejtek és hálózatok funkcionális jellemzésére, valamit a cortikális és bulbaris fejlődés vizsgálatára. (2. ábra) Megjelent közlemények: Aungst, J.L., Heyward, P.M., Puche, A.C., Karnup, S.V., Hayar, A., Szabo G., Shipley, M.T. (2003) Center-Surround Inhibition Among Olfactory Bulb Glomeruli. Nature 426: Brager,D.H., Luther, P.W., Erdélyi, F., Szabó, G. and Alger, B.E., (2003) Regulation of exocytosis from single visualized GABAergic boutons in hippocampal slices. J Neurosci 23: López-Bendito, G., Sturgess1, K., Erdélyi, F., Szabó, G., Molnár, Z. and Paulsen. O. (2004) Preferential origin and layer destination of GAD65-GFP cortical interneurons. Cerebral Cortex (in press). Beküldött közlemények: K.A. Hamilton, T. Heinbockel, M. Ennis, G. Szabó, F. Erdélyi, and A. Hayar. (2004) Functional Properties of External Plexiform Layer Interneurons in the Mouse Olfactory Bulb. J. Neurophisiol (közlésre benyújtva) De Marchis, S., Temoney, S., Erdelyi, F., Bovetti, S., Bovolin, P.1, Szabo, G., and Puche, A.C. (2004) GABAergic phenotypic differentiation of a subpopulation of sub-ventricular derived migrating progenitors. Eur J Neurosci (közlésre benyújtva) A GABAerg idegsejtek célzásához az általunk jellemzett GAD65 regulációs kazettát úgy alakítottuk át, hogy a transzláció ne a GAD génről, hanem az irányítani kívánt gén saját transzlációs start szignálájáról (ATG) induljon el. Ezért irányított PCR-mutagenezissel eltávolítottuk a GAD65 gén első exonjában található ATG kodonját és egyben azt egy NotI klónozó hellyé alakítottuk, mögé pedig és mögé egy SV40 eredetű poli(a) addíciós szignált is beültettünk. Ez utóbbi szignál fogja a transzgén átírását terminálni. A korábban tesztelt GABAerg-specifikus transzgenikus-expressziós kazettát kiegészítettük a gén 3. exonjától a 6. exonjáig terjedő szakaszával, mivel a humán és egér GAD65 gén szekvenciájának összehasonlításakor a 4. intronban a génregulációban feltehetően szerepet játszó konzervált DNS szakaszokat azonosítottunk (1. ábra. A panel). Az elkészült GAD65-alapú transzgenikus expressziós kazetta NotI klónozó helyére bármely cdns beültethető, amelyet a GABAerg idegsejtekben kívánunk kifejeztetni (GAD65-ATGexon1-6NotpA) (3. ábra). Ezt a GABAerg-specifikus expressiós kazettát felhasználtuk fel a tetraciklin-indukálható transzgenikus vektorrendszer kidolgozásához. 11

12 hippocampus olfactory bulb 2. ábra. GFP expresszió a GAD65/gfp transzgenikus egér(#30) különböző agyi struktúráiban A principális glutamaterg idegsejtek célzott genetikai módosítására alkalmas DNS vektor elkészítése és tesztelés transzgenikus egérben Az agykéreg és a hippocampus principális serkentő idegsejtjei kitüntetett szerepet játszik olyan magasabb rendű idegi tevékenységek szabályozásban, mint a tanulás, memória és a környezeti hatásokhoz való adaptáció. A működésükben fontos szerepet játszó jelátviteli rendszerek megváltozott működése és az ennek következményeként kialakuló sejtpusztulás olyan idegrendszeri betegségek kialakulásában, mint a neurodegeneratív megbetegedések (pl. Alzheimer kór) és az epilepszia, játszik szerepet. Ezért működésük anatómiai, fiziológiai, sejt és génszintű alapjainak megértése elengedhetetlen ahhoz, hogy számos gyakran előforduló, súlyos egyéni, családi és társadalmi problémát jelentő 12

13 neuropszichiátriai betegség okait kiderítsük, melyek következményeinek enyhítésére és gyógyítására nem rendelkezünk megfelelő hatásos gyógyszerekkel. NotI célzására alkalmas GAD65-gén alapú DNS vektor 3. ábra. A GABAerg rendszer genetikai EcoRI NcoI az idegsejteknek a genetikai BamHI célzására a kalcium kalmodulin kináz II Ezeknek BamHI EcoRI (CamkII ) gén alkalmasnak tűnik, mivel fehérje a fő komponense a SmaIez a EcoRI XhoI XhoI NcoI idegsejtek BamHI SmaI denzitásának, és az SalI principális glutamaterg posztszinaptikus XhoI SalI BamHI SmaI BamHI NcoI EcoRI irodalomban is gyakran használják transzgenikus egerekben ezeknek a sejteknek a genetikai célzására Az egér CamkII gén promotert is tartalmazó 8 kb hosszúságú 5 konzervált régiójának glutamaterg specificitását az egfp markergén segítségével egfp cdns transzgenikus egérben teszteltük. Ehhez a 8,5kb hosszúságú CamkII DNS fragmentumhoz többlépéses rtta Not klónozás során hozzákapcsoltuk I a GFP-t kódoló DNS szakaszt. A konstrukció SV40 poli(a) elkészítésekor pires-egfp, valamint BlueScript II klónozó vektorokat alkalmaztuk, és a GFP/BSII fragmentumot a CamKII promóter régiót tartalmazó GAD65 vektorba klónoztuk. exonok A transzgenikus pmm403 konstrukcióból PauI emésztéssel gén 4 állítottuk elő a CamkII /egfp A transzgenikus egereket standard ATGtranszgént. TTG mikroinjektálási módszerrel állítottuk elő. A transzgént hordozó egyedeket a gfp expresszió közvetlen kimutatásával azonosítottuk, majdgad65 vonalakat alapítottunk. A BAC transzgén kifejeződését agyi metszeteken a gfp-t tartalmazó idegsejtek közvetlen GAD65-ATGexon1-6NotpA (12894 bps) mikroszkópos kimutatásával vizsgáltuk. Megállapítottuk, hogy a CamKII gén általunk kiválasztott régiója alkalmas a glutamaterg sejtek specifikus genetikai célzására (4. ábra). CamKII promoter CA1 pmm403 hippocampus egfp CA3 bghpas pires-egfp DG 13

14 cortex 4. ábra. CamKIIa/egfp transzgenikus konstrukció, gfp pozitív glutamaterg idegsejtek a hippocampus-ban és a cortex-ben A GABAerg rendszer indukálható genetikai módosításához szükséges DNS vektor kidolgozása Transzgének indukálható expressziójára azért van szükség, mert bizonyos géntermékek embrionális korban való megjelenése fejlődési rendellenességekhez, sőt pusztuláshoz is vezethet, továbbá kompenzációs mechanizmusok is felléphetnek. Ezt elkerülendő előnyös lehet az, ha a transzgént tetszőleges időben be és ki is tudjuk kapcsolni. Ilyen esetekben a létrejött elváltozás egyértelműen a transzgén kifejeződéséhez köthető. A leggyakrabban használt időben szabályozott transzgenikus rendszer a tertaciklinnel (tet) szabályozható bakteriális operonon alapszik. A kettős transzgenikus rendszerben használt tet operátort tartalmazó mesterséges promóter (teto/cmv) csak akkor aktív, ha egy tet függő transzaktivátor fehérje kapcsolódik hozzá. E fehérjék közül az egyik (tta ) tet jelenlétében nem képes a promóterhez kötődni, ebben a rendszerben a tet adagolás felfüggeszti a működést (tet off rendszer). A másik transzaktivátor (rtta) viszont csak tet jelenlétében aktiválja a promótert (tet on rendszer). Az egyik transzgenikus egérben a kifejeztetni kívánt gén az inaktív teto/cmv promóter kontrollja alatt áll. A rendszer másik tagjában a transzaktivátor fehérje kifejeződédét egy szövetspecifikus promóter irányítja. A két transzgenikus egeret keresztezve a génünk csak abban a sejttípusban fejeződik ki, amelyikben a transzaktivátor is jelen van. Az pedig, hogy a rendszer tet adagolással, vagy megvonással működik, attól függ, hogy melyik típusú transzaktivátort alkalmazzuk. Az alaprendszernek az a hátránya, hogy a teto/cmv promóter alacsony szinten a transzaktivátor nélkül is működik, továbbá sokszor olyan magas tet koncentráció szükséges a ki-be kapcsoláshoz, amit különösen nehéz elérni az agyban. Ezt a nehézséget úgy lehet kiküszöbölni, hogy a tet on rendszerben a rtta aktivátornak egy kevesebb tet-et igénylő változatát használjuk és vele együtt egy olyan represszort is beiktatunk a rendszerbe, amelyik a teto/cmv promóterhez kötődve azt erőteljesen gátolja, amit a tet teljes mértékben felfüggeszt. 14

15 Mi egy olyan opitmalizált tet on vektort készítettünk el, amelyben az rtta2sm2 optimalizált reverz tet transzaktivátort és a tts represszort tartalamazó kettős gént a GAD65-alapú transzgenikus vektor NotI klónozó helyére ültettük be. A tts szintézise egy belső riboszóma kötőhelyről indul. Ez a represszor megakadályozza azt, hogy doxiciklin (tet analóg) adagolás nélkül a célgénről fehérje képződjön (4. ábra). Az jövőben elkészülő GAD65/rtTA2s-M2irestTS transzgenikus egereket úgy teszteljük, hogy azokat egy olyan riporter egérrel keresztezzük, amelyik a GFPtetO/CMV-laZ transzgént hordozza (Z/EG- ez a transzgenikus egér a rendelkezésünkre áll) (4. ábra). Azt várjuk, hogy doxiciklin adagolásra mind a GFP, mind pedig a -gal megjelenik a GABAerg sejtekben. Ezzel a riporterrendszerrel azt tesztelhetjük, hogy mennyire szorosan szabályozható tetel a transzgén-expresszió (4. ábra). Egyik markergént egy tetszőleges génre cserélve, ez a rendszer alkalmas arra, hogy bármely gént indukálható módon kifejeztessünk a GABAerg idegsejtekben. 5. GABAerg egfp idegsejtek egfp SVpA -gal -globinpa pc2 TRE pc1 lacz Z/EG transzgenikus egér tetracikli s GAD65 rtta2 -M2 transzgenikus egér GAD65 + represszor rtta2s-m2 tts GABAerg idegsejtek ábra. A GABAerg specifikus tetraciklinnel indukálható transzgenikus rendszer Mesterséges bakteriális kromoszóma alapú (BAC), nagy pontosságú szövetspecifikus transzgenezis Transzgenikus egér előállítása módosított mesterséges bakteriális kromoszóma megtermékenyített petesejtbe történő injektálásával: BACparvalbumin/gfp transzgenikus egér A mesterséges gént hordozó transzgenikus egerek esetében a transzgén működésének térbeni és időbeli szabályozását a felhasznált DNS regulációs régiók határozzák meg. A hagyományos technikákkal létrehozható DNS konstrukciók mérete limitált, ezért a transzgén sok esetben nem tartalmazza az összes szabályozó elemet, ami szükséges a pontos, integrációs helytől független 15

16 szövetspecifikus kifejeződéséhez. Annak érdekében, hogy a transzgén expressziója pontos legyen, tartalmaznia kell a távolabbi DNS regulációs elemeket is, ami a transzgenikus konstrukció méretének növelésével biztosítható. Ez klasszikus klónozási technikákkal már nem oldható meg. A távoli elemeket úgy építhetjük be a transzgénbe, hogy több száz kb hosszúságú genomiális DNS klónt tartalmazó bakteriális mesterséges kromoszómába, in vivo rekombinációval beültetjük a kifejeztetni kívánt idegen gént. Az ilyen típusú BAC klón már nagyon nagy valószínűséggel tartalmazza egy adott gén minden fontos regulációs elemét. A nagyméretű (> 100 kb), egy szokásos transzgenikus konstrukció méreténél legalább egy nagyságrenddel nagyobb DNS fragmentum mikroinjektálásának beállításához egy olyan 180 kb hosszúságú módosított BAC klónt használtunk, amely a parvalbumin génbe beültetett gfp markergént tartalmazza. (A klónt Hannah Monyer bocsátotta rendelkezésünkre, University of Heidelberg.) Azért választottuk ezt a klónt, mert ezzel azt is tesztelhetjük, hogy a parvalbumin BAC valóban alkalmas-e a GABAerg idegsejtek parvalbumin-tartalmú populációjának genetikai célzására. (5. ábra) A módosított BAC klónt hordozó bakteriális kultúrából nagytisztaságú DNS-t izoláltunk, preperatív NotI restrikciós emésztéssel a módosított egér parvalbumin gént tartalmazó DNS fragmentumot kihasítottuk a vektorból és attól CL4B kromatográfiával elválasztottuk. Megtermékenyített petesejtbe való injektáláshoz közvetlenül a parvalbumin fragmentumot tartalmazó csúcs -frakciót használtuk. Transzgenikus egeret a csoportban rutinszerűen alkalmazott technológiával állítottuk elő. A megszületett utódokból a transzgén hordozókat a gfp expresszió izomban való direkt kimutatása alapján azonosítottuk, mivel a parvalbumin ott is expresszálódik. A 3db pozitív egyed utódaiban a transzgén agyi expresszióját közvetlenül a GFP fluoreszcencia alapján, agymetszeteken jellemeztük. A PV-GFP BAC transzgenikus egerekben a GFP markergén expressziója teljes értékben sejttípus-specifikusnak bizonyult, tehát a PV-BAC klón megfelelően módosítva alkalmas a parvalbumin-tartalmú idegsejtek genetikai módosítására. (6. ábra) 6. ábra. arvalbumin-gfp transzgenikus egér előállítása és az agyi expresszió analízise 16

17 17

18 Az agyi kannabinoid receptorok funkcionális jellemzése A szervezetünkben található endocannabinoid rendszer élettani és kórélettani jelentőségének tisztázása az elmúlt évek egyik legforróbb kutatási területévé vált az orvosbiológiában. A 90-es évek során kiderült, hogy kétféle receptor, a CB1 cannabinoid receptor az idegrendszerben, valamint a CB2 cannabinoid receptor az immunrendszerben közvetíti a cannabinoidszármazékok élettani hatását. Ezzel párhuzamosan arra is fény derült, hogy szervezetünk több lipidszármazékot is termel, amelyek e receptorok ligandumai, ezek az ún. endocannabinoidok. Az orvostudományi kutatások napjainkban ismerik fel, hogy számos betegség etiológiájában az endocannabinoid rendszer kulcsszerepet játszik, ezért befolyásolása jelentős terápiás potenciállal rendelkezik. Korábbi eredmények A Funkcionális Anatómiai Kutatócsoport célul tűzte ki, hogy felderítse a CB1 cannabinoid receptor pontos lokalizációját és élettani jelentőségét az idegrendszerben. Feltártuk, hogy a CB1 receptor a hippocampus nevű agyterületen az idegvégződéseken található (7. ábra), ahol élettani jelentősége a gátló hatású ingerületátvivő anyag, a GABA felszabadulásának szabályozása (Katona et al., 1999). 7. ábra. A CB1 receptor lokalizációja GABAerg idegvégződéseken az emberi hippocampusban A kísérletben a CB1 receptorok jelenlétét immunarany jelöléssel tettük láthatóvá, a vékony nyilak ezeket az ezüst-intenzifikált aranyszemcséket jelzik. A vastag nyíl egy tipikus szimmetrikus szinapszisra mutat, amely a GABAerg szinapszisok sajátossága a hippocampusban. A felfedezés világszerte új kutatásokat indított el, a kutatócsoport pedig számos további jelentős megfigyeléssel gazdagította az endocannabinoid rendszerről lévő ismereteinket. Igazoltuk, hogy a kísérleti állatokból származó megfigyelés az emberi hippokampuszban (Katona et al., 2000) és más agyterületeken, így pl. az amygdalában is érvényes (Katona et al., 2001). Feltártuk, hogy a tüdőben is idegvégződéseken fordul elő a CB1 receptor, ahol a

19 noradrenalin felszabadulását szabályozza, így hozzájárulva a bronchiális simaizmok kontrakciójának regulációjához (Calignano et al., 2000; Vizi et al., 2001). Elektrofiziológiai kísérletekben kimutattuk, hogy a GABAerg szinapszisokban a cannabinoidok a CB1 receptoron keresztül gátolják a neurotranszmissziót (Hájos et al., 2000). Ez az eredmény újabb kísérleti áttöréshez vezetett, amikor igazoltuk, hogy a serkentő hatású glutamaterg neurotranszmissziót egy ma még nem ismert új receptoron keresztül szintén befolyásolják a cannabinoidok (8. ábra) (Hájos et al., 2001). 8. ábra. Elektrofiziológiai bizonyíték egy új cannabinoid receptor létezésére. Az a ábrán egy vad típusú egérben látható, hogy a cannabinoid receptor agonista WIN csökkenti a kiváltott serkentő posztszinaptikus áramok amplitudóját. A b ábrán a CB1 receptort nem tartalmazó knockout egérben ugyanolyan hatása van a cannabinoid receptor agonistának, tehát a hatás hátterében nem a CB1, hanem egy ma még nem azonosított receptor áll. A serkentő idegvégződéseken található, molekulárisan még nem azonosított receptorokon történt vizsgálatok közül különösen fontos terápiás jelentőséggel bírnak a farmakológiai kísérletek, amelyben feltérképeztük az egyes receptorokra szelektíven ható kémiai anyagokat (Hájos és Freund; 2002) ezzel elősegítve szelektív, csak az egyes receptortípusokon ható gyógyszerek kifejlesztését (9. ábra).

20 9. ábra. Az AM251 vegyület szelektív gátlószere a CB1 receptornak, de hatástalan az új cannabinoid receptorra. Az A ábrán látható, hogy a WIN kezelés hatására történő amplitudócsökkenést a serkentő posztszinaptikus áramok esetében nem képes gátolni az AM251. Ezzel ellentétben a B ábrán megfigyelhető, hogy a gátló posztszinaptikus áramok esetében az AM251 hatásos ellenszere a WIN cannabinoid receptor agonistának. Ennek jelentőségére rámutat, hogy ezzel párhuzamosan viselkedésélettani kísérletekben kiderítettük, hogy a két receptortípus ellentétes előjellel játszik szerepet a szorongásban (Haller et al., 2002). Végül, de nem utolsósorban az endocannabinoid rendszer új molekuláris elemeinek vizsgálatában is részt vettünk egy nemzetközi kollaboráció keretei között, amelynek során sikerült felfedezni a 2-arachidonilglicerol endocannabinoid lebontó enzimét, a monoacilglicerol-lipázt (Dinh et al., 2002). A pályázat periódusban elért eredmények Az endocannabinoid rendszer morfológiai és funkcionális jellemzését újabb agyterületekre és újabb molekuláris építőelemekre terjesztettük ki, valamint fontos eredményeket értünk el az endocannabinoid rendszer elemeinek, mint potenciális gyógyszer-támadáspontoknak a pszichiátriai megbetegedésekben játszott szerepének tisztázásában. Kimutattuk, hogy a CB1 receptor előfordulása és aktiválásának következményei a GABA felszabadulására a gátló hatású idegvégződéseken a neocortexben, illetve posztnatális fejlődés során is a hippocampusban tapasztaltakhoz hasonlóan történik (Bodor et al., 2004; Morozov és Freund, 2003). Továbbá anatómiai módszerekkel felderítettük az endocannabinoidokat lebontó hidroláz és lipáz enzimek celluláris és szubcelluláris eloszlását számos előagyi területen (Gulyás et al., 2004). Az endocannabinoid szignalizáció élettani folyamatokban játszott szerepének és hatóidejének szempontjából további fontos felfedezés volt a 2-arachidonilglicerol hatásmechanizmusának feltárása a hippocampális szinaptikus transzmisszió szabályozásában, amely jelentősen módosítható az endocannabinoid

21 transzporterekkel. Ez az eredmény új terápiás célpontra világított rá, amely fontos targetje lehet pl. új támodáspontú szorongáscsökkentőknek. Ezen túlmenően gyógyászati szempontból különösen lényeges eredmény, hogy egy nemzetközi kollaboráció keretében felfedeztük, hogy a posztnatális fejlődés alatti epilepsziás lázgörcsök okozta tartós növekedést okoznak az endocannabinoid rendszer aktivitásában (Chen et al., 2003). Irodalom Calignano, A., Katona I., Desarnaud F., Giuffrida A., La Rana G., Mackie K., Freund T.F. and Piomelli D. (2000) Bidirectional control of airway responsiveness by endogenous cannabinoids. Nature, 408: Hájos N., Katona I., Naiem S.S., Mackie K., Ledent C., Mody I. and Freund T.F. (2000) Cannabinoids inhibit hippocampal GABAergic transmission and network oscillations. Eur. J. Neurosci. 12: Hájos N., Ledent C. and Freund T.F. (2001) Novel cannabinoid-sensitive receptor mediates inhibition of glutamatergic synaptic transmission in the hippocampus. Neuroscience, 106:1-4. Katona I., Sperlágh B., Sík A., Kőfalvi A., Vizi E.S. and Freund T.F. (1999) Presynaptically located CB1 cannabinoid receptors regulate GABA release from axon terminals of specific hippocampal interneurons. J.Neurosci., 19: Katona I., Sperlágh B., Maglóczky Zs., Sántha E., Kőfalvi A., Czirjak S., Mackie K., Vizi E.S. and Freund T.F. (2000) GABAergic interneurons are the targets of cannabinoid actions in the human hippocampus. Neuroscience, 100: Katona I., Rancz E. A., Acsády L., Ledent C., Mackie K., Hájos N. and Freund T.F. (2001) Distribution of CB1 cannabinoid receptors in the amygdala and their role in the control of GABAergic transmission. J. Neurosci., 21: Vizi E. S., Katona I. and Freund T. F. (2001) Evidence for presynaptic cannabinoid CB1 receptormediated inhibition of noradrenalin release in the guinea pig lung. Eur. J. Pharmacol., 431: Dinh T.P., Freund T.F. and Piomelli D. (2002) A role for monoglyceride lipase in 2arachidonoylglycerol inactivation. Chemistry and Physics of Lipids, 121: Dinh T.P., Carpenter D., Leslie F.M., Freund T.F., Katona I., Sensi S.L., Kathuria S. and Piomelli D. (2002) Brain monoglyceride lipase participating in endocannabinoid inactivation. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 99: Haller J., Bakos N., Szirmay M., Ledent C. and Freund T.F. (2002) The effects of genetical and pharmacological blockade of the CB1 cannabinoid receptor on anxiety. Eur. J. Neurosci., 16: Hájos N. and Freund T. F. (2002) Pharmacological separation of cannabinoid sensitive receptors on hippocampal inhibitory and excitatory fibres. Neuropharmacology, 43: Hájos N. and Freund T. F. (2002) Distinct cannabinoid sensitive receptors regulate hippocampal excitation and inhibition. Chemistry and Physics of Lipids, 121: ban megjelent közlemények Freund T.F. and Hájos N. (2003) Excitement reduces inhibition via endocannabinoids. Neuron, 38: Chen K, Ratzliff A, Hilgenberg L, Gulyás A, Freund TF, Smith M, Dinh TP, Piomelli D, Mackie K, Soltesz I (2003) Long-term plasticity of endocannabinoid signaling induced by developmental febrile seizures. Neuron, 39,

22 Freund T.F., Katona I. and Piomelli D. (2003) The role of endogenous cannabinoids in synaptic signaling. Physiol. Rev., 83: Morozov Y.M. and Freund T.F. (2003) Postnatal development of CB1 cannabinoid receptor immunoreactivity in the rat hippocampus. Eur. J. Neurosci. 18: ben elfogadott, ill. benyújtott közlemények Gulyas AI, Cravatt BF, Bracey MH, Dinh TP, Piomelli D, Boscia F. and T.F. Freund (2004) Segregation of two endocannabinoid-hydrolyzing enzymes into pre- and postsynaptic compartments in the hippocampus, cerebellum and amygdala Eur. J. Neurosci. (elfogadva) Hájos N, Kathuria S, Dinh T, Piomelli D and Freund TF (2004) Endocannabinoid transport tightly controls 2-arachidonoyl glycerol actions in the hippocampus: effects of low temperature and the transport inhibitor AM404. Eur. J. Neurosci. (elfogadva) Bodor Á, Katona I., Mackie K, Hájos N. and Freund TF (2004) Peculiar layer and target speficity of endocannabinoid signaling in the somatosensory cortex (közlésre benyújtva).

23 DUDITS DÉNES*, PUSKÁS LÁSZLÓ*, HARRACH BALÁZS** *MTA Szegedi Biológiai Központ, **MTA Állatorvos-tudományi Kutatóintézet Gyógyászati és diagnosztikai célú genomikai kutatások Az MTA Szegedi Biológiai Központ Funkcionális Genomika Laboratóriumában végzett kutatások eredménye A pályázat során több technikai megoldás kidolgozása mellett (DNS-chip fejlesztés, nyomtatási puffer optimalizálása, jelölési és hibridizálási stratégiák kidolgozása, oligonukleotid-alapú témachipek elkészítése) több olyan alapkutatási eredményt is sikerült elérnünk (áttétre és interferon érzékenységre jellemző génkifejeződések igazolásához kísérleti minták létrehozása, génexpressziós vizsgálatok), amely kiinduló pont lehet diagnosztikai DNS-chipek létrehozásához, elsősorban a melanóma klinikai minták jellemzésére. Módosítatlan oligonukleotidok nyomtatási stratégiáinak optimalizálása Sikerült előre megszintetizált módosítatlan és primer amino-csoportot tartalmazó oligonukleotidokat kémiailag aktivált tárgylemezhez rögzítenünk és olyan jelölési és hibridizálási körülményeket kialakítanunk, amelyek alkalmasak génexpressziós vizsgálatokra. A kikötés kulcslépése a szilárd hordozó és a nyomtatási puffer tesztelése és optimalizálása volt. Az általunk kidolgozott technikai megoldások így lehetővé teszik a gyors és egyedi próbatervezést, nem igényel DNS-klónokat és adott géntermék megfelelő régiójára tervezhető. Nagysűrűségű humán DNS-chip előállítása és tesztelése A pályázat egyik legfontosabb eredménye egy olyan oligonukleotid alapú humán DNS-chip elkészítése, amely több mint génspecifikus mintát tartalmaz. Több tesztkísérlet után kiválasztottuk azt a fajta oligonukleotid könyvtárat, mely legerősebb jelet adta próbahibridizációk során. Sikerült megvásárolnunk közel darab oligonukleotidot tartalmazó humán génspecifikus könyvtárat, mely egyedi génre tervezett 60 nukleotid hosszúságú amino-módosított próbát tartalmaz. Az egyes oligonukleotidokat a pályázat során optimalizált pufferben oldottuk fel, majd 384-es lemezekbe mértük. A nyomtató puffert úgy optimalizáltuk, hogy megfelelően kis méretű pont keletkezzen (lehetővé váljon ez által a nagysűrűségű nyomtatás) és viszonylag nagy mintakoncentráció alakuljon ki a felületen. Így, nyomtató robot segítségével 3 grides nyomtatással sikerült olyan sűrűséget elérnünk, aminek során egyetlen mikroszkóplemezre nyomtattuk mind a mintát.

24 A kapott DNS-chipeket melanómából nyert, majd fluoreszcensen jelzett, átírt RNS-sel hibridizáltuk és lézerszkenner segítségével leolvastuk. A leolvasott lemez egy részletét az 1. ábra szemlélteti. Ennek a humán DNS-chipnek a melanómák génexpressziós jellemzése mellett a további fő előnye, hogy alkalmas más humán projektekben is globális génexpressziós változások nyomonkövetésére, így további hazai és nemzetközi kutatási kooperációk kialakítására, újabb pályázatok technikai hátterének megteremtésére. 1. ábra. Oligonukleotid alapú humán DNS-chip egy részlete melanómából nyert mintával történő hibridizáció után

25 Jelamplifikációs mintajelölési eljárás optimalizálása génexpressziós vizsgálatokhoz Az eddigi lineáris mintasokszorozási eljárás helyett egy sokkal hatékonyabb jelölési stratégiát állítottunk be, mely jelsokszorozáson alapul, így nem torzítja a kiindulási RNS-ek mennyiségi arányát, és nem függ a mintasokszorozás egyedi eltéréseitől. A jelölés lényege, hogy két lépcsős hibridizálás során a chipre már bekötődött cdns molekulákhoz egy fluoreszcens festéket tartalmazó gömbszerű óriásmolekula kötődik, így egy hibridizációs eseményt festékmolekula emissziója követ, ami az érzékenységet két nagyságrenddel megnöveli. A technika a GenisphereTM jelölési stratégiát követi egyedi módosításokkal. Ezzel a technikával már 1 g alatti teljes RNS is jelölhető, ami igen fontos kis biológiai vagy klinikai minták (pld. biopszia) esetén. A jelölési stratégiát a második ábra szemlélteti: Hibridizációs állomás használata nagysűrűségű DNS-chipek hibridizációjához Nemrégiben OM Műszerpályázat (OMFB-00619/2003) keretén belül beszerzésre került egy automata hibridizációs központ (Ventana), mely alkalmas DNS-chipek validált körülmények közötti gyors és hatékony hibridizációjára. Segítségével egyenletes próbaeloszlás érhető el a DNS-chipek felületén, ami pontosabb és reprodukálhatóbb kísérleteket tesz lehetővé. Jelen pályázat keretein belül sikerült a dendrimer-alapú jelamplifikációs jelölési stratégiát a hibridizációs állomáshoz igazítani (egy új hibridizációs puffer létrehozásával és a hibridizációs idők optimalizálásával). Melanóma-specifikus gének kiválasztása, tervezése és nyomtatása Melanóma áttétes irodalmi adatok alapján és az eddig ismert melanóma antigének figyelembevételével sikerült olyan oligonukleotid próbákat tervezni, melyek hosszúságban, olvadáspontban, GC-tartalomban egységesek és amelyek nem mutatnak kereszthomológiát más humán géntermékekkel. Ezeken a mintákon kívül az eddig ismert melanóma antigének figyelembevételével is terveztünk oligonukleotidokat. Az oligonukleotidokat megszintetizáltattuk és többszörös ismétléssel aktivált üveglemezre nyomtattuk. A válogatott klónok egy részének leírását lásd az 1. táblázatban. Ezeket az oligonukleotid-alapú kevesebb génspecifikus mintát tartalmazó chipeket a teljes humán könyvtárat tartalmazó DNS-chipek mellett olyan kísérletekben használhatók, melyek sok minta tesztelését igénylik. A specifikus ún. melanóma téma-chip fejlesztése folyamatos, vagyis a es DNS-chipből kapott adott tulajdonságra jellemző marker szekvenciák folyamatosan beépíthetők. Az eddigi markerekből előállított próbákat szilárd hordozóhoz kötöttük, és igazoltuk a kezdeti melanóma-chip használhatóságát génexpressziós analízishez.

26 2. ábra. A jelamplifikációs stratégia összefoglaló ábrája

27 1. TÁBLÁZAT Melanóma-specifikus markerek melanóma-chip létrehozásához [áttét és általános melanóma markerek] SELECTED MARKERS melanoma adhesion molecule absent in melanoma 1-like absent in melanoma 2 B melanoma antigen chemokine (C-X-C motif) ligand 1 CD63 antigen (melanoma 1 antigen) (CD63) Melanoma associated gene (D2S448), mrna. melanoma antigen melanoma antigen, family A, 10 melanoma antigen, family A, 11 melanoma antigen, family A, 2, copy b melanoma antigen, family A, 8 melanoma antigen, family A, 9 melanoma antigen, family B, 1 melanoma antigen, family B, 2 melanoma antigen, family B, 3 melanoma antigen, family B, 4 melanoma antigen, family C, 1 melanoma antigen, family D, 1 melanoma antigen, family D, 2 melanoma antigen, family E, 1 melanoma differentiation associated protein-5 melanoma inhibitory activity melanoma inhibitory activity protein 2 melanoma-associated antigen p97, isoform 1, precursor melanoma-associated. chondroitin sulfate proteoglycan 4 melanoma leucine zipper, extra-nuclear factor preferentially expressed antigen in melanoma similar to Absent in melanoma 1 protein similar to absent in melanoma 2 Similar to melanoma antigen, family B, 4 Similar to melanoma chondroitin sulfate proteoglycan 4 suppression of tumorigenicity 16 SELECTED MARKERS pirin hydroxyacyl-coa dehydrogenase/3ketoacyl-coa endothelin receptor type B, isoform 1 retinoid X receptor, alpha integrin beta 1 isoform 1A precursor syndecan 4 (amphiglycan, ryudocan) tropomyosin 1 (alpha) AXL receptor tyrosine kinase isoform 1 EphA2 growth associated protein 43 phosphofructokinase, liver alpha-synuclein isoform NACP140 RAB2, member RAS oncogene family wingless-type MMTV integration site family, subtype 5A VCL isoform meta-vcl Integrin alpha-1 (Laminin/collagen receptor) (CD49a) interleukin 2 interleukin 8 interferon, gamma interferon (alpha, beta and omega) receptor 1 28kD interferon responsive protein ATP-dependant interferon response protein 1 interferon induced 6-16 protein isoform c interferon regulatory factor 5 isoform a similar to interferon inducible protein 1 Diagnosztikai DNS chip előzetes tesztelése és klinikai minták gyűjtése

28 Melanóma és humán DNS-chipek, melyek a pályázat keretein belül készültek el A pályázat keretein belül összesen három olyan DNS-chipet hoztunk létre, amelyek alkalmasak melanómák génexpressziós monitorozására: 1. Egy olyan általános humán chip, mely oligonukleotid mintát tartalmaz. 2. Az előző pályázatból nyert adatok alapján a 3200 génspecifikus mintát tartalmazó cdns-alapú chip eredményeit figyelembevéve egy válogatott cdns-alapú melanóma chipet, melyet főként metasztázis vizsgálatokban kívánunk felhasználni. 3. Új oligonukleotid alapú DNS-chip, melyen irodalomban már leírt melanómaspecifikus és interferonnal kapcsolatos gének mintái találhatóak (részletes mintákat lásd előző munkaszakasz beszámolója). Ez a témachip jelenleg 73 különböző génaktivitás monitorozására képes (kontroll génekkel együtt), de a technológia, melyet a laboratóriumunkban fejlesztettünk ki alkalmas tetszőleges számú, előre megszintetizált oligonukleotid felkötésére. Sikerült több olyan klinikai mintát beszereznünk, melyekből RNS-t tisztítottunk. Ezek a minták alkalmasak lesznek az általunk kidolgozott melanóma-specifikus mintákat tartalmazó DNS-chipek jellemzésére. Áttétképződéssel kapcsolatos gének azonosítása egérmodell és humán DNS-chip segítségével Olyan kísérleti rendszer felállítását valósítottunk meg, amely melanoma áttétképződés molekuláris hátterének felderítését teszi lehetővé. Az Országos Onkológiai Intézetben kidolgozott modell során újszülött és felnőtt SCID egerekbe injektált humán melanóma sejtvonalak megtapadnak és primer daganatot hoznak létre. A felnőtt állatban nem, azonban az újszülött állatban áttétképződés figyelhető meg. Így ugyanannak a melanóma vonalnak (azonos genetikai háttér) a környezeti szövetek (és immunrendszer) hatására eltérő génexpressziós változások a különböző korú állatokban eltérő fenotípust eredményeznek. Az állatban található daganatokat az in vitro sejttenyészetekkel is összehasonlítjuk, hogy meghatározzuk azokat a géneket, amelyek in vitro és in vivo eltérő kifejeződést mutatnak. Ez a modell a pályázatban elkészített es humán oligochippel alkalmas az áttétképződéssel kapcsolatos génexpresszióváltozások nyomonkövetésére. Három különböző sejtvonal globális génkifejeződési térképét határoztuk meg négy különböző állapotban: 1) sejtkultúra, 2) felnőtt primer daganat, 3) újszülött primer daganat és 4) újszülött áttét. A következő három különböző génexpressziós arányt határoztuk meg: A) felnőtt primer daganat vs. sejtkultúra, B) újszülött primer daganat vs. felnőtt primer daganat, C) újszülött primer daganat vs. újszülött áttét.

29 Az összesített eredmények a 2-4. táblázat mutatja. Látható, hogy több olyan új génmarkert sikerült azonosítanunk, mely a sejtadhézióval kapcsolatos, és amelyek eddig még nem hoztak összefüggésbe melanóma áttétekkel. Az eredmények visszaigazolása és további bioinformatikai elemzését folyamatosan végezzük. Interferonérzékenységgel kapcsolatos gének azonosítása humán DNS-chip segítségével Laboratóriumi körülmények között egy melanóma sejtvonalból az Országos Onkológia Intézet létrehozott két szelektált vonalat. Az egyik érzékeny, a másik rezisztens interferon kezelésre. Mindkét vonalat és egység interferonnal kezelve RNS-t preparáltunk és a jelen pályázatban létrehozott es humán oligonukleotid DNS-chip segítségével meghatároztuk a génexpresszió változásokat. Mindegyik mintát háromszor ismételünk meg és három összehasonlítást hajtunk végre: I) érzékeny sejt vs. rezisztens sejt kezelés nélkül, II) érzékeny sejt vs. rezisztens sejt 1000 egység interferonnal kezelve, III) érzékeny sejt vs. rezisztens sejt 1000 egység interferonnal kezelve. A kísérletekből kapott eredmények értékelése folyamatban van. Tervezzük ugyanezen minták génexpressziós vizsgálatát az általunk kifejlesztett témachipeken is elvégezni. 2. TÁBLÁZAT

30 Felnőtt primer/sejtkultúra REPRESSED Atlag-F/K Szoras-F/K GenBank_accession Description Gene_ontology -3,04 0,84 AB Homo sapiens mrna for KIAA1484 protein, partial cds. cell adhesion [ ] -2,67 0,90 NM_ Homo sapiens CGI-149 protein (LOC51652), mrna. protein modification [ ] -2,53 0,42 S83198 BPLP=basic proline-rich protein [human, lacrimal gland, mrna, 947 nt]. biological_process unknown [ ] -2,19 0,07 BE F1 NIH_MGC_20 Homo sapiens cdna clone IMAGE: neurogenesis 5', mrna[ ] sequence. -2,15 0,38 AK Homo sapiens cdna FLJ10698 fis, clone NT2RP , weakly similar virulence to POLIOVIRUS [ ] RECEPTOR PRECURSOR. -2,12 0,79 AL Homo sapiens mrna; cdna DKFZp666D074 (from clone DKFZp666D074). electron transport [ ] -2,08 0,12 NM_ Homo sapiens ubiquitin-activating enzyme E1C (UBA3 homolog, yeast) ubiquitin (UBE1C), cycle mrna. [ ] -2,04 0,25 NM_ Homo sapiens EphB4 (EPHB4), mrna. signal transduction [ ] -2,03 0,18 X99660 H.sapiens SH3GLP2 pseudogene, 5' end. signal transduction [ ] -2,01 0,69 NM_ Homo sapiens nuclear transcription factor Y, gamma (NFYC), mrna.regulation of cell cycle [ ] -1,96 0,59 NM_ Homo sapiens basic leucine zipper and W2 domains 1 (BZW1), mrna. amino acid metabolism [ ] -1,93 0,44 D28384 Human mrna for histone H3.3, 5'UTR (sequence from the 5'cap to the biological_process start codon). unknown [ ] -1,92 0,12 NM_ Homo sapiens triggering receptor expressed on myeloid cells 1 (TREM1), humoral mrna. immune response [ ] -1,90 0,52 NM_ Homo sapiens chromosome 14 open reading frame 3 (C14orf3), mrna. protein folding [ ] -1,89 0,72 Z15114 H.sapiens mrna for protein kinase C gamma (partial). protein amino acid phosphorylation [ ] -1,88 0,47 AK Homo sapiens cdna: FLJ23449 fis, clone HSI apoptosis [ ] -1,85 0,26 M12078 Human cytochrome P mrna, partial cds. electron transport [ ] -1,81 0,66 BF F1 NIH_MGC_66 Homo sapiens cdna clone IMAGE: development 5', mrna[ ] sequence. -1,80 0,58 NM_ Homo sapiens palmitoyl-protein thioesterase 2 (PPT2), transcript variant locomotory 1, mrna. behavior [ ] -1,74 0,43 NM_ Homo sapiens isoprenylcysteine carboxyl methyltransferase (ICMT), mrna. protein modification [ ] -1,70 0,44 NM_ Homo sapiens transient receptor potential cation channel, subfamily V, sensory member perception 2 (TRPV2), [ ] mrna. -1,69 0,12 AF Homo sapiens putative DNA polymerase mrna, partial cds. DNA replication [ ] -1,66 0,17 NM_ Homo sapiens dual specificity phosphatase 12 (DUSP12), mrna. protein amino acid dephosphorylation [ ] -1,60 0,14 NM_ Homo sapiens ephrin-b2 (EFNB2), mrna. development [ ] -1,60 0,45 X01394 Human mrna for tumor necrosis factor. inflammatory response [ ] -1,56 0,59 AL Homo sapiens mrna; cdna DKFZp434L1713 (from clone DKFZp434L1713); sensory organ partialdevelopment cds. [ ] -1,54 0,22 D17289 Human HepG2 3' region MboI cdna, clone hmd6h07m3. protein biosynthesis [ ] -1,52 0,14 AK Homo sapiens cdna: FLJ22584 fis, clone HSI peroxidase reaction [ ] -1,51 0,02 NM_ Homo sapiens serine (or cysteine) proteinase inhibitor, clade A (alpha-1 acute-phase antiproteinase, response antitrypsin), [ ] member 6 (SERPINA6), mrna. OVEREXRESSED 1,51 1,53 1,55 1,55 1,58 1,61 1,61 1,64 1,65 1,71 1,73 1,74 1,76 1,77 1,78 1,79 1,81 1,82 1,83 1,87 1,97 1,97 1,98 2,02 2,02 2,03 2,03 2,27 2,28 2,29 2,3 2,33 2,41 2,43 2,45 2,48 2,54 2,73 2,75 0,43 0,5 0 0,38 0,21 0,06 0,37 0,48 0,03 0,58 0,47 0,04 0,47 0,47 0,72 0,67 0,71 0,27 0,03 0,15 0,48 0,58 0,76 0,81 0,73 0,33 0,41 0,46 0,47 0,17 0,18 0,12 0,56 0,11 0,52 0,16 0,08 0,02 0,6 AF Homo sapiens full length insert cdna clone YS05E02. biological_process unknown [ ] NM_ Homo sapiens ribosomal protein S4, X-linked (RPS4X), mrna. protein biosynthesis [ ] NM_ Homo sapiens CGI-49 protein (LOC51097), mrna. lysine metabolism [ ] AF Homo sapiens clone mrna sequence. DNA repair [ ] AK Homo sapiens cdna FLJ11565 fis, clone HEMBA cell cycle [ ] NM_ Homo sapiens KIAA0682 gene product (KIAA0682), mrna. RNA processing [ ] NM_ Homo sapiens chemokine (C-C motif) ligand 1 (CCL1), mrna. inflammatory response [ ] BF F1 NIH_MGC_58 Homo sapiens cdna clone IMAGE: regulation 5', mrna of translational sequence. initiation [ ] NM_ Homo sapiens interleukin 12 receptor, beta 1 (IL12RB1), mrna. antimicrobial humoral response (sensu Invertebrata) [ ] NM_ Homo sapiens hypothetical protein FLJ10847 (FLJ10847), mrna. cell cycle [ ] NM_ Homo sapiens SMT3 suppressor of mif two 3 homolog 1 (yeast) (SMT3H1), proteinmrna. sumoylation [ ] AB Homo sapiens mrna for RNA-binding protein PIPPin, complete cds. intracellular signaling cascade [ ] NM_ Homo sapiens myosin regulatory light chain 2, smooth muscle isoformactivation (MYRL2),ofmRNA. JUN kinase [ ] AB Homo sapiens mrna for KIAA1053 protein, partial cds. signal transduction [ ] M62403 Human insulin-like growth factor binding protein 4 (IGFBP4) mrna, complete signal transduction cds. [ ] AF Homo sapiens full length insert cdna clone ZD70H02. biological_process unknown [ ] X03689 Human mrna fragment for elongation factor TU (N-terminus). translational elongation [ ] X62468 H.sapiens mrna for IFN-gamma (pkc-0). immune response [ ] AF Homo sapiens ELK variant mrna, complete cds. regulation of transcription, DNA-dependent [ ] NM_ Homo sapiens glutamate receptor, ionotropic, kainate 4 (GRIK4), mrna. glutamate signaling pathway [ ] AK Homo sapiens cdna FLJ11509 fis, clone HEMBA protein biosynthesis [ ] AK Homo sapiens cdna FLJ13152 fis, clone NT2RP , highly similar nucleotide-excision to Mus musculusrepair SKD3[ ] mrna. NM_ Homo sapiens HIV TAT specific factor 1 (HTATSF1), mrna. regulation of transcription from Pol II promoter [ ] NM_ Homo sapiens actin, gamma 1 (ACTG1), mrna. cytoskeleton organization and biogenesis [ ] NM_ Homo sapiens hypothetical protein dj122o8.2 (DJ122O8.2), mrna. cell cycle [ ] NM_ Homo sapiens aryl-hydrocarbon receptor nuclear translocator 2 (ARNT2), regulation mrna. of transcription, DNA-dependent [ ] AK Homo sapiens cdna: FLJ21234 fis, clone COL cell growth and/or maintenance [ ] NM_ Homo sapiens KIAA0445 gene product (KIAA0445), mrna. development [ ] NM_ Homo sapiens ribosomal protein L4 (RPL4), mrna. protein biosynthesis [ ] AK Homo sapiens cdna FLJ10434 fis, clone NT2RP cytoskeleton organization and biogenesis [ ] M33197 Human glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) mrna, glycolysis complete[ ] cds NM_ Homo sapiens guanylate cyclase 2D, membrane (retina-specific) (GUCY2D), protein amino mrna. acid phosphorylation [ ] AF Homo sapiens putative superoxide-generating NADPH oxidase Mox2 electron mrna, complete transport cds. [ ] AK Homo sapiens cdna: FLJ22656 fis, clone HSI biological_process unknown [ ] AB Human mrna for KIAA0368 gene, partial cds. regulation of protein biosynthesis [ ] AF Homo sapiens clone HEA5 Cri-du-chat critical region mrna. biological_process unknown [ ] AK Homo sapiens cdna FLJ13089 fis, clone NT2RP , weakly similar cytoskeleton to DEC1 organization PROTEIN. and biogenesis [ ] AL Homo sapiens mrna; cdna DKFZp434H052 (from clone DKFZp434H052); snrnp complete recycling cds. [ ] NM_ Homo sapiens tubulin, gamma 2 (TUBG2), mrna. microtubule cytoskeleton organization and biogenesis [ ] 3. TÁBLÁZAT