(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

Átírás

1 !HU T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E (22) A bejelentés napja: (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP A (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP B (1) Int. Cl.: C07K 14/47 (06.01) A61K 38/00 (06.01) C12N /00 (06.01) C12P 21/00 (06.01) A61K 39/00 (06.01) (72) Feltalálók: Singh, Harpreet, 772 Tübingen (DE); Emmerich, Niels, 770 Tübingen (DE); Walter, Steffen, Dusslingen (DE); WEINSCHENK, Toni, Aichwald (DE) (73) Jogosult: Immatics Biotechnologies GmbH, 776 Tübingen (DE) (74) Képviselõ: Lengyel Zsolt, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest (4) I. és II. osztályú humán leukocita antigén (HLA) molekulákhoz kötõdõ, tumorasszociált peptidek és a kapcsolódó rákellenes vakcina HU T2 A leírás terjedelme 46 oldal (ezen belül 9 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 199. évi XXXIII. törvény 84/H. -a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.

2 A jelen találmány tárgyát immunterápiás módszerek, valamint immunterápiás módszerek során használható molekulák és sejtek képezik. A jelen találmány tárgya nevezetesen a rák konkrétan a veserák immunterápiája. A jelen találmány tárgyát képezi továbbá egy olyan, tumorasszociált T¹helper sejt peptidepitóp, amely önmagában vagy más tumorasszociált peptidekkel együtt tumorellenes immunválaszt stimuláló vakcinakészítmények aktív hatóanyagaként szolgál. A jelen találmány tárgya nevezetesen egy olyan új peptidszekvencia, amely humán tumorsejtvonalak HLA II molekuláiból származik, és amely felhasználható tumorellenes immunválasz kiváltását célzó vakcinakészítményekben A találmány háttere Az immunválasz serkentésének a feltétele olyan antigének jelenléte, amelyeket a gazdaszervezet immunrendszere idegen anyagként ismer fel. A tumorasszociált antigének létezésének felfedezésével megnyílt a lehetõség a gazdaszervezet immunrendszerének felhasználására a tumornövekedés megakadályozásában. A napjainkban folyó kutatások az immunrendszer humorális és celluláris folyamatainak különbözõ felhasználási lehetõségeit próbálják feltárni a tumorellenes immunterápia területén. A sejtes immunválasz egyes elemei képesek specifikusan felismerni és elpusztítani a tumorsejteket. A citotoxikus T¹sejtek (CTL) izolálása a tumorinfiltráló sejtpopulációkból vagy a perifériás vérbõl arra utal, hogy az ilyen sejtek fontos szerepet játszanak a rák elleni természetes immunvédelemben (Cheever et al., Annals N.Y. Acad. Sci :1 112). A CD8- pozitív T¹sejtek (TCD8-pozitív) különösen azok, amelyek felismerik az általában 8 aminosavmaradékból álló, a citoszolban található fehérjékbõl származó peptideket hordozó fõ hisztokompatibilitási komplex I (MHC) molekuláit jelentõs szerepet játszanak ebben a típusú immunválaszban. Az emberi MHC molekulákat humán leukocita antigéneknek (HLA) is nevezik. Az MHC molekulák két osztályba sorolhatók: az MHC I molekulák megtalálhatók a legtöbb olyan sejten, amelyek sejtmagja endogén fehérjék és nagyobb peptidek proteolitikus hasításából keletkezett peptideket prezentál. Az MHC II molekulák csak a professzionális antigénprezentáló sejteken (APC) találhatók meg, és az APC¹k által endocitózissal felvett, majd feldolgozott exogén fehérjék peptidjeit prezentálják. A peptidekbõl és az MHC I¹bõl álló komplexeket a CD8-pozitív citotoxikus T¹limfociták, míg a peptidekbõl és az MHC II¹bõl álló komplexeket a CD4-pozitív T¹helper sejtek ismerik fel. A CD4-pozitív T¹helper sejtek fontos szerepet játszanak a tumorellenes T¹sejtválasz effektorfunkcióinak koordinációjában, ezért a tumorasszociált antigénekbõl (TAA) származó, CD4-pozitív T¹sejt epitópok azonosítása különösen jelentõs lehet a tumorellenes immunválasz kiváltását célzó gyógyszerkészítmények kifejlesztése során [Kobayashi, H., R. Omiya, M. Ruiz, E. Huarte, P. Sarobe, J. J. Lasarte, M. Herraiz, B. Sangro, J. Prieto, F. Borras-Cuesta, and E. Celis. 02. Identification of an antigenic epitope for helper T lymphocytes from carcinoembryonic antigen. Clin. Cancer Res. 8: , Gnjatic, S., D. Atanackovic, E. Jäger, M. Matsuo, A. Selvakumar, N. K. Altorki, R. G. Maki, B. Dupont, G. Ritter, Y. T. Chen, A. Knuth, and L. J. Old. 03. Survey of naturally occurring CD4+ T¹cell responses against NY¹ESO¹1 in cancer patients: Correlation with antibody responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 0():8862 7]. Emlõsállatmodellekben (pl. egérben) kimutatták, hogy a CD4-pozitív T¹sejtek még citotoxikus T¹limfocita (CTL) effektorsejtek (azaz CD8-pozitív T¹limfociták) hiányában is elegendõk a tumorok kifejlõdésének megakadályozásához, azáltal, hogy gamma-interferon (IFN ) szekretálásával gátolják az angiogenezist (Qin, Z. és T. Blankenstein. 00. CD4+ T¹cell-mediated tumor rejection involves inhibition of angiogenesis that is dependent on IFN gamma receptor expression by nonhematopoietic cells. Immunity. 12: ). Ezenfelül kimutatták, hogy a HLA II molekulák által prezentált, tumorasszociált antigénekbõl származó peptideket felismerõ CD4-pozitív T¹sejtek gátolhatják a tumor progresszióját az antitestválasz indukcióján keresztül (Kennedy, R. C., M. H. Shearer, A. M. Watts, és R. K. Bright. 03. CD4 + T lymphocytes play a critical role in antibody production and tumour immunity against simian virus large tumour antigen. Cancer Res. 63: 4). A HLA I molekulákhoz kötõdõ tumorasszociált peptidekkel szemben eddig csak kevés olyan TAA-ligandot írtak le, amelyek a HLA II molekulákhoz kötõdnek ( Mivel a HLA II molekulák konstitutív expressziója rendszerint az immunrendszer sejtjeire korlátozódik (Mach, B., V. Steimle, E. Martinez-Soria, és W. Reith Regulation of MHC class II genes: lessons from a disease. Annu. Rev. Immunol. 14:1 331), nem tartották lehetségesnek a HLA II. osztályba tartozó peptidek izolálását közvetlenül primer tumorokból. Ennélfogva számos stratégiát leírtak azzal kapcsolatban, hogy hogyan lehet az antigéneket az antigénprezentáló sejtekre (APC) jellemzõ II. osztályú antigénfeldolgozási útra terelni, például az APC¹k inkubálásával, hogy ezáltal lehetõvé tegyék az adott antigén felvételét, feldolgozását és prezentálását (Chaux, P., V. Vantomme, V. Stroobant, K. Thielemans, J. Corthals, R. Luiten, A. M. Eggermont, T. Boon, és B. P. van der Bruggen Identification of MAGE¹3 epitopes presented by HLA¹DR molecules to CD4(+) T lymphocytes. J. Exp. Med. 189: ), illetve a sejtek transzfekciójával az érintett antigént kódoló, az invariáns láncba integrált génekkel vagy minigénekkel, amely közvetíti az antigének transzlokációját a lizoszomális MHC II feldolgozó és kapcsoló kompartmentbe (MIIC). Ahhoz, hogy egy peptid sejtes immunválaszt válthasson ki, kötõdnie kell egy MHC molekulához. Ez a folyamat az MHC molekula alléljától és a peptid aminosavszekvenciájának specifikus polimorfizmusától függ. Az MHC I molekulához kötõdõ peptidek rendszerint 2

3 aminosavmaradékból állnak, és primer aminosavszekvenciájuk két konzervált aminosavat ( horgonyt ) tartalmaz, amelyek kölcsönhatásba lépnek az MHC molekula megfelelõ kötõhelyeivel. Gyulladás hiányában az MHC II molekulák expressziója elsõsorban az immunrendszer sejtjeire korlátozódik, különösen a professzionális antigénprezentáló sejtekre (APC), például a monocitákra, a monocitaeredetû sejtekre, a makrofágokra és a dendritikus sejtekre. A tumorspecifikus T¹limfociták által felismert antigének pontosabban azok epitópjai lehetnek bármelyik fehérjeosztályból származó molekulák, például enzimek, receptorok, transzkripciós faktorok stb. Ezenfelül elõfordulhat az is, hogy például a tumorasszociált antigének kizárólag a tumorsejtekben vannak jelen: létrejöhetnek többek között mutálódott gének termékeiként. A tumorasszociált antigének másik jelentõs osztályát a szövetspecifikus struktúrák képezik: ilyenek például a CT ( cancer testis )-antigének, amelyek különféle típusú tumorokban, valamint az egészséges hereszövetben expresszálódnak. Többféle tumorasszociált antigént azonosítottak, és a kutatók nagy erõfeszítéssel dolgoznak további tumorasszociált antigének azonosításán. A tumorasszociált (más szóval tumorspecifikus) antigének néhány csoportja szövetspecifikus. Néhány példa erre: a tirozináz melanomában, a PSA és a PSMA a prosztatarákban, illetve a kromoszomális átkeresztezõdések (transzlokációk), mint például a bcr/abl átkeresztezõdés a limfómában. Ugyanakkor sok azonosított tumorasszociált antigén többféle tumortípusban is elõfordul, néhány pedig például az onkogén fehérjék és/vagy a tumorszuppresszor gének (a tumorszuppresszor génekrõl a veserákban lásd például: Linehan WM, Walther MM, Zbar B. The genetic basis of cancer of the kidney. J Urol. 03 Dec; 170[6 Pt 1): ], amelyek a transzformáció tényleges kiváltói szinte minden tumortípusban jelen van. Például a sejtnövekedést és sejtdifferenciálódást szabályozó normál sejtfehérjék mint a p3 (amely példa a tumorszuppresszor génre), a ras, a c¹met, a myc, a prb, a VHL és a HER-2/neu képesek növelni a mutációk számát, amelynek eredménye e géntermékek expressziójának upregulációja, aminek következtében ezek a fehérjék onkogénné válnak (McCartey et al. Cancer Research 1998 :8 21 ; Disis et al. Ciba Found. Symp : ). A mucin 1 (MUC¹1) egy jelentõs mértékben glikozilált, I. típusú transzmembrán glikoprotein, amelynek nagymértékû, túlzott expressziója számos humán adenokarcinóma pl. emlõ- és petefészekrákok sejtfejszínén megfigyelhetõ. A rosszindulatú daganatokban gyakori az abnormális deglikoziláció, ami szabaddá tesz a tumorsejtekben olyan epitópokat, amelyek esetleg nincsenek jelen a normálsejteken. Ezen túlmenõen a MUC1 expresszióját kimutatták myeloma multiplexben és egyes B¹sejtes non-hodgkin-limfómákban [Gendler S, Taylor-Papadimitriou J, Duhig T, Rothbard J, és Burchell J. A highly immunogenic region of a human polymorphic epithelial mucin expressed by carcinomas is made up of tandem repeats. J. Biol. Chem. 263: (1988); Siddiqui, 1988.; Girling A, Bartkova J, Burchell J, Gendler S, Gillett C, és Taylor- Papadimitriou J. A core protein epitope of the polymorphic epithelial mucin detected by the monoclonal antibody SM¹3 is selectively exposed in a range of primary carcinomas. Int. J. Cancer 43:72 76 (1989); Brossait, 1999.; Duperray, 1989.; Mark, 1989.; Delsol, 1988.; Apostolopoulos V és McKenzie IF. Cellular mucins: targets for immunotherapy. Crit Rev. Immunol. 14:293 9 (1994); Finn OJ, Jerome KR, Henderson RA, Pecher G, Domenech N, Magarian-Blander J, és Barratt-Boyes SM. MUC¹1 epithelial tumor mucin-based immunity and cancer vaccines. Immunol. Rev. 14:61 89 (199)]. Számos újabb közlemény [Apostolopoulos V és McKenzie IF. Cellular mucins: targets for immunotherapy. Crit Rev. Immunol. 14:293 9 (1994); Finn OJ, Jerome KR, Henderson RA, Pecher G, Domenech N, Magarian-Blander J, és Barratt-Boyes SM. MUC¹1 epithelial tumor mucin-based immunity and cancer vaccines. Immunol. Rev. 14:61 89 (199); Barnd, 1989.; Takahashi, 1994.; Noto, 1997.] igazolta, hogy a petefészek¹, emlõ- és hasnyálmirigytumorokból, valamint myeloma multiplexbõl nyert citotoxikus, nem MHC-korlátozott T¹sejtek képesek felismerni a tandem ismétlõdésben lokalizált MUC1 fehérjemagot. Két, a MUC1 fehérjébõl származó, HLA A2-korlátozott T¹sejt epitópot azonosítottak (Brossart 1999, EP ). Az egyik peptid a MUC1 fehérje tandem ismétlõdési régiójából származik. A második peptid a MUC1 szignálszekvenciáján belül található. Elõrehaladott emlõ- vagy petefészekrákban szenvedõ betegekben a peptiddel kezelt dendritikus sejtekkel történõ vakcináció után sikeres volt az adott peptidek használatával a citotoxikus T¹limfocitaválaszok in vivo indukciója (Brossart 00) (Wierecky 0). A vesesejtes karcinómák tekintetében a MUC1 expressziója gyakori a szokásos tumorokban, és a közlemények szerint összefügg a tumor grádusával és stádiumával (Fujita 1999; Kraus 02; Leroy 02; Bamias 03; Cao 00). A MUC1 esetében a fehérje túlzott mértékû expressziója nem korrelál a túlzott mrns-expresszióval. Az adipofilin a lipidcseppecskéket tartalmazó, speciálisan differenciált sejtek és a zsírfelhalmozó sejtekkel kapcsolatos betegségek markere (). Az adipofilin sokféle tenyésztett sejtvonalban elõfordul, beleértve a fibroblasztokat, az endotél- és az epitélsejteket. A szövetekben azonban az adipofilin expressziója bizonyos sejttípusokra korlátozódik, például a laktáló emlõ epitélsejtjeire, a mellékvesekéreg-sejtekre, a férfi reprodukciós rendszer Sertoli- és Leydig-sejtjeire és szteatózisban vagy alkoholos májcirrózisban a zsírosan elfajult hepatocitákra (Heid 1998). Beszámoltak az adipofilin túlzott expressziójáról kolorektális rákban (Saha 01), hepatocelluláris karcinómában (Kurokawa 04) és vesesejtes karcinómában (Young 01). A c¹met egy tirozin-kináz-aktivitással rendelkezõ heterodimer transzmembrán receptort kódol, amely egy, diszulfiddalhíddal egy ¹alegységhez kapcsolódó 3

4 ¹láncból áll (Bottaro 1991; Rubin 1993). Mindkét alegység a felszínen expresszálódik; a nehéz ¹alegység felelõs a hepatocita növekedési faktor (HGF) ligand megkötéséért, az ¹alegység pedig egy intracelluláris domént tartalmaz, amely közvetíti a különbözõ szignáltranszdukciós utak aktiválását. A c¹met által közvetített jelátvitel részt vesz a szervregenerációban amint azt kimutatták a máj és a vese esetén, az embriogenezisben, a vérképzésben, az izomfejlõdésben, valamint a normálisan aktivált B¹sejtek és monociták migrációjának és adhéziójának a szabályozásában. Számos vizsgálat kimutatta továbbá a c¹met túlzott expressziójának a szerepét a malignus sejtek malignus transzformációjában és invazivitásában. A c¹met közvetíti a HGF/szóródási faktor sokfunkciós és potenciálisan onkogén aktivitását, beleértve a sejtnövekedés, a motilitás és a túlélés, az extracelluláris mátrixterjedés és az angiogenezis elõsegítését (). A HGF kötõdése a receptorhoz a c¹met autofoszforilációját indukálja, valamint aktiválja a jelátviteli eseményeket, beleértve a ras-hoz, a foszfatidilinozitol-3 -kinázhoz, a foszfolipáz-c -hoz és a mitogénaktivált protein-kinázhoz kapcsolódó utakat. A c¹met gén túlnyomórészt az epitélsejtekben expresszálódik, és számos malignus szövetben és sejtvonalban túlzott mértékben expresszálódik. Egyre nagyobb számú közlemény mutatta ki, hogy a nem epiteliális eredetû sejtek, például a vérképzõrendszeri, az idegrendszeri és a csontrendszeri sejtek, reagálnak a HGF¹re; valamint számos rosszindulatú hematológiai betegségben, például myeloma multiplexben, Hodgkin-kórban, leukémiákban és limfómákban c¹met fehérje expresszálódik. Az invazív növekedési fenotípus deregulált szabályozása a c¹metet aktiváló mutációk által provokált, onkogénné aktivált c¹met, a c¹met-amplifikáció/túlzott expresszió és a HGF/c¹Met autokrin hurkok megszerzése által kölcsönzi az invazív és áttétképzõ tulajdonságokat a malignus sejteknek. Kiemelendõ, hogy a c¹met konstitutív aktiválódása a HGF¹et túlzott mértékben expresszáló transzgén egerekben széles körben elõsegíti a tumorképzõdést (Wang 01; Takayama 1997). A G¹fehérje által közvetített jelátviteli folyamatok. szabályozója (RGS) a heterotrimer G¹fehérje jelátviteli utaknak egy negatív szabályozója, bár in vivo mûködését egyelõre nem derítették fel. Az RGS-fehérjék olyan molekulacsaládot képeznek, amelyek egyforma katalitikus funkcióval, ugyanakkor eltérõ szöveti eloszlással rendelkeznek. Stimulálják az aktivált G -alegységek intrinszik guanozin-trifoszfatáz (GTP¹áz)-aktivitását, így meggyorsítják a G¹fehérje inaktivációját. Ilyen módon az RGS-molekulák gátolják a G¹fehérjéhez kapcsolt receptorok jeltovábbítását (De 00). Újabban kimutatták, hogy a G¹fehérje által közvetített jelátviteli folyamatok. szabályozójának indukciója a pericitákban egybeesik a tumor érújdonképzõdése során az aktív érremodellinggel. A hasnyálmirigy-szigetsejtek karcinogenezisének egy egérmodelljében, valamint a jelentõs mértékben érképzõ asztrocitómákban kimutatták az RGS túlzott expresszióját a pericitákban az aktív érremodellinget kísérõ angiogén átkapcsolás során. A túlzott mértékû expresszió a tumor érhálózatára korlátozódott, összehasonlítva egy normál Langerhans-szigettel. Az RGS azonban a sebgyógyulás és az ovuláció során is upregulált (Berger 0). Az RGS expressziója fokozott vesesejtes karcinómában (RCC) (Rae 00). Egy másik vizsgálatban az RT¹PCR az RGS jelentõs expresszióját mutatta ki az összes vizsgált RCC-ben, ugyanakkor az expresszió nagyon csekély vagy nem kimutatható volt a normál vesékben (6,6:1 valós idejû PCR-rel). RCC-ben az RGS fõleg a tumor endotélsejtjeiben volt megtalálható (Furuya 04). Beszámoltak továbbá arról, hogy az RGS hepatocelluláris karcinómában a szinuszoidális endotélsejtek markereként funkcionál (Chen 04). Az apolipoprotein L1 (APOL1) egy nagy sûrûségû, szekretált lipoprotein, amely az apolipoprotein A¹1-hez kötõdik. Az apolipoprotein A¹1 a plazmában aránylag nagy mennyiségben jelen lévõ fehérje, és a HDL fõ apoproteinje. A plazmában részt vesz a legtöbb koleszterinészter képzésében, és elõmozdítja a koleszterin kiáramlását a sejtekbõl. Az apolipoprotein L1 szerepet játszhat a szervezetben zajló lipidcserében és ¹transzportban, valamint a perifériás sejtekbõl vissza a májba történõ koleszterintranszportban. A plazmafehérje egy egyláncú polipeptid, amelynek látszólagos molekulatömege körülbelül kda (Duchateau 1997; Duchateau 01). Az APOL1 cdns¹t egy aktivált endotélsejt cdns-könyvtárból izolálták, és kimutatták, hogy upregulálja a TNF- ¹t, amely egy hatásos proinflammatorikus citokin (Monajemi 02). A Kazusa cdns projektben azonosították a KIAA0367¹et. A projekt célja vélelmezett fehérjéket kódoló, ismeretlen humán transzkriptumok azonosítása (Ohara 1997). Bár a KIAA0367 vélelmezett, 8 aminosavból álló fehérjetermékének funkciója ismeretlen, a C¹terminálisán tartalmaz egy CRAL-TRIO lipidkötõ doménprofilt, amely kis, hidrofób molekulákat köt meg, és amely megtalálható számos nukleotidcserélõ faktorban és a BCL2/adenovírus E1B 19 kda tömegû, fehérjeinterakciós 2. fehérjéjében (BNIP¹2). A BNIP¹2 szerepet játszik különbözõ sejtfunkciók szabályozásában, beleértve a sejtmorfológiát és ¹migrációt, az endocitózist és a sejtciklus elõrehaladását (Zhou 0). A KIAA0367 a 9q21 kromoszómarégióban található. Ezt a régiót számos tumorban a homozigótadeléció (), illetve a heterozigótaság elvesztésének (Louhelainen 00; Tripathi 03) gyakori célpontjaként írták le. Az oldékony guanilát-cikláz (sgc) egy heterodimer fehérje, amely egy alfa- és egy béta-alegységbõl (1 hemcsoport) áll katalizálja a GTP átalakítását cgmp¹vé, vagyis másodlagos hírvivõvé, és a nitrogénmonoxid, valamint a nitrovazodilatátor gyógyszerek fõ receptoraként mûködik (Zabel 1998). A GUCYa3 és b3 a humán gliómákban túlzott mértékben expresszálódik. Az ellenirányú GUCY1A3 vagy GUCY1B3 transzfekciója csupasz egerekben csökkentette az érképzõdést és a tumornövekedést. Ennek az lehet az oka, hogy a cgmp indukálja a VEGF¹et (Saino 04). A GU- CY1A3 elõsegíti egy egér emlõtumor-sejtvonal tumorsejt-migrációját (Jadeski 03). 4

5 2 4 0 A ciklin D1 az erõsen konzervált ciklincsaládhoz, szorosabban véve a ciklin D alcsaládhoz tartozik (Xiong 1991; Lew 1991). A ciklinek a CDK¹k (ciklindependens kinázok) szabályozóiként mûködnek. A különbözõ ciklineknek eltérõ az expressziós és degradációs mintázatuk, amelyek hozzájárulnak az egyes mitotikus események idõbeli összehangolásához (Deshpande 0). A ciklin D1 komplexet képez a CDK4-gyel vagy a CDK6-tal, és ezek szabályozó alegységeként mûködik, amelyek aktivitása szükséges a sejtciklusban a G1/S átmenethez. A CCND1 a CDK4-gyel és a CDK6- tal egy szerin¹/treonin-kináz holoenzim komplexet képez, amely átadja szubsztrátspecificitását a komplexnek (Bates 1994). Kimutatták, hogy a fehérje kölcsönhatásba lép az Rb tumorszuppresszor fehérjével (Loden 02), és ennek a génnek az expresszióját pozitívan szabályozza az Rb (Halaban 1999). A gén mutációit, amplifikációját és túlzott expresszióját amely megváltoztatja a sejtciklus elõrehaladását gyakran megfigyelték számos tumorban, és ez hozzájárulhat a tumorképzõdéshez (Hedberg 1999; Vasef 1999; Troussard 00). A mátrix metalloproteináz (MMP) család fehérjéi részt vesznek az extracelluláris mátrix lebontásában a normál élettani folyamatok, például az embrionális fejlõdés, a reprodukció és a szöveti remodelling; valamint kóros folyamatok, például az artritisz és az áttétképzõdés során (Mott 04). A mátrix metalloproteináz 7 (MMP7) 29,6 kda molekulatömegû inaktív elõfehérjeként szekretálódik, amely akkor aktiválódik, amikor az extracelluláris proteinázok elhasítják. Az aktív enzim 19,1 kda molekulatömegû, alegységenként két cinkiont és két kalciumiont köt (Miyazaki 1990; Browner 199). Az MMP7 zselatinokat, fibronektint és kazeint bont (Miyazaki 1990; Quantin 1989), és abban különbözik az MMP család legtöbb tagjától, hogy hiányzik egy konzervált C¹terminális fehérjedoménje (Gaire 1994). Az MMP7 gyakran túlzott mértékben expresszált rosszindulatú szövetekben (Lin 04; Bramhall 1997; Denys 04), és úgy tûnik, hogy in vivo elõsegíti a tumorsejtek invázióját (Wang 0). Ezek a fehérjék többféle ráktípusban egy tumorspecifikus immunválasz célfehérjéi lehetnek. A hepatitis B vírus mag antigén HBV-001¹es peptidje nem egy endogén, humán tumorasszociált antigénbõl származik, hanem a hepatitis B vírus mag antigénbõl. Elsõsorban lehetõvé teszi a TUMAP¹ok által indukált T¹sejtválaszok mértékének kvantitatív összehasonlítását, és így lehetõvé teszi a tumorellenes válaszok kiváltási képességére vonatkozó fontos következtetések levonását. Másodsorban fontos pozitív kontrollként mûködik, ha a betegben nincs semmilyen T¹sejtválasz. Harmadrészt pedig lehetõvé teszi, hogy következtetéseket vonjanak le a beteg immunkompetenciájának állapotáról. A hepatitis B (HBV) vírusfertõzés a májbetegségek vezetõ okai között szerepel, és világszerte körülbelül 0 millió embert érint (Rehermann 0). Könnyû horizontális és vertikális terjedése, valamint az akár májcirrózishoz és hepatocelluláris karcinómához vezetõ krónikus betegség kialakulásának lehetõsége miatt a HBV világszerte jelentõs hatást gyakorol számos ország népegészségügyi rendszerére. A HBV genom (Previsani 02) egy részlegesen kettõs szálú, cirkuláris DNS-bõl áll. A HBV virionokban ez összecsomagolódik a HBc mag fehérjével és más fehérjékkel, így nukleokapszidot képez, amelyet egy külsõ, lipideket és a HB¹k felszíni fehérjecsaládját (más néven burokfehérje) tartalmazó burok vesz körül. A HBc-hez és a HBs-hez tartozó antigéndeterminánsok jelölése HBcAg, illetve HBsAg. Ezek az antigének összefüggenek a beteg vérében lévõ szerológiai, vagyis antitestválaszokkal, és a HBV-fertõzés diagnózisának a felállításakor a klinikailag leghasznosabb antigén-antitest rendszerek közé tartoznak. Mindenkiben, akinek az anamnézisben nem szerepel HBV-fertõzés, a HBc egy új, idegen antigént jelent. Mivel ennek az antigénnek az immunogén peptidjei jól ismertek (Bertoletti 1993; Livingston 1997), a HBcAg-bõl egy tíz aminosavat tartalmazó peptidet választottunk ki, hogy az IMA-ban pozitív kontroll antigénként szerepeljen. Ezután a HBcpeptidspecifikus CTL¹ek indukcióját használhatjuk a beteg immunkompetenciája és a sikeres vakcináció markereként. A rákbetegek immunterápiájának célja az immunrendszer sejtjeinek különösen az úgynevezett citotoxikus T¹sejteknek (CTL, más néven ölõsejtek, más néven CD8-pozitív T¹sejtek) specifikus aktiválása a tumorsejtek ellen, de az egészséges szövet ellen nem. A tumorsejtek a tumorasszociált fehérjék expressziójában térnek el az egészséges sejtektõl. A sejtfelszíni HLA molekulák prezentálják a külsõ környezet felé a sejt tartalmát, így lehetõvé teszik, hogy a citotoxikus T¹sejtek megkülönböztessenek egy egészséges és egy tumoros sejtet. Ez úgy történik, hogy a sejten belül minden fehérje rövid peptidekre bomlik, amelyek ezután HLA molekulákhoz kötõdnek, és prezentálódnak a sejtfelszínen (Rammensee 1993). A tumorsejteken prezentálódó peptideket amelyek nem, vagy jóval kisebb mértékben prezentálódnak a szervezet egészséges sejtjein tumorasszociált peptideknek (TU- MAP¹ok) nevezzük. Az elsõ, tumorasszociált peptideket alkalmazó klinikai vizsgálatokat Boon és munkatársai kezdték az 1990¹es évek közepén, fõként a melanoma indikációjára. A legeredményesebb vizsgálatokban a klinikai válasz %-tól %¹ig terjedt. A peptidalapú vakcina monoterápiát alkalmazó klinikai vizsgálatok egyikében sem számoltak be súlyos mellékhatásokról vagy súlyos autoimmunitásról. Melanomaasszociált peptidekkel kezelt néhány betegnél a vitiligo enyhe formáiról számoltak be. Egyféle CTL aktiválása azonban rendszerint nem elégséges az összes tumorsejt elpusztításához. A tumorok erõsen mutagének, ezért képesek fehérjemintázatuk megváltoztatásával gyorsan reagálni a CTL¹ek támadásaira, így kikerülve, hogy a CTL¹ek felismerjék õket. A tumor védekezõmechanizmusainak hatástalanítására a vakcináláshoz többféle specifikus peptidet

6 2 használnak. Ilyen módon széles spektrumú, egyidejû támadás indítható a tumor ellen, számos CTL-klón egyidejû alkalmazásával. Ez csökkentheti a tumor esélyét arra, hogy kikerülje az immunválaszt. Ezt a hipotézist újabban egy klinikai vizsgálatban igazolták, amelynek során késõi stádiumú melanomás betegeket kezeltek. Néhány kivételtõl eltekintve azoknál a betegeknél, akiknél legalább 3 különbözõ T¹sejtválasz alakult ki, objektív klinikai választ, vagy a betegség stabilizálódását figyelték meg (Banchereau 01), valamint nõtt a túlélés is (személyes kommunikáció J. Banchereauval), míg a 3¹nál kevesebb T¹sejtválasszal rendelkezõ betegek többsége esetén a betegség progresszióját diagnosztizálták. Napjainkig számos stratégiát leírtak azzal kapcsolatban, hogy hogyan lehet az antigéneket a II. vagy I. osztályú antigénfeldolgozási utakra terelni. Lehetséges az antigénprezentáló sejtek (APC) inkubálása az érintett antigénnel, hogy azt az elõbbiek felvegyék és feldolgozzák [Chaux, P., Vantomme, V., Stroobant, V., Thielemans, K., Corthals, J., Luiten, R., Eggermont, A. M., Boon, T. & van der, B. P. (1999) J. Exp. Med. 189, Dengjel J, Schoor O, Fischer R, Reich M, Kraus M, Muller M, Kreymborg K, Altenberend F, Brandenburg J, Kalbacher H, Brock R, Driessen C, Rammensee HG, Stevanovic S. Autophagy promotes MHC class II presentation of peptides from intracellular source proteins. Proc Natl Acad Sci USA. 0 May 31; 2(22): ]. Más stratégiák lizoszomális célszekvenciákat tartalmazó fúziós fehérjéket alkalmaznak. Az APC-kben expresszált ilyen fúziós fehérjék az antigéneket a II. osztályú antigénfeldolgozó kompartmentbe irányítják [Marks, M. S., Roche, P. A., van Donselaar, E., Woodruff, L., Peters, P. J. & Bonifacino, J. S. (199) J. Cell Biol. 131, 1 369, Rodriguez, F., Harkins, S., Redwine, J. M., de Pereda, J. M. & Whitton, J. L. (01) J. Virol. 7, 421 4]. Sajátos elõfeltételeknek kell teljesülniük ahhoz, hogy ezeket a fehérjéket a citotoxikus T¹limfociták tumorspecifikus antigénként ismerjék fel, és, hogy ezeket alkalmazni lehessen terápiás céllal. Az antigént fõleg a tumorsejteknek kell expresszálniuk, nem pedig az egészséges sejteknek, vagy csak nagyon kis mennyiségben lehetnek jelen az egészséges sejtekben. Kívánatos továbbá, hogy az adott antigén ne csak jelen legyen egy adott tumortípusban, hanem hogy nagy koncentrációban legyen jelen (az antigén nagy számban forduljon elõ a sejtekben). Kulcsfontosságú az epitópok jelenléte az antigén aminosavszekvenciájában, mivel egy ilyen peptid ( immunogén peptid ), amely egy tumorasszociált antigénbõl származik, in vitro vagy in vivo T¹sejtválaszt kell hogy eredményezzen. A betegek körülbelül %¹a a megjelenéskor áttétes betegségben, a betegek további 2%¹a pedig lokálisan elõrehaladott daganatban szenved. Azon betegek %-ánál, akiknél mûtéti rezekció történt, biztosan kialakul áttét. Az áttétes betegségben szenvedõk körülbelül 7%-ánál van jelen tüdõáttét, 36%-uknál nyirokcsomó- és/vagy lágyszövet-érintettség, %-uknál csontérintettség és 18%-uknál májérintettség. Az éves túlélés a Robson-stádiumbesorolástól függõen eltérõ. Összességében az RCC a betegek közel 80%- ában továbbra is halálos betegség [Senn HJ, Drings P, Glaus A, Jungi WF, Pralle HB, Sauer R, és Schlag PM. Checkliste Onkologie, th edition. Georg Thieme Verlag, Stuttgart/New York (01), Vokes EE, és Golomb HM. Oncologic Therapies, 2. kiadás. Springer-Verlag, Berlin/Heidelberg (03)]. A vesesejtes karcinóma osztályozását a TNMklasszifikáció alapján (Guinan P. TNM Staging of Renal Cell carcinoma. Presented at Diagnosis and prognosis of Renal Cell Carcinoma: 1997 Workshop, Rochester, Minnesota, March 21 22, Communication of the UICC Union Internationale Contre le Cancer, and AJCC American Joint Committee on Cancer, published by ASC American Society Cancer (1997), Communication of the UICC) végzik, lásd az alábbi A és B táblázatot. A táblázat A vesesejtes karcinóma TNM-klasszifikációja T1 <=7,0 cm, csak a vesében N1 egyetlen regionális nyirokcsomó T2 >7,0 cm, csak a vesében N2 egynél több regionális nyirokcsomó T3 terjedés a nagy vénákba, a mellékvesébe vagy a perinefrikus szövetekbe M0 nincs távoli áttét T4 betör a Gerota-fascia mögé M1 távoli áttét AJCC-besorolás TNM-klasszifikáció I. stádium T1 N0 M0 II. stádium T2 N0 M0 III. stádium T1 N1 M0 T2 N1 M0 T3 N0, N1 M0 IV. stádium T4 N0, N1 M0 bármilyen N2 M0 T bármilyen M1 bármilyen N T 6

7 B táblázat A vesesejtes karcinóma Robson-féle stádiumbesorolása és az éves túlélés Robson-stádium éves túlélési ráták* I./II. stádium 7% 86% III. stádium 41% 64% IV. stádium (T4) % 18% IV. stádium (M1) 0% 3% *American Foundation for Urologic Disease Az RCC standard kezelése a radikális nefrektómia (minden stádiumban). A rák terjedésének csökkentésére lehet alkalmazni irradiációt, de a vesesejtes karcinómák gyakran rezisztensek a besugárzásra. A hormonterápia néhány (%-nál kevesebb) esetben csökkentheti a daganat növekedését. Máig nem igazolódott, hogy a kemoterápiának bármilyen lényeges hatása lenne ebben a betegségben. A legtöbbet vizsgált kemoterápiás szerek a vinblasztin, az ¹FU (¹fluorouracil) és a floxuridán (FUDR), de csak az ¹FU és metabolitja, az FUDR esetében mutattak ki 12%¹os hatásossági arányt [Vokes EE, és Golomb HM. Oncologic Therapies, 2. kiadás. Springer- Verlag, Berlin/Heidelberg (03)]. A gemcitabin és az ¹FU kombinációja 17%¹os válaszarányt eredményezett. Az utóbbi években az USA és Európa szabályozó hatóságai vizsgálták az immunterápiák, például az interferon-alfa (IFN ) vagy az interleukin 2 (IL 2) hatékonyságát az elõrehaladott RCC kezelésében. A nagy dózisú IL 2 terápia a mai napig az egyetlen olyan immunológiai kezelési séma, amelyet az FDA engedélyezett. Az IFN -monoterápiával kapcsolatban kezdetben 2 %¹os válaszarányról számoltak be, sok kiegészítõ vizsgálat szerint azonban a valódi válaszarány csak körülbelül %¹os [Vokes EE, és Golomb HM. Oncologic Therapies, 2. kiadás. Springer-Verlag, Berlin/Heidelberg (03)]. Úgy tûnik, hogy az IL¹2-nek hasonló az összesített válaszaránya, mint az IFN ¹é, a betegek körülbelül %¹ánál értek el tartós, komplett remissziót (Rosenberg 1987). Több mint 00, elõrehaladott RCC-ben szenvedõ beteg újabb metaanalízisével arra a következtetésre jutottak, hogy átlagosan csak 12,9%¹os klinikai válaszarány érhetõ el citokinkezeléssel, vagyis IFN-alfával, nagy dózisú IL 2 bolusinjekciókkal vagy az IL 2 inhalációjával. Ugyanez az analízis 4,3%¹os választ mutatott ki a placebóra, és 2,%¹os választ a nem immunterápiás kontrollcsoportokban (Cochrane Database Syst Rev. 00;(3):CD Immunotherapy for advanced renal cell cancer. Coppin C, Porzsolt F, Awa A, Kumpf J, Coldman A, Wilt T). Bár az új terápiák sokféle tumortípusnál bizonyultak hatásosnak, és ezeket engedélyezték az utóbbi években, a vesesejtes karcinóma túlélési rátái az utóbbi évtizedben nem változtak lényegesen. A jelenleg rendelkezésre álló szisztémás kezelési lehetõségek a kemoterápia, valamint az immunterápiák viszonylag gyenge hatékonyságú eredményeket hoztak, és ami még fontosabb, alkalmazásukat korlátozza jelentõs szisztémás toxicitásuk. Következésképpen jelentõs kielégítetlen igény áll fenn a vesesejtes karcinóma új terápiás lehetõségeire. A T¹helper sejtek fontos szerepet játszanak a tumorellenes immunitásban a CTL¹ek effektorfunkcióinak koordinálása révén. A T¹helper sejtek epitópjai, amelyek kiváltják a TH1-típusú T¹helper sejtválaszt, támogatják a CD8-pozitív ölõ T¹sejtek effektorfunkcióit, többek között a sejtfelszínükön tumorasszociált peptid/mhc komplexeket megjelenítõ tumorsejtekre irányuló citotoxikus funkciókat. Ilyen módon a tumorasszociált T¹helper sejt peptidepitópok önmagukban vagy más tumorasszociált peptidekkel együtt tumorellenes immunválaszt stimuláló vakcinakészítmények aktív hatóanyagaként szolgálhatnak. Gaire és munkatársai [in: Gaire M, Magbanua Z, McDonnell S, McNeil L, Lovett DH, Matrisian LM. Structure and expression of the human gene for the matrix metalloproteinase matrilysin J Biol Chem Jan 21; 269(3):32 ] beszámoltak egy, az MMP-7-bõl származó peptid használatáról a rákvakcinációban, amely eltér a SEQ 1. azonosító számú szekvenciától, és MHC I¹kötõhely. Tehát egy tumorellenes vakcina kifejlesztése során a legfõbb feladat azon új tumorasszociált antigének és az ezekbõl képzõdött immunogén T¹helper epitópok azonosítása és jellemzése, amelyeket a CD8-pozitív T¹sejtek vagy a CD4-pozitív T¹sejtek ismernek fel, különösen a T H1 típusú CD4-pozitív T¹sejtek. Ezért a jelen találmány tárgya többek között egy hatásos rákellenes vakcina bemutatása, amely egy új aminosavszekvenciát tartalmaz egy olyan peptidhez, amely képes a humán fõ hisztokompatibilitási komplex II (MHC II) (HLA II) molekulához való kötõdésre. A jelen találmány szerint az elsõ feladat megoldható egy olyan rákellenes vakcina elõállításával, amely magában foglal egy, a mellékelt szekvencialista szerinti SEQ 1. azonosító számú szekvenciát tartalmazó, 16 aminosavból álló tumorasszociált peptidet, amelyben az adott peptid képes a humán fõ hisztokompatibilitási komplex II (MHC II) (HLA II) molekulához való kötõdésre. A jelen találmány keretében a feltalálók bemutatják, hogy lehetséges a HLA I és a HLA II molekulákhoz kötõdõ peptideket közvetlenül emlõsök tumoraiból, lehetõleg humán szolid tumorokból, fõként vesesejtes karcinómákból izolálni és jellemezni. A jelen találmány egy vakcinát mutat be, amely egy olyan, a tumorképzõdéshez társuló antigénbõl származó peptidet tartalmaz, amely képes kellõ mértékben kötõdni a HLA II molekulákhoz, annak érdekében, hogy immunválaszt váltson ki a humán leukocitákban, különösen a limfocitákban, azokon belül is a T¹limfocitákban, elsõsorban a CD4-pozitív T¹limfocitákban, elsõsorban a T H1 típusú immunválaszt közvetítõ CD4-pozitív T¹limfocitákban. A jelen találmány továbbá olyan, a tumorképzõdéshez társuló antigénekbõl származó peptideket mutat be, amelyek képesek kellõ mértékben kötõdni a HLA I molekulákhoz, annak érdekében, hogy immunválaszt váltsanak ki a humán leukocitákban, különösen a limfo- 7

8 citákban, azokon belül is a T¹limfocitákban, elsõsorban a CD8-pozitív citotoxikus T¹limfocitákban. A peptidek tumorasszociált antigénekbõl származnak, elsõsorban olyan tumorasszociált antigénekbõl, amelyeknek szerepük van például a proteolízisben, az angiogenezisben, a sejtnövekedésben, a sejtciklusszabályozásban, a sejtosztódásban, a transzkripció vagy a transzláció szabályozásában, illetve a szöveti invázióban, beleértve például a mátrix metalloproteináz 7¹bõl származó tumorasszociált peptideket (MMP7; SEQ 1. azonosító szám, a találmány tárgya) és az apolipoprotein L1¹et (APOL1; SEQ 4. azonosító szám). A jelen találmány keretében a feltalálók döntõ bizonyítékot szolgáltatnak arra is, hogy a HLA II molekulákhoz válogatás nélkül, de kellõképpen kötõdõ tumorasszociált peptidek különösen a genetikailag a humán genom HLA¹DR lokuszai által kódolt HLA II allélek képesek a humán CD4-pozitív T¹sejtek által közvetített immunválasz kiváltására. A CD4-pozitív T¹sejteket emberi perifériás vérbõl izolálták, ami azt bizonyítja, hogy a szabadalmaztatni kívánt peptidek alkalmasak az emberi immunrendszer T¹sejtválaszának kiváltására a tumorsejt-peptidkészlet egyes kiválasztott peptidjeivel szemben. Amint azt az alábbiakban egy MMP7-bõl származó peptiddel (SEQ 1. azonosító szám) szemléltetjük, a kutatási eredmények szerint a CD4-pozitív T¹sejtek felismerik ezt a válogatás nélkül a HLA-DRhez kapcsolódó, tumorasszociált peptidet. Hasonlóképpen, a kutatási eredmények alapján a HLA I molekulákhoz kellõképpen kötõdõ tumorasszociált peptidek képesek a humán CD8-pozitív citotoxikus T¹limfociták által közvetített immunválasz kiváltására, amely szintén azt bizonyítja, hogy a szabadalmaztatni kívánt peptidek alkalmasak az emberi immunrendszer válaszának kiváltására a tumorsejt-peptidkészlet egyes kiválasztott peptidjeivel szemben. Mivel a peptidek kémiai úton szintetizálhatók, és gyógyszerkészítmények aktív hatóanyagaiként használhatók fel, a jelen találmányban bemutatott peptideket alkalmazni lehet immunterápiás, elsõsorban rákellenes immunterápiás célokra. Annak érdekében, hogy HLA I vagy II ligandokat azonosítsanak a TAA-ból a peptidalapú immunterápia kifejlesztéséhez, a feltalálók megkísérelték a peptideket közvetlenül a szolid tumorokból izolálni, nevezetesen a vesesejtes karcinómából (RCC) (lásd az alábbi példákat). A következõ okok miatt összpontosítottak az RCC¹re a koncepció technikai bizonyítása érdekében: Világszerte évente mintegy új RCC-megbetegedést diagnosztizálnak, és a betegség mortalitási aránya nagy, amely megközelítõleg évi halálesetet jelent (Pavlovich, C. P. és L. S. Schmidt. 04. Searching for the hereditary causes of renal-cell carcinoma. Nat. Rev. Cancer 4: ). Ha áttétet diagnosztizálnak, akkor az egyéves túlélési ráta körülbelül %¹ra csökken (Jemal, A., R. C. Tiwari, T. Murray, A. Ghafoor, A. Samuels, E. Ward, E. J. Feuer, és M. J. Thun. 04. Cancer statistics, 04. CA Cancer J. Clin. 4:8 29), ami hangsúlyozza az ezen indikációval szemben támasztott, kielégítetlen orvosi igényt. Mivel az RCC ismerten immunogén tumor (Oliver RTD, Mehta A, Barnett MJ. A phase 2 study of surveillance in patients with metastatic renal cell carcinoma and assessment of response of such patients to therapy on progression. Mol Biother. 1988; 1:14. Gleave M, Elhilali M, Frodet Y, et al. Interferon gamma¹1b compared with placebo in metastatic renal cell carcinoma. N Engl J Med. 1998; 338:126), amint azt a tumorreaktív és tumorinfiltráló CTL¹ek jelenléte jelzi (Finke, J. H., P. Rayman, J. Alexander, M. Edinger, R. R. Tubbs, R. Connelly, E. Pontes, és R. Bukowski Characterization of the cytolytic activity of CD4+ and CD8+ tumorinfiltrating lymphocytes in human renal cell carcinoma. Cancer Res. 0: ), klinikai vizsgálatokat kezdeményeztek a peptidalapú tumorellenes vakcina kifejlesztése érdekében (Wierecky J, Mueller M, Brossart P. Dendritic cell-based cancer immunotherapy targeting MUC¹1. Cancer Immunol Immunother. 0 Apr 28). Ugyanakkor a TAA-ból származó T¹helper sejt epitópok hiányában a molekulárisan tervezett vakcinák rendszerint csak I. osztályú ligandként funkcionáló peptideket tartalmaznak. A vakcina tartalmazhat továbbá egyéb peptideket és/vagy segédanyagokat, hogy még hatékonyabb legyen, amint azt a továbbiakban ismertetjük. A peptid vagy a peptidet kódoló nukleinsav tumorvagy rákellenes vakcinát is képezhet. Ez közvetlenül beadható a betegnek, az érintett szervbe vagy szisztémásan, vagy ex vivo alkalmazható a betegbõl származó sejteken vagy egy humán sejtvonalon, amelyet azután beadnak a betegnek, illetve alkalmazható in vitro a betegbõl származó immunsejtek valamely alpopulációjának a kiválasztására, amelyet azután ismét beadnak a betegnek. A jelen találmány egy olyan peptidet mutat be, amely egy, a SEQ 1. azonosító szám (SQDDIK- GIQKLYGKRS) szerinti, összesen 9 16 aminosavból álló aminosavszekvenciát tartalmaz (a hozzáférési számokat lásd az alábbi, 1. táblázatban). Az alábbiakban leírtaknak megfelelõen a jelen találmány alapját képezõ peptidrõl megállapították, hogy MHC II molekulát hordozó (RCC) sejtek prezentálják. Ennélfogva e konkrét peptid, csakúgy, mint a többi egyéb, az adott szekvenciát tartalmazó (azaz származtatott) peptid, mind specifikus T¹sejtválaszt váltanak ki, bár a kiváltott válasz mértéke az egyes peptidek esetében különbözõ lehet. Az eltérések oka lehet például az adott peptidekben létrejövõ mutáció (lásd alább). A korszerû tudományos felkészültséggel rendelkezõ szakember ismeri az egyes peptidek által kiváltott válasz mértékének meghatározása érdekében alkalmazandó módszereket, különös tekintettel az itt bemutatott példákra és a vonatkozó szakirodalomra. Az olyan vakcinát tartjuk kedvezõnek, amelyben az említett peptid a SEQ 1. azonosító szám szerinti aminosavszekvenciát tartalmazza. Az adott aminosavszekvencia variánsa alatt azt értjük, hogy például egy vagy két aminosavmaradék módosított (például helyettesítik valamelyik másik, ter- 8

9 mészetesen elõforduló aminosavmaradék oldalláncával vagy valamilyen más oldallánccal) oly módon, hogy a peptid továbbra is képes lényegében ugyanúgy kötõdni egy HLA molekulához, mint az adott aminosavszekvenciát tartalmazó peptid. Egy peptid módosítható például úgy, hogy legalábbis megmarad (esetleg fokozódik) egy megfelelõ MHC molekulával például HLA II molekulák esetében a HLA-DRB1-gyel, HLA I molekulák esetén a HLA A2-vel való interakcióra és kötõdésre való képessége, egyben megmarad (esetleg fokozódik) a találmány részeként definiált aminosavszekvenciát tartalmazó polipeptidet kórosan expresszáló sejtek felismerésére és elpusztítására képes aktivált CTL¹ek generálására való képessége, valamint a T¹helper sejtek stimulálására való alkalmassága, amelyek segíthetik a CD8-pozitív T¹sejteket, vagy citokinek szekréciójával közvetlenül megtámadják a célsejteket. Amint az az alábbiakban bemutatott adatbázisból megállapítható, a HLA-DR-hez kötõdõ peptidek bizonyos pozíciói tipikusan horgony szerepet töltenek be azáltal, hogy egy, a HLA kötõzsebébe illõ alapszekvenciát képeznek. Ezek és más, a HLA-DR-hez való kötõdésben szerepet játszó aminosavmaradékok módosításai elõsegíthetik a kötõdést anélkül, hogy megváltoztatnák a CTL általi felismerést. A T¹sejt-receptorral való interakció szempontjából nem lényeges aminosavmaradékok módosíthatók olyan más aminosavval történõ helyettesítés útján, amelynek beépítése nem befolyásolja érdemben a T¹sejtek reaktivitását, és nem akadályozza meg a releváns MHC-hez való kötõdést. Ennélfogva, az említett feltételen kívül, a találmányban leírt peptid lehet bármely olyan peptid (ideértjük az oligopeptideket és a polipeptideket is), amely tartalmazza a megadott aminosavszekvenciákat, vagy azok egy részét, vagy azok variánsát. Ismert tény továbbá az MHC II molekulák által prezentált peptidekkel kapcsolatban, hogy ezek a peptidek egy bizonyos HLA-specifikus aminosavmotívumot tartalmazó alapszekvenciából állnak, valamint opcionálisan az alapszekvencia funkcióját nem zavaró (azaz a peptid és a T¹sejt interakciója szempontjából lényegtelennek tekinthetõ) N¹ és/vagy C¹terminális kiterjesztésekbõl állnak. Az N¹ és/vagy C¹terminális kiterjesztések egyenként 1 aminosav hosszúságúak lehetnek. Ennek megfelelõen a jelen találmány szerinti peptid ideális esetben összesen 16 aminosavból áll. E peptidet közvetlenül fel lehet használni az MHC II molekulákkal való komplexképzés céljából, vagy a szekvencia vektorokba klónozható az alábbiakban leírtaknak megfelelõen. A találmány egy további aspektusa, hogy, hasonlóan a fentiekben tárgyalt MHC II molekulákhoz, a peptidek felhasználhatók MHC I molekulaspecifikus válasz kiváltására, mivel a peptidek egyszerre tartalmazhatják a HLA I molekulák fõ¹ vagy részszekvenciáit. Egy MHC I¹specifikus peptid teljes hossza 9 16 aminosav. A szakember ismeri a HLA I molekulákban bizonyos HLA-specifikus aminosavmotívumot tartalmazó, MHC I¹molekulaspecifikus alapszekvenciák azonosításának módszereit, illetve azok predikciójára használható például a PAProC ( és a SYFPEITHI ( számítógépes program (lásd alább). A peptidek különösen hasznosak azon immunterápiás módszerekben, amelyek képessé teszik a T¹sejteket azoknak a sejteknek a felismerésére, amelyek abnormálisan olyan polipeptideket expresszálnak, amelyek a jelen találmány tárgyát képezik. Mivel ezek az adott aminosavszekvenciákból álló sajátos peptidek kötõdnek a HLA I vagy a HLA II molekulákhoz, szükséges, hogy a peptidek kötõdjenek a HLA I vagy a HLA II molekulákhoz, és a kötõdés után a HLA-peptid komplex megfelelõ antigénprezentáló sejt felszínén prezentálva képes legyen olyan T¹sejtek stimulálásának kiváltására, amelyek felismerik azokat a sejteket, amelyek abnormálisan expresszálják az adott aminosavszekvenciát tartalmazó polipeptidet. Ha egy körülbelül 12 aminosavmaradéknál nagyobb peptidet alkalmaznak közvetlenül az MHC molekulához való kötõdésre, ajánlatos, hogy a HLA-hoz való kötõdés központi helyét olyan aminosavmaradékok vegyék körül, amelyek nem befolyásolják érdemben sem a peptidnek az MHC-molekula kötõzsebéhez való specifikus kötõdését, sem pedig a peptid prezentálását a T¹sejteknek. Ugyanakkor, amint azt már a fentiekben jeleztük, nyilvánvalóan használhatók nagyobb peptidek is, különösen akkor, ha azokat egy polinukleotid kódolja, mivel e nagyobb peptideket fragmentálhatják a megfelelõ antigénprezentáló sejtek. MHC ligandok peptidjeire, motívumaira, variánsaira, valamint bizonyos N¹ és/vagy C¹terminális kiterjesztéseikre példák találhatók többek között a SYFPEITHI adatbázisban [Rammensee H, Bachmann J, Emmerich NP, Bachor OA, Stevanovic S. SYFPEITHI: database for MHC ligands and peptide motifs. Immunogenetics Nov; 0(3 4): Review.] a weboldalon, továbbá az itt megadott hivatkozásokban. Nem kizárólagos példaként az adatbázisban szereplõ bizonyos peptidek, amelyek kötõdnek a HLA-DRhez, lg kappa lánc eredetûek: K H K V Y AC E V THQGL S S [Kovats et al. Eur J Immunol Apr;27(4):14 21]; vagy lg kappa lánc 14 9 eredetûek: KVQW KVD NAL Q S GNS [Kovats et al. Eur J Immunol Apr;27(4):14 21]; vagy GAD eredetûek: L P R L I AFT- SEHSHF [Endl et al. J Clin Invest May ;99():2 ]; vagy GAD6 6 7 eredetûek: F F RMV I SNP AATHQDIDFLI [Endl et al. J Clin Invest May ;99():2 ]. Ezen túlmenõen peptidek származhatnak mutáns antigénszekvenciákból is: erre példa a bcr-abl 2 kd¹os fúziós proteinbõl származó ATGFKQ SSK ALQRPVAS[ten Bosch et al. Blood Nov 1; 88(9):22 7], a HCV¹1 NS bõl származó G Y KVL VLN P S V A A T [Diepolder et al. J Virol Aug; 71(8):11 9], vagy a HIV¹1 (HXB2) RT bõl származó F RKONPD I V IQYMDDLYVG[van der Burg et al. J Immunol Jan 1; 162(1):2 ]. 9

10 Valamennyi horgony aminosavat [lásd Friede et al., Biochim Biophys Acta Jun 7; 1316(2):8 1; Sette et al. J Immunol Sep ; 1(6): ; Hammer et al. Cell Jul 16;74(1):197 3., és Hammer et al. J Exp Med. 199 May 1; 181():1847. Példaként a HLA-DR4¹re] félkövér szedéssel emeltük ki, a vélelmezett alapszekvenciákat pedig aláhúzással jelöltük. A fentiekben leírt peptidek mindegyikére az adott aminosavszekvencia variánsai kifejezéssel hivatkozunk. A peptid kifejezés alatt a feltalálók nemcsak olyan molekulákat értenek, amelyekben az aminosavak peptidkötéssel ( CO NH ) kapcsolódnak, hanem olyanokat is, amelyekben a peptidkötés fordított szekvenciájú. Az ilyen retro-inverso peptidszerû képletek létrehozása szakszerû módszerekkel ismert, például az itt megadott hivatkozásban Meziere és munkatársai (1997, J. Immunol. 9, ) által leírtak szerint. Ebben a megközelítésben olyan pszeudopeptidek elõállításáról van szó, amelyek a vázként szolgáló peptidlánc módosításával, nem pedig az aminosav-oldalláncok orientációjának a módosításával jönnek létre. Meziere és munkatársai (1997) bemutatják e pszeudopeptidek hasznosságát legalábbis az MHC II molekulák és a T¹helper sejtválaszok tekintetében. A CO NH peptidkötés helyett NH CO kötést tartalmazó retro-inverso peptidek jóval ellenállóbbak a proteolízissel szemben. A peptid ha egy antigénprezentáló sejt expresszálja feldolgozásakor jellemzõen olyan fragmentum keletkezhet, amely képes kötõdni egy megfelelõ MHC molekulához, egy alkalmas sejt által prezentálható, és képes kiváltani a megfelelõ T¹sejtválaszt. Nyilvánvaló, hogy a peptidbõl készített fragmentum is lehet egy, a találmány szerinti peptid. Kedvezõ esetben a peptid tartalmaz egy olyan szakaszt, amely tartalmazza az adott aminosavszekvenciát, vagy annak egy részét, illetve annak variánsát, és egy további olyan szakaszt, amely valamely kívánatos tulajdonságot hordoz. Ez a további szakasz például tartalmazhat egy további T¹sejt epitópot (akár ugyanabból a polipeptidbõl származót, mint az elsõ T¹sejt epitópot tartalmazó szakasz, akár másikból), vagy tartalmazhat egy hordozó fehérjét vagy peptidet. Különösen ideális, amikor a peptidek tartalmazzák az aminosavszekvenciákat és legalább egy további T¹sejt epitópot, és ez a további T¹sejt epitóp képes elõsegíteni az abnormálisan tumorasszociált antigént expresszáló tumortípus ellen irányuló T¹sejtválasz kialakulását. Így a peptidek közé tartoznak az úgynevezett beads-on-a-string (gyöngysor) polipeptidek, amelyeket szintén lehet vakcinaként használni. Az ilyen peptidek között térköz hozható létre olyan kémiai kötésekkel, amelyek tartalmazhatnak aminosavakat (például G¹láncok), de amelyek kiegészítésként vagy alternatívaként tartalmazhatnak kémiai kötõcsoportokat is (vagyis nincs funkciójuk, kivéve egy bizonyos térköz biztosítását). Az abnormálisan expresszált kifejezés alatt azt értjük, hogy a polipeptid a normális expresszálódási szinthez képest túlzott mértékben expresszált, vagy hogy a gén csendes abban a szövetben, amelybõl a tumor származik, de a tumorban expresszálódik. A túlzott mértékben expresszált kifejezés alatt azt értjük, hogy a polipeptid a normálszövethez képest legalább 1,2-szeres mennyiségben van jelen; illetve lehetõség szerint a normálszövethez képest legalább 2¹szeres, még kedvezõbb esetben legalább ¹szörös vagy ¹szeres mennyiségben. A peptideket (legalábbis az aminosavmaradékok között peptidkötéseket tartalmazókat) Fmoc-poliamid technikát alkalmazó szilárd fázisú peptidszintézissel lehet szintetizálni; lásd Lu és munkatársai (1981, J. Org. Chem. 46, ), és az abban foglalt hivatkozásokat. Az N¹amino-csoportok ideiglenes védelmét a 9¹fluorenil-metil-oxi-karbonil (Fmoc)-csoport biztosítja. E bázisokkal szemben nagymértékben labilis védõcsoport ismételt hasítását %¹os piperidin¹n,n-dimetilformamid alkalmazásával végzik el. Az oldalláncok funkcionalitását meg lehet óvni, ha ezekbõl butil-éterszármazékot (a szerin, a treonin és a tirozin esetében), butil-észter-származékot (a glutaminsav és az aszparaginsav esetében), butil-oxi-karbonil-származékot (a lizin és a hisztidin esetében), tritilszármazékot (a cisztein esetében) és 4¹metoxi-2,3,6-trimetil-benzénszulfonilszármazékot (az arginin esetében) képezünk. Ahol glutamin vagy aszparagin a C¹terminális aminosavmaradék, az oldallánc amidofunkciójának védelmére a 4,4 - dimetoxi-benzhidril-csoport használható. A szilárd fázisú támogatás a három monomerbõl dimetil-akrilamid (vázalkotó monomer), biszakriloil-etilén-diamin (keresztkötõ) és akriloil-szarkozin-metil-észter (funkcionalizáló ágens) álló polidimetil-akrilamid polimeren alapul. A peptidet a gyantához hasítható módon kapcsoló anyag a savakkal szemben labilis 4¹hidroxi-metilfenoxi-ecetsav-származék. Minden aminosavszármazék preformált, szimmetrikus anhidridszármazékként kerül hozzáadásra, kivéve az aszparagint és a glutamint, amelyeket megfordított N,N-diciklohexil-karbodiimid/1¹hidroxi-benzotriazol által közvetített kötési eljárással adnak hozzá. Minden kötési és deprotektív reakció ellenõrzése ninhidrin¹, trinitro-benzénszulfonsavvagy izotinteszteljárások alkalmazásával történik. A szintézis megtörténtekor a peptideket az oldallánci védõcsoportok egyidejû eltávolításával, 0%¹os scavengerkeveréket tartalmazó, 9%¹os trifluoroecetsavval történõ kezelés útján lehasítják a hordozó gyantáról. A leggyakrabban használt scavengerek az etánditiol, a fenol, az anizol és a víz keveréke; a választás mindig a szintetizálandó peptidet felépítõ aminosavaktól függ. A trifluoro-ecetsavat vákuumbepárlással választják le, majd dietil-éterrel porlasztják a nyers peptid kinyerése érdekében. Az esetleg még jelen lévõ scavengereket egyszerû extrakciós eljárással távolítják el, amelynek eredményeképpen a vizes fázis liofilizálása után visszamarad a scavengertõl mentes nyers peptid. A peptidszintézishez szükséges reagensek általában beszerezhetõk a következõ cégtõl: Calbiochem-Novabiochem (UK) Ltd, Nottingham NG7 2QJ, UK.

11 A tisztítás megoldható a következõ módszerek bármelyikének önálló vagy egymással kombinált alkalmazásával: méretkizárásos kromatográfia, ioncserélõ kromatográfia, vagy (általában) fordított fázisú, nagy teljesítményû folyadékkromatográfia. A peptidanalízis elvégezhetõ vékonyréteg-kromatográfia, fordított fázisú, nagy teljesítményû folyadékkromatográfia, savhidrolízist követõ aminosavanalízis, gyors atomütköztetéses (FAB) tömegspektrométeres analízis, továbbá MALDI és ESI-Q-TOF tömegspektrométeres analízis útján. A találmány egy nukleinsavat (például egy polinukleotidot) mutat be, amely egy peptidet kódol. A nukleinsav lehet DNS, cdns, PNS, CNS, RNS vagy ezek kombinációi, és amennyiben a peptidet kódolja, (nem kötelezõ jelleggel) tartalmazhat intronokat is. Magától értetõdõen a polinukleotidok csak természetesen elõforduló peptidkötéssel kapcsolódó, természetesen elõforduló aminosavmaradékokat tartalmazó peptideket képesek kódolni. A találmány része egy olyan expressziós vektor, amely képes egy polipeptidet expresszálni. Többféle módszert fejlesztettek ki arra, hogy hogyan lehet polinukleotidokat (különösen DNS¹t) például komplementer kohezív végeken keresztül vektorokkal mûködõképesen összekötni. Az egyik lehetõség például komplementer homopolimer szakaszok hozzáadása a vektor DNS-ébe beépítendõ DNS-szakaszhoz. Ekkor a vektor és a DNS-szakasz, a komplementer homopolimer végek között hidrogénkötéssel kapcsolódva rekombináns DNS-molekulákat képez. Az egy vagy több restrikciós helyet tartalmazó szintetikus kapcsolók is lehetséges alternatíváját jelentik a DNS-szakasz vektorokhoz kötésének. Az elõzõekben leírtak szerint restrikciós endonukleázokkal való emésztéssel generált DNS-szakaszt bakteriofág T4 DNS-polimerázzal vagy E. coli DNS-polimeráz I¹gyel kezelik, azaz olyan enzimekkel, amelyek 3 ¹ - exonukleáz-aktivitásukkal eltávolítják a kiálló 3 ¹egyszálú végeket, és a megüresedett 3 ¹végeket polimerázaktivitásuk útján töltik fel. E tevékenységek kombinációjának eredményeképpen tompa végû DNS-szakaszok jönnek létre. Ezután a tompa végû szakaszokat nagy moláris feleslegû kapcsolómolekulákkal inkubálják a tompa végû DNS-molekulák kötõdésének katalizálására képes enzim (például a bakteriofág T4 DNS-ligáz) jelenlétében. Így a reakció termékei a végükön polimerikus kapcsolószakaszokat hordozó DNS-szakaszok lesznek. Ezeket a DNS-szakaszokat azután a megfelelõ restrikciós enzimmel elhasítják, és egy, a DNS-szakaszéval kompatibilis végeket elõállító enzimmel elhasított expressziós vektorhoz kötik. Többféle restrikciós endonukleáz hasítási helyet tartalmazó szintetikus kapcsoló van kereskedelmi forgalomban, és számos forrásból beszerezhetõ, például a következõ cégtõl: International Biotechnologies Inc, New Haven, CN, USA. A polipeptidet kódoló DNS módosításának kívánatos módja a Saiki és munkatársai (1988, Science 239, ) által leírt polimeráz-láncreakció. E módszer használható a DNS egy megfelelõ vektorba történõ beépítésére (például a megfelelõ restrikciós helyekre való szerkesztésére), vagy a DNS egyéb hasznos módokon történõ módosítására a szakmai ismeretek szerint. E módszer során az enzimatikusan amplifikálandó DNS¹t két specifikus primer határolja, amelyek maguk is beépülnek az amplifikált DNS¹be. Az említett specifikus primerek tartalmazhatnak olyan restrikciós endonukleázfelismerõ helyeket, amelyek az ismert szakmai eljárásokkal felhasználhatók az expressziós vektorba történõ klónozáshoz. A DNS (vagy retrovirális vektorok esetén az RNS) ezután megfelelõ gazdában expresszálódik, hogy létrehozzon egy, a vegyületet tartalmazó polipeptidet. Ennélfogva a vegyületet képezõ polipeptidet kódoló DNS felhasználható az ismert és az itt leírt szempontok figyelembevételével megfelelõen módosított technikák alkalmazásával olyan expressziós vektor létrehozására, amely azután felhasználható egy alkalmas gazdasejtnek a találmány szerinti polipeptid expressziója és elõállítása céljából történõ átalakítására. Ilyen technikákat közölnek például a következõ, Amerikai Egyesült Államokban érvényes szabadalmak: 4489 (1984. április 3.), Rutter és munkatársai; 4901 (198. július 23.), Weissman; (1986. április.), Crowl; (1987. június.), Mark és munkatársai; (1987. július 7.), Goeddel; (1987. november 3.), Itakura és munkatársai; (1987. december 1.), Murray; (1988. július 12.), Toole, Jr. és munkatársai; 4767 (1988. augusztus 23.), Goeddel és munkatársai; valamint (1989. március 7.) Stalker. A vegyületet alkotó polipeptidet kódoló DNS (illetve retrovirális vektorok esetében RNS) számos további DNS-szekvenciához kapcsolható a megfelelõ gazdába való bejuttatás érdekében. A társ DNS megválasztása a gazda jellegétõl, a DNS abba való bejuttatásának módjától, valamint attól függ, hogy kívánatos¹e az episzomális fenntartás vagy integráció. A DNS¹t általában egy expressziós vektorba (például plazmidba) juttatják be az expresszióhoz megfelelõ orientációban és helyes leolvasási keretben. Szükség esetén a DNS kapcsolható a kívánt gazda által felismert megfelelõ transzkripciós és transzlációs szabályozószekvenciákhoz, bár ilyen szabályozószakaszok rendszerint rendelkezésre állnak az expressziós vektorban. Ezután a vektort a hagyományos technikák segítségével bevezetik a gazdába. A vektor általában nem alakít át minden gazdát. Ennélfogva szükséges az átalakított gazdasejtek szelektálása. Az egyik szelekciós technika során az expressziós vektorba olyan DNS-szekvenciát építenek be az összes szükséges szabályozóelemmel együtt, amely az átalakított sejtben valamilyen szelektálható tulajdonságot (például antibiotikumrezisztenciát) kódol. Más módszerrel az ilyen kiválasztott tulajdonság génje lehet egy másik vektoron, amelyet a kívánt gazdasejt kotranszformációjára használnak. A találmány szerinti rekombináns DNS által transzformált gazdasejteket ezután elegendõ ideig és az itt 11

12 2 4 0 leírt korszerû szakmai ismeretek szerinti megfelelõ körülmények között tenyésztik, hogy expresszálódhasson a polipeptid, amely ezt követõen kinyerhetõ. Számos ismert expressziós rendszer létezik: többek között baktériumok (például az E. coli és a Bacillus subtilis), élesztõgombák (például a Saccharomyces cerevisiae), fonalas gombák (például az Aspergillus),, valamint növényi, állati és rovarsejtek. Legjobb, ha a rendszer RCC- vagy Awells-sejt. A promoter egy DNS-szekvenciából álló expressziós szabályozóelem, amely lehetõvé teszi az RNS-polimeráz kötõdését és a transzkripció lezajlását. A példaként felsorolt bakteriális gazdákkal kompatibilis promoterszekvenciák jellemzõen plazmidvektorokban állnak rendelkezésre, amelyek tartalmazzák a jelen találmány szerinti DNS-szakasz beépítésére alkalmas restrikciós helyeket. Tipikus prokarióta plazmidvektorok a Biorad Laboratoriestól (Richmond, CA, USA) beszerezhetõ puc18, puc19, pbr322 és pbr329, valamint a Pharmaciától (Piscataway, NJ, USA) beszerezhetõ ptrc99a és pkk Tipikus emlõssejt-plazmidvektor például a Pharmaciától (Piscataway, NJ, USA) beszerezhetõ psvl. Ez a vektor az SV késõi promotert használja a klónozott gének expressziójának ösztönzésére; a legmagasabb expressziós szintet a T¹antigéntermelõ sejtekben, például a COS¹1 sejtekben találták. Az indukálható emlõs expressziós vektorra példa a szintén a Pharmaciától beszerezhetõ pmsg. Ez a vektor az egér emlõrákvírus hosszú terminális ismétlõdésének glükokortikoidok által indukálható promoterét használja a klónozott gén expressziójának fokozására. Hasznos élesztõ-plazmidvektor a prs3 6 és a prs : ezek általánosan beszerezhetõk a Stratagene Cloning Systemstõl (La Jolla, CA 937, USA). A prs3, a prs4, a prs és a prs6 élesztõbe integrálódó plazmidok (YIp) a HIS3, a TRP1, a LEU2 és az URA3 élesztõ szelekciós markereket tartalmazzák. A prs plazmidok élesztõ centromer plazmidok (Ycp). A szakmában egyéb vektorok és expressziós rendszerek is ismertek, amelyek számos különféle gazdasejttel használhatók. A jelen találmány bemutat egy olyan gazdasejtet is, amelyet polinukleotid-vektor konstrukcióval transzformáltak. A gazdasejt lehet prokarióta vagy eukarióta is. Bizonyos körülmények között prokarióta gazdasejtként a bakteriális sejteket preferálják, jellemzõen az E. coli törzseit, például a Bethesda Research Laboratories Inc.¹tõl (Bethesda, MD, USA) beszerezhetõ E¹coli DH, illetve az American Type Culture Collectiontõl (ATCC: Rockville, MD, USA) beszerezhetõ RR1 (No ATCC 31343) törzset. A preferált eukarióta gazdasejtek között szerepelnek élesztõgomba¹, rovar- és emlõssejtek (lehetõleg gerincesekéi, például egér, patkány vagy majom sejtjei), illetve humán fibroblaszt- és vesesejtvonalak. Élesztõgomba-gazdasejt például az YPH499, az YPH00 és az YPH01: ezek általában beszerezhetõk a Stratagene Cloning Systemstõl (La Jolla, CA 937, USA). Preferált emlõs gazdasejtek többek között az ATCC-tõl CCL61¹es számon beszerezhetõ kínaihörcsög-ováriumsejtek (CHO), az ATCCtõl CRL 168NIH számon beszerezhetõ NIH/3T3 svájciegér-embriósejtek, az ATCC-tõl CRL 1¹es számon beszerezhetõ, majmok veséjébõl kivont COS¹1 sejtek, továbbá a 293¹as számú humán embrionális vesesejtek. Kedvezõ esetben a rovarsejtek bakulovírus expressziós vektorokkal transzfektálható Sf9- sejtek. A megfelelõ gazdasejteknek a jelen találmány szerinti DNS-konstrukcióval történõ átalakítása elvégezhetõ jól ismert módszerekkel, amelyek jellemzõen a használt vektor típusától függenek. A prokarióta gazdasejtek transzformációjának tekintetében lásd például: Cohen et al. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69,21, valamint Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. Az élesztõsejtek transzformációjának leírását lásd a következõ közleményben: Sherman et al. (1986) Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY. Hasznos a Beggs (1978 Nature 27, 4 9) által leírt módszer is. A gerincesekbõl származó sejtek transzfektálásában hasznos reagensek (például kalciumfoszfát és DEAE-dextrán vagy liposzómaformulációk) beszerezhetõk a Stratagene Cloning Systemstõl vagy a Life Technologies Inc.¹tõl (Gaithersburg, MD 877, USA). Az elektroporáció is hasznos a sejtek transzformálásában és/vagy transzfektálásában, és a szakmában elterjedt az élesztõsejtek, bakteriális sejtek, valamint rovar- és gerincessejtek átalakításában. A sikeresen átalakított sejtek vagyis azok a sejtek, amelyek tartalmazzák a DNS-konstrukciót közismert technikák segítségével azonosíthatók. A jelen találmány szerinti expressziós konstrukció bevezetésébõl keletkezõ sejteket például tenyészteni lehet a találmány szerinti polipeptid elõállítása érdekében. A sejteket ki lehet nyerni, lizálni lehet, DNS-tartalmuk pedig, például a Southern (197., J. Mol. Biol. 98,03), illetve a Berent és munkatársai (198., Biotech. 3,8) által leírt módszerrel vizsgálható arra nézve, hogy jelen van¹e DNS. 3,8. Hasonlóképpen antitestek felhasználásával is kimutatható a fehérje jelenléte a felülúszóban az alábbiakban leírt módon. A rekombináns DNS jelenlétének közvetlen vizsgálatán túlmenõen a sikeres transzformáció igazolható közismert immunológiai módszerekkel is, amennyiben a rekombináns DNS képes szabályozni a fehérje expresszióját. Például valamely expressziós vektorral sikeresen transzformált sejtek megfelelõ antigenicitást mutató fehérjéket termelnek. A gyaníthatóan transzformált sejtekbõl mintát gyûjtenek, és megfelelõ antitestek használatával vizsgálják bennük a fehérje jelenlétét. Így az átalakított gazdasejteken kívül a jelen találmány bemutat egy, ezen sejtekbõl létrehozott kultúrát is, lehetõség szerint monoklonális (klonális szempontból homogén) vagy monoklonális kultúrából létrehozott kultúrát, tápoldatban. Nyilvánvaló, hogy bizonyos gazdasejtek (például bakteriális, élesztõ- és rovarsejtek) hasznosak lehetnek a találmány szerinti peptidek elõállításában. Más 12

13 2 4 0 gazdasejtek azonban bizonyos terápiás módszerek során hasznosíthatók. Az antigénprezentáló sejtek, úgymint a dendritikus sejtek, például hasznosan alkalmazhatók a találmány szerinti peptidek expresszálására, így azok a megfelelõ MHC molekulákhoz kapcsolódhatnak. Kedvezõ esetben a gazdasejt rekombináns RCCvagy Awells-sejt. Ideálisan egy tumorasszociált peptid termelésére szolgáló módszer egy olyan módszer, amely magában foglalja a gazdasejt tenyésztését és a peptid izolálását a gazdasejtbõl, vagy a tápoldatból, a hagyományos módszereknek megfelelõen. A találmány egy további része egy orális, rektális, nazális vagy lingvális bevételre, intravénás (iv.) injekcióban, szubkután (sc.) injekcióban, intradermális (id.) injekcióban, intraperitoneális (ip.) injekcióban vagy intramuszkuláris (im.) injekcióban történõ beadásra alkalmas peptid elõállítására alkalmas módszer. A peptidinjekció preferált beadási módjai: sc., id., ip., im. és iv. A DNS-injekció preferált beadási módjai: id., im., sc., ip. és iv. A beadható adag a peptid és a DNS esetében 0,1 00 mg. A jelen találmány céljának egy gyógyszerészeti készítmény felel meg, egy olyan rákellenes vakcina formájában, amely tartalmaz egy, a SEQ 1. azonosító szám szerinti tumorasszociált peptidet, amelynek teljes hossza 16 aminosav, és egy gyógyszerészeti szempontból elfogadható hordozómolekulát. Ez a készítmény parenterálisan alkalmazható, például szubkután, intradermális, intraperitoneális, intravénás vagy intramuszkuláris módon, illetve orálisan is beadható. Ehhez a peptideket gyógyszerészeti szempontból elfogadható, lehetõleg vizes vivõanyagban feloldják vagy szuszpendálják. A készítmény ezenfelül tartalmazhat segédanyagokat: például puffereket, kötõanyagokat, dezintegrálóés térfogatkitöltõ anyagokat, ízesítõanyagokat, lubrikánsokat stb. A peptidek beadhatók immunstimuláló anyagokkal például citokinekkel együtt is. Az ilyen készítményekben használható segédanyagok kimerítõ listája megtalálható például a következõ kiadványban: A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3. Ed., 00, American Pharmaceutical Association and pharmaceutical press. A gyógyszerkészítmény alkalmazható adenomatózus vagy rákos megbetegedések prevenciójára, profilaxisára és/vagy terápiájára. A rákellenes vakcina amely tartalmazza a SEQ 1. azonosító szám szerinti, összesen 16 aminosavat tartalmazó peptidet beadható olyan betegeknek, akik olyan adenomatózus vagy rákos megbetegedésben szenvednek, amely kapcsolatban áll az adott peptiddel vagy antigénnel. Ezzel beindítható egy T¹sejt által közvetített immunválasz. A jelen találmány szerinti gyógyszerészeti készítmény ideális esetben tartalmaz még legalább egy további tumorasszociált peptidet, amely tartalmazza a SEQ 2 SEQ 11. azonosító szám szerinti szekvenciák bármelyikét, és amelynek teljes hossza 9 16 aminosav. Egy olyan, a jelen találmánynak megfelelõ rákellenes vakcina preferált, amely a SEQ 1. azonosító szám és a SEQ 2 SEQ 11. azonosító szám szerinti aminosavszekvenciákból álló (különösképpen tumorasszociált) peptideket tartalmaz. Egy olyan, a jelen találmánynak megfelelõ rákellenes vakcina preferált, amelyben az említett készítményben jelen lévõ (különösképpen tumorasszociált) peptid(ek) szövet¹, rák- és/vagy betegspecifikus(ak). Elõnyös, ha a vakcina hatóanyaga nukleinsav. Ismeretes, hogy a polipeptidet kódoló nukleinsavat tartalmazó (például DNS¹) vakcinával történõ oltás T¹sejtválaszhoz vezet. Ez közvetlenül beadható a betegnek, az érintett szervbe vagy szisztémásan, vagy ex vivo alkalmazható a betegbõl származó sejteken vagy egy humán sejtvonalon, amelyet azután beadnak a betegnek, illetve alkalmazható in vitro a betegbõl származó immunsejtek valamely alpopulációjának a kiválasztására, amelyet azután ismét beadnak a betegnek. Ha a nukleinsavat in vitro juttatják be a sejtekbe, hasznos lehet a sejtek transzfekciója az immunstimuláló citokinek (például az interleukin 2 vagy a GM¹CSF) együttes expressziója érdekében. A peptid lehet lényegében tiszta, vagy kombinálható immunstimuláló adjuvánssal, illetve alkalmazható immunstimuláló citokinekkel együtt is, vagy beadható megfelelõ hatóanyag-leadó rendszerrel (például liposzómákkal). A nukleinsavtartalmú vakcina beadható adjuvánssal is, például BCG-vel vagy timsóval. Egyéb, alkalmas adjuváns lehet az Aquila QS21 stimulon (Aquila Biotech, Worcester, MA, USA), amely szaponinból készül, valamint a mikobaktériumkivonatok és szintetikus baktériumsejtfal-utánzatok, valamint védjegyzett adjuvánsok, mint például a Ribi Detox készítménye. Alkalmazható a Quil A is, amely egy másik szaponinszármazék adjuváns (Superfos, Dánia). Elõnyös, ha a nukleinsavtartalmú vakcina adjuváns nélkül kerül beadásra. Hasznosak lehetnek még egyéb adjuvánsok, például a Freund-adjuváns is. Hasznos lehet, ha a peptidet lyukas csigákból származó hemocianinnal (KLH) vagy mannánnal [lásd WO 9/1814 és Longenecker et al (1993) Ann. NY Acad. Sci. 690, ] konjugálva adják be. A peptid lehet jelölt vagy fúziós protein, vagy hibrid molekula is. A polinukleotid lehet lényegében tiszta, illetve tartalmazhatja megfelelõ vektor vagy hatóanyag-leadó rendszer. A megfelelõ vektorok és hatóanyag-leadó rendszerek lehetnek virális eredetûek: például adenovíruson, vakcíniavíruson, retrovírusokon, herpeszvíruson, adenoasszociált víruson vagy több különbözõ víruselemet tartalmazó hibrideken alapuló rendszerek. A nem virális hatóanyag-leadó rendszerek lehetnek például a DNS-bejuttatásban jól ismert kationos lipidek és kationos polimerek. Alkalmazható továbbá fizikai bejuttatás is, például finom eloszlású fémszemcsékhez kötött géneken ( gene gun ) keresztül. A peptid vagy a nukleinsav által kódolt peptid lehet fúziós protein, például egy olyan, tetanusz toxoidból származó epitóppal, amely stimulálja a CD4-pozitív T¹sejteket. A betegnek beadott bármely nukleinsavnak sterilnek és pirogénmentesnek kell lennie. A csupasz DNS beadható intramuszkulárisan, intradermálisan vagy szubkután. A peptidek beadhatók intramuszkulárisan, intradermálisan vagy szubkután. 13

14 A nukleinsavtartalmú vakcinának lehetõség szerint tartalmaznia kell valamilyen megfelelõ nukleinsavbejuttató megoldást. A nukleinsav (lehetõleg DNS) beadható csupasz formában (azaz lényegében minden más komponens nélkül), vagy bejuttatható egy liposzómában vagy egy virális vektor hatóanyag-leadó rendszer részeként. Feltételezhetõ, hogy a professzionális antigénprezentáló sejtek, például a dendritikus sejtek nukleinsavfelvétele és a kódolt polipeptid általuk történõ expressziója lehet az immunválasz beindításának mechanizmusa; ugyanakkor a dendritikus sejtek nem transzfektálhatók, ennek ellenére fontosak, mivel felvehetik az expresszált peptidet a szövet transzfektált sejtjeibõl [ keresztaktiválás, pl., Thomas AM, Santarsiero LM, Lutz ER, Armstrong TD, Chen YC, Huang LQ, Laheru DA, Goggins M, Hruban RH, Jaffee EM. Mesothelinspecific CD8(+) T cell responses provide evidence of in vivo cross-priming by antigen-presenting cells in vaccinated pancreatic cancer patients. J Exp Med. 04 Aug 2; 0(3):297 6]. Elõnyös, ha a vakcinát, úgymint a DNS-vakcinát izomba adják be, míg a peptidvakcinákat szubkután vagy intradermális módon elõnyös beadni. Preferált a vakcina bõrbe történõ beadása is. A nukleinsavtartalmú vakcina beadható adjuváns nélkül. A nukleinsavtartalmú vakcina beadható adjuvánssal is, például BCGvel vagy timsóval. Egyéb, alkalmas adjuváns lehet az Aquila QS21 stimulon (Aquila Biotech, Worcester, MA, USA), amely szaponinból készül, valamint a mikobaktériumkivonatok és szintetikus baktériumsejtfal-utánzatok, valamint védjegyzett adjuvánsok, mint például a Ribi Detox készítménye. Alkalmazható a Quil A is, amely egy másik szaponinszármazék adjuváns (Superfos, Dánia). Elõnyös, ha a nukleinsavtartalmú vakcina adjuváns nélkül kerül beadásra. Hasznosak lehetnek még egyéb adjuvánsok, például a Freund-adjuváns is. Hasznos lehet, ha a peptidet lyukas csigákból származó hemocianinnal konjugálva adják be, lehetõleg szintén adjuvánssal együtt. A rák polinukleotid által közvetített immunizációs terápiájáról számolnak be a következõ szerzõk: Conry et al (1996) Seminars in Oncology 23, 1 147; Condon et al (1996) Nature Medicine 2, ; Gong et al (1997) Nature Medicine 3, 8 61; Zhai et al (1996) J. Immunol. 6,700 7; Graham et al (1996) Int J. Cancer 6, ; valamint Burchell et al (1996) pp In: Breast Cancer, Advances in biology and therapeutics, Calvo et al (eds), John Libbey Eurotext; ezeket a közlemények teljes tartalmára való hivatkozásként soroltuk fel. Hasznos lehet az is, ha a vakcinával specifikus sejtpopulációkat (például az antigénprezentáló sejteket) célzunk meg, akár a befecskendezés helyének a megválasztásával, akár célzóvektorok és hatóanyag-leadó rendszerek használatán keresztül, vagy egy, a betegbõl származó ilyen sejtpopuláció szelektív tisztítása, és a peptid vagy nukleinsav ex vivo alkalmazása útján [például a dendritikus sejtek szétválogatásának módszerét lásd: Zhou et al. (199) Blood 86, ; Roth et al. (1996) Scand. J. Immunology 43,646 61]. A célzóvektorok tartalmazhatnak például olyan szövetvagy tumorspecifikus promotert, amely egy alkalmas helyen szabályozza az antigén expresszióját. A találmánynak egy további része egy olyan rákellenes vakcinára vonatkozik, amely a közzététel szerinti említett egy vagy több peptidet tartalmaz. Ez a készítmény alkalmazható parenterálisan, például szubkután, intradermális vagy intramuszkuláris módon, illetve orálisan is beadható. Ehhez a peptideket gyógyszerészeti szempontból elfogadható, lehetõleg vizes vivõanyagban feloldják vagy szuszpendálják. A készítmény ezenfelül tartalmazhat segédanyagokat: például puffereket, kötõanyagokat, dezintegráló- és térfogatkitöltõ anyagokat, ízesítõanyagokat, lubrikánsokat stb. A peptidek beadhatók immunstimuláló anyagokkal például citokinekkel együtt is. Az ilyen készítményekben használható segédanyagok kimerítõ listája megtalálható például a következõ kiadványban: A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3. Ed., 00, American Pharmaceutical Association and pharmaceutical press. A gyógyszerkészítmény alkalmazható adenomatózus vagy rákos megbetegedések prevenciójára, profilaxisára és/vagy terápiájára. A rákellenes vakcina amely tartalmazza a SEQ 1. azonosító szám szerinti, 16 teljes aminosavhosszúságú peptidet beadható olyan betegeknek, akik olyan adenomatózus vagy rákos megbetegedésben szenvednek, amely kapcsolatos az adott peptiddel vagy antigénnel. Ezzel beindítható egy CTL-specifikus immunválasz. A jelen találmány egy másik szempontjából a közzétett két vagy számos peptid együttesen vakcinaként alkalmazható, akár közvetlen kombinációban vagy ugyanabban a kezelési sémában. Ezen túlmenõen alkalmazható kombináció más peptidekkel is, például MHC I¹ vagy MHC II¹specifikus peptidekkel. A gyakorlatban jártas szakember tesztekkel ki tudja választani az immunogén peptidek preferált kombinációit, például a T¹sejtek in vitro keletkezésének vizsgálatával, illetve azok hatékonyságának és általános jelenlétének a vizsgálatával, vagy a bizonyos peptidekre aktiválódott egyes T¹sejtek proliferációjának, affinitásának és expanziójának a vizsgálatával, valamint a T¹sejtek funkcionalitásának a vizsgálatával például az IFN¹ (lásd még a lenti példákat is) termelõdésének elemzésével. A leghatékonyabb peptideket ezután rendszerint kombinációban alkalmazzák a vakcinában, a fentiekben bemutatott célok érdekében. A megfelelõ vakcina lehetõleg 1 peptidet, kedvezõ esetben 2, 3, 4,, 6, 7, 8, 9, vagy 11, még kedvezõbb esetben 6, 7, 8, 9, vagy 11, a legkedvezõbb esetben 11 különbözõ peptidet tartalmaz. A rákellenes vakcinában alkalmazandó peptid hosszát adhatja bármilyen alkalmas peptid. Nevezetesen lehet egy megfelelõ 9 alegységbõl álló peptid, vagy egy, vagy 11, vagy 12 alegységbõl álló peptid. Hosszabb peptidek is megfelelõek lehetnek, a mellékelt 1. táblázatban leírt 9 vagy alegységbõl álló peptidek preferáltak az MHC I peptidekhez. 14

15 A peptid(ek) egy tumor- vagy rákvakcinát képez(nek). Ez közvetlenül beadható a betegnek, az érintett szervbe vagy szisztémásan, vagy ex vivo alkalmazható a betegbõl származó sejteken vagy egy humán sejtvonalon, amelyet azután beadnak a betegnek, illetve alkalmazható in vitro a betegbõl származó immunsejtek valamely alpopulációjának a kiválasztására, amelyet azután ismét beadnak a betegnek. A peptid konjugálható egy megfelelõ hordozóval is, például lyukas csigákból származó hemocianinnal (KLH) vagy mannánnal [lásd WO 9/1814 és Longenecker et al (1993) Ann. NY Acad. Sci. 690, ]. A peptidtartalmú vakcina beadható adjuváns nélkül. A peptidtartalmú vakcina beadható adjuvánssal is, például BCGvel vagy timsóval. Egyéb, alkalmas adjuváns lehet az Aquila QS21 stimulon (Aquila Biotech, Worcester, MA, USA), amely szaponinból készül, valamint a mikobaktériumkivonatok és szintetikus baktériumsejtfal-utánzatok, valamint védjegyzett adjuvánsok, mint például a Ribi Detox készítménye. Alkalmazható a Quil A is, amely egy másik szaponinszármazék adjuváns (Superfos, Dánia). Hasznosak lehetnek még egyéb adjuvánsok, például a Freund-adjuváns is. Hasznos lehet, ha a peptidet lyukas csigákból származó hemocianinnal konjugálva adják be, lehetõleg szintén adjuvánssal együtt. A peptid lehet jelölt vagy fúziós protein, vagy hibrid molekula is. A jelen találmányban megadott szekvenciájú peptidek várhatóan stimulálják a CD8 + CTL-sejteket. A stimuláció azonban hatékonyabb, ha a folyamatot segítik a jelen lévõ CD4 + T¹sejtek. Így a hibrid molekulák fúziós partnere vagy szakaszai olyan megfelelõ epitópokat szolgáltatnak, amelyek stimulálják a CD4 + T¹sejteket. A CD4 + stimuláló epitópok a szakmában közismertek, és idetartoznak például a tetanusz toxoidban azonosított epitópok is. A találmánynak megfelelõ, peptidtartalmú vakcina egy különösen elõnyös alkalmazásában az említett vakcina egy több peptidet tartalmazó tumorellenes vakcina, amely a vesesejtes karcinóma kezelésére szolgál. Ideális esetben az említett vakcina egy a SEQ azonosító számnak megfelelõ tumorasszociált peptidkészletet tartalmaz, amelyek a primer veseráksejteken találhatók meg, illetve ezeken azonosították õket. Ez a készlet HLA I és HLA II peptideket tartalmaz. A peptidkészlet tartalmazhat még legalább egy peptidet például a HBV mag antigént amely pozitív kontroll peptidként használható, immunmarkerként szolgálva az intradermális alkalmazás hatékonyságának a tesztelésére. Egy speciális alkalmazási módban a vakcina 11 egyedi peptidbõl áll (a SEQ azonosító szám szerint), minden egyes peptid esetén körülbelül 00 g és7 g közötti, kedvezõ esetben körülbelül 00 g és 70 g közötti, még kedvezõbb esetben körülbelül 00 g és0 g közötti, a legkedvezõbb esetben körülbelül 78 g mennyiségben, amelyek mindegyike HPLC-vel és ioncserélõ kromatográfiával tisztítható, megjelenése fehér-törtfehér por. A liofilizátumot lehetõleg nátrium-hidrogén-karbonátban oldják, és szobahõmérsékleten történõ oldódása után percen belül intradermális injekcióként alkalmazzák A jelen találmány szerint a peptidek preferált mennyisége körülbelül 0,1 0 mg között változhat, kedvezõ esetben körülbelül 0,1 1 mg között, a legkedvezõbb esetben 00 l oldatban körülbelül g között. Itt a körülbelül kifejezés az adott érték ± százalékát jelenti, kivéve, ha ezt másképp adjuk meg. A szakember számos tényezõ például az adott beteg immunrendszerének állapota és/vagy az adott típusú rákban prezentált TUMAP mennyisége alapján képes arra, hogy módosítsa az alkalmazandó peptid valós mennyiségét. A jelen találmány tárgyát képezõ peptidek a liofilizátum helyett egyéb, megfelelõ formában is (steril oldatok stb.) alkalmazhatók. A jelen találmányban megadott szekvenciájú egyes peptidek várhatóan stimulálják a CD8-pozitív T¹sejteket (CTL). A stimuláció azonban hatékonyabb, ha a folyamatot segítik a jelen lévõ CD4-pozitív T¹sejtek. Így a hibrid molekulák fúziós partnere vagy szakaszai olyan megfelelõ epitópokat szolgáltatnak, amelyek stimulálják a CD4-pozitív T¹sejteket. A CD4-pozitív stimuláló epitópok a szakmában közismertek, és idetartoznak például a tetanusz toxoidban azonosított epitópok, illetve a találmányban bemutatott, MMP7-bõl származó peptid is. Végezetül megemlítendõ, hogy a találmány szerinti vakcina összetétele függhet a kezelendõ beteg konkrét ráktípusától, valamint a betegség státusától, a korábbi kezelési sémáktól, a beteg immunrendszerének állapotától, és természetesen a beteg HLA-haplotípusától. A találmány tárgyát képezõ vakcina tartalmazhat továbbá egyedi összetevõket az adott beteg személyes igényeinek megfelelõen. Példák az említett, adott betegben a vonatkozó TAA¹k expressziója alapján a peptidek különbözõ mennyiségei, a nemkívánatos mellékhatások személyes allergia vagy egyéb kezelések miatt, valamint az elsõ kezelési ciklust vagy sémát követõ másodlagos kezelések módosításai. A jelen találmány egy további része a találmány szerinti vakcina felhasználása egy olyan gyógyszer gyártása során, amely alkalmazható a betegekben az olyan célsejtek elpusztítására, amelyek kórosan egy, a találmány szerinti aminosavszekvenciát tartalmazó polipeptidet expresszálnak. Meglepõ módon a jelen találmánnyal kapcsolatban arra derült fény, hogy szemben ugyanazon szövet egészséges sejtjeivel, a tömör tumorok tumorsejtjei felületükön humán HLA II molekulákat expresszálnak. Ezt a tényt még csak egyszer írták le, méghozzá Brasanac és munkatársai [Brasanac D, Markovic-Lipkovski J, Hadzi-Djokic J, Muller GA, Muller CA. Immunohistochemical analysis of HLA class II antigens and tumor infiltrating mononuclear cells in renal cell carcinoma: correlation with clinical and histopathological data. Neoplasma. 1999; 46(3):173 8.], akik 37 vesesejtes karcinóma (RCC) kriosztátos metszeteit 2 világossejtes típust, granulárist és 2 kromofóbot tanulmányozták indirekt immunperoxidáz módszerrel, monoklonális antitesteket (MoAb) alkalmazva HLA¹DR, ¹DP és ¹DQ antigénekre a HLA II antigének elemzése céljából, valamint anti-cd14, ¹CD3, ¹CD4 és ¹CD8 MoAb¹ot

16 2 4 0 a tumorinfiltráló mononukleáris sejtek (TIM) vizsgálatához. A pozitív sejtek számát szemikvantitatív módszerrel becsülték meg, és az immunhisztokémiai vizsgálat eredményeit összevetették az RCC klinikai (betegek kora, neme, a tumor mérete és TNM-beosztása) és kórszövettani (citológia, szövettan, grádus) jellemzõivel. Valamennyi RCC expresszált olyan HLA¹DR 92%¹uk ¹DQ és 73%¹uk ¹DP antigéneket, amelyek expressziós szintje megfelel a DR>-DQ>¹DP hierarchiának, de statisztikailag jelentõs korreláció nem volt megállapítható egyik elemzett hisztopatológiai vagy klinikai paraméterrel sem. Monociták nagyobb számban voltak jelen, mint T¹limfociták, és több volt a CD4+, mint a CD8+ T¹sejt, míg a legnagyobb átlagos átmérõvel a T¹limfocita predominanciájú, valamint CD4+ és CD8+ T¹sejteket megközelítõleg egyenlõ számban tartalmazó tumorok rendelkeztek. A T¹limfociták tumorsejtek általi nem megfelelõ aktiválása (az antigénprezentációra való képesség dacára) lehet az oka a paraméterek olyan együttállásának, ami agresszívebb viselkedésû tumorra utal, az RCC¹n aberráns HLA II antigénexpresszióval. A találmány további részei aktivált T¹limfociták in vivo vagy in vitro létrehozására szolgáló módszerek, amelyek közül az elsõ módszerben a T¹sejteket egy alkalmas, antigénprezentáló sejt felszínén expresszált, antigénnel kapcsolt humán MHC I vagy MHC II molekulákkal hoznak érintkezésbe annyi ideig, ami elégséges az antigénspecifikus aktiváláshoz, ahol az említett T¹sejt, amelyben az antigén a bemutatott peptid. A második, elõnyösebb módszer, amelyet Walter és munkatársai írtak le [Walter S, Herrgen L, Schoor O, Jung G, Wernet D, Buhring HJ, Rammensee HG, Stevanovic S. Cutting edge: predetermined avidity of human CD8 T cells expanded on calibrated MHC/anti- CD28-coated microspheres. J Immunol. 03 Nov ; 171():4974 8]. Az MHC II molekulák expresszálódhatnak bármilyen alkalmas sejt felszínén; és kedvezõbb, ha a sejt természetes körülmények között nem expresszál MHC II molekulákat (ebben az esetben a sejtet transzfektálják, hogy ilyen molekulát expresszáljon), vagy ha mégis, akkor ez az antigénfeldolgozás vagy az antigénprezentálás tekintetében defektív. Ilyen módon lehetõvé válik, hogy az MHC II molekulákat expresszáló sejt lényegében teljesen aktiválódjon egy kiválasztott peptidantigén hatására, még a CTL aktiválása elõtt. Az antigénprezentáló sejt (vagy stimulátorsejt) felszínén tipikusan egy MHC I vagy MHC II molekula található, és az esetek többségében lényegében képtelen önmaga megtölteni az említett MHC I vagy MHC II molekulát a kiválasztott antigénnel. Amint azt az alábbiakban részletesen tárgyaljuk, az MHC I vagy MHC II molekula in vitro könnyen megtölthetõ a kiválasztott antigénnel. Kedvezõ esetben az emlõssejtbõl hiányzik a TAP peptidtranszporter, vagy az csak kis mennyiségben, vagy korlátozott funkcionalitással van jelen. TAP petidtranszportert nem tartalmazó, megfelelõ sejt például a T2, az RMA¹S és a Drosophilasejt. A TAP az antigénfeldolgozáshoz kapcsolódó transzporter rövidítése (Transporter Associated with antigen Processing). A humán peptidkötésre képtelen T2 sejtvonal beszerezhetõ az American Type Culture Collectiontõl (121 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 82, USA) a CRL 1992¹es katalógusszámon; a Drosophila Schneider line 2 sejtvonal beszerezhetõ az ATCC-tõl a CRL 19863¹as katalógusszámon; az egér RMA¹S sejtvonal leírását lásd: Karre és Ljunggren (198) J. Exp. Med. 162,174. Az említett gazdasejt ideális esetben a transzfekció elõtt gyakorlatilag nem expresszál MHC I molekulát. Szintén elõnyös, ha a stimulátorsejt expresszál valamely, a T¹sejt kostimulációjában fontos molekulát, például a B7.1, a B7.2, az ICAM¹1 vagy az LFA 3 bármelyikét. Egy további alkalmazási lehetõség a HLA molekulák kombinációinak használata. A rekombináns poliepitóp vakcinák használatát a többszörös CD8-pozitív CTL-epitópok bejuttatására Thomson és munkatársai (1996) írják le (J. Immunol. 7, és WO 96/03144), mindkét publikációjukat hivatkozásként szerepeltetjük. A jelen találmánnyal kapcsolatban megemlítendõ, hogy kívánatos és elõnyös egyetlen vakcinában kombinálni egy olyan peptidet (vagy egy peptidet kódoló nukleinsavat), amelyben a peptid bármilyen sorrendben tartalmaz egy bemutatott aminosavszekvenciát, valamint egy másik, CD4- pozitív T¹sejtstimuláló epitópot (mint például az MMP7- bõl származót). Egy ilyen vakcina rendkívül hasznos lenne a rákos betegségek kezelésében. Több más módszer is alkalmazható a CTL¹ek in vitro generálására. A Peoples és munkatársai (199, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, ), illetve Kawakami és munkatársai (1992, J. Immunol. 148, ) által leírt módszerek például autológ tumorinfiltráló limfocitákat használnak a CTL¹ek generálásához. Plebanski és munkatársai (199, Eur. J. Immunol. 2, ) autológ, perifériás vérbõl származó limfocitákat (PLB) alkalmaznak a CTL¹ek generálásához. Jochmus és munkatársai (1997, J. Gen. Virol. 78, ) az autológ CTL¹ek generálásához peptiddel vagy polipeptiddel kezelt, illetve rekombináns vírussal infektált dendritikus sejteket alkalmaznak. Hill és munkatársai (199, J. Exp. Med. 181, ), valamint Jerome és munkatársai (1993, J. Immunol. 1, ) a B¹sejteket használják fel az autológ CTL¹ek generálásához. Ezenfelül peptiddel vagy polipeptiddel kezelt, vagy rekombináns vírussal infektált makrofágok is használhatók autológ CTL¹ek generálására. A CTL¹ek elõkészítésében allogén sejtek is használhatók: ezt az eljárást részletesen a WO 97/26328 írja le. A Drosophilasejteken és a T2¹sejteken kívül például más sejtek is használhatók antigének prezentálására: ilyenek a CHO-sejtek, bakulovírussal infektált rovarsejtek, baktériumok, élesztõsejtek, vakcíniával infektált célsejtek. Ezen túlmenõen növényi vírusok is használhatók [lásd például a tehénborsó-mozaikvírus, mint az idegen peptidek prezentálásában nagy teljesít- 16

17 2 4 0 ményû rendszer leírását: Porta et al. (1994) Virology 2, 449 9]. Ideális esetben a bemutatott módszerben az antigénprezentáló sejt tartalmaz egy expressziós vektort, lásd fentebb. A peptidek ellen irányított, aktivált T¹sejtek hasznosak a terápiában. Az aktivált T¹sejtek egy T¹sejt-receptort (TCR) expresszálnak, amelynek szerepe van az abnormális polipeptidet expresszáló sejtek felismerésében. Hasznos, ha a TCR¹t kódoló cdns¹t az aktivált T¹sejtekbõl klónozzák, és azt az expresszió céljából egy másik T¹sejtbe viszik át. A CD4-pozitív T¹sejtek célsejtjei in vivo lehetnek a tumor sejtjei (amelyek néha MHC II molekulákat expresszálnak) és/vagy a tumort körülvevõ strómasejtek (daganatsejtek) (amelyek néha szintén expresszálnak MHC II molekulákat). A találmány szerinti peptidekre specifikus, T¹sejtklónok TCR-eit klónozzák. A T¹sejtklónokban a TCR használatának meghatározása (i) a TCR variábilis régióspecifikus monoklonális antitestek használatával, illetve (ii) a Va és Vp géncsaládokra specifikus primerekkel RT¹PCR (reverz transzkriptáz polimeráz-láncreakció) használatával történik. A T¹sejtklónokból kivont poli¹a mrns-bõl cdns-könyvtár készül. A TCR a¹ és P¹láncok C¹terminális részére, valamint az azonosított Va¹ és P¹szegmensek N¹terminális részére specifikus primereket használnak. A TCR a¹ és P¹lánc teljes cdns¹ét nagy pontosságú DNS-polimerázzal amplifikálják, és az amplifikált termékeket megfelelõ klónozóvektorba klónozzák. A klónozott a¹ és P¹láncok génjeit be lehet építeni egy egyláncú TCR¹be a Chung és munkatársai (1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, ) által leírt módszerrel. Ebben az egyláncú konstrukcióban a VaJ-szegmentumot a V DJ¹szegmentum követi, majd a Cp¹szegmentum, majd a CD3- lánc transzmembrán és citoplazmatikus szegmentuma. Ezt az egyláncú TCR¹t ezután beépítjük egy retrovirális expressziós vektorba (egy vektorpanel használata azon alapul, hogy azok képesek¹e infektálni az érett humán CD8-pozitív T¹limfocitákat és közvetíteni a génexpressziót: a Kat retrovirális vektorrendszer egy preferált lehetõség [lásd: Finer et al. (1994) Blood 83, 43]. A Roberts és munkatársai (1994, Blood 84, ) által publikált protokoll szerint nagy titerû amfotróf retrovírust alkalmaznak a tumoros betegek perifériás vérébõl izolált, tisztított CD8-pozitív vagy CD4-pozitív T¹limfociták infektálására (további részletek a hivatkozásban megadott cikkben). Anti-CD3 antitesteket használnak a tisztított CD8-pozitív T¹sejtek proliferációjának kiváltására, ami elõsegíti a retrovirális integrációt és az egyláncú TCR¹ek stabil expresszióját. A retrovirális transzdukció eredményességét az infektált CD8-pozitív T¹sejteknek az egyláncú TCR¹re specifikus antitestekkel történõ megfestésével határozzák meg. A transzdukált CD8-pozitív T¹sejtek in vitro analízise alapján megállapítható, hogy azok képesek ugyanúgy tumorspecifikusan elpusztítani a sejteket, mint azon allokorlátozott T¹sejtklón, amelybõl a TCRláncokat eredetileg klónozták. A várt specificitású transzdukált CD8-pozitív T¹sejtpopulációk felhasználhatók a tumorban szenvedõ betegek átvett immunterápiájában. A betegek 8 11 autológ, transzdukált T¹sejttel kezelhetõk. A CD8-pozitív sejtek analógiájára generálni lehet hasonló konstrukciókat hordozó transzdukált, CD4-pozitív T¹helper sejteket is. A gének T¹sejtekbe történõ bejuttatására alkalmas további rendszereket Moritz és munkatársai írják le (1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, , további részletek a hivatkozásban megadott cikkben). Eshhar és munkatársai (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7 724), valamint Hwu és munkatársai (1993., J. Exp. Med. 178, ) szintén leírják a T¹sejtek transzfekcióját. Ennélfogva egy olyan TCR¹t mutatunk be, amely felismeri azokat a sejteket, amelyek kórosan expresszálnak egy, a találmány szerinti aminosavszekvenciát tartalmazó polipeptidet, és a TCR kinyerhetõ az aktivált T¹sejtekbõl. A TCR mellett a TCR-rel funkcionálisan egyenértékû molekulákat is bemutatunk. Ezek magukban foglalnak minden olyan molekulát, amely funkcionálisan egyenértékû a TCR-rel, vagyis képes azzal azonos funkciót ellátni. Nevezetesen, az ilyen molekulák közé tartoznak a Chung és munkatársai (1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, , amelyre fent már történt utalás; további részletek a hivatkozásban megadott cikkben) által leírt módszerrel létrehozott, genetikailag átalakított, három domént tartalmazó, egyláncú TCR¹ek. A találmány magában foglal továbbá egy, a TCR¹t vagy egy funkcionálisan azzal egyenértékû molekulát kódoló polinukleotidot és annak egy, a TCR¹t vagy egy funkcionálisan azzal egyenértékû molekulát kódoló expressziós vektorát. A találmány szerinti TCR expressziójára alkalmas expressziós vektorok lehetnek például a peptidek expressziójával kapcsolatban fentebb leírt expressziós vektorok. Elõnyös azonban, ha az expressziós vektorok képesek a transzfekció után a T¹sejtekben a TCR expresszálására is. Az antigénprezentáló sejtek lehetõleg dendritikus sejtek legyenek. Az alkalmas dendritikus sejtek autológ, antigénpeptiddel kezelt dendritikus sejtek. Az antigénpeptid lehet bármilyen, megfelelõ T¹sejtválaszt kiváltó antigénpeptid. A tumorasszociált antigénbõl származó peptidekkel kezelt autológ dendritikus sejteket alkalmazó T¹sejt-terápiát Murphy és munkatársai (1996, The Prostate 29, ), valamint Tjua és munkatársai (1997., The Prostate 32, ) írják le. Egy további alkalmazás, hogy az antigénprezentáló sejteket (például a dendritikus sejteket) a találmány szerinti peptidet kódoló polinukleotiddal hozzák érintkezésbe. A polinukleotid lehet bármilyen alkalmas polinukleotid, amely kedvezõ esetben képes a dendritikus sejt transzdukálására, ami egy peptid prezentációját és az immunitás indukálását eredményezi. Az is megfelelõ, ha a polinukleotidot egy virális polinukleotid vagy egy vírus tartalmazza. Kimutatták például a MUC1 vonatkozásában, hogy az adenovírus által transzdukált dendritikus sejtek antigénspecifikus tu- 17

18 2 4 0 morellenes immunitást indukálnak [lásd Gong et al. (1997) Gene Ther. 4,23 28]. Hasonlóképpen alkalmazhatók adenovírusalapú rendszerek [lásd például: Wan et al. (1997) Hum. Gene Ther. 8, 1363]; vagy retrovirális rendszerek [Specht et al. (1997) J. Exp. Med. 186, és Szabolcs et al (1997)]. Használható a vérösszetevõk által közvetített transzfer is a dendritikus sejtekhez [Tuting et al. (1997) Eur. J. Immunol. 27, ]; ezenfelül alkalmazható RNS is [Ashley et al. (1997) J. Exp. Med. 186, ]. A betegben lévõ célsejtek elpusztításának módszereire való tekintettel nyilvánvaló, hogy különösen kedvezõ, ha a célsejtek ráksejtek, ezen belül is elsõsorban vese- vagy vastagbélráksejtek. Egy kedvelt alkalmazás során a kezelés elõtt meghatározzák a beteg HLA-haplotípusát. A HLA-haplotipizálás bármely erre alkalmas módszerrel elvégezhetõ; e módszerek a szakmában közismertek. A találmány különösképpen kiterjed a benne leírt peptidek (vagy az azokat kódoló polinukleotidok) felhasználására az aktív in vivo vakcinálásban; az autológ dendritikus sejtek in vitro manipulációjában, amelyet az így manipulált dendritikus sejtek in vivo beadása követ a T¹sejtválasz kiváltása céljából; az autológ T¹sejtek in vitro aktiválásában, amelyet átvett terápia követ (azaz az így manipulált T¹sejteket beadják a betegnek); és az egészséges donoroktól származó (MHC egyezik vagy nem egyezik) T¹sejtek in vitro aktiválásában, amelyet átvett terápia követ. A találmány alkalmazásának preferált módja, ha a jelen találmány szerinti vakcinákat akár önmagukban, akár más, a tumorok képzõdését gátló vagy megszüntetõ rákterápiával kombinálva adják be a gazdaszervezetbe. A peptidtartalmú vakcina beadható adjuváns nélkül. A peptidtartalmú vakcina beadható adjuvánssal is, például BCG-vel vagy timsóval. Egyéb alkalmas adjuvánsokat is ismertetünk a fentiekben. A mellékelt 1. táblázat felsorolja az azonosított peptideket. Ezenkívül a táblázat feltünteti azon fehérjéket, amelyekbõl a peptidek származnak, valamint az adott peptid pozícióját az adott fehérjében. Ezen túlmenõen megadjuk a National Institute of Health National Centre for Biotechnology Information génbank idevonatkozó hozzáférési számait (lásd http: A találmány alkalmazásának egy másik preferált módja, amikor a peptideket leukociták különösen a T¹limfociták megfestésére alkalmazzák. Ez a felhasználási mód rendkívül elõnyös, ha azt kell igazolni, hogy valamely CTL-populáción belül jelen vannak¹e egy peptid ellen irányuló specifikus CTL¹ek. Ezenfelül a peptid markerként is használható adenomatózus vagy rákos megbetegedésekben vagy rendellenességekben a terápiás progresszió megállapítására. A találmány alkalmazásának egy további preferált módja, amikor a peptideket egy antitest termelése céljából használják fel. Poliklonális antitestek nyerhetõk hagyományos módon állatok immunizációja útján, amikor a peptidet befecskendezik az állatba, majd a keletkezõ immunglobulint kinyerik és tisztítják. Monoklonális antitestek elõállíthatók például a Methods Enzymolban (1986., 121, Hybridoma technology and monoclonal antibodies.) leírt standard protokollok szerint. A tumorasszociált antigének T¹helper sejt epitópjainak azonosítása továbbra is fontos feladat marad a tumorellenes immunterápiában. Mostanáig már számos különbözõ stratégiát leírtak a TAA-ból származó I. vagy II. osztályú peptidek meghatározására: ilyen például az APC¹k inkubálása az érintett antigénnel annak felvételének és feldolgozásának lehetõvé tétele érdekében [Chaux, P., V. Vantomme, V. Stroobant, K. Thielemans, J. Corthals, R. Luiten, A. M. Eggermont, T. Boon, and B. P. van der Bruggen Identification of MAGE¹3 epitopes presented by HLA¹DR molecules to CD4(+) T lymphocytes. J. Exp. Med. 189: ], illetve a különféle fúziós fehérjéket alkalmazó transzfekciós stratégiák (Dengjel, J., P. Decker, O. Schoor, F. Altenberend, T. Weinschenk, H. G. Rammensee, and S. Stevanovic. 04. Identification of a naturally processed cyclin D1 T¹helper epitope by a novel combination of HLA class II targeting and differential mass spectrometry. Eur. J. Immunol. 34: ). E módszerek mindegyike igen idõigényes, és gyakran tisztázatlan marad, hogy az azonosított HLA-ligandokat az emberi szövetek valóban prezentálják¹e in vivo. A feltalálók azonosítottak egy ligandot, amely az MMP7 egyik alapszekvenciájáért felelõs. A feltalálók eredményei alapján ez a fehérje túlzott mértékben expresszálódik a vesesejtes karcinómákban, illetve tumorasszociált fehérjeként írták le (Miyamoto, S., K. Yano, S. Sugimoto, G. Ishii, T. Hasebe, Y. Endoh, K. Kodama, M. Goya, T. Chiba, és A. Ochiai. 04. Matrix metalloproteinase¹7 facilitates insulin-like growth factor bioavailability through its proteinase activity on insulinlike growth factor binding protein 3. Cancer Res. 64:66 671; Sumi, T., T. Nakatani, H. Yoshida, Y. Hyun, T. Yasui, Y. Matsumoto, E. Nakagawa, K. Sugimura, H. Kawashima, és O. Ishiko. 03. Expression of matrix metalloproteinases 7 and 2 in human renal cell carcmoma. Oncol. Rep. :67 70). Ez a peptid válogatás nélkül kötõdött a HLA II molekulákhoz, és képes volt a különbözõ egészséges donoroktól származó CD4-pozitív T¹sejtek aktiválására. Ennélfogva a feltalálók megközelítése hasznos lehet a klinikai vakcinációs protokollokban alkalmazható, TAA-ból származó új, II. osztályú peptidjelöltek azonosítására. Most a találmány részletesebb leírása következik, hivatkozással az alábbi ábrákra, a szekvencialistára és a példákra. A következõ példák csak szemléltetõ célt szolgálnak, tehát a találmány nem korlátozódik csupán ezekre. A SEQ 1 2. azonosító szám szerinti szekvenciák MHC I vagy MHC II által prezentált peptideket tartalmazó T¹sejt epitópok peptidszekvenciáit mutatják be. A SEQ azonosító szám szerinti szekvenciák a jelen találmány szerinti vakcinában használt peptidek peptidszekvenciáit mutatják be. 18

19 2 4 0 Az 1. ábra az RCC013 primer tumormintán az IMA- MET-001 prezentációját mutatja be. Az RCC013-ról leoldott peptideken ESI MS nanokapilláris, nagy teljesítményû folyadékkromatográfiát végeztek. Az 06,4±0, Da tömegkromatogramja 47,8 perces retenciós idõnél mutat egy csúcsot. Az ütköztetéssel kiváltott bomlási tömegspektrum az m/z 06,4-bõl amelyet az adott retenciós idõnél egy második LC¹MS-ben rögzítettek, és amely a mellékletben látható igazolta az IMA-MET-001 jelenlétét (Weinschenk 02). A 2. ábra a c¹met protoonkogén (MET) szöveti expresszióját ábrázolja. Az expressziót oligonukleotid csip módszerrel analizáltuk. A másolatok számát a veséhez viszonyítjuk, amelyet 1,0¹re állítottunk be. A statisztikai abszolút döntési algoritmusnak megfelelõen a P azt jelenti, hogy a gén jelen van; az A azt, hogy hiányzik és az M azt, hogy marginálisan van jelen. Az I azt jelenti, hogy a gén szignifikánsan fokozott mértékben van jelen a veséhez képest, a D csökkent expressziót jelent, az NC pedig azt, hogy nincs változás az expresszióban. Az expressziós értéket a veséhez viszonyítva a logaritmikus jelarányból számítottuk ki, és az oszlopok tetején tüntettük fel. A szaggatott vízszintes vonal mutatja a normálszövetekben megfigyelt legnagyobb expressziót (ebben az esetben a tüdõben). A 3. ábrán látható a peptiddel megtöltött célsejtek elpusztítása az IMA-MET-001 által aktivált CTL-sejtek által. A 4. ábrán látható a malignus sejtek elpusztítása az IMA-MET-001 által aktivált CTL-sejtek által. Az. ábra mutatja be a hideg célgátlásos vizsgálatot. A 6. ábrán látható a mikrogyöngy által irányított expanzió tetramer analízise. A 7. ábrán látható az IMA-MMP-001 in vitro immunogenitását reprezentatív intracelluláris IFN-gamma összevetve négy egészséges donor CD4 festéseivel. Az 1., a 2. és a 3. donornál a harmadik és negyedik stimulálás után kimutathatók voltak az MMP-001-gyel szemben reaktív CD4-pozitív T¹sejtek. A 4. donornál mindig negatív volt az eredmény. A 8. ábrán látható a differenciált peptidprezentáció a tumoron és az egészséges szöveten (A) Normál vesébõl és az RCC 0¹as beteg vesesejtes karcinómaszövetébõl származó két peptidfajta m/z 739,96, illetve 741,9 tömegspektruma. A tömegspektrum az adipofilin-peptidnek körülbelül négyszeresen emelkedett prezentációját mutatja a vesesejtes karcinómában, szemben a megfelelõ autológ normálszövettel (B). Az m/z 741,9 (tumor) ütköztetéssel kiváltott bomlási tömegspektrometria analízise felfedte az IMA-ADF-003 peptidszekvenciát, ami az adipofilinbõl származik. A 9. ábrán látható az IMA-ADF-001-gyel szembeni, in vivo immunitás T¹sejtes immunitás számos nem vakcinált peptiddel szemben 2 olyan RCC¹s betegben, akiket MUC-bõl származó két TUMAP-pal kezelt autológ dendritikus sejtekkel vakcináltak. Az IMA-ADF-001¹re ( adipofilin ) specifikus T¹sejtek nem voltak jelen a vakcináció elõtt, és 6 vakcináció után kimutathatók voltak a 3. számú betegben (felsõ panel), míg 8 vakcináció után a 8. számú betegben (alsó panel). Példák Szószedet Fogalom vagy rövidítés AE AJCC BfArM CTL DC GM-CSF rhugm-csf HBV HLA IARC IMP INF MAA MHC RCC SAE SmPC TUMAP Leírás Nemkívánatos esemény American Joint Committee on Cancer Bundesinstitut für Arzneimittel und Medizinprodukte Citotoxikus T¹sejtek Dendritikus sejtek rhugm-csf (rekombináns humán granulocita-makrofág kolóniastimuláló faktor) Hepatitis B vírus Humán limfocita antigén International Agency for Research on Cancer Vizsgált gyógyszer Interferon Forgalombahozatali engedély iránti kérelem Fõ hisztokompatibilitási komplex Vesesejtes karcinóma Súlyos nemkívánatos esemény A termékjellemzõk összefoglalása Tumorasszociált peptid I. A peptidek jellemzõi A géntermékek expressziójára vonatkozó adatok, amelyekbõl az IMA peptidek származnak Egy belsõ besorolási rendszer szerint, fõként a génexpresszió analízise, a szakirodalom és egy olyan antigén amelybõl származó peptidet azonosítottunk ismert tulajdonságainak az adatbázisban történõ keresése alapján választottunk ki a primer RCC-szövetbõl azonosított peptideket, hogy azokat beépítsük az IMA vakcinába (lásd alább). Minden természetesen prezen- 19

20 tált peptid nagymértékben túlzott expressziót mutat a vesesejtes karcinómaszövetben, összehasonlítva a normál veseszövettel, valamint számos egyéb életfontosságú szervvel és szövettel. Egy ilyen szelekció szükséges ahhoz, hogy (1) olyan peptideket válasszunk ki, amelyek képesek erõsen specifikus T¹sejtek aktiválására a tumor felismerése céljából, amelyek azonban a többi szövetet nem ismerik fel, így minimálisra csökkenhet az IMA vakcináció által indukált autoimmunitás esélye, és (2) biztosítsuk, hogy egy betegcsoportban a tumorok többségét az indukált T¹sejtek felismerjék. Az IMA-ban az antigének amelyekbõl a peptidek származnak átlagos prevalenciája 68% (n=24 RCC¹s minta, túlzott expresszió az RCC-ben, szemben az életfontosságú szervekkel és szövetekkel), az egyes antigének esetén ez az érték 4 96% között van. Ez szignifikánsan nagyobb, mint a standard tumorantigének, például a Her-2/neu esetén (prevalencia: 2 %). A globális génexpressziós profilt a kereskedelemben elérhetõ nagy sûrûségû csip módszerrel (Affymetrix) készítettük el. Az RNS¹t izoláltuk a szövetekbõl, feldolgoztuk és nagy sûrûségû oligonukleotid csiphez hibridizáltuk. Festés és átmosás után a csipeket szkenneltük; a csipen az egyes foltok fluoreszcenciaintenzitása az oligonukleotid DNS-szekvenciájával megegyezõ gén expressziós szintjét képviselte. A csipeken számos oligonukleotid fedi az egyes gének szekvenciáját. Statisztikai szoftveres analízissel minden génre megkaphatók a két minta között a páronkénti relatív expressziós értékek. Egy állandó minta alapértékként történõ használatával a különbözõ mintákból származó összes adat normalizálása lehetõvé teszi a minták között az expressziós szintek relatív mennyiségi meghatározását. RNS-források a humán szövetekbõl a teljes RNS¹t kereskedelmi úton szereztük be (Ambion, Huntingdon, UK; Clontech, Heidelberg, Németország; Stratagene, Amsterdam, Hollandia, BioChain, Heidelberg, Németország). A számos egyénbõl származó teljes RNS¹t úgy kevertük össze, hogy az egyes egyénekbõl származó RNS¹t egyenlõen mértük ki. A minõséget és 2 a mennyiséget az RNA 00 Nano LabChip Kit (Agilent) használatával az Agilent Bioanalyzeren (Agilent, Waldbronn, Germany) ellenõriztük. Nagy sûrûségû oligonukleotid csip analízis a kettõs szálú DNS¹t összesen 8 g RNS-bõl szintetizáltuk SuperScript RTII (Life Technologies, Inc., Karlsruhe, Németország) és a primer (Eurogentec, Seraing, Belgium) használatával, az Affymetrix kézikönyv leírása szerint. In vitro transzkripció a BioArray High Yield RNA Transcript Labelling Kit (ENZO Diagnostics, Inc., Farmingdale, NY) alkalmazásával, fragmentálás, hibridizálás Affymetrix U133A vagy U133 Plus 2.0 GeneChipsen (Affymetrix, Santa Clara, CA) és festés sztreptavidin-fikoeritrinnel és biotinilált antisztreptavidin antitesttel (Molecular Probes, Leiden, Hollandia) a gyártó protokollja szerint (Affymetrix). Az Affymetrix GeneArray Scannert alkalmaztuk, és az adatokat a Microarray Analysis Suite.0 szoftverrel vagy a Gene- Chip operációs szoftverrel (GCOS) elemeztük. A normalizáláshoz az Affymetrix által biztosított 0, úgynevezett housekeeping gént alkalmaztunk. Alapértékként a vese expressziós értékeit vettük figyelembe a páronkénti összehasonlítások kiszámításához. Ennek megfelelõen minden, logaritmikus jelarányból kiszámított expressziós értéket a veséhez viszonyítottunk, amelyet 1¹re állítottunk be. A differenciális expresszió szignifikanciáját a szoftverbe épített statisztikai algoritmusok változás értékeivel ítéltük meg. Az expresszió abszolút detektálásához az adatokat ismét elemeztük a statisztikai algoritmusok használatával. A génexpresszió jelenlétét vagy hiányát az abszolút döntési algoritmusokkal határoztuk meg. A 2. ábrán látható példa egy szöveti expressziós panel a c¹met protoonkogén (MET) génexpressziójára. Az analizált vesesejtes karcinómák (n=24, a jobb oldalon) 96%-ában a MET túlzott mértékû expressziója volt megfigyelhetõ, ugyanakkor számos kiválasztott, életfontosságú egészséges szövetben és szervben, valamint immunológiailag fontos szövetekben és sejtekben nem, vagy jóval kisebb mértékû expresszió látható (a 2. ábra bal oldalán). Az 1. táblázat tartalmazza a találmány szerinti IMA vakcinában lévõ peptideket. 1. táblázat Peptidek Belsõ szekvenciaazonosító Antigén Szekvencia SEQ azonosító szám IMA-MMP-001 Mátrix metalloproteináz 7 SQDDIKGIQKLYGKRS 1 IMA-ADF-002 Adipofilin VMAGDIYSV 2 IMA-ADF-001 Adipofilin SVASTITGV 3 IMA-APO-001 Apolipoprotein L1 ALADGVQKV 4 IMA-CCN-001 Ciklin D1 LLGATCMFV IMA-GUC-001 GUCY1A3 SVFAGVVGV 6 IMA-K KIAA0367 ALFDGDPHL 7 IMA-MET-001 c-met protoonkogén YVDPVITSI 8 IMA-MUC-001 MUC1 STAPPVHNV 9