Sántha Péter Sejtek: a szervezet morfológiai és funkcionális alapegységei

Átírás

1 Sejtélettan - membránfiziológia A sejtmembrán felépítése és funkciói. Transzportfolyamatok. Sántha Péter Sejtek: a szervezet morfológiai és funkcionális alapegységei Plazmamembrán (sejtmembrán): határhártya a intracelluláris és az extracelluláris folyadékterek között Folyamatos anyag-, energia- és információ áramlás a membránon keresztül ( Interface ) Plazmamembrán rendkívül dinamikus rendszer A gyógyászatban használt hatóanyagok túlnyomó része befolyásolja a sejtmembrán funkcióit pl.: helyi érzéstelenítők, általános érzéstelenítők, antiepileptikus és anitarrhythmiás szerek, vízhajtók, pszichoaktív hatóanyagok, stb. 1

2 A plazmamembrán klasszikus fluid mosaic modellje (Singer és Nicholson, 1972 ) Schmidt/Thews: Physiologie des Menschen 27. Auflage 1997 A plazmamembrán felépítése I. lipidek - lipoidok Amphiphyl lipid molekulák által képzett lipid kettősréteg: foszfolipidek: foszfatidilkolin, foszfatidilszerin, foszfatidiletanolamin, stb. sphingomyelin glikolipidek: gangliozidok koleszterin Spontán membrán képződés (mesterséges membránok) + micellák, liposzómák A lipidmembrán permeabilitása: hirofób anyagok >> hidrofil anyagok Plaszticitás: deformáció, lefűződés, összeolvadás Lipid Raft -ok: koleszterinben és glikolipidekben gazdag membrán szigetek (raftok): Detergent Resistant Lipid Microdomain 2

3 Mesterséges lipid membrán és lipid struktúrák Detergensek megbontják a struktúrák integritását (pl. vörösvértest hemolízis) A plazmamembrán lipid komponenseinek aszimmetrikus megoszlása 3

4 A lipid raftok Jelentőségük: platform egyes fehérjék felszíni sűrűségének növelésére, fehérje komplexek kialakulására és stabilizálására (jelátvitel, endo-/exocitózis, stb.) A plazmamembrán alkotói II. - fehérjék (a tömeg 25-70%-a) A fehérjék hidrofób aminosav oldalláncai és a zsírsav láncok közötti apoláros kölcsönhatások rögzítik az integráns membrán fehérjéket -transzmembrán domének hidrofób aminosav oldalláncok dominálnak (Val, Leu, Ile stb.) A membrán fehérjék (és a lipoidok) transzport vezikulák segítségével recirkulálna Intracelluláris transzport folyamatok biztosítják a fehérjék célzott mozgását Trafficking, transzlokáció Laterális diffúzió: a membrán alkotó molekulák mozgása a membrán síkjában Single Particle Imaging/Tracking de: a laterális diffúziót különböző kölcsönhatások akadályozhatják: más membrán fehérjék, citoszkeleton, membránszkeleton ( Confinement ) 4

5 Példa: az 1. típusú glükóz transzporter (GLUT-1) szerkezete A 12 transzmembrán domén helikális szerekzetében a hidrofób aminósavak dominálnak A vörösvértestek membránszkeletonja Funkciók: A sejtek alakjának biztosítása, polaritás biztosítása (pl. epithel sejtek) Sejt szintű mozgásformák Intracelluláris transzport (citózisok, trafficking) 5

6 A membrán fehérjék mozgásának mikroszkópos vizsgálatának eredményei A membránfehérjék életciklusa Fehérjék transzlokációja Stimulus által kiváltott transzlokáció (pl. TRPV1 ioncsatorna) konfokális live cell imaging 6

7 A sejtmembrán funkciói: Diffúziós barrier korlátozott (szabályozott) anyagtranszport Elektromos szigetelés - ellenállás és kapacitás is egyben Kommunikáció jel felfogás és továbbítás (receptorok, ioncsatornák, másodlagos hírvivők) Sejt identitás sejt-specifikus makromolekulák (pl.:mhc, vércsoport antigének) Sejtek közötti kapcsolatok - sejtadhéziós molekulák (pl.: immun válasz, gyulladás) Metabolikus jelentőség - membrán eredetű lipid mediátorok : phosphatidil inozitol (IP3) diacylglycerol, (inozitol trifoszfát) arachidonsav: prosztaglandinok, leukotriének, endogén cannabinoidok Anyagáramlás a IC és az EC folyadéktér között transzmembrán transzport folyamatok Szabad diffúzió Ioncsatornán és pórusokon keresztül történő transzport Facilitált diffúzió (karrier/transzporter mediált passzív transzport) Karrier-mediált aktív transzport (pumpák) Exo- és endocytózis (vezikuláris transzport) Transzepitheliális transzport (később pl. a vese élettana kapcsán) 7

8 Szabad transzmembrán diffúzió Diffúzió: részecskék passzív mozgása folyadékkal vagy gázzal kitöltött terekben Hajtóerő: koncentráció különbségek (+ ionok esetében elektrosztatikus erők) - tendencia a helyi koncentráció különbségek kiegyenlítésére Kinetikai leírás (a diffúzió sebessége): Fick diffúziós törvénye Diffúziós modell (biológiai membránokra alkalmazva): 2 kompartment, permeábilis barrierrel elválasztva Fick törvénye: dm/dt = -D x c x A/d dm/dt: diffúzió sebessége D: diffúziós konstans A: diffúziós felszín d: diffúziós membrán vastagsága c: koncentráció különbség Élettani jelentőség: Sejtélettan + légzési gáztranszport (alveolus) mikrocirkuláció (endothél) enterális tápanyagfelszívódás stb. Schmidt/Thews: Physiologie des Menschen 27. Auflage

9 A lipid kettősréteg permeabilitása Diffúziós konstans függ: hőmérséklettől A diffundáló anyag és a diffúziós barrier fiziko-kémiai tulajdonságaitól: Zsír- és vízoldékonyság (víz/olaj megoszlási hányados) Palzmamembrán esetében magas permeabilitás: Gázok (O 2, CO 2, NO), etilalkohol, urea, lipidek nagyméretű vízoldékony molekulák és ionok: nagyon csekély permeabilitás Schmidt/Thews: Physiologie des Menschen 27. Auflage 1997 Hypotone Lösung Ozmózis: a diffúzió speciális esete Hypertone Lösung Ozmotikus nyomás P osm =R x T x n/v A vérplazma ozmotikus koncentrációja: ~300 mosmol/l P osm : 660 KPa (7x atmoszf. nyomás!) Ozmolaritás Ozmolalitás (osmol/kg H 2 O) Tonicitás (reflexiós koeffciens) Kolloidozmotikus (onkotikus) nyomás: makromolekulák (kolloidok) által fenntartott ozmotikus nyomás: Π plazma = 25 Hgmm 9

10 A legegyszerűbb ozmométer a szervezetben: vörösvértestek A sejtek ozmotikus rezisztenciája Ozmotikus hemolízis Mesterséges izotóniás oldatok: 0.9% NaCl oldat 5.5% Glukóz oldat Krebs, Ringer, Tyrode stb. oldatok Transzport molekulák Ioncsatornák és pórusok (porinok, perforin, komplement MAC) Karrier molekulák, pumpák Hajtóerő lehet passzív: koncentráció grádiens elektrokémiai grádiens (Nernst potenciál) aktív trp.: metabolikus energia (ATP) Általános tulajdonságok: Specifikus: szelektív permeabilitás, szubsztrátspecifikus kötés Szaturáció: A transzport sebessége függ az aktív karrierek/csatornák mennyiségétől (hasonlóság az enzim reakciók kinetikájához Michaelis Menten tv.) (T max ): maximális transzport ráta Hőmérséklet függés Aktiválható/szabályozható: Gating (csatorna alegységek konformáció váltása Kovalens/nem-kovalens modifikációk gén expresszió változás, transzlokáció Szelektív gátolhatóság szelektív farmakonokkal gátolható (aktiválható) (pl. kompetitív kötés, csatorna gátlás) 10

11 Csatornák: Vezetőképesség nagy: ion/s (Siemens (S): ps = S) A csatornák részei: pórus, szelektivitás szűrő, kapuzó alegység(ek) Ionszelektivitás: szelektív és nem szelektív ioncsatornák (pl. NMDA receptor) Rektifikáció: a csatorna vezetőképessége függhet az áram irányától is A csatornák aktivitása (nyitás/zárás) általában szabályozott: kapuzás (Gating) feszültségfüggő csat. (transzmembrán potenciál) ligandfüggő csat. (transzmitter, mediátor) feszülés érzékeny csat. (mechano- és ozmoreceptorok) hőmérséklet érzékeny csat. (termoreceptorok) intracelluláris szignálra érzékeny csat. (g-fehérje, foszforiláció, stb.) Szivárgó (leaky) csatornák tartósan (nyugalomban is) nyitott csatornák Víz transzport: aquaporin család a sejtmembrán alap illetve fokozott (szabályozható) vízpermeabilitását biztosítják (pl. vese ADH hatás) Az ioncsatorna működés funkcionális modellje kölcsönhatás a transzportált ion és a csatorna között A csatorna molekula konformáció váltása biztosítja az ionok áthaladását (nem csupán vízzel telt cső!) A kalcium csatornák szelektivitás filtere: 4 glutaminsav karboxi csoportja IC Ion potenciális energiája EC Schmidt/Thews: Physiologie des Menschen 27. Auflage

12 Példa I.: ligandfüggő ioncsatorna - nikotinerg acetylcholin (Ach) receptor ionotróp receptor: a receptor fehérje egyben ioncsatorna is (motoros véglemez, vegetatív ganglion) Példa II.: feszültségfüggő ioncsatorna TTX (tetrodotoxin) érzékeny Na + -csatorna (axolemma, izomrostok) 12

13 Példa III: g-fehérje (receptor) kapcsolt ioncsatorna: muszkarinerg Ach receptor (szív, zsigeri simaizomsejtek, szekretoros hámsejtek) Metabotróp receptor: a ligand kötés másodlagos hírvivőket aktivál Schmidt/Thews: Physiologie des Menschen 27. Auflage 1997 Példa IV.: Hőmérséklet függő ioncsatornák A hőmérséklet hatására aktiválódó ioncsatornák Fájdalmas meleg (>43 C) receptor ( capsaicin is aktiválja paprika hatóanyaga) hideg (<25 C) receptor (menthol is aktiválja borsmenta) elsődleges érző neuronok, fájdalom és hőérzékelés Nagy und Rang J.Neusci

14 A humán ioncsatornák és membrán receptorok mint farmakológiai célmolekulák IUPHAR-adatbázis: IUPHAR: International Union of Basic and Clinical pharmacology 2013 : : ~ 5500 VGIC: Voltage-gated ion channel; LGIC: Ligand-gated ion channel Karrier-mediált transzport : Enzim analógia: S( bent ) S+karrier S( kint ) Transzport sebessége mérsékelt: <10 4 (pumpák 10 2 ) ion(molekula)/s Passzív trp. (facilitált diffúzió): csak az elektrokémai grádiensnek megfelelő irányba lehetséges ( downhill ) SLC (Solute carrier) szupercsalád: kb. 50 alosztály Aktív trp. (primer, szekunder, tercier): az elektrokémai grádienssel szemben is folyhat ( uphill ) metabolikus energia (ATP) felhasználásáva ATP-ázok és ABC (ATP-binding casette) transzporterek Primer aktív trp.: pumpák, ATPáz aktivitással Szekunder/tercier aktív trp.: passzív transzporterek és ionpumpák kapcsolt transzport rendszert képeznek Uniporter: 1 molekula transzportja (pl. GLUT1-12: glukóz transzporter család) Szimporter: több ion/molekula egyirányú transzportja Antiporter: több ion/molekula ellentétes irányú transzportja A transzportált anyagok sztöchiometrikus aránya ionok transzportja esetén: Elektrogén transzport: nettó töltésáramlás egy irányba (pl. Na/K ATPáz: 3 Na+ vs. 2 K+) Elektroneutrális transzport: nincs nettó töltésáramlás (pl.: H+/K+ pumpa: 1:1 arány) 14

15 Transzport kinetika: hasonló az enzim kinetikában tanultakhoz (Michaelis-Menten egyenlet) Diffúzió Vmax: arányos a rendelkezésre álló karrier molekulák számával Transzporter (pumpa) Függ a karrierek sebességétől is (hőmérséklet, modulátor faktorok) A transzportált molekula/ion koncentrációja Schmidt/Thews: Physiologie des Menschen 27. Auflage 1997 Példa.: facilitált diffúzió glukoz transzporter (GLUT) A transzporter molekula egy munkaciklusa Ebben az esetben a transzport megfordítható, reverzibilis (IC/EC konc. viszonya) 15

16 Példa II.: primer aktív transzport Na+/K+ ATPáz (pumpa) elektrogén antiport Jens C Skou kémiai Nobel díj (1997) ECF ICF Szelektív gátlóanyag: szívglikozidok (Digoxin, Ouabain) Digitalis lanata gyapjas gyűszűvirág ATP hiány hatása a sejtek Na+ transzportjára (DNP: dinitro-fenol) Hasonló: szöveti hypoxia Schmidt/Thews: Physiologie des Menschen 27. Auflage 1997 Példa III.: Szimport és antiport mechanizmusok Ezek részlépései a kapcsolt, másodlagos aktív transzportoknak EC IC NCX: Na-Ca Exchanger (SLC8) SGLT: Na-Glucose Linked (Luminal) Transporter (SLC5) (Robert K. CRANE; Nobel díj: 1960) Schmidt/Thews: Physiologie des Menschen 27. Auflage

17 Példa IV.: szekunder és tercier aktív transzport folyamatok a vesetubulusban SGLT: Sodium-Glucose Luminal Transporter (vese, vékonybél) Tubulus lumen GLUT Peritubuláris kapilláris Tubulus lumen aminosavak Peritubuláris kapilláris Schmidt/Thews: Physiologie des Menschen 27. Auflage 1997 Az ioncsatornák (ionáramok) jellemzése Farmakológiai módszerek agonisták (aktivátor anyagok) vagy antagonisták (gátlószerek: nyitás gátlása, refrakteritás stabilizálása) Tetrodotoxin (TTX) (fugu vernicularis) Feszültségfüggő Na + csatorna gátlása Skorpió toxin: számos K + csatorna gátlószere 17

18 A feszültségfüggő Ca 2+ csatornák családfája (új nómenklatúra) Molekuláris biológiai módszerek: Heterológ expresszió sejtkultúrákban (Xenopus oocyta, inmortalizált sejtvonalak) Knock-out egér modellek, antiszenz RNS, RNS-interferencia: a vizsgált csatornák expressziójának célzott gátlása A sejtek glukóz felvételének hormonális szabályozása: a GLUT-4 inzulin által kiváltott transzlokációja 18

19 Az ioncsatornák jelentősége a gyakorló orvoslásban A szöveti sejtek elektromos (és egyéb funkcionális) tulajdonságai nagyban függnek az általuk expresszált ioncsatornák típusaitól és ezek mennyiségétől Számos hatóanyag közvetlenül az ioncsatornákon hat: Feszültségfüggő Na+ csatorna: helyi érzéstelenítők, antiaritmiás és antiepilepsziás szerek Ionotróp Ach receptor: izomlazítók ATP-függő K+ csatornák: orális antidiabetikus szerek GABA-A receptor (ligand függő Cl- csat.): altatók, szorongás gátlók Öröklött funkciózavarok (mutáns ioncsatornák/karrierek): Channelopathy Veleszületett szívritmuszavarok (long QT syndrom) K+ csatorna Myotonia (az izomrelaxáció zavara): Cl- csatorna Renális diabetes insipidus (csökkent vízreabszorpció, polyuria): Aquaporin-2 hiány Cysticus fibrosis: CFTR Protein (Cystic Fibrosis Transepithelial conductance Regulator - Cl- transzporter zavara) Az ionáramok feszültségfüggése a rektifikáció jelensége I m Kifelé (outward) rektifikálás Ohmikus áram (nincs rektifikáció) A kalcium csatornák szelektivitás filtere: 4 glutaminsav karboxi csoportja E m Befelé (inward) rektifikáció 19