(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

Átírás

1 !HU T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E (22) A bejelentés napja: (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP A (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP B (1) Int. Cl.: A23L 1/29 (06.01) A23L 1/ (06.01) A61K 3/74 (06.01) A61P 37/00 (06.01) A61K 31/702 (06.01) A61K 31/733 (06.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO PCT/NL 04/ () Elsõbbségi adatok: EP (72) Feltalálók: SPEELMANS, Gelske, NL-6708 LW Wageningen (NL); KNOL, Jan, NL-6708 SM Wageningen (NL); HAARMAN, Monique, NL-6702 BW Wageningen (NL); GARSSEN, Johan, NL-3434 SG Nieuwegein (NL) (73) Jogosult: N. V. Nutricia, 2712 HM Zoetermeer (NL) (74) Képviselõ: dr. Svingor Ádám, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda KFt., Budapest (4) Szimbiotikus készítmény csecsemõk számára (7) Kivonat A találmány tárgyát képezi Bifidobacterium breve¹t és emészthetetlen ok keverékét tartalmazó készítmény nem vagy csak részben szoptatott csecsemõk részére, továbbá annak alkalmazása immunbetegségek kezelésére vagy megelõzésére nem vagy csak részben szoptatott csecsemõkben. HU T2 A leírás terjedelme 18 oldal (ezen belül 1 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 199. évi XXXIII. törvény 84/H. -a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.

2 Mûszaki terület A találmány tárgyát csecsemõknek, elõnyösen nem szoptatott csecsemõknek szánt, probiotikumot és prebiotikumot tartalmazó készítmények képezik. A technika állása Születésükkor a csecsemõknek hiányzik a bélflórájuk. Születésükkor és az azt következõ szoptatás során az anyával való érintkezés eredményeként a bélflóra gyorsan kifejlõdik és gyarapodik. A fejlõdés során a bélflóra még mindig éretlen, egyensúlya törékeny, és kórokozók jelenlétében gyors változásra, és így a megbetegedések és bántalmak elõfordulására hajlamos. A szoptatással táplált csecsemõkrõl ismert, hogy õket kevésbé sújtják a különféle fertõzések vagy betegségek a nem szoptatott csecsemõkhöz képest. Ennélfogva a nem szoptatott csecsemõkkel összehasonlítva a szoptatott babáknál mind az elõfordulás, és mind pedig az idõtartam tekintetében kevesebb gyomor- és bélrendszeri fertõzés, kevesebb atópiás betegség, például allergia, ekcéma, allergia által kiváltott asztma, és kevesebb székrekedés fordul elõ. Általában a szoptatott csecsemõk bélflórája elsõsorban bifidobaktériumokból és tejsavbaktériumokból tevõdik össze. Az anyatej emberi, tejeredetû oligoszacharidokat [human milk oligosaccharides (HMO)] tartalmaz, amelyek növekedési faktorok a csecsemõk belében található bifidobaktériumok számára. Az elõírásos tejkeverékkel (tápszerrel) táplált csecsemõk flórája változékonyabb és általában több Bacteroides, Clostridium és Enterobaeteriaceae fajt tartalmaz. Tápszerrel táplált csecsemõkben a bifidobaktériumok száma körülbelül egytizede durván kétharmada a szoptatott csecsemõkben találtakhoz képest. A bifidobaktériumokról úgy vélik, hogy fontos tényezõk a bél jól kiegyensúlyozott mikroflórájának fenntartásában, és tudományosan megállapították, hogy a bifidobaktériumoknak számos egészségjavító hatása, így például a hasmenést és bélfertõzéseket megelõzõ és/vagy kezelõ hatásuk van. Továbbá a bifidobaktériumokról kimutatták azt is, hogy a gazda immunrendszerében is valamilyen szerepet töltenek be. A csecsemõk bélflórája megváltoztatható a táplálék megváltoztatásával, például probiotikumok vagy prebiotikumok fogyasztásával. A probiotikumon alapuló megközelítése egyik példája, az EP A számú európai szabadalmi irat, Bifidobacterium törzseket tartalmazó mikroorganizmuskeverék beadását ismerteti. Azonban az ezzel társult egyik probléma az, hogy a mikrobakeverék, miközben egészségre bizonyos mértékben jótékony hatású, széles hatásspektruma miatt a nem szoptatott csecsemõk még mindig éretlen bélflórájára káros lehet. Továbbá sok probiotikumként számon tartott táplálékkiegészítõnek rövid a féléletideje, és túl kevés számú mikroorganizmust tartalmaz, ezáltal nem tudja a várt probiotikus hatásokat biztosítani. A prebiotikumok olyan, emészthetetlen táplálékösszetevõk, amelyek a vastagbélben lévõ egy vagy több baktérium szaporodását és/vagy aktivitását szelektíven serkentõ hatásuk révén jótékonyan befolyásolják a gazdaszervezetet [Gibson és Roberfroid, J. Nutr., , (199)]. Cumisüvegbõl táplált babák bélflórája javításának elõnyös módja a cumisüvegbõl táplált csecsemõkben már jelen levõ bifidobaktériumok specifikus, emészthetetlen oligoszacharidokkal, azaz prebiotikumokkal történõ szelektív serkentése. Oligoszacharidok és poliszacharidok keverékeit is javasolták prebiotikumnak, lásd például a WO 00/08948, DE számú nemzetközi közzétételi iratban leírtak. Egy ilyen példa a galaktooligoszacharid kombinálása fruktopoliszacharidokkal. E prebiotikumokat tartalmazó, tápszerrel táplált csecsemõkben kimutatták, hogy bennük a bifidobaktériumok szintje megemelkedett a standard tápszerrel etetett csecsemõkhöz képest [lásd például Moro és munkatársai, J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr., 34, (02)]. Eddig az volt a megközelítés, hogy a bifidobaktériumokat általában, azaz a fajok szintjén, bevezessék. A Bifidobacterium nemzetség sok különféle fajból áll, amelyek metabolizmusukat, enzimaktivitásukat, oligo- és poliszacharidhasznosításukat, sejtfaluk összetételét és a gazda immunrendszerével való kölcsönhatásukat tekintve eltérnek. Ennélfogva várható, hogy nem minden Bifidobacterium fajnak van azonos funkcionális hatása a csecsemõn. A példaként említett Bifidobacterium fajok B. longum, B. breve, B. infantis, B. adolescentis, B. bifidum, B. animalis és B. dentium, B. adolescentis elterjedtebb a felnõttek flórájában, és kevésbé gyakori az egészséges csecsemõk és babák székletében. A B. animalis/b. lactis természetes körülmények között nem fordul elõ emberekben, míg a B. dentium kórokozó baktérium. Egészséges csecsemõkben a bifidobaktérium flóra fõként Bifidobacterium infantis, B. breve és B. longum fajokból áll. Kalliomaki és munkatársai [Curr Opin Allergy Clin Immunol., 3, (03), és az abban hivatkozott közlemények] leírták, hogy allergiás csecsemõkben a felnõttekre jellemzõ Bifidobacterium flórát, míg egészséges csecsemõkben a csecsemõkre jellemzõ Bifidobacterium flórát találtak, ami jelzi, hogy bizonyos Bifidobacterium fajok elõfordulása és az allergia kifejlõdésének esélye között valamilyen összefüggés áll fenn. Ezen eredmények jelzik, hogy a babák vastagbelében lévõ Bifidobacterium nemzetség serkentése esetleg nem elégséges. A cél annak elérése, hogy a cumisüvegbõl táplált csecsemõkben a szoptatott babáknál található flórára emlékeztetõ flórához jussunk a fajok tekintetében. A leírás szerinti értelmezésben a szoptatott csecsemõk kifejezés a kizárólag emberi anyatejjel táplált csecsemõket jelenti. A nem vagy részben anyatejjel táplált csecsemõk kifejezés a nem vagy nem kizárólag emberi anyatejet kapó csecsemõket jelenti. E kifejezés magában foglalja azokat a csecsemõket, akik legalább naponta egy cumisüvegnyi, azaz naponta legalább 80 ml elõírásos tejkeveréket kapnak, míg a maradék ha van tápot szilárd tápként vagy folyékony tápként kapják, például anyatejként a részben anyatejjel táplált csecsemõk esetében. Találmány szerinti megoldás összefoglalása Úgy találtuk, hogy a nem emészthetõ keverékek alkalmazásával a Bifidobacteriumok szintjé- 2

3 ben bekövetkezett emelkedés a Bifidobacterium populációt inkább a csecsemõkre jellemzõ populáció azaz alacsony B. catenulatum, B. pseudocatenulatum és B. adolescentis szintek irányába szabályozza, míg a standard tápszerrel táplált csecsemõkre inkább a felnõttkori flóra jellemzõ, amelyben nagyrészt B. catenulatum, B. pseudocatenulatum és B. adolescentis található. Továbbá felismertük azt is, hogy az ilyen prebiotikumokkal táplált csecsemõkben lévõ Bifidobacterium populációból még mindig hiányzott egy konkrét mikroorganizmus, nevezetesen a Bifidobacterium breve. Eszerint a találmány egyik szempontja szerint a találmány tárgyát Bifidobacterium breve¹t és nem emészthetõ -prebiotikumok keverékét tartalmazó készítmény képezi. Úgy találtuk, hogy egy ilyen készítmény elõnyös és igen alkalmas a csecsemõk gyomor- és bélcsatornájában található Bifidibacterium populáció fajok szintjén történõ szabályozására. Továbbá nem várt felismerés volt az is, hogy a B. breve¹n kívül más Bifidobacterium fajok hozzáadása nem szükséges, mivel azokat a készítmény önmagában megfelelõképpen szabályozza. A találmány egy másik szempontja szerint a találmány tárgyát Bifidobacterium breve¹t és nem emészthetõ -prebiotikumok keverékét tartalmazó készítmény képezi, ahol a nem emészthetõ -prebiotikumok keveréke legalább két különbözõ, lényegében oldható A és B komponenst tartalmaz. A találmány egy másik szempontja szerint a találmány tárgyát képezi a készítmény nem vagy csak részben szoptatott csecsemõknél való alkalmazása. A találmány egy további szempontja szerint a találmány tárgya a készítmény alkalmazása a nem vagy részben szoptatott csecsemõk gyomor- és bélrendszerében lévõ Bifidobacterium fajok populációjának szabályozására szolgáló készítmény gyártására. A találmány egy további szempontja szerint a találmány tárgya a készítmény alkalmazása egy adott immunállapot megelõzésére vagy kezelésére szolgáló készítmény gyártására. A találmány egy további szempontja szerint a találmány tárgya egy adott keverék alkalmazása a nem vagy részben szoptatott csecsemõk gyomor- és bélrendszerében lévõ Bifidobacterium catenulatum, B. pseudocatenulatum és/vagy Bifidobacterium adolescentis populációjának szabályozására. A találmány részletes leírása Készítmény 1. Bifidobacterium breve A Bifidobacterium breve a találmány elengedhetetlen részét képezi. Kimutatási eljárásunk alkalmazásával errõl a baktériumról kimutattuk, hogy korlátozott mennyiségben van jelen a nem szoptatott gyermekekben. Eszerint e baktériumnak a keverékkel történõ beadása lehetõvé teszi a Bifidobacterium fajok alkotta populáció a szoptatott csecsemõk gyomor- és bélrendszerében jelen levõ szinttel egyenértékû szintre való normalizálását Elõnyös Bifidobacterium breve törzsek azok, amelyeket az egészséges, szoptatott csecsemõk székletébõl vett izolátumokból szelektáltak. Jellemzõ, hogy ezek kereskedelmi forgalomban beszerezhetõk a tejsavbaktériumokat termelõ cégektõl, de izolálhatók közvetlenül a székletbõl, azonosíthatók, jellemezhetõk és termelhetõk. Kereskedelmi forgalomban elérhetõ B. breve például a B. breve Bb¹03 a Rhodiától, B. breve MV¹16 a Morinagától, és B. breve a Rosell Intézetbõl (Lallemand), de B. breve különféle tenyészgyûjteményektõl is beszerezhetõ (például DSM 091 és LMG 11613). A találmány szerinti készítményben lévõ B. breve mennyisége alapulhat az oldható, emészthetetlen ok összes mennyiségén, és az összes 1 grammjában a B. breve mennyisége elõnyösen 7 11, elõnyösebben 8 cfu baktérium. A készítmény kiegészítõ táplálékként való alkalmazása esetén legelõnyösebb, ha a kiegészítõ táplálékban a Bifidobacterium breve mennyisége 1 6 1, 11 cfu/g, elõnyösen 3 7 cfu/g, elõnyösebben 8 1 cfu/g. A készítmény (teljes) csecsemõtápszerként való alkalmazása esetén legelõnyösebb, ha a csecsemõtápszerben a B. breve mennyisége cfu/g, elõnyösen cfu/g, elõnyösebben cfu/g. E koncentrációk úgy lettek megválasztva, hogy a napi dózis körülbelül 1 6 és 1, 11 cfu/g közötti, elõnyösen 3 7 és cfu/g közötti, elõnyösebben 8 és 1 cfu/g közötti legyen. 2. Nem emészthetõ szénhidrogén-prebiotikumok keveréke Nem emészthetõ szénhidrogén-prebiotikumok keveréke is elengedhetetlen eleme a találmány szerinti megoldásnak. A nem emészthetõ kifejezés azt jelenti, hogy a szénhidrogének emésztetlenül maradnak a gyomor- és bélrendszerben, és a vastagbél eléréséig nem szívódnak fel. A találmány szerinti megoldás céljára a nem emészthetõ szénhidrogének keveréke legalább két különbözõ, lényegében oldható A és B komponenst tartalmaz, amelyek emésztetlenül maradnak a gyomor- és bélrendszerben, és a vastagbél eléréséig nem szívódnak fel. A találmány szerinti szénhidrogénkeverékek állhatnak kizárólag e két A és B komponensbõl. A legalább két, nem emészthetõ, oldható A és B komponens alkotta keverékben az A komponens mennyisége az A és B komponens összes súlyának 9%¹át teszi ki. Továbbá a nem emészthetõ, oldható A és B komponensek összességének legalább 0%¹a, elõnyösen 7%¹a a diszacharidok és eikozaszacharidok ( monoszacharidegységet tartalmazó poliszacharidok) határolta poliszacharidok közül van kiválasztva, a maradék pedig lehet nem emészthetõ monoszacharid vagy egységnél hosszabb, nem emészthetõ poliszacharid. Az is elõnyös, ha az összes oldható, nem emészthetõ több mint 9%-ának, elõnyösen 3

4 több mint 98%-ának lánca 0-nál nem több egységbõl áll. Az említett leírásban a százalékok és átlagok tömegszázalékokat és ¹átlagokat jelentenek, hacsak nem egyértelmû, hogy a kérdéses értékek másként értendõk vagy másként vannak meghatározva. A komponensek jai az alábbiakban térhetnek el egymástól: (i) a monoszacharidegységeinek (átlagos) számában, az A komponens átlagos lánchossza legalább monoszacharidegységgel rövidebb, mint a B komponens átlagos lánchossza; ez azt jelenti, hogy ha az A és B ok ugyanazokból a szerkezeti egységekbõl épülnek fel, azaz csak a lánchossz tekintetében eltérõ homológ keveréket képeznek, a homológok eloszlásában legalább két maximumnak, egy maximumnak 7 alatt és egy másiknak pedig 7 felett kell lennie, a két maximumnak egymástól legalább egységre kell lennie; a maximum 6 egységbõl álló ok (hexaszacharidok) az A komponens részét képezik, és a 7 vagy több egységbõl álló ok (heptaszacharidok) a B komponens részét képezik; (ii) a monoszacharidegységeinek szerkezetét tekintve az A komponens a B komponenst alkotó szerkezeti egységektõl eltérõ szerkezeti egységekbõl épül fel; ahol A ¹t és/vagy B ¹t különféle monoszacharidegységek ismétlõdõ kombinációi alkotják, például galaktomannánok és arabinogalaktánok esetében, a két komponens monoszacharidegységeinek legalább 0%¹a különbözõ kell hogy legyen (a fenti példában az egyikben vagy mindkettõben 0%-nál kevesebb anhidrogalaktózegységnek kell lennie). Elõnyös, ha az A komponens nem emészthetõ, ugyanolyan -szerkezetû, maximum hexaszacharid méretû monoszacharidokból kerül kiválasztásra, míg a B komponens ugyanolyan szerkezetû heptaszacharidok vagy annál magasabb tagszámú poliszacharidok közül kerül kiválasztásra. Ennélfogva az A komponens legalább egy nem emészthetõ monoszacharidból vagy legalább egy nem emészthetõ oligoszacharidból áll. Egyértelmû, hogy oligoszacharidok közé azok tartoznak, amelyek legkevesebb 2 és legfeljebb 6 monoszacharidegységet tartalmaznak. Az A komponens a fentiekben említett két vagy több szacharidok keverékébõl képezhetõ, és elõnyösen abból készült. Ennélfogva bármilyen számú, különféle monoszacharidból és/vagy ugyanazonféle, azaz ugyanolyan szerkezetû oligoszacharidból állhat. A találmány ezen elõnyös megvalósítási módjában, a B komponens legalább egy, 7 vagy annál több monoszacharidegységet tartalmazó poliszacharidból áll. Poliszacharidok tekintetében egyértelmû, hogy azok a heptaszacharidtól kezdõdnek (például heptaszacharid, oktaszacharid, nonaszacharid, dekaszacharid stb.). A poliszacharid lánchosszát illetõen nincs specifikus felsõ határ, és ezek lehetnek akár sok száz vagy akár több ezer monoszacharidegység hosszúak. Azonban a találmány szerint kevésbé elõnyösek a 0-nál hosszabb (körülbelül 16 kd), és különösen a 700-nál hosszabb láncok (körülbelül 0 kd). Elõnyös, ha a B komponens nem tartalmaz %¹nál több, vagy még inkább 2%¹nál több, 0 monoszacharidegységbõl álló homológot. A B komponens állhat mindössze egyetlen ilyen típusú poliszacharidból, vagy elõnyösen két vagy több, különbözõ hosszúságú, ilyen típusú, azaz azonos szerkezetû poliszacharidból. Az A komponens az A komponens és a B komponens összegének (A+B=0 tömeg%) maximum 9 tömeg%¹át teszi ki. A B komponens az A komponens és a B komponens összegének (A+B=0 tömeg%) 9 tömeg%¹át teszi ki. A találmány egy elõnyös megvalósításában az összes jelen lévõ nak (A+B=0 tömeg%) 9 tömeg%¹át, elõnyösebben 9 80 tömeg%¹át, és még elõnyösebben 9 90 tömeg%¹át az A komponens, míg tömeg%¹át, elõnyösebben tömeg%¹át, és még elõnyösebben tömeg%¹át a B komponens teszi ki. A leírás szerinti értelemben egyértelmû, hogy oldható ok közé a Prosky és munkatársai által közölt [Prosky és munkatársai, J. Assoc. Anal. Chem., 71, (1988)] eljárás szerint legalább 0%- ban oldható ok tartoznak. Ezáltal az A és B komponensek összességébõl a ok és poliszacharidok legalább 80 tömeg%-ának prebiotikus hatása van. Elõnyös, ha az A komponens részét képezõ ok legalább 80 tömeg%-ának, és a B komponens részét képezõ ok legalább 80 tömeg%-ának prebiotikus hatása van. Más szavakkal, elõnyös, ha az A és B komponenseket alkotó ok vagy szacharidok legalább 80 tömeg%¹a emésztetlenül éri el a vastagbelet (ennélfogva nem szívódik fel a vékonybélben). Más szavakkal, az A és B komponensek jai vagy szacharidjai a gyomor- és bélcsatornában nem szívódnak fel, és nem is emésztõdnek meg a gyomorban és a vékonybélben, hanem változatlanul eljutnak a vastagbélbe. A találmány szerinti, prebiotikusan aktív ot tekintve egyértelmû, hogy az olyan, amely a vastagbélbe emésztetlenül eljutva (azaz a vékonybélben nem szívódik fel) szelektíven támogatja a bélben lévõ egy vagy korlátozott számú baktériumfaj(ok) szaporodását és/vagy aktivitását, és ennek következtében egészségjavító hatása van. Az ilyen ok prebiotikus hatása és azok specifikus hatásmechanizmusát az irodalomban részletesen leírták [lásd Gibson és Roberfroid, J. Nutr., 12, (199), amelyre kifejezetten hivatkozunk, és amely publikáció a kitanítás részét képezi]. Az A és B komponens prebiotikusan nem aktív jainak vagy szacharidjainak aránya maximum tömeg%¹ot érhet el. Ezen ok vagy szacharidok közé azok tartoznak, amelyek valójában oldhatók, de emésztetlen formában ürülhetnek ki. E oknak lehet bizonyos élettani hatásuk, például olyasmi, hogy növelik a széklet térfogatát vagy ösztönzik a víz adszorpcióját. Egy adott élelmiszer- 4

5 vagy gyógyászati termékben az A és B komponens arányának meghatározására az alábbi lépéseket végezzük el. Az elsõ lépésben a termékbõl vízzel kivonjuk az összes oldható ot. A zsírokat és fehérjéket eltávolítjuk a kivonatból. Egy második lépésben az oldható okat vagy a kivonatot, megfelelõen, emberi enzimekkel, például emberi amilázzal, emberi hasnyálmirigy-váladékkal vagy a vékonybél bélbolyhaiból készített készítményekkel emésztjük. Az eredményül kapott emésztetlen ok (ezen in vitro vizsgálatban elõállított, felszívódó monoszacharidok kivételével) alkotják a két, A és B komponenst, amely 80%¹a feltételezhetõen prebiotikusan aktív. Ennélfogva a találmány szerinti készítményben alkalmazandó keverékek olyan, a fentiekben leírtak szerinti értelemben oldható és emészthetetlen ok, amelyek megfelelnek a leírásban megadott követelményeknek, és az A és B komponenseket alkotják. Az A komponens állhat például az alábbi ok közül egybõl vagy többõl: ¹galaktooligoszacharidok, ¹galaktooligoszacharidok, fruktooligoszacharidok, inulooligoszacharidok, fukooligoszacharidok, mannooligoszacharidok, xilooligoszacharidok, szialiloligoszacharidok, N¹glikoprotein oligoszacharidok, O¹glikoprotein oligoszacharidok, glikolipid oligoszacharidok, cellooligoszacharidok, kitosanoligoszacharidok, kitinoligoszacharidok, galakturonooligoszacharidok, glukuronooligoszacharidok, ¹glükán (például 1,3¹) oligoszacharidok, arabinoxilooligoszacharidok, arabinogalaktooligoszacharidok, xiloglükooligoszacharidok, galaktomannooligoszacharidok, rhamnooligoszacharidok, szójaeredetû oligoszacharidok (sztachióz, raffinóz, verbaszkóz) és lakto-n-neotetraóz, illetve a B komponens állhat például az alábbi ok vagy szacharidok közül egybõl vagy többõl: frukt(oz)ánok, így inulinok, galaktánok, ftikoidánok, arabinánok, xilánok, xantánok, ¹glükánok, emészthetetlen polidextróz, emészthetetlen maltodextrin, galakturonánok, N¹glikánok, O¹glikánok, hialuronsavak, kondroitinek, xiloglükánok, arabinogalaktánok, gumiarábikum, alginátok, karraginánok, galaktomannánok, glükomannánok, arabinoxilánok, glikolipid glikánok, glikoprotein glikánok, proteoglikánok, szójaeredetû poliszacharidok. Felhívjuk a figyelmet arra, hogy emészthetõ ok nem képzik részét az A és B komponenseknek. Így a glükóz, fruktóz, galaktóz, szukróz, laktóz, maltóz és a maltodextrinek nem számítanak bele e komponensekbe, még ha azok például a galaktooligoszacharidok, fruktooligoszacharidok (inulin) és hasonlók alacsonyabb homológjai. A találmány szerinti emészthetetlen okban rendszerint a glükózegységek nagy része nincs az alfa-1,4 és/vagy alfa-1,6 pozíciókban kapcsolt helyzetben, mint a keményítõszármazékokban (az így kapcsolt glükózegységeket tartalmazó ok emészthetõk). Azonban bizonyos keményítõ típusú poliszacharidokat és maltodextrineket fizikai vagy enzimatikus úton emészthetetlenné vagy rezisztenssé alakítottak; amennyiben az ilyen oligo- és poliszacharidok elégséges mértékig oldhatók, akkor a találmány részét képezik. Oligoszacharidok és poliszacharidok szelektív kombinálásával és ennek következtében az A és B komponens egyidejû jelentével, a vastagbélben lévõ, egészségjavító mikroorganizmusok segíthetõk és/vagy a kórokozó mikroorganizmusok elnyomhatók, mégpedig lényegesen magasabb hatékonysággal, mint amilyen csak az egyik komponens alkalmazása esetén elérhetõ lenne. Így a kombináció beadásával gyorsan vissza lehet állítani egy normális vastagbélflórát, fenntartani azt, vagy stresszhelyzetekben profilaktikusan megakadályozni a bélflóra megváltozását, és így a korábban alkalmazott okkal tapasztaltaknál hatékonyabban befolyásolni a vastagbél bakteriális kolonizációját. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint az A komponens legalább 80 tömeg%¹a akárcsak B komponensé bifidogén és/vagy tejsavbaktériumokat elõsegítõ okból áll. Az említett tulajdonságokkal bíró oligoszacharidok és poliszacharidok ilyen kombinációjának köszönhetõen a tejsavbaktériumok szaporodása nem várt mértékben elõmozdítható, mégpedig lényegesen erõteljesebb módon, mint ahogyan az az oligoszacharidokkal vagy poliszacharidokkal önmagukban elérhetõ lenne. Ezáltal nemcsak a természetes körülmények között a bélben elõforduló tejsavbaktériumok kapnak támogatást, hanem igény szerint szelektív módon a kívülrõl bevittek szaporodása is elõre lesz mozdítva. Önmagukban a baktériumok és azok metabolitikumai például szerves savak (acetát, laktát stb.) révén gyakorolt közvetett hatás mellett a ph hatásai és kolonoziták serkentése, közvetlen élettani hatások, például perisztaltika, víztartalom, a széklet mennyisége, a bél nyálkahártyára gyakorolt mechanikai tevékenység is feltehetõen pozitívan lesz befolyásolva. Így a keverékek nemcsak tápláló hatásúak, hanem különféle tevékenységeket is kifejtenek. A fentiekben leírt biológiai hatások mellett az alábbiak is elérhetõk a találmány szerinti keverékek révén: a természetes mikroflóra stabilizálása, kórokozó anyagok/szervezetek például toxinok, vírusok, baktériumok, gombák, transzformált sejtek és paraziták kitapadásának megelõzése, toxinkomplexeket, vírusokat, baktériumokat, gombákat és más kórokozókat tartalmazó sejtek feloldása és eltávolítása a testbõl, és a sebgyógyulás felgyorsítása, így a keverékek alkalmasak például az említett anyagok és szervezetek epitéliumhoz való kapcsolódása vagy azok más endogén sejtekhez történõ adhéziója következtében megzavart bélflórával kapcsolatban elõforduló tünetek vagy betegségek megelõzésére és/vagy kezelésére. Különösen hatékonynak találtuk az olyan keverékeket, amelyekben az A komponens szerkezete különbözik a B komponensétõl. E különbözõ szerkezet például vonatkozhat a monoszacharid-összetételre, például amennyiben egyrészrõl fruktánok, másrészrõl pedig galaktánok alkalmazására kerül sor. E különbözõ szerkezet hasonló-

6 képpen vonatkozhat a glikozidkötésre is [például ¹galaktooligoszacharidok vs. ¹galaktooligoszacharidok, vagy ¹glükánok (keményítõ) vs. ¹glükánok (cellulóz)]. A monomer-összetétel és a glikozidkötés hatást gyakorolhat a kémiai viselkedésre (például oldhatóság) vagy az élettani viselkedésre (például emészthetõség). Lánchosszúságukat tekintve esetleg eltérõ azonos szerkezetû okat, viszont ugyanolyan monoszacharidegységekbõl vagy monoszacharidegységek kombinációjából álló homológoknak tekintjük. Általában a következõ homológ az elõzõtõl egyetlen, az elõzõben jelen lévõ monoszacharidegység hozzáadásában különbözik. Mindazonáltal egy egyedülálló egység, rendszerint a terminális egység tekintetében eltérés lehet, mint például bizonyos fruktánok esetében, ahol azok (anhidro)fruktózegységekbõl álló láncot tartalmaznak, amelynek terminálisán glükózegység található. Elõnyös, ha a B poliszacharidkomponens lánchossza, vagy poliszacharidkeverékek esetében a lánchosszúság súlyozott átlaga legalább három egységgel, elõnyösen legalább öt egységgel hosszabb, mint az A poliszacharidkomponens lánchossza, vagy oligoszacharidkeverékek esetében a lánchosszúság súlyozott átlaga. Az A oligoszacharidok elõnyös átlagos lánchossza 2 6 egység, míg a B poliszacharidok elõnyös átlagos lánchossza 7, elõnyösebben 8 egység. Azonos szerkezetû oligoszacharidok és poliszacharidok jelenléte esetén az ilyen szerkezetû okat akkor tekintjük A komponensnek, ha lánchosszúságuk súlyozott átlaga 6, alatti, és a 7¹nél vagy annál hosszabb lánchosszúságú egyedi tagok nem számítanak be az A komponensek közé; másfelõl ezeket B komponenseknek tekintjük, ha lánchosszúságuk súlyozott átlaga 6, feletti, és a 6¹nál vagy annál rövidebb lánchosszúságú egyedi tagok nem számítanak be a B komponensek közé. Amennyiben ugyanolyan szerkezetû oligoszacharidok, illetve poliszacharidok, más szerkezetû szacharidok hiányában jelen vannak, a 7 egység valamelyik oldalán két maximumnak kell lennie, máskülönben a két különbözõ komponens nem felel meg a fentiekben leírtak szerinti elõírásoknak. A keverékek lényegét, többek között, a ok alkotják. Különféle méretû és/vagy különféle osztályokba tartozó vagy szerkezetû keverékek beadásakor szinergista hatás léphet fel a külön A és B anyagcsoportok prebiotikus hatásaival összehasonlítva. Az A komponens jai tartozhatnak egyetlen anyagcsoporthoz, de különféle osztályba tartozó okból is kialakíthatók (például A : galaktooligoszacharidok plusz fukooligoszacharidok), míg a B komponens jai származhatnak ugyanabból az anyagosztályból, de akár több anyagosztályból is (például B : inulinok plusz xilánok). Elõnyös keverék galaktooligoszacharidból és inulinból áll. Különösen hatékonyak azok a keverékek, ahol az A komponensek legalább tömeg%¹a, elõnyösen 80 0 tömeg%¹a a galaktooligoszacharidok csoportjába tartozik. Elõnyösek azok a keverékek is, ahol a B komponensek legalább tömeg%¹a, elõnyösen 80 0 tömeg%¹a a fruktopoliszacharidok csoportjába tartozik. A keverékek elõállításához a jelenleg ismert és elsõsorban élelmiszerek vagy élelmiszertermékek elõállítására alkalmazott okat és keverékeket alkalmazunk. Technikai úton elõzõleg már módosított nyersanyagok is alkalmazhatók. Ennélfogva a keverékek elkészíthetõk a megfelelõen kiválasztott ok vagy oligoszacharidok poliszacharidokal vagy a keverékekkel történõ egyszerû összekeverésével. A kiindulókomponenseket ennek megfelelõen úgy kell összekeverni egy másikkal, hogy figyelembe legyenek véve a kész keverékek paraméterei. Szénhidrátforrásként nyersanyagok is alkalmazhatók (fruktánok, hüvelyesekbõl származó galaktooligoszacharidok, fukoidán, ¹glükán, laminarin, karraginán, mannánok, galaktomannánok, agar), természetes gumi, glikoproteinek N¹glikozid-kötésû jai, glikoproteinek O¹glikozid-kötésû jai, glikolipidek glikánjai, enzimatikus úton elõállított ok (galaktooligoszacharidok, glükooligoszacharidok, fruktooligoszacharidok, xilooligoszacharidok), baktériumokból származó ok (például xantánok), és oligoszacharidok [galaktooligoszacharidok, glükooligoszacharidok (1 2 és 1 3 glükózcsoportokból), xilooligoszacharidok], és vázalkotó ok, például cellulózok, hemicellulózok (arabinanok, galaktánok), pektinek és kitinek is alkalmazhatók. Az anyagoknak elõnyösen élelmiszer minõségûnek kell lennie [vö. Complex Carbohydrates in Foods, British Nutrition Foundation; Chapman & Hall, London (1990)]. A nyersanyagokon enzimatikus módosításokat lehet végezni a nyersanyagok és termékek hidrolázaival (például glikozidázok, transzglikozidázok és lipázok), transzferázaival, izomerázaival (például aldolázok és ketolázok), oxidoreduktázaival (például oxidázok) és reduktázaival (például glükóz-dehidrogenázok), liázaival (például poliszacharid liázok) és ligázaival. Ezenfelül a nyersanyagokon és termékeken technikai módosításokat lehet végezni, nevezetesen préselés (például sajtolás), hõmérséklet megváltoztatása (például karamellizáció), szerves szintézissel, szerves módosítás (például karboximetiláció és peracetilezés), savas és/vagy lúgos hidrolízis és frakcionálás (például mérettõl és/vagy fizikokémiai paraméterektõl mint amilyen például a töltés és hidrofobicitás függõen) vagy különféle módosítások kombinálása révén. Ennélfogva a keverékek lényegében az alább felsorolt monoszacharidokból és oligoszacharidokból és az azok alkotta poliszacharidokból állnak: D¹glükóz, D¹fruktóz, D¹galaktóz, D¹mannóz, L¹fukóz, D¹N-acetilglükózamin, D¹N-acetilgalaktózamin, D¹xilóz, L¹ramnóz, D¹arabinóz, D¹allóz, D¹talóz, L¹idóz, D¹ribóz, illetve karboxilcsoportokat tartalmazó monoszacharidok, például D¹galakturonsav, D¹glükuronsav, D¹mannuronsav és/vagy azok metilezett formái, például N¹acetilneuraminsav, N¹glikolilneuraminsav és/vagy azok O¹acetilezett formái. Ezenfelül ezen monomerek és az azokon alapuló nagyobb egységek OSO 3 H cso- 6

7 portok és/vagy OPO 3 H csoportok révén módosíthatók. A találmány szerinti emészthetetlen ok beadása jellemzõen napi 0, g dózisban, elõnyösen 2 g dózisban, elõnyösebben 3 9 g dózisban történik. A készítmény beadásának egyik elõnyös módja a táplálékkiegészítõként történõ beadás. A tápszer nem szoptatott vagy csak részben szoptatott csecsemõk számára alkalmas, ideértve a nem vagy részben szoptatott koraszülött babákat és a nem vagy csak részben szoptatott éretten született babákat. A készítmény csecsemõtápként is alkalmazható. Ebben az esetben a találmány szerinti csecsemõtáp tartalmaz még a következõk közül választott egy vagy több összetevõt: emészthetõ, lipidforrás, fehérjeforrás és azok keveréke. 3. Más összetevõk Az A és B komponensek mellett más ok is jelen lehetnek. Ilyen ok lehetnek 1. az emészthetõ ok, amelyek a fentiekben leírtak szerint emészthetõk, és 2. az oldhatatlan ok, amelyek lehetnek felszívódók/emészthetõk vagy akár nem felszívódók/emészthetõk. A csecsemõtápszerben való alkalmazásra szánt, jellemzõ oldhatatlan, nem emészthetõ ok a szójaeredetû poliszacharidok, és rezisztens keményítõ, cellulóz és hemicellulóz; elõnyösebben ezek a ok a szójaeredetû poliszacharidok és rezisztens keményítõ közül vannak kiválasztva. A csecsemõtápszerben való alkalmazásra szánt, jellemzõ oldható, emészthetõ ok a maltodextrinek, keményítõ, laktóz, maltóz, glükóz, fruktóz és szukróz és más mono¹, illetve diszacharidok közül, elõnyösebben a maltodextrin, laktóz, maltóz, glükóz, fruktóz, szukróz és ezek keverékei közül vannak kiválasztva. Ezen 1. és 2. számú alcsoportba sorolt ok a kívánt végterméktõl függõen bármilyen tetszõleges mennyiségben lehetnek jelen az A és B komponens mellett. Elõnyös, ha az oldhatatlan ok a keverék 0 % tömeg%¹át teszik ki. A csecsemõknek szánt tápszerben lipidforrásként alkalmazandó összetevõk jellemzõen lehetnek bármilyen, csecsemõknek szánt elõírásos tápszerekben való alkalmazásra megfelelõ lipidek vagy zsírok. Elõnyös lipidforrások közé tartozik a tejzsír, pórsáfrányból (Carthamus tinctorius) származó olaj, tojássárgájából származó lipid, kanolaolaj, olívaolaj, kókuszolaj, pálmaolaj, pálmamagolaj, pálmaolein, szójaolaj, napraforgóolaj, halolaj és hosszú szénláncú többszörösen telítetlen zsírsavakat tartalmazó, mikrobiális fermentációs olaj. Ezen olajok lehetnek magas olein formában, például magas olefines napraforgóolaj és magas olefines pórsáfrányolaj. A lipidfrakció lehet ezen olajokból származó frakciók formájában, mint például pálmaolein, közepes szénláncú trigliceridek (MCT), és zsírsavak, például arachidonsav, linolénsav, palmitinsav, szterinsav, dokozahexaénsav, linolsav, olajsav, laurinsav, kaprinsav, kaprilsav, kapronsav és hasonlók A pre elõjelû tápszer esetében elõnyös, ha a lipidforrás közepes szénláncú triglicerideket tartalmaz, elõnyösen a lipidforrás súlyának 3%¹át kitevõ mennyiségben. Elõnyös, ha lipidforrás moláris n 6 n 3 zsírsavaránya :1 :1, elõnyösen 8:1 :1. A tápszerben a lipidek szintje ha a készítmény tartalmaz ilyet elõnyösen a készítmény tömegének %¹át teszi ki vagy 0,8 1, g/0 kj. A találmány szerinti táplálkozási termékben alkalmazható fehérjék közé tartozik minden, emberi fogyasztásra alkalmas fehérje vagy nitrogénforrás. Tápszerben alkalmazandó fehérjék elõnyös forrása például jellemzõen kazein, tejsavó, kondenzált fölözött tej, nem zsíros tej, szója, borsó, rizs, kukorica, fehérjehidrolizátum, szabad aminosavak, a fehérjével kolloid szuszpenziót képezõ kalciumot tartalmazó fehérjeforrások és ezek keverékei. Az alkalmazás szempontjából elõnyös, ha a fehérje hidrolizált formában van jelen, ezáltal csökkentve az allergia kockázatát az ilyen csecsemõkben. Kereskedelmi forgalomban beszerezhetõ fehérjeforrások könnyen elérhetõk, és ezeket a szakember ismeri. Jellemzõen a tejalapú, csecsemõknek szánt tápszer-hidrolizátumokban 0%-ban tehéntejbõl származó, hidrolizált tejsavófehérje van jelen. Más, csecsemõknek szánt, tejalapú tápszerekben a kazein/tejsavó aránya jellemzõen 1,8/0,3 3,0 közötti. Ha a készítményben van fehérje, akkor elõnyös, ha a fehérjeforrás a készítmény tömegének 9 19%-ának megfelelõ szinten van jelen. Csecsemõtápszerként való alkalmazás esetén elõnyös, ha a fehérjeforrás 0,4 1,0 g/0 kj mennyiségben van jelen. Egy táplálkozás szempontjából teljes tápszer elõnyösen tartalmaz minden, a napi táplálkozásban köztudottan elengedhetetlenül fontos vitamint és ásványi anyagot a táplálkozás szempontjából jelentõs mennyiségben. Bizonyos vitaminokra és ásványi anyagokra létezik minimális elõírás. A csecsemõtápszerben adott esetben jelen lévõ ásványi anyagok, vitaminok és más tápanyagok közé tartoznak az alábbiak: A¹vitamin, B¹vitamin, B2¹vitamin, B6¹vitamin, B12-vitamin, E¹vitamin, K¹vitamin, C¹vitamin, D¹vitamin, folsav, inozitol, niacin, biotin, pantoténsav, kolin, kalcium, foszfor, jód, vas, magnézium, réz, cink, mangán, klorid, kálium, nátrium, szelén, króm, molibdén, taurin és L¹carnitin. Ásványi anyagok rendszerint só formájában vannak hozzáadva. A specifikus ásványi anyagok és más vitaminok jelenléte és mennyisége a célzott csecsemõpopulációtól függ. Ha szükséges, a csecsemõtápszer tartalmazhat emulgeálókat és stabilizálókat, mint például szójalecitin, citromsav, mono- és digliceridek észtere és hasonlók. Ez különösen akkor képezi a találmány tárgyát, ha a tápszer folyékony formában biztosítandó. A csecsemõtápszer igény szerint tartalmazhat még más jótékony hatású anyagot is, mint például nem ok alkotta rostokat, laktoferrint, immunglobulinokat, nukleotidokat, nukleozidokat és hasonlókat. 7

8 2 Alkalmazások A találmány szerinti készítmények különösen alkalmasnak bizonyultak a szoptatott csecsemõkben talált fajeloszlás szerinti Bifidobacterium populáció standard populáció normalizációjára a nem vagy csak részben szoptatott csecsemõk, különösen a koraszülött vagy érett babák mellett a szilárd táplálkozásra váltási periódusban lévõ csecsemõk gyomor- és bélcsatornájában. A találmány szerinti készítmény a szoptatásról a cumisüveges táplálásra áttérõ csecsemõknek is alkalmas. Eszerint a találmány tárgya a készítmény alkalmazása a nem vagy részben szoptatott csecsemõk gyomor- és bélcsatornájában lévõ Bifidobacterium fajok populációjának normalizálására szolgáló készítmény gyártására. A találmány szerinti készítmények különösen alkalmasnak bizonyultak immunállapotok megelõzésére vagy kezelésére. Elképzelések szerint ezen immunállapot a szoptatott csecsemõk és a nem vagy csak részben szoptatott csecsemõk gyomor- és bélcsatornájában lévõ Bifidobacterium fajok összetételében fennálló különbségek eredménye. Ilyen immunállapotok közé tartozik jellemzõen az allergia, atópiás bõrgyulladás, ekcéma, asztma, atópia, az orrnyálkahártya allergiás gyulladása, táplálék-túlérzékenység, pelenkakiütés, hasmenés és ezek keverékei. Eszerint a találmány tárgya a találmány szerinti készítmény alkalmazása egy vagy több, elõnyösen az allergia, atópiás bõrgyulladás, ekcéma, asztma és pelenkakiütés közül választott immunállapot megelõzésére vagy kezelésére. Emellett baktériumok által okozott hasmenés és különösen a vírusok által okozott hasmenés kezelhetõ a találmány szerinti készítménnyel. A találmány tárgya továbbá a készítmény alkalmazása hibás energiafelvétel megelõzésére és/vagy kezelésére. Elõnyösen a készítményt kedvezõnek találtuk allergiás léziók esetén az eozinofil, neutrofil granulociták és mononukleáris sejtek beszûrõdésének gátlására, és/vagy a Th2 típusú immunválasz gátlására és/vagy a Th1 által közvetített immunválasz serkentésére. Eszerint a találmány tárgya a találmány szerinti készítmény vagy összetétel alkalmazása allergiás léziókban az eozinofil, neutrofil granulociták és mononukleáris sejtek beszûrõdésének gátlására, és/vagy a Th2 típusú immunválasz gátlására és/vagy a Th1 által közvetített immunválasz serkentésére szolgáló készítmény gyártására. A találmány tárgya továbbá a fentiekben leírt keverék alkalmazása bizonyos, a Bifidobacterium breve-tõl eltérõ Bifidobacterium fajok populációjának szabályozására, elõnyösen a Bifidobacterium catenulatum, B. pseudocatenulatum és/vagy B. adolescentis relatív mennyiségeinek csökkentésére. 1. példa: A bifidobaktériumokra kifejlesztett próbák és láncindítók validálása A különféle Bifidobacterium fajok relatív mennyiségi meghatározására szolgáló vizsgálatok validálására alkalmazott baktériumtörzseket a 2. táblázat sorolja fel. 2. táblázat Az ¹nukleázvizsgálat kifejlesztésére alkalmazott baktériumtörzsek és azok eredete Törzs Eredet 3 Bifidobacterium strains B. adolescentis ATCC 703 T ATCC 70 B. angulation DSM 098 T B. animalis ATCC 227 T DSM 1 B. bifidum DSM 46 T NC1MB 88 B. bourn ATCC T B. breve ATCC 700 T DSM 091 LMG B. catenulatum ATCC 2739 T ATCC 2767 B. dentium ATCC 2734 T B. gallicum DSM 093 T B. gallinarum ATCC T B. infantis LMG 8811 T B. inopinatum DSM 7 T B. longum ATCC 707 T B. magnum ATCC 27 T B. pseudocatenulatum DSM 438 T B. pseudolongum ATCC 226 T B. suis ATCC 2733 T 8

9 2. táblázat (folytatás) Törzs Eredet 3 Más törzsek Bacillus cereus ATCC Bacteroides fragilus LMG 263 T Brevibacterium casei Clostridium difficile Enterococcus feacalis ATCC 313 T ATCC 9689 T DSM 478 T Escherichia coli ATCC 3218 Lactobacillus acidophilus ATCC 436 T Lactobacillus brevis LMG Lactobacillus bulgaricus ATCC T Lactobacillus casei ATCC 393 T DSM 011 T Lactobacillus fermentum Lactobacillus plantarum Lactobacillus renteri DSM 02 T DSM 174 T LMG 9213 T Lactobacillus rhamnosus ATCC 33 Listeria monocytogenes ATCC 7644 Pediococcus acidilactici DSM 284 T Propionibacterium avidum DSM 4901 Pseudomonas aeruginosa DSM 1117 Saccharomyces cerevisiae DSM 248 Salmonella typhimurum ATCC 128 Staphylococcus aureus ATCC ATCC: USA-beli sejttenyészet- és mikroorganizmusgyûjtemény (American Type Culture Collection); DSM: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Németország; LMG: Mikrobiológiai Laboratórium, Genti Egyetem (Laboratory for Microbiology, University of Gent), Belgium; NCIMB: Ipari és Tengeri Baktériumok Nemzeti Gyûjteménye (National Collections of Industrial and Marine Bacteria), Egyesült Királyság. Minden bifidobaktérium törzset Mann Rogosa Sharp (MRS) tápoldaton (Oxoid, Basingstoke, Egyesült Királyság), 37 C¹on, 24 órán át tenyésztettünk anaerob körülmények között. A 12 órás tenyészeteket a további feldolgozásig C¹on tároltuk. Baktériumtenyészetbõl DNS¹t vontunk ki oly módon, hogy ml¹es 12 órás fagyasztott tenyészetet jeges vízben felolvasztottunk. Ezt követõen a tenyészeteket percig 00 rpm-mel végzett centrifugálással (Sorvall RT7, Du Pont, Stevenage, Egyesült Királyság) leülepítettük a baktériumsejteket. Az üledékeket 1 ml TES-sel (0 mm Tris-HCl [ph 8,0], mm EDTA, 0 mm NaCl) mostuk, majd percig 00 rpm-mel cetrifugáltuk 4 C hõmérsékleten. A felülúszókat eltávolítottuk, és az üledékeket 1 ml THMS-ben ( mm Tris-HCl [ph 8,0], 3 mm MgCl 2, 2% (w/v) szukróz) felszuszpendáltuk. Miután a szuszpenziókat 2 ml¹es Eppendorf-csõbe transzferáltuk, a csövekbe 0 l lizozimet (0,1 g/ml; Sigma Aldrich Chemie, Steinheim, Németország) és l mutanolizint (1 mg/ml; Sigma Aldrich Chemie, 4 0 Németország) mértünk be, és percig 37 C¹on inkubáltuk. Ezt követõen az oldatokat percig 000 rpmmel centrifugáltuk (Sigma 1, Sigma Laborzentrifugen GmbH, Osterode am Harz, Németország) 4 C hõmérsékleten. A felülúszókat eltávolítottuk, és az üledéket 0 l THMS-ben felszuszpendáltuk, majd ehhez 0 l, 0,% SDS¹t tartalmazó TES¹t és 7, l Proteináz K¹t ( mg/ml; Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Németország) adtunk. A keveréket vortexeltük és 6 C¹on inkubáltuk percig. Standard fenol/kloroform extrakció után, 2, l RNáz A¹val (1 mg/ml; Roche Diagnostics, Mannheim, Németország) perces kezelést végeztünk 37 C¹on. A DNS¹t lecsaptuk 2 térfogat jéghideg 96%¹os etanol és 0,1 térfogat 3 M nátrium-acetát (ph,2) hozzáadása után történt legalább perces C¹on való tárolással. A lecsapott oldatokat percig rpm-mel, 4 C¹on centrifugáltuk, és a felülúszókat 00 l 70%¹os etanollal mostuk, majd percig rpm-mel, 4 C¹on centrifugáltuk. A felülúszókat kiöntöttük, és az üledéket 9

10 szobahõmérsékleten szárítottuk. A DNS¹t 0 l steril milliq vízben felszuszpendáltuk és C¹on tároltuk. Elõször az összes ¹nukleázvizsgálat specificitását a különbözõ törzsek (lásd 2. táblázat) 2 l térfogatban történt amplifikálásával teszteltük. E 2 l¹es PCR reakciókban 2, l DNS templát, 12, l TaqMan Universal Master Mix (Applied Biosystems), minden láncindítóból 900 nm és mindegyik próbából 0 nm volt. Ezután futtattuk a TaqMan Universal Temperature Profile¹t, amely az alábbiakból állt: 0 C¹on 2 perc, 90 C¹on perc, majd 9 C¹on perc és C¹on 1 perc 4 ciklusban (ABI Prism 7700 berendezés, Applied Biosystems, Nieuwerkerk a/d Ussel, Hollandia). Az összes ¹nukleázvizsgálat specifikus volt azokra a Bifidobacterium fajokra, amelyekre ki lettek fejlesztve, és az összes Bifidobacterium mennyiségének meghatározására szolgáló ¹nukleázvizsgálat kimutatta az összes tesztelt Bifidobacterium fajt, de más törzsekre, például Propioni-bacterium vagy Lactobacillus, nem reagált. Meg kell jegyeznünk, hogy a B. catenulatum¹ra készített ¹nukleázvizsgálat a B. pseudocatenulatum¹ot is azonosította. Továbbá DNÁzzal és RNÁzzal kezelt mintákat is teszteltünk annak igazolására, hogy a vizsgálat során nem került sor szennyezet RNS kimutatására. Másodszor B. adolescentis, B. angulatum, B. breve, B. bifidum, B. catenulatum, B. dentium, B. infantis és B. longum fajok monokultúráiból keveréket készítettünk, annak igazolása céljából, hogy e keverék összegzése kitesz¹e körülbelül 0%¹ot. Abban az esetben a különféle, templátként szolgáló Bifidobacterium fajok közötti versengés kizárható. Ténylegesen ez a helyzet áll fenn, ahogyan az a keverékben lévõ egyes Bifidobacterium fajok meghatározott mennyiségét és a keverékben lévõ Bifidobacterium fajok összes mennyiségét bemutató 1. ábrán látható. A különféle ¹nukleázvizsgálatok reprodukálhatóságára és megismételhetõségére meghatározott CV értékek a 3. táblázatban találhatók. 3. táblázat Az ¹nukleázvizsgálatok érzékenysége a hagyományos PCR-rel összehasonlítva, és a nukleázvizsgálatok reprodukálhatósága és megismételhetõsége Cél Érzékenység 3 (x) Reprodukálhatóság 0 [CV (%)] Megismételhetõség 0 [CV (%)] B. adolescentis 000,11,68 B. angulatum ,48,92 B. bifidum 0 11,6 11, B. breve 0 2,06 4,08 B. catenulatum ,42 14,83 B. dentium 0 12,6 11,3 B. infantis ,34 2,31 B. longum 000 9, 8,18 a az olyan esetek száma, amikor az ¹nukleázvizsgálat a hagyományos PCR-nél érzékenyebb volt b a reprodukálhatóságot 0%¹os monokultúrák tízszeres tesztelésével határoztuk meg, a CV (%) kiszámítása a kapott eredmények alapján történt c a megismételhetõséget 0%¹os monokultúrák tízszeres tesztelésével határoztuk meg, a CV (%) kiszámítása a kapott eredmények alapján történt A különféle vizsgálatok érzékenységének meghatározása és a tévesen pozitív vagy negatív eredmények ellenõrzése céljából a kifejlesztett ¹nukleázvizsgálatot összehasonlítottuk a Matsuki és munkatársai által leírt láncindítók [Matsuki. Watanabe, Tanaka, Fukuda, és Oyaizu, Distribution of bifidobacterial species in human intestinal microflora examined with 16S rrna-gene-targeted species-specific primers. 4 0 Appl. Environ. Microbiol., 6, (1999)] alkalmazásával végzett hagyományos, kvalitatív fajspecifikus PCR-rel. A 3. táblázat mutatja be az ¹nukleázvizsgálat különféle érzékenységeit a hagyományos fajspecifikus PCR-hez viszonyítva. A 4. táblázat mutatja be a duplex ¹nukleázvizsgálatban alkalmazott láncindító és próba végsõ optimális koncentrációit. 4. táblázat A duplex ¹nukleázvizsgálatokban alkalmazott láncindító és próba végsõ optimalizált koncentrációja Cél -nukleázvizsgálat Elõre láncindító (nm) Vissza láncindító (nm) Próba (nm) B. adolescentis B. adolescentis Összes Bifidobacterium 0 0 0

11 4. táblázat (folytatás) Cél -nukleázvizsgálat Elõre láncindító (nm) Vissza láncindító (nm) Próba (nm) B. angulation B. angulatum Összes Bifidobacterium B. bifidum B. bifidum Összes Bifidobacterium B. breve B. breve Összes Bifidobacterium 0 B. catenulatum B. catenulatum Összes Bifidobacterium B. dentium B. dentium Összes Bifidobacterium B. infantis B. infantis Összes Bifidobacterium B. longum B. longum Összes Bifidobacterium Összes Összes Bifidobacterium 0 Bifidobacterium Összes baktérium példa: Klinikai vizsgálat A vizsgálat kettõs vak, placebóval szabályozott, több központban zajló, két kezelési csoporton végzett vizsgálat volt. Teljesen tápszerrel táplált, napos csecsemõket négy németországi kórházból válogattunk be. Olyan csecsemõk kerültek be a vizsgálatba, akiknek születési súlya 20 és 0 g közötti volt, és akiket a beavatkozási idõszak kezdete elõtt legalább négy hétig teljes mértékben tápszerrel etettek. Veleszületett rendellenességtõl szenvedõ, illetve tehéntejre bizonyítottan vagy feltételezetten allergiás csecsemõk, ikerszülésbõl származó csecsemõk, a vizsgálat 3 kezdete elõtt két héten belül antibiotikummal kezelt csecsemõk, a vizsgálat kezdete elõtt egy hónapon belül bármilyen pro- vagy prebiotikummal táplált csecsemõk a vizsgálatban nem vettek részt. A beválogatás után a csecsemõket véletlenszerûen a két kezelési csoport egyikébe soroltuk be. Az egyik csoportot 0,8 g/0 ml galaktooligoszacharidokkal és fruktopoliszacharidokkal kiegészített csecsemõtápszerrel etettük (GFSF csoport), a másik csoport pedig standard csecsemõtápszert kapott (SF csoport). A tápszerek makrotápanyag-összetételét az. táblázatban mutatjuk be.. táblázat A vizsgált tápszerek makrotápanyag-összetétele (a kész tápszer 0 ml¹ére vetítve) Szénhidrátkeverékkel kiegészített tápszer (GOS/FOS-tartalmú Aptamil 1, Milupa) Standard tápszer (Aptamil 1, Milupa) Energiatartalom (kcal) Fehérje (g) 1, 1, Szénhidrát (g) 8, 8, laktóz (g) 7, 7, keményítõ (g) 1 1 Emészthetetlen oligoszacharidok (g) 0,8 0 galaktooligoszacharidok (g) 0,72 0 fruktopoliszacharidok (g) 0,08 0 Zsiradék (g) 3,6 3,6 Referenciacsoportként (BF csoport) egy csoport szoptatott csecsemõ szerepelt. Ürülékmintákat gyûjtöttünk a vizsgálati szakasz kezdete után három napon belül, 4 héttel késõbb és a vizsgálati szakasz (6 hét) 11

12 2 3 4 végén. A vizsgálatot a négy kórház orvosetikai bizottságai engedélyezték. A vizsgálat kezdete elõtt a szülõktõl írott beleegyezési nyilatkozatot szereztünk be. Nukleinsavak izolálásához, székletmintákat olvasztottunk ki jeges vízben, majd a mintákat PBS-sel (0,37 M NaCl, 2,7 mm KCl, 8,1 mm Na 2 HPO 4 [ph 7,4]) ¹szeresre hígítottuk, és stomacher homogenizáló (IUL Instruments, Barcelona, Spanyolország) alkalmazásával percig homogenizáltuk. A homogenizált székletmintákat az aktuális DNS-izolálás elõtt C¹on tároltuk. Az extrakcióhoz 1 ml homogenizált székletmintát jeges vízben kiolvasztottunk, majd 1 percig 10 rpm-mel centrifugáltuk a törmelékek és a nagyobb részecskék eltávolítása végett. A felülúszókat egy új csõbe vittük át, és percig 000 rpm-mel centrifugáltuk. Ezt követõen az üledéket 1 ml TN0 oldatban ( mm Tris-HCl [ph 8,0], mm EDTA) felszuszpendáltuk, és 0,3 g cirkóniumgyöngyöt (0,1 mm átmérõjû, BioSpec Products, Bartlesville, USA) tartalmazó steril csõbe vittük át. Ehhez a szuszpenzióhoz 0 l, TE¹vel pufferelt fenolt (ph±7,) adtunk, és a mintákat egy minigyöngyzúzó gépbe mini-bead beater ¹be (BioSpec Products, Bartlesville, USA) helyeztük 3 percre (000 rpm). A gyöngyök zúzása után a mintákat jégen azonnal lehûtöttük, majd 0 l kloroformot adtunk hozzájuk. Rövid vortexelés és perces, 000 rpmmel végzett centrifugálás után a minták felsõ fázisát tiszta 2 ml¹es Eppendorf-csövekbe vittük át, és fenol/kloroform extrakcióba kezdtünk. A fenol/kloroform extrakció után a DNS¹t, 1 ml jéghideg etanol (96%) és 0 l 3 M nátrium-acetát (ph,2) hozzáadása után, a minták legalább percig tartó C¹os hûtésével csaptuk le. Ezután a mintákat percig rpmmel centrifugáltuk és 00 l 70%¹os etanollal mostuk. Öt percig tartó rpm¹es centrifugálás után a felülúszókat kiöntöttük, és az üledéket levegõn, szobahõmérsékleten megszárítottuk. A DNS¹t 0 l steril milliq vízben felszuszpendáltuk és C¹on tároltuk. A duplex ¹nukleázvizsgálatot alkalmaztuk a székletmintákban lévõ különbözõ Bifidobacterium fajok relatív mennyiségi meghatározására. Az egyes fajok relatív mennyiségét a Liu és munkatársai által leírtak [Liu és munkatársai (02)] szerint számítottuk ki. Röviden, minden amplifikációs görbe hatékonyságát külön-külön számítottuk ki az E=(küszöb A /küszöb B ) (Ct,A Ct,B) 1 képlet segítségével. A kiszámított hatékonyságok segítségével kiszámítottuk a DNS kezdeti mennyiségét (R 0 )az Ro=küszöb/(1+E) Ct képlet alkalmazásával. Egy adott Bifidobacterium faj DNS-ének kezdeti mennyiségét ekkor el lehetett osztani az összes Bifidobacterium faj DNSének kezdeti mennyiségével. Ezután a kapott arányokat normalizálni lehetett a 0%-nak vett monokultúraarány segítségével. A korábbiakban leírt FISH segítségével [Langendijk, Schut, Jansen, Raangs, Kamphuis, Wilkinson és Welling Quantitative fluorescence in situ hybridisation of Bifidobacterium spp. with genus-specific 16S rrnatargeted probes andits application in fecal samples Appl. Environ. Microbiol. 61, (199)] meghatároztuk a Bifidobacteriumok összes mennyiségét is. A Bifidobacterium nemzetség aránya az összes baktériumhoz képest 7% (BF), 47% (SF) és 68% (GFSF csoport) volt, ami jelzi, hogy akárcsak a BF csoportban, az emészthetetlen ok keverékével táplált GFSF csoportban több bifidogén flóra van, mint az SF csoportban. A 6. táblázat bemutatja az egyes fajok elterjedtségét a különféle csoportokban a vizsgálat kezdetekor és végén. A 7. táblázat a Bifidobacterium fajok százalékos arányát mutatja be a Bifidobacteriumok összes mennyiségéhez viszonyítva. 6. táblázat A Bifidobacterium fajok százalékos elterjedtsége anyatejjel (BF), prebiotikus keveréket tartalmazó csecsemõtápszerrel (GFSF) vagy standard tápszerrel (SF) 6 hétig táplált csecsemõk székletében Faj BF GFSF SF B. catenulatum B. adolescentis 11 0 B. breve B. longum B. bifidum B. angulatum B. infantis B. dentium táblázat Hathetes táplálási idõszak után a székletben talált Bifidobacterium fajok százalékos aránya a Bifidobacteriumok összes számával összehasonlítva Faj Szoptatott % (sd) GFSF-fel táplált % (sd) SF-fel táplált % (sd) B. catenulatum 1,9 (1,0) 1, (3,0) 9,8 (12,6) B. adolescentis 0,3 (0,9) 0,1 (0,2) 2,9 (6,0) B. breve 11,7 (9,6),4 (,8) 4,9 (,7) B. longum 7,3 (13,9),4 (,7) 6,2 (9,4) B. bifidum <0,1 (0,0) <0,1 (0,0) <0,1 (0,0) B. angulatum <0,0 (0,0) <0,1 (0,2) <0,1 (0,0) 12

13 7. táblázat (folytatás) Faj Szoptatott % (sd) GFSF-fel táplált % (sd) SF-fel táplált % (sd) B. infantis 32,0 (18,9) 32,1 (,0) 37,8 (18,4) B. dentium <0,1 (0,0) <0,1 (0,0) <0,1 (0,0) A három különbözõ csoportban a legkülönfélébb Bifidobacterium fajok voltak jelen. Továbbá a B. adolescentis elterjedtségében és mennyiségében a standard tápszerrel etetett csecsemõkhöz képest jelentõs csökkenés látható a szoptatott csecsemõk és a GFSF-fel táplált csecsemõknél. Hathetes táplálás után a B. adolescentis elterjedtsége és aránya sokkal magasabb az SF¹fel táplált babákban, mint a GFSF-fel táplált vagy szoptatott babákban. GFSF csecsemõk székletmintáinak analízise a szoptatott csecsemõkéhez hasonló, változatos bifidobaktérium flórát mutatott ki, és nem figyeltünk meg olyan jelenséget, miszerint csak egyetlen vagy néhány lett volna serkentve. A B. adolescentis hatása mellett a szoptatott csecsemõk és GFSF¹et kapó csecsemõk profilja a standard tápszerrel táplált csecsemõk profiljához képest kevesebb B. catenulatum (+ B. pseudocatenulatum) jelenlétére utalt. Úgy tûnik, hogy a szoptatott csecsemõkben, akárcsak a standard tápszerrel (SF) vagy prebiotikumokkal kiegészített standard tápszerrel (GFSF) etetett csecsemõkben, a B. infantis és B. longum az uralkodó faj. A B. breve szintén domináns volt mindhárom csoportban, de az anyatejjel táplált csoportban a B. breve százalékos aránya az összes bifidobaktériumtartalomra viszonyítva magasabb (11,7%) volt, mint az SF (4,9%) és GFSF (,4%) csoportban. 3. példa: Állatokon végzett allergiavizsgálat Speciális, kórokozótól mentes BALB/c egereket szereztünk be a Charles Rivertõl (Maastricht, Hollandia). Víz és táplálék szabadon elérhetõ volt, és az egereket 6 9 hetes korukban használtuk fel. Minden vizsgálatot a University of Utrecht (Hollandia) állatetikai bizottsága engedélyezett. A 0. és 7. napon egereket érzékenyítettünk 2,2 mg alumínium-hidroxidra adszorbeált g ovalbumint tartalmazó sóoldat vagy csak sóoldat formájában beadott 2 ip. injekcióval. A 3., 38. és 41. napon egereket kezeltünk ovalbumintartalmú aeroszol percig tartó inhaláltatásával egy plexibõl készült kamrában. Az aeroszolokat mg/ml ovalbumintartalmú sóoldat Pari LC Star nebulizer (Pari respiratory Equipment, Richmond, VA, USA) alkalmazásával végzett porlasztásával állítottuk elõ. Az egereket naponta egyszer 1 9 cfu Bifidobacterium breve-vel és 2 mg, galaktooligoszacharidokból és fruktopoliszacharidokból álló keverékkel (9:1) kezeltük gyomorszondán át (0,2 ml, fiziológiás sóoldat) a 28. naptól kezdve egészen a vizsgálat végéig (azaz a 42. napig). Kontrollként 0,2 ml fiziológiás sóoldatot adtunk be szondán át. Belélegzett, porlasztott metakolinra adott légúti reakciókat az utolsó aeroszolos kezelés után 24 órával határoztunk meg öntudatánál lévõ, szabad egereken végzett teljes test pletizmográfiával (BUXCO, EMKA, Párizs, Franciaország). A légúti választ fokozott szünetként [enhanced pause (PenH)] adtuk meg. Statisztikai analízis: A metakolinra adott légúti válasz görbéjét általános lineáris modell vagy megismételt mérések formájában, majd a csoportok között ezután végzett összehasonlítással statisztikailag analizáltuk. Sejtszámokat statisztikailag analizáltunk a Mann Whitney-féle U teszt alkalmazásával [Siegel és Castellan, Nonparameiric statistics for the behavioural sciences 2 nd ed. McGraw Hill Book Company, New York, USA (1988)]. Minden más analízist a Student-féle t¹teszt alkalmazásával végeztünk [Abramowitz és Stegun, Handbook of mathematical functions Dover publications, Inc. New York, USA (1972)]. Statisztikailag szignifikánsnak a p<0,0 valószínûségi értéket tekintettük. Légúti túlérzékenységre kapott eredmények: Légúti túlérzékenységen végzett mérések kimutatták, hogy a kontrollhoz képest a B. breve¹t+galaktooligoszacharidok és fruktopoliszacharidok keverékét kapott egereknél a légúti túlérzékenység statisztikailag lecsökkent, ami alacsonyabb asztmatikus reakciót jelent. A 2. ábrán a relatív PenH-ként (fokozott szünet) megadott légúti túlérzékenységet a B. breve + GOS/FOS keverék kombinációjával kezelt és az ehelyett csak sóoldatot kapott kontrollegereknek adott metakolin koncentrációjának függvényében ábrázoltuk. A feltüntetett relatív PenH értékekhez az ovalbuminnal nem érzékenyített egereknél kapott blank értékek levonásával és a legmagasabb metakolinkoncentrációval kezelt kontrollcsoport esetében kapott értékhez való normalizálással jutottunk. Az alábbi minden példa összetétele tartalmazhat továbbá ásványi anyagokat, nyomelemeket és vitaminokat, kolint, taurint, karntint és/vagy mioinozitolt, vagy ezek keverékeit a technikában ismertek szerint és a nemzetközi útmutatásokkal összhangban. Ezenfelül szerves savak, ízanyagok vagy színezékek is jelen lehetnek, de akár hiányozhatnak is. Ovalbumint (V. minõségû) és acetil-p-metil-kolinkloridot (metakolin) a Sigma Chemical Co.¹tól (St. Louis, MO, USA) szereztünk be. Alumínium-hidroxidot (AlumInject) a Pierce-tõl (Rockford, IL, USA) vásároltunk. 4. példa Csecsemõtejtápszer, amely 0 ml végtermékre (és 13,1 g porra) nézve az alábbiakat tartalmazza: 8 energia% fehérje 1,4 g (kazeintejsavó keverék) 4 energia% emészthetõ 7, g 13

14 47 energia% zsír 3, g GOS (90% galaktooligoszacharidok, Borculo Domo NL)/polifruktóz, (% inulin, Raftilin HP, Orafti BE) 0,4 g B. breve 1,3 8 cfu. példa Csecsemõtejtápszer, amelynek 0 ml¹e (és 14 g energia% fehérje 1,8 g (kazeintejsavó keverék) 46 energia% emészthetõ 8,0 g 44 energia% zsír 3,4 g GOS/polifruktóz (lásd 4. példa) 0,4 g B. breve 1,4 8 cfu 6. példa Csecsemõtejtápszer, amelynek 0 ml¹e (és 16,1 g energia% fehérje 1,9 g (kazeintejsavó keverék) 1 energia% emészthetõ 9,9 g 39 energia% zsír 3,3 g FOS (Raftilin, Orafti)/galaktomannán 9/1 0,4 g B. breve 1,6 8 cfu 7. példa Csecsemõtejtápszer, amelynek 0 ml¹e (és 13 g energia% fehérjeekvivalens 1,6 g (hidrolizált tejsavófehérje) 42 energia% emészthetõ 7,1 g 48 energia% zsír 3,6 g Szialil oligoszacharidok, emészthetetlen maltodextrinek 9/1 0,4 g B. breve 6, 8 cfu/g 8. példa Csecsemõtejtápszer, amelynek 0 ml¹e (és g energia% fehérjeekvivalens 1,8 g (hidrolizált tejsavófehérje) 42 energia% emészthetõ 8,6 g 44 energia% zsír 3,6 g Fukooligoszacharidok (algaeredetû fukoidánból), galaktomannán 8/2 0,4 g B. breve 7, 8 cfu 9. példa Csecsemõtejtápszer, amelynek 0 ml¹e (és,1 g energia% fehérjeekvivalens 1,8 g (hidrolizált tejsavófehérje) energia% emészthetõ 8,6 g 44 energia% zsír 3,6 g Mannooligoszacharidok, arabinogalaktán 9/1 0,4 g B. breve 1, 8 cfu. példa Csecsemõtejtápszer, amelynek 0 ml¹e (és,2 g energia% fehérje 1,7 g (hidrolizált tejsavófehérje) 48 energia% emészthetõ 8,4 g 42 energia% zsír 3,3 g GOS/galaktoruron oligoszacharidok/polifruktóz 7/2/1 1,0 g B. breve 7, 8 cfu 11. példa Csecsemõtejtápszer, amelynek 0 ml¹e (és,8 g 11 energia% fehérje 1,9 g (hidrolizált tejsavófehérje) 48 energia% emészthetõ 8,7 g 41 energia% zsír 3,3 g Xilooligoszacharidok/galaktán 9/1 0,8 g B. breve 8 8 cfu 12. példa Csecsemõtejtápszer, amelynek 0 ml¹e (és g energia% fehérje 1,7 g (kazeintejsavó keverék) 48 energia% emészthetõ 8,1 g 42 energia% zsír 3,1 g GOS/polifruktóz 9/1 0,8 g Galaktomannán 0,42 B. breve 1, 8 cfu 13. példa Csecsemõtejtápszer, amelynek 0 ml¹e (és,9 g 13 energia% fehérje 2,2 g (kazeintejsavó keverék) 49 energia% emészthetõ 8,6 g 37 energia%zsír 3,0 g GOS/polifruktóz 9/1 0,8 g Galaktomannán 0,4 g B. breve 1,6 8 cfu 14. példa Csecsemõtejtápszer, amelynek 0 ml¹e (és 13, g 9 energia% fehérjeekvivalens 1, g (hidrolizált tejsavófehérje) 14

15 42 energia% emészthetõ 6,9 g 49 energia% zsír 3,6 g GOS/polifruktóz/szialillaktóz 7/2/1 0,8 g B. breve 1,4 8 cfu. példa Csecsemõtejtápszer, amelynek 0 ml¹e (és 13,7 g 9 energia% fehérjeekvivalens 1,4 g (szabad aminosavak) 44 energia% emészthetõ 7,1 g 47 energia% zsír 3,4 g GOS/polifruktóz 6/4 0,8 g B. breve 1,4 8 cfu 16. példa Csecsemõtápszer, amelynek 0 ml¹e (és 13, g 11 energia% fehérje 1,8 g (szójaeredetû fehérje) energia% emészthetõ 6,7 g 49 energia% zsír 3,6 g GOS/galaktooligoszacharidok/ polifruktóz 8/1/1 0,8 g B. breve 1,4 8 cfu 17. példa Csecsemõtápszer, amelynek 0 ml¹e (és,1 g 12 energia% fehérje 2,2 g (szójaeredetû fehérje) 43 energia% emészthetõ 7,7 g 4 energia% zsír 3,6 g FOS/galaktán 9/1 0,8 g B. breve 1, 8 cfu 18. példa Csecsemõtápszer, amelynek 0 ml¹e (és 16, g 13 energia% fehérje 2,0 g (hidrolizált tejsavófehérje) 7 energia% emészthetõ 8,6 g energia% zsír 2,0 g GOS/polifruktóz 9/1 1,0 Szójaeredetû poliszacharidok 0, B. breve 1, 9 cfu 19. példa Tejalapú termék, amelynek 0 ml¹re az alábbiakat tartalmazza: 14 energia% fehérje 2, g (tehéntejbõl származó fehérje) 43 energia% emészthetõ 7, g energia% zsír 3,4 g GOS/polifruktóz 7/3 1, g B. breve 3 8 cfu. példa Csecsemõtápszer, amelynek 0 ml¹e (és,4 g 11 energia% fehérje 2,0 g (hidrolizált kollagén és szójaeredetû fehérje) 46 energia% emészthetõ 8,6 g 43 energia% zsír 3,6 g GOS/polifruktóz 3/1 0,4 g B. breve 6 8 cfu 21. példa Táplálékkiegészítõ: 0 ml tejhez adandó por, amelynek 3 g¹ja az alábbiakat tartalmazza: 28 energia% fehérje 0,7 g (kazeintejsavó keverék) 72 energia% emészthetõ 2,0 g GOS/polifruktóz 6/3 0,3 g B. breve 3 9 cfu 22. példa Táplálékkiegészítõ, amelybõl 0,4 0,8 g¹ot kell 0 ml tejhez adni, és amelynek 1 grammja az alábbiakat tartalmazza: 0,26 g galaktomannán 0,44 g emészthetõ 0,3 g GOS/polifruktóz 8/ 1,0 9 cfu B. breve 23. példa Táplálékkiegészítõ, amelynek 0 ml¹e az alábbiakat tartalmazza: 0 energia% emészthetõ 2,2 g Ásványi anyagok K, Na, Cl Ozmotikus nyomás 261 mosm/l GOS/polifruktóz /4 0,4 g B. breve 1 9 cfu 24. példa Csecsemõtáp, amelynek 0 g¹ja az alábbiakat tartalmazza (8 g¹ot kell adni 2 ml tejhez): 4 energia% fehérje 4,7 g (tehéntejbõl származó fehérje) 3 energia% emészthetõ 68 g 43 energia% zsír 24,6 g GOS/polifruktóz 9/1 0,8 g B. breve 1,2 9 cfu 2. példa Csecsemõtáp (csövön át tápláláshoz), amelynek 0 ml¹e az alábbiakat tartalmazza: 9 energia% fehérje 3,4 g (kazein)

16 0 energia% 18,8 g 41 energia% zsír 8 g GOS/polifruktóz 7/3 0,4 g B. breve cfu 26. példa Csecsemõtáp, amelynek 0 ml¹e az alábbiakat tartalmazza: 11 energia% fehérje 2,8 g (kazein) 49 energia% 12,3 g energia% zsír 4,4 g GOS/polifruktóz 8/ 0,8 g B. breve cfu 27. példa Rizslisztbõl álló csecsemõtáp, amely száraz termék 0 g¹ja az alábbiakat tartalmazza (4 7 evõkanálnyit kell adni 0 ml meleg csecsemõtápszerhez, anyatejkiegészítõ tápszerhez, kisgyerekeknek szánt tejhez vagy tehéntejhez): 7,4 g fehérje (növényi eredetû) 83 g 0, g zsír 3 g étkezési rost, amelynek fele (1, g) GOS/polifruktóz 9/1 1 cfu B. breve 28. példa Elõfõzött (búza, rozs, rizs, árpa, kukorica, zab, hajdina) pelyheket tartalmazó csecsemõtáp, amelybõl 0 g száraz termék az alábbiakat tartalmazza ( 7 evõkanálnyit kell adni ml meleg csecsemõtápszerhez, anyatej-kiegészítõ tápszerhez, kisgyerekeknek szánt tejhez vagy tehéntejhez): 9, g fehérje (növényi eredetû) 74 g 2,0 g zsír 3 g étkezési rost, amelynek fele (1, g) GOS/polifruktóz 8/2 2 cfu B. breve 29. példa Homogenizált zöldségekbõl vagy gyümölcsökbõl álló csecsemõtáp, amelynek 0 ml¹e az alábbiakat tartalmazza: GOS/polifruktóz 7/2 2,0 g B. breve 2 9 cfu SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Bifidobacterium breve¹t és legalább két, emészthetetlen, oldható komponens, azaz A és B komponensek keverékét tartalmazó készítmény, ahol az A komponens szerkezete -monoszacharid-egységek tekintetében eltér a B komponensétõl, az A komponens az A és B komponens összes mennyiségének 9 tömeg%¹át kitevõ mennyiségben van jelen, az összes emészthetetlen, oldható ok legalább 0%¹a a diszacharidoktól az eikozaszacharidokig terjedõ ok közül választott; és az A és B komponens különbözik egymástól a monoszacharidegységek számában, ahol az A komponens átlagos lánchosszúsága legalább monoszacharidegységgel rövidebb, mint a B komponens átlagos lánchosszúsága. 2. Az 1. igénypont szerinti készítmény, ahol az A komponens nem emészthetõ, ugyanolyan szerkezetû, legfeljebb hexaszacharid méretû monoszacharidokból választott, míg a B komponens ugyanolyan -szerkezetû heptaszacharidok vagy annál magasabb tagszámú poliszacharidok közül választott. 3. Az 1 2. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, ahol az A komponens 9 tömegszázalékot, a B komponens tömeg%¹ot tesz ki, és ahol A+B=0 tömeg%. 4. Az 1 3. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, ahol az A komponens legalább tömeg%¹a, elõnyösen 80 0 tömeg%¹a a galaktooligoszacharidok csoportjába, elõnyösen a transzgalaktooligoszacharidok közé tartozik.. Az 1 4. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, ahol a B komponens legalább tömeg%¹a, elõnyösen 80 0 tömeg%¹a a fruktooligoszacharidok csoportjába tartozik, az inulint is beleértve. 6. Az 1. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, amely az összes emészthetetlen, oldható 1 g¹jára vonatkoztatva 11 cfu Bifidobacterium breve¹t tartalmaz. 7. Az 1 6. igénypontok bármelyike szerinti készítmény táplálékkiegészítõként való alkalmazásra, ahol a táplálékkiegészítõben a probiotikum Bifidobacterium breve cfu/g mennyiségben van jelen a táplálékkiegészítõ 1 grammjára számolva. 8. Az 1 6. igénypontok bármelyike szerinti készítmény csecsemõtápként való alkalmazásra, ahol a táplálékkiegészítõben a probiotikum Bifidobacterium breve cfu/g mennyiségben van jelen a csecsemõtáplálék-kiegészítõ 1 grammjában. 9. Csecsemõknek szánt táplálékkiegészítõ, amely az 1 7. igénypontok bármelyike szerinti készítményt, továbbá emészthetõ ot, lipidforrást és/vagy fehérjeforrást tartalmaz, és/vagy ezek keverékét tartalmazza.. Csecsemõtáp, amely az 1 6. és 8. igénypontok bármelyike szerinti készítményt, továbbá emészthetõ ot, lipidforrást és fehérjeforrást tartalmaz. 11. Az 1 8. igénypontok bármelyike szerinti készítmény alkalmazása nem vagy csak részben szoptatott csecsemõk gyomor- és bélcsatornájában lévõ Bifidobacterium fajok összetételének a szoptatott csecsemõk gyomor- és bélcsatornájában lévõ összetételre való normalizálására szolgáló készítmény gyártására. 12. Az 1 8. igénypontok bármelyike szerinti készítmény alkalmazása egy vagy több immun-rendellenes- 16

17 ség megelõzésére vagy kezelésére szolgáló készítmény gyártására. 13. A 12. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az immun-rendellenesség az alábbiak közül választott: allergia, atópia, az orrnyálkahártya allergiás gyulladása, táplálék-túlérzékenység, atópiás bõrgyulladás, ekcéma és asztma. 14. A 12. vagy 13. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az immun-rendellenesség az alábbiak közül választott: hasmenés és vírusos hasmenés.. Az 1 8. igénypontok bármelyike szerinti készítmény alkalmazása energiafelvétel zavarának megelõzésére és/vagy kezelésére szolgáló készítmény gyártására. 16. Az 1 8. igénypontok bármelyike szerinti készítmény alkalmazása allergiás léziókban az eozinofil, neutrofil granulociták és mononukleáris sejtek beszûrõdésének gátlására, és/vagy a Th2 típusú immunválasz gátlására és/vagy a Th1 által közvetített immunválasz serkentésére szolgáló készítmény gyártására. 17. Legalább két, emészthetetlen, oldható komponens, azaz A és B komponensek keverékének alkalmazása Bifidobacterium catenulatum, B. pseudocatenulatum és/vagy B. adolescentis baktériumfajoknak nem vagy részben szoptatott csecsemõk gyomor- és bélcsatornájában található Bifidobacteria teljes számához viszonyított relatív mennyiségeinek csökkentésére szolgáló készítmény gyártás, ahol az A komponens az A és B komponensek összes mennyiségének 9 tömeg%¹át kitevõ mennyiségben van jelen; az összes emészthetetlen, oldható ok legalább 0%¹a a diszacharidoktól az eikozaszacharidokig terjedõ ok közül választott; és az A és B komponens különbözik egymástól (i) a monoszacharidegységeinek átlagos számában, és (ii) az A komponens szerkezete -monoszacharid-egységek tekintetében eltér a B komponensétõl. 17

18 HU T2 Int. Cl.: A23L 1/29 Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest