Készítette: G.-Tóth László

Átírás

1 Beszámoló a A veszélyeztetett biodiverzitás megőrzése a Pannon ökorégióban: az ökológiai, morfológiai és genetikai diverzitás értékelése szentély jellegű és emberi tájhasználatnak kitett élőhely komplexekben. -című pályázat (OTKA NKTH CNK80140, vezető kutató: Dr. Bíró Péter akadémikus) első évében végzett zooplankton kutatások eredményeiről. Készítette: G.-Tóth László A kutatómunkában közreműködtek: Laura Parpala, Nédli Judit, Ponyi Jenő és Tóth Adrienne Bevezetés Munkánk fő célja 2010-ben a mintaterületek kiválasztása, és a mintavételek és mikroszkópos feldolgozások megkezdése volt a zooplankton fajdiverzitáss feltárása céljából a zavart és a zavartalan, szentély jellegű vízterekben, valamint a morfometriai mérések megkezdése néhány kitüntetett fajon. Továbbá, a szikesekben jellegzetes piros színű Copepoda rák, az Arctodiaptomus spinosus (Daday,1891) genetikai vizsgálatának technikai előkészítése volt még feladatunk. Három különböző víztest típust választottunk ki a vizsgálatokhoz, a nagy és sekély Balatont, a fehér és barna szikes tavakat, valamint Mosoni Duna-menti holtágakat, és ezekben történtek az első feltáró jellegű mintavételek, zavartalan, szentély jellegűnek, és zavartnak tekintett területeken. A Balaton esetében azonban egy teljes, részletes fajdiverzitás monitoring történt már 2010-ben. 1. Zooplankton a Balatonban 2010 március és november között három hetenkénti mintavételi gyakorisággal vizsgáltuk a zooplankton fajösszetételét és egyedsűrűségét a Balaton hossztengelyének 5 nyílt vízi pontján (Siófok, Tihany, Zánka, Szigliget és Keszthely magasságában, azaz, az E, A, G, K, és M standard szelvények tóközépi pontjain), amelynek során összesen 60 zooplankton mintát vettünk, és dolgoztunk fel minőségi és mennyiségi vonatkozásban. A tó esetében a siófoki és a tihanyi térségek tekinthetők zavartalannak, a zánkai átmenetinek, és a Szigliget-keszthelyi zavartnak. A mintavételekhez 50 cm magas, és egyszerre 34 liter térfogatú víztömeget megszűrő Schindler- Patalas mintavevőt alkalmaztunk, amely 58 m-es lyukbőségű hálóval volt felszerelve. A

2 vízoszlop mélységétől függően 5-9 -szer engedtük le a mintavevőt egyre lejjebb úgy, hogy a végén a teljes vízoszlopot reprezentáló kompozit mintát nyerjünk. A mintákat etilalkohollal konzerváltuk, és Zeiss-Opton planktonmikroszkóppal dolgoztuk fel 8-10 alminta alapján. A feldolgozás során mintegy 400 egyedig számoltuk. A fajlisták elkészítése mellett kiszámítottuk az egyedszámokat is. A kvalitatív-kvantitatív feldolgozás mellett kalibrált okulár mikrométer segítségével szezonálisan vizsgáltuk a leggyakoribb balatoni Copepoda és Cadocera taxnok morfometriai jellemzőt is Tihanynál és Keszthelynél. Ennek során neutralizált formalinnal tartósított mintákból válogattunk ki állatokat, mert az alkohol túl lággyá téve a vázakat, azok a tárgylemezre terülve amorf módon torzultak. E mérésekhez Zeiss Jenaval kutatómikroszkópot használtunk. A következő taxonok testhosszát mértük: Bosmina longirostris + coregoni, mindig a legnagyobbak (összesen 1080 egyed), Daphnia cucullata, mindig a legnagyobbak (összesen 1560 egyed), Daphnia galeata, mindig a legnagyobbak (összesen 774 egyed), Diaphanosoma sp., mindig a legnagyobbak (összesen 287 egyed), Eudiaptomus gracilis felnőtt hím, felnőtt nőstény, petés nőstény (összesen 295 egyed). A Cladocera-k esetében a sisak, vagy fejtető és a héjtüske közötti távolságot, az E. gracilis-nál a homlok teteje és a furka eredése közötti távolságot mértük. Március 22 és november 8 között, az öt tóközépi mintavételi helyen összesen 9 Rotatoria, 7 Cladocera, 3 Cyclopoida, egy Calanoida Copepoda fajt, ezek különböző korú és fejlődési állapotú lárváit, és a Dreissena (D. polymorpha és D. bugensis) veligera lárváit mutattunk ki. A tó a fajösszetétel tekintetében meglehetősen homogénnek mutatkozott. A Rotatoria-kon belül egyedül a Keratella titinensis fordult elő csak a keleti, zavartalan tóterületeken, illetve az Acanthocyclops vernalis Copepoda az átmenetin. A veligera lárvák teljes Balatonra kapott átlagos egyedsűrűsége 10,44, a Rotatoria sűrűség 31,26, a Cladocera rákoké 33,88, és a Copepoda rákoké 114,40 és a teljes zooplanktoné 191,2 ind liter -1 volt. Medencénként (E, A, G, K és M, azaz Siófok, Tihany, Zánka, Szigliget, Keszthely) a veligera átlagsűrűség 10; 5,3; 11,6; 6,5 és 27,8; a Rotatoria 69,8; 53,6; 41,2; 38,6 és 37,1; a Cladocera 24,3; 21,1; 28; 35,9, 34,1; a Copepoda 132; 103,3; 123,2; 141,3; 159,1, és a teljes zooplankton 235; 183,3; 204,1; 222,2 és 258,1 ind l -1 volt. Tehát, a zooplankton sűrűségi viszonyainak alakulását növekvő sorrendben Tihany < Zánka < Siófok < Szigliget < Keszthely gradiens jellemezte. A tóban a Copepoda-k, majd a Rotatoria-k voltak a legtömegesebbek, a Cladocera-k 8 12 %-ot tettek ki. A különböző taxonok és fejlődési állapotok előfordulását az öt helyen az 1. táblázat, a Cladocera-k, a Copepoda-k, a Rotatoria-k és a kagylólárvák egyedszámainak szezonális alakulását pedig az 1., 2., 3. és a 4. ábra mutatja.

3 1. Ábra: A Cladocera rákok egyedszám alakulása Egyedszám (i l -1 ) /03/ /04/2010 A Cladocera rákok egyedszám változása a Balatonban 2010-ben 22/05/ /06/ /07/2010 Dátum 22/08/ /09/ /10/2010 Keszthely Szigliget Zánka Tihany Siófok 2. Ábra: A Copepoda rákok egyedszám alakulása Egydszám (i l -1 ) /03/2010 A Copepoda rákok egyedszám változása a Balatonban 2010-ben 22/04/ /05/ /06/ /07/2010 Dátum 22/08/ /09/ /10/2010 Keszthely Szigliget Zánka Tihany Siófok

4 3. Ábra: A Rotatoria-k egyedszám alakulása Egyedszám (i l-1 ) A kerekesférgek egyedszám változása a Balatonban 2010-ben Keszthely Szigliget Zánka Tihany Siófok 0 22/03/ /04/ /05/ /06/ /07/2010 Dátum 22/08/ /09/ /10/ ábra: A vándorkagyló lárvák egyedszám alakulása Egyedszám (i l -1 ) A kagylólárvák egyedszám változása a Balatonban 2010-ben 140 Keszthely 120 Szigliget 100 Zánka /03/ /04/ /05/ /06/ /07/2010 Dátum 22/08/ /09/ /10/2010 Tihany Siófok

5 1. Táblázat: A balatoni zooplankton taxonok és formák előfordulása (1) vagy hiánya (0) az öt mintavételi helyen 2010-ben M szelvény K szelvény G szelvény A szelvény E szelvény Taxonomiai csoport Dreissena Keratella cochlearis Keratella quadrata Keratella titinensis Kelicottia sp Polyarthra sp Brachionus sp Pompholyx sp Anaeropsis fissa Ascomorpha sp Rotatoria sp Trihocerca sp Filinia sp Asplanchna sp Daphnia cucculata ad D. cucullata juv Daphnia galeata ad D. galeata juv Diaphanosoma brachiurum ad D. brachiurum juv Bosmina longirostris ad B. longirostris juv Bosmina coregoni ad B. coregoni juv Alona affinis ad A. affinis juv Alona rectangula ad A. rectangulata juv Leptodora kindtii ad L. kindtii juv Sum nauplius Cyclopoida CI Cyclopoida CII Cyclopoida CIII Cyclopoida CIV Cyclopoida CV Cyclopoida CI-V Cyclops vicinus ad Mesocyclops leuckarti ad Acanthocyclops vernalis ad Acanthocyclops viridis ad Cyclops strenus ad Eudiaptomus gracilis CI E. gracilis CII E.gracilis CIII E. gracilis CIV E. gacilis CV E. gracilis CI-V E. gracilis ad

6 A biometriai adatok szerint az állatok testhossza általában nagyobb volt a Keszthelyi Medencében, mint Tihanynál, amelyet a 2. táblázat mutat. A tó leggyakoribb rákja, az E. gracilis, amelynek testhossz-arányait a 5. ábra is mutatja. Taxon 2. Táblázat: Különböző zooplankton taxonok testhossza Tihanynál és Keszthelynél Bosmina (longirostris+coregoni, n=1080) Diaphanosoma sp. (n=287) Daphnia galeata (n=774) Daphnia cucullata Testhossz ( m) S.D. Testhossz ( m) S.D. Tihanynál Keszthelynél 378,35 59,50 407,41 64,33 785,60 169,25 876,02 197, ,2 188, ,23 262,54 949,81 289, ,5 (n=1560) Eudiaptomus gracilis (n=298) E. gracilis hím 975,31 77,1 1044,7 86,6 E. gracilis nőstény 1030,18 56,5 1066,6 76,8 E. gracilis petés nőstény 1053,4 52,9 1105,8 78,33 5 ábra: A felnőtt Eudiaptomus gracilis nemenkénti testhossza Tihanynál, Keszthelynél, és az átlagos hosszak E.gracilis testhossz Testhossz ( m) Adatsor1 Adatsor2 Adatsor3 hím nőstény petés nőstény átlagnőstény átlag felnőtt Szex, Tihany: Adatsor1, Keszthely: adatsor2, Balaton átlag: adatsor3

7 2. Zooplankton a dunai holtágakban A felmérő jellegű zooplankton vizsgálathoz 2010 szeptember 13.-án vettünk mintákat 60 m lyukbőségű planktonhálóval a Püspökerdei Holt Dunából, valamint a Lipóti morotvató nyíltvízi (Lipót 1), valamint szubmerz és emerz vízi makrovegetációval sűrűn benőtt területéről (Lipót 2). Mindkét víztest a Mosoni-Duna mentén található. A Püspökerdei Holt Duna 1985-ben jött létre, amikor a folyó e kanyarját levágták. Az így létrejött holtág 3,8 km hosszú, 75 m széles, és átlagosan 1,7 m mély, vízminősége viszonylag jó, a feliszapolódás és benövényesedés csekély mértékű. A Lipóti morotva-tó fokozottan védett, szentély-jellegű víztest. A mintegy 110 éve létrejött morotva, 2,6 km hosszú, 390 m széles, 0,8 m mély, és vízinövénnyel erősen benőtt. A mintavételek során a felszínről, a vízoszlop közepéről, és a meder közeléből vettünk 3-3 liter vizet, ezeket összeöntöttük, majd 58 mm lyukbőségű hálón szűrtük át, és alkohollal tartósítottuk. A mintákat Zeiss-Opton planktonmikroszkóppal dolgoztuk fel, és a kimutatott taxonómiai egységeket az 3. táblázatban mutatjuk be (3. Táblázat). Megállapítottuk, hogy a Rotatoria-k és a Cladocera rákok tekintetében fajgazdagság a Lipóti morotva-tó nyílvízi területén (Lipót 1) volt a legnagyobb, a Copepoda-k viszont a Püspökerdei Holt Dunában jelentkeztek több fajjal. A növényzettel benőtt Lipót 2 területen viszont szinte nem volt zooplankton, mindössze két Rotatoria fajt mutattunk ki, és egy Copepoda rák naupliusz stádiumú lárváját találtuk. A zooplankton funkcionális diverzitása is a Lipót 1 területen volt a legnagyobb, amennyiben szűrve, ülepítve, és válogatva táplálkozók, és ragadozók is előfordultak. 3. Táblázat: A Rotatoria-k, az Ostracoda-k, a Cladocera-k és a Copapoda-k előfordulása a Püspökerdei Holt Dunában, a Lipót morotva-tóban egy nyíltvízi területen (Lipót 1) és egy vízinövényzettel erősen benőtt területen (Lipót 2.).: PÜSPÖK LIPÓT 1 LIPÓT 2 Taxonómiai összetétel ELSŐDLEGES FOGYAZTÓK ROTATORIA Bdelloidea g.sp + Brachionus calyciflorus + B. calyciflorus dorcas + Habrotrocha sp. + Keratella cochlearis + Lecane arcuata + L. luna + Notomata sp. +

8 Rotatoria g.sp. + Trichocerca sp. + OSTRACODA Ostracoda g.sp. + CLADOCERA Acroperus elongatus + Acroperus sp. + Bosmina coregoni + Camtocercus resctirostris + Daphnia cucullata + Daphnia galeata + Diaphanosoma brachyurum + Pleuroxus aduncus + P. truncatus + Scapholeberis kingi + Simocephalus serrulatus + COPEPODA Nauplius Copepoda g.sp Copepodids I Cyclopoida g.sp + Copepodids II Cyclopoida g.sp + Copepodids V-VI Diaptomida g.sp + Eudiaptomus gracilis + MÁSODLAGOS FOGYASZTÓK Copepodids IV Cyclopoida g.sp + Copepodids V Cyclopoida g.sp + + Microcyclops sp. + TELJES ZOOPLANKTON Zooplankton a szikes tavakban. A szikes tavak kiválasztását a diverzitás vizsgálatokhoz 2010-ben hónapokon át megnehezítette az árvíz és a belvíz, amely nem engedte e kis tavak jellegzetes nyári kémiai karakterét kialakulni. A fajdiverzitás első felmérése a szikes tavakban én, 50 μm - es lyukbőségű kézi plankton hálóval történt gyűjtés a következő helyszíneken: Sós-ér, Büdös-szék, Böddi-szék, Zab-szék, Kelemen-szék. A mintavételi helyek a Felső-Kiskunsági Szikes Tavak láncolatának tagjai. A Sós-ér kivételével fehér vizű szikesek, melyek mélysége 40 cm, vagy ennél is kisebb. A Sós-ér azonban 40 cm-nél mélyebb, átlátszó barna vizű szikes tó, melyet nádas-sásos makrovegetáció övez. A Büdös szék 60 ha, cm mély, és nyáron gyakran teljesen kiszárad. A 656 ha Böddi-szék kiemelten értékes része egy 250 hektáros terület, mely egykor egységes tó volt, de ma több kisebb csatornával megosztották ha sok sekély területtel. Az öt tő közül a Kelemen-szék tekinthető leginkább szentélynek, és a Sós-ér áll legtávolabb ettől. A mintákat a helyszínen etilalkohollal tartósítottuk. A minta feldolgozást Wild M5A sztereo mikroszkóppal és Olympus CH2, valamint Nikon YS2-H fénymikroszkóppal végeztük.

9 A rákplankton összetételét a tipikus szikesekben gyakori fajok alkották. Az Arctodiaptomus spinosus (sziki lebegő kandics) és a Moina brachiata (sziki vízibolha) dominanciája jellemezte a vizeket. Kiemelendő, hogy a későbbi genetikai diverzitás vizsgálatokra kiszemelt, és piros színe miatt dekoratív A. spinosus a Büdös-székben és a Zabszékben 90% fölötti részesedést mutatott a rákok között (3. Táblázat). A Daphnia magna és a Moina fajok számottevő jelenléte pedig arra utal, hogy e vizek bőven szolgáltatnak pikoméretű táplálékot is e finomszűrők számára. 3. Táblázat: Táblázat: Kisrákok % -os összetétele a szikes mintákban Rákfajok és relative arányuk a mintákban % Sós-ér Arctodiaptomus spinosus (Daday) juv. 45 Moina brachiata (Jurine) juv. 45 Cyclops sp. (Metacyclops minutus?) (Claus) juv. 5 Daphnia magna Straus 5 Büdös - szék Arctodiaptomus spinosus (Daday) 92 Daphnia atkinsoni Baird 8 Böddi szék Arctodiaptomus spinosus (Daday) 39 Moina brachiata (Jurine) 36 Daphnia magna Straus 25 Zab - szék Moina brachiata (Jurine) 2 Daphnia magna juv. Straus 2 Arctodiaptomus spinosus (Daday) 96 Kelemen - szék Archtodiaptomus spinosus (Daday) 69 Daphnia magna Straus 27 Moina sp. juv. 4 A Rotatoria plankton 15 faj alkotta. E fajok sós vizekben is előforduló taxonjai közül meg kell említeni a Hexarthra fennica, Filinia terminalis, Filinia cornuta, Lophocharis

10 oxysternon fajokat. A fajdiverzitás szempontjából kiemelendő a Sós-ér, itt forult elő a legtöbb Rotatoria. A Büdös-székben és a Zab-szákben azonban csak egy-egy (4. Táblázat). 4. Táblázat: Kerekesféreg fajok előfordulási adatai Kelemenszék Zabszék Böddiszék Büdösszék Rotatoria Anuraeopsis fissa Gosse, Brachionus angularis Gosse, Brachionus nilsoni Ahlstrom, Bdelloidea sp. + Cephalodella sp + + Colurella colurus (Ehrenberg, 1830) + Conochilus sp. + Filinia cornuta (Weisse, 1847) + Filinia terminalis (Plate, 1886) + Lecane closterocerca (Schmarda, 1859) + + Lecane ungulata (Gosse, 1887) + Lophocharis oxysternon (Gosse, 1851) + Hexarthra sp. + Hexarthra fennica (Levander, 1892) + + Hexarthra mira (Hudson, 1871) + Sós-ér 4. Az Arctodiaptomus spinosus (Daday, 1891) genetikai vizsgálata A Diaptomus fajok közül az Arctodiaptomus spinosus (Daday,1891) (Copepoda) egyike a legkönnyebben felismerhetőknek, a jellegzetes alakú utolsó potrohszelvény és az ivarszelvény alapján (1. fotó). Ez a faj a Pannon Alföld szikes vizein kívül, ahol a rákfauna nagyon jellegzetes tagját alkotja, csak néhány sós vízű kelet- anatóliai tóban fordul elő. Az Arctodiaptomus spinosus előfordulása alapján a Pannon medence összes szikes élőhelye szentély jellegűnek tekinthető, amennyiben faunájában megjelenik az Arctodiaptomus spinosus. Ezért nagyon fontos, hogy megismerjük a faj morfológiai és genetikai változatosságát hazánkban. Az Arctodiaptomus spinosus (Daday, 1891) fajt korábban nem vizsgálták genetikai módszerekkel. Ilyen esetben a genetikai vizsgálatok első, elhagyhatatlan lépése az alkalmazandó módszerek és reakciók (DNS- izolálási technika, PCR reakciók) körülményeinek pontos beállítása. A zooplankton szervezetek kicsi mérete miatt a DNS izolálás lépése különösen kritikus, a kis méretű rendelekezésre álló szövetanyag miatt.

11 1. Fotó: Arctodiaptomus spinosus (Daday, 1891; Dr. Somogyi Boglárka felvétele) A reakciók beállításához a pályázat első évében a Büdös székből én, horizontális hálóvonásokkal gyűjtött, majd 95%-os ethanolban konzervált állatokat használtuk. A gyűjtések random hálózással történtek. A DNS izolálás és a PCR reakciók körülményeinek beállításához a mintából sztereomikroszkóp alatt adult nőstény egyedeket válogattunk ki és a feldolgozásig elkülönítve tároltuk. A DNS izolálást az A.s spinosus adult nőstényekből kétféle módszerrel próbáltuk meg. Qiagen Dneasy Blood & Tissue kit-tet használtunk izolálásra a gyártó által ajánlott használati utasításnak megfelelően négy darab Arctodiaptomus spinosus egyedből. Az izoláló kit alkalmazásán kívül a H3 puffer (Schwenk et al. 1998) módszerrel izoláltunk 15 darab egyedből. Ehhez az állatokat éjszakára Tris-EDTA pufferbe áztattuk, majd csiszoltüveg eppendorf csőben óvatosan szétnyomtuk egy csiszoltüveg spatulával, 50µl H3 pufferben. Ezután a homogenizált szövetet 1,5 ml -es eppendorf csőbe pipettáztuk, hozzáadtunk további 50µl H3 puffert és a fehérjék emésztésére 20µl proteinázk (Fermentas, 18,5 mg/ml) enzimet állatonként. Ezt követően 24 órát 56 C-on inkubáltuk a mintákat, majd 10 percig 96 C-on forralva denaturáltuk a proteinázk-t. Mivel mind a két izolálási módszer megfelelő minőségű

12 és mennyiségű DNS izolátumot eredményezett, a további vizsgálatok elvégzéséhez a költséghatékonyabb H3 puffer módszert használjuk majd. A PCR reakciók körülményeinek beállításakor kétféle Taq polimeráz enzimet teszteltünk négyféle annelációs hőmérsékleten (40 C; 42,9 C; 50,6 C és 57,6 C). Az enzimek közül a sima Taq-polimerázzal (Fermentas) szemben a DreamTaq (Fermentas) enzim adott élesebb jelet. A tesztelt annelációs hőmérsékletek közül 42,9 C on kaptuk a legjobb reakciót (6. ábra). Ez alapján a továbbiakban a PCR reakciókat a DreamTaq enzimmel, 43 C os annelációs hőmérsékletre rakjuk majd össze. Négy egyeden kipróbáltuk a citokróm oxidáz I-es régió szekvenálását is. A szekvenáló reakciót egy ABI 3130 Genetic Analyser kapilláris gélelektroforézis készüléken végeztük el sikeresen. A szekvenciák manuális illesztését a BioEdit (Hall 1999) szoftverrel végeztük, végeredményként 502 bázispárnyi szekvenciákat kaptunk. Két haplotípust sikerült kimutatni (7. ábra). Az A. spinosus genetikai vizsgálatát sikeresen előkészítettük. DNS izolálásra a költséghatékony H3 puffer módszert használjuk majd a továbbiakban, és a PCR reakciókat a DreamTaq enzimmel, 43 C os annelációs hőmérsékletre rakjuk össze. 6. ábra: A PCR reakció körülményeinek tesztelése az Arctodiaptomus spinosus fajra.

13 7. ábra: A büdös- széki Arctodiaptomus spinosus minták összehasonlítása a génbankból letöltött Arctodiaptomus dorsalis egyed szekvenciájával. A fát neighbour-joining algoritmussal, Kimura 2-paraméteres modellje alapján szerkesztettük. Felhasznált irodalom: Hall, T. A BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids. Symp. Ser. : Schwenk, K., A. Sand, M. Boersma, M. Brehm, E. Mader, D. Offerhaus, and P. Spaak Genetic markers, genealogies and biogeographic patterns in the cladocera. Aquatic Ecology 32: Tihany április. 15. Dr. G.-Tóth László tudományos tanácsadó