Doktori (Ph.D.) értekezés. Szegvári Dávid. Semmelweis Egyetem Gyógyszertudományok Doktori Iskola

Átírás

1 A kiroptikai spektroszkópia alkalmazása szteroidok meghatározására és elválasztásuk detektálására, valamint ciklodextrinekkel történő enantioszelektív oldhatóságuk tanulmányozására Doktori (Ph.D.) értekezés Szegvári Dávid Semmelweis Egyetem Gyógyszertudományok Doktori Iskola Témavezető: Dr. Gergely András, a kémiai tudomány kandidátusa Hivatalos bírálók: Dr. Szökő Éva, a gyógyszerészeti tudomány kandidátusa Dr. Török Ilona, a kémiai tudomány kandidátusa Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Klebovich Imre, az MTA doktora Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Perjési Pál, a kémiai tudomány kandidátusa Dr. Török Ilona, a kémiai tudomány kandidátusa Budapest 2007.

2 TARTALOMJEGYZÉK ÖSSZEFOGLALÁS... 4 SUMMARY BEVEZETÉS IRODALMI ÁTTEKINTÉS Kiroptikai spektroszkópia Az optikai aktivitással kapcsolatos alapfogalmak Optikai rotációs diszperzió (ORD) elméleti alapjai Cirkuláris dikroizmus (CD) elméleti alapjai ORD, CD spektrumok és a Cotton-effektus Enantiomerek meghatározása, enantiomer tisztaság Enantiomerek elválasztása elválasztástechnikai módszerekkel Az enantiomer tisztaság és a g-faktor fogalma Kiroptikai detektálás A fontosabb modellvegyületek analitikájának irodalmi háttere etiszteron mellett 5 -etiszteron szennyezés meghatározása Dehidroepiandroszteron meghatározási lehetőségei Enantioszelektív kioldódás, enantioszelektív oldhatóság Poliszacharid származékok vizsgálata Fehérjék vizsgálata Ciklodextrinek alkalmazása Ciklodextrinek szerkezete, tulajdonságai Ciklodextrinek alkalmazása Ciklodextrinek gyógyszertechnológiai felhasználása Ciklodextrinek toxicitása Ciklodextrinek gyógyszeranalitikai felhasználása Enantioszelektív kioldódás tanulmányozása ciklodextrinekkel A komplexstabilitási állandó meghatározásának lehetőségei UV spektrofotometriás módszerek Elválasztástechnikai módszerek (HPLC, CE) Fázis-oldhatósági módszer Egyéb módszerek Norgesztrel-ciklodextrin zárványkomplexek az irodalomban Enantioszelektív folyadék-folyadék fázishatár transzport CÉLKITŰZÉSEK ALKALMAZOTT MÓDSZEREK Alkalmazott kiroptikai módszerek A CD és az ORD spektroszkópia kvantitatív analitikai alkalmazása Enantiomerarány meghatározása g-faktor alkalmazásával A norgesztrel enantiomerarányának meghatározási nehézségei Fázis-oldhatósági vizsgálatok gyakorlata KÍSÉRLETI RÉSZ Műszerek CD spektropolariméter Kromatográfiás mérőrendszerek A kromatográfiás rendszer paraméterei az etiszteron izomerek elválasztására

3 A kromatográfiás rendszerek paraméterei a DHEA és rokon vegyületeik elválasztására Egyéb eszközök Vegyszerek, oldószerek Mintaelőkészítés és mérési körülmények Mintaelőkészítés és mérési körülmények az etiszteron és 5 -etiszteron közvetlen meghatározásánál Mintaelőkészítés és mérési körülmények etiszteron és 5 -etiszteron izomerizációs reakció segítségével történő meghatározásánál Spektrumfelvételi és detektálási körülmények a DHEA és rokon vegyületek HPLC-CD elválasztásánál Mintaelőkészítés és mérési körülmények az alkalmazott ciklodextrinek koncentrációinak ORD módszerrel történő meghatározásánál Mintaelőkészítés és mérési körülmények a norgesztrel enantioszelektív oldhatóságának vizsgálata során Mintaelőkészítés és mérési körülmények a norgesztrel fázis-oldhatósági vizsgálata során Mintaelőkészítés és mérési körülmények a norgesztrel fázishatár transzportjának vizsgálata során Mintaelőkészítés és mérési körülmények a norgesztrel g-faktor kalibrációs egyenesének meghatározása során EREDMÉNYEK ÉS MEGBESZÉLÉS Etiszteron és 5 -etiszteron meghatározása keveréküket tartalmazó mintákból Etiszteron és 5 -etiszteron egymás mellett történő közvetlen meghatározása CD spektroszkópiás módszerrel Etiszteron és 5 -etiszteron közvetett CD spektroszkópiás meghatározása Az etiszteron izomerek meghatározása HPLC-t követő CD detektálással DHEA meghatározása rokon szerkezetű szteroidok mellett, HPLC-CD módszerrel A DHEA és a rokon vegyületek CD spektrumainak jellemzése DHEA és rokon vegyületek elválasztása HPLC rendszerben, CD detektálást alkalmazva Ciklodextrinekkel történő enantioszelektív komplexképzés tanulmányozása Racém norgesztrel enantioszelektív oldhatósága γ- és HP-γ-ciklodextrinek jelenlétében ORD módszer alkalmazása a vizes és oktanolos fázisok ciklodextrin koncentrációjának meghatározására Az enantioszelektiv oldhatóság bizonyítása és mértéke Fázis-oldhatósági vizsgálatok A norgesztrel fázishatár transzportja vizes ciklodextrin oldatból oktanolba Norgesztrel enantiomerek arányának meghatározása vizes ciklodextrin oldatban A norgesztrel enantiomerek zárványkomplexeinek moláris ellipticitás és moláris abszorbancia értékeinek meghatározása vizes oldatban Az enantiomerek koncentrációjának meghatározása vizes ciklodextrin oldatban KÖVETKEZTETÉSEK KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁT KÉPEZŐ KÖZLEMÉNYEK IRODALOMJEGYZÉK

4 ÖSSZEFOGLALÁS A kiroptikai spektroszkópia alkalmazása szteroidok meghatározására és elválasztásuk detektálására, valamint ciklodextrinekkel történő enantioszelektív oldhatóságuk tanulmányozására Készítette: Szegvári Dávid Témavezető: Dr. Gergely András, a kémiai tudomány kandidátusa Semmelweis Egyetem, Gyógyszertudományok Doktori Iskola, Budapest, A kiroptikai spektroszkópia az egyik leggyorsabban fejlődő területe a napjainkban egyre nagyobb szerepet kapó királis analitikának. Az értekezésben néhány példán keresztül bemutatásra kerülnek a cirkuláris dikriozmuson (CD) és az optikai rotációs diszperzión (ORD) alapuló módszerek új gyógyszeranalitikai alkalmazási lehetőségei. Gyors és pontos CD spektroszkópiás módszert dolgoztunk ki az etiszteron és a 5 -etiszteron izomerek egymás mellett történő meghatározására. A 4-3-keto csoporttal rendelkező etiszteron szelektív negatív Cotton-effektussal rendelkezik, így két hullámhosszon való ellipticitás méréssel egyszerűen megoldható az izomerek koncentrációjának meghatározása, elválasztástechnikai módszert alkalmazása nélkül. Az etiszteron izomerek nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás (HPLC) elválasztásakor CD detektálást alkalmazva, az izolált keto csoporttal rendelkező 5 -etiszteron is jól mérhető. A dehidroepiandroszteron (DHEA), dehidroepiandroszteron-szulfát (DHEA-S) és egyéb rokon szerkezetű szteroidok HPLC-s elválasztásához a telített ketonok meghatározására kiválóan alkalmas és szelektív CD detektálást alkalmaztunk. A rendkívül rossz vízoldhatóságú racém norgesztrel γ-ciklodextrin és hidroxipropil-γ-ciklodextrin oldatokban történő oldódása során enantioszelektivitás lépett fel, amely a g-faktor mérésén alapuló CD spektroszkópiás módszerrel kiválóan tanulmányozható. Mindkét ciklodextrin alkalmazásakor a levonorgesztrel, azaz a hatásos enantiomer oldódott fel nagyobb arányban. A γ-ciklodextrinnel nagyobb oldhatóságot értünk el, azonban az enantioszelektív hatás a hidroxipropil-γ-ciklodextrin alkalmazásakor bizonyult jelentősebbnek. Fázis-oldhatósági vizsgálataink alapján bizonyítottuk, hogy a komplexek sztöchiometriája 1:1-es, és a kialakult enantiomerarány független a ciklodextrin koncentrációjától. Kidolgoztunk továbbá egy új számítási módszert, amelynek alkalmazásával közvetlenül, a szerves fázisba történő extrakció nélkül is meghatározható a vizes oldatokban a norgesztrel komplexek enantiomeraránya. Szegvári D, Horváth P, Gergely A, Németh S, Görög S. (2003) CD spectrometric methods for the simultaneous determination of ethisterone and its 5 -isomer. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 375: Szegvári D, Zelkó R, Horváth P, Gergely A. (2006) Tracking of enantioselective solubility of rac-norgestrel in the presence of cyclodextrin by a CD spectroscopic method. Chirality, 18: Gergely A., Szász Gy, Szentesi A, Gyimesi-Forrás K, Kökösi J, Szegvári D, Veress G. (2006) Evaluation of CD detection in an HPLC system for analysis of DHEA and related steroids. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 384:

5 SUMMARY The applications of chiroptical spectroscopy for the determination and the detection of steroids and for the examination of their cyclodextrin-mediated enantioselective solubility Written by Dávid Szegvári Supervised by Dr. András Gergely, C.Sc. Semmelweis University, Doctoral School of Pharmaceutical and Pharmacological Sciences, Budapest, Chiroptical spectroscopy is one of the most developing areas of chiral analysis which role has been enhanced in recent years. In the thesis new applications of circular dichroism (CD) and optical rotatory dispersion (ORD) methods are presented via some examples. A quick and accurate CD spectroscopic method was developed for the simultaneous determination of ethisterone and its 5 -isomer ( 5 -ethisterone). The method is based on the selective negative Cotton effect of the 4-3-oxo group of ethisterone. The concentrations of the two isomers can be easily determined by ellipticity measurements at two different wavelengths without the application of any separation technique. CD detection for the separation of ethisterone isomers by high performance liquid chromatography (HPLC) is suitable even for the determination of the 5 -ethisterone, that contains isolated oxo groups. The separation of dehydroepiandrosterone (DHEA), dehydroepi-androsterone sulfate (DHEA-S) and related steroids was also elaborated by a CD detected HPLC technique. CD detection is a good tool for the determination of saturated ketones. Enantioselectivity was observed when the solubility of raceme norgestrel was examined in aqueous solutions of γ-cyclodextrin and hydroxypropyl-γ-cyclodextrin. A CD spectroscopic method, based on the measurement of g-factor was applied for the determination of the enantiomer ratio obtained. Levonorgestrel, the effective enantiomer was dissolved in greater extent using either cyclodextrins. The obtained solubility of norgestrel was greater using γ-cyclodextrin, although the enantioselectivity was more significant when hydroxypropyl-γ-cyclodextrin was applied. Phase-solubility examinations were appropriate for the verification of 1:1 stoichiometry and that the enantiomer ratios were independent of the cyclodextrin concentrations. A new calculation method was also elaborated, suitable for the direct determination of the concentrations of norgestrel enantiomers in aqueous cyclodextrin solutions. D. Szegvári, P. Horváth, A. Gergely, S. Németh, S. Görög. (2003) CD spectrometric methods for the simultaneous determination of ethisterone and its 5 -isomer. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 375: D. Szegvári, R. Zelkó, P. Horváth, A. Gergely. (2006) Tracking of enantioselective solubility of rac-norgestrel in the presence of cyclodextrin by a CD spectroscopic method. Chirality, 18: A. Gergely, Gy. Szász, A. Szentesi, K. Gyimesi-Forrás, J. Kökösi, D. Szegvári, G. Veress. (2006) Evaluation of CD detection in an HPLC system for analysis of DHEA and related steroids. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 384:

6 1. BEVEZETÉS A biomolekulák nagy része királis, és szinte minden esetben csak az egyik enantiomer fordul elő az élő szervezetben. Az aminosavak esetében majdnem kizárólagosan csak az L-aminosavak, cukrok esetében a D-cukrok építik fel a biológiai szervezeteket. A fenti királis molekulák képződési energiája megegyezik tükörképi párjaikkal, ezért rendkívül meglepő, hogy miért nincsenek jelen a szervezetben az ellentétes konfigurációjú vegyületek. A biológiai homokiralitás eredetét számos kutató vizsgálta, azonban még nem sikerült egyértelmű tudományos magyarázatot találni rá [1,2]. Az emberi szervezet egy magas fokon szervezett királis objektum, a benne lejátszódó biokémiai folyamatok nagyfokú sztereospecificitással rendelkeznek. Tekintettel kell lennünk a biológiai homokiralitásra, amennyiben ezen folyamatokat gyógyszerekkel befolyásolni szeretnénk. A forgalomban lévő gyógyszerek több mint háromnegyed része királis, amelyeket általában akirális színtézissel állítanak elő, amely során racemátok keletkeznek, azaz a két tükörképi forma, más néven a két enantiomer azonos arányban jön létre. Az enantiomerek közül általában csak az egyik, az úgynevezett eutomer a hatásos molekula. A másik enantiomer, azaz a disztomer, vagy jóval gyengébb hatással rendelkezik, vagy esetleg hatástalan, gyakran azonban valamilyen toxikus mellékhatásért is felelős. Jól ismert példa erre az úgynevezett Contergan botrány. A szedato-hipnotikus hatású szer hatóanyaga, a thalidomid, racemát formában volt jelen a gyógyszerben. Később kiderült, hogy az S-(-)-thalidomid teratogén hatású, ezért a gyógyszerrel kezelt anyák csecsemői súlyos rendellenességgel jöttek világra [3,4]. A Contergan botrány a hatvanas években óriási port kavart a gyógyszerkutatók és a gyógyszergyártók körében. Azóta ugrásszerűen megnőtt a figyelem a kiralitással kapcsolatban. Ma már lehetőség szerint csak enantiomertiszta új gyógyszer kerülhet forgalomba, de még ebben az esetben is részletes fiziko-kémiai, farmakológiai, toxikológiai, farmakokinetikai stb. vizsgálatok szükségesek mindkét enantiomerre vonatkozóan, mivel előfordulhat az enantiomerek in vivo racemizációja, azaz egymásba történő átalakulása [5]. A helyzet hasonló a generikus készítményeknél is. Az 6

7 irányelvek szerint a királis hatóanyagot tartalmazó készítményeknél ugyanazokat a gyártási és ellenőrzési standardokat kell alkalmazni, mint az eredeti molekulánál. A fenti törekvések ellenére a forgalomban lévő gyógyszerek között ma még többségben vannak a racém hatóanyagok, aminek legfőbb oka, hogy a tiszta enantiomer előállítása általában rendkívül drága technológiát igényel. A királis segédanyagok racém hatóanyagokkal való kölcsönhatása diasztereomer molekulapárokat eredményez, amelyek tulajdonságai alapvetően eltérőek. A királis segédanyagok enantioszelektív kioldódást, illetve enantioszelektív oldhatóságot eredményezhetnek a hatóanyag felszabadulása során. Királis segédanyagok jelenléte végső soron befolyásolhatja a hatóhelyhez jutó gyógyszer enantiomerarányát is. A fentiek alapján könnyen belátható a kiralitással kapcsolatos kutatások jelentősége, valamint a jelenségek tanulmányozására kiválóan alkalmas kiroptikai spektroszkópiás módszerek fontossága. Az értekezésben több új kiroptikai analitikai módszer kerül bemutatásra, amelyek olyan vegyületek analízisére alkalmasak, amelyek más technikákkal nem, vagy csak nehézkesen határozhatók meg. Az enantoszelektív oldhatóság bizonyítására, valamint mértékének meghatározására szintén kiroptikai spektroszkópiás módszereket alkalmaztunk. 7

8 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 2.1. Kiroptikai spektroszkópia A királis molekulák optikai mérésén alapuló módszereket kiroptikai módszereknek nevezzük. A két, analitikai szempontból legfontosabb kiroptikai spektroszkópiás módszer az optikai rotációs diszperzió (ORD) és a cirkuláris dikroizmus (CD). Az egyéb kiroptikai módszerek, mint például a lineáris dikroizmus, vagy a magnetooptikai rotációs diszperzió, gyógyszeranalitikai szempontból nem jelentősek Az optikai aktivitással kapcsolatos alapfogalmak Optikailag aktív anyagon síkban poláros fényt átbocsátva, a minta a polarizált fény síkját elforgatja. Az optikai aktivitást, mint anyagi sajátságot alkalmazták a legkorábban arra, hogy az általa szerzett információval a molekulák térszerkezetére, illetve szimmetria viszonyaira következtessenek. Pasteur ismerte fel először, hogy a forgatóképesség a molekulák térszerkezetével, valamint kiralitásával kapcsolatos [6,7]. A kiralitás elnevezés a görög kürosz szóból ered, ami kezet jelent, ugyanis a királis molekulákra jellemző, hogy tükörképi párjukkal nem hozhatók fedésbe, azaz úgy viselkednek, mint jobb és bal kezünk. Az ilyen szerkezetekre jellemző, hogy nem rendelkeznek sem szimmetriasíkkal, sem szimmetriacentrummal, azonban forgástengelyük lehet. A molekulák térszerkezetét a konfiguráció és konformáció együttesen határozza meg. A konfigurációt az atomhoz közvetlenül kapcsolódó atomok vagy atomcsoportok relatív helyzete határozza meg. Különböző konfigurációjú molekulák egymásba nem vihetők át kémiai kötés felszakítása nélkül. A konformáció a közvetlenül nem kapcsolódó atomok vagy atomcsoportok relatív helyzete a molekulában. Az egyszeres kötések mentén történő elfordulás során helyi energiaminimumok, és energiamaximumok alakulnak ki. Energiaminimum általában akkor alakul ki, ha az egyes atomok vagy atomcsoportok nem fedő állásban helyezkednek el. 8

9 Centrális kiralitásról beszélünk, amikor egy centrális atomhoz kapcsolódó szubsztituensek eltérőek. Leggyakrabban a Cahn-Ingold-Prelog (CIP) konvenció szerint nevezzük el a kiralitáscentrumokat. R konfigurációjú a centrum, ha a kapcsolódó szubsztituensek az óramutató járásával megegyező irányba számozódnak a CIP szabály értelmében kapott csökkenő rangsor sorrendjében, amennyiben a legkisebb rangú csoport a megfigyeléssel ellentétes oldalon helyezkedik el. Az ellentétes konfigurációt S betűjellel jelöljük. Amennyiben egy molekula csavarmenet alakú, helikális kiralitásról beszélünk. A jobbmenetes molekulák R-, a balmenetesek S-konfigurációjúak. Enantiomereknek nevezzük azokat a molekulákat, amelyek egymás tükörképi párjai, és egymástól csak az általuk elforgatott polarizált fény szögének előjelében térnek el. Az enantiomereket egymástól a nevük elé tett előjel alapján különböztetjük meg. A jobbra forgató vegyületek (+) előjelet kapnak. A két enantiomer képződése energetikailag megegyezik, ezért királis molekula szintézisekor elvileg a keletkező két enantiomer mennyisége megegyezik, úgynevezett racém forma alakul ki. A racemátok optikailag látszólag inaktívak, mivel az enantiomerek optikai forgatóképességei kioltják egymást [6-9] Optikai rotációs diszperzió (ORD) elméleti alapjai A lineárisan polarizált fénysugár elektromos térerősség vektorának csak egy síkban van rezgési komponense, szemben a normál, azaz anizotróp fénnyel, amely a tér minden irányába rezeg. Fresnel már 1817-ben megfogalmazta, hogy a lineárisan poláros fény két cirkulárisan polározott fény eredőjeként jön létre. Ezek a cirkulárisan poláros fénykomponensek spirális pálya mentén haladnak, tehát irányuk folyamatosan változik, de rezgési amplitudójuk állandó. A jobb spirál, vagy P(plusz)-hélix az óramutató járásával megegyező irányba forgó, és egyben lineárisan távolodó elmozdulást végez. A bal spirál, vagy M(mínusz)-hélix az óramutató járásával ellentétes, távolodó pályát ír le [8,9]. Optikailag inaktív közegben a P-hélix és M-hélix elektromos térerősség vektorainak (E P ; E M ) eredője szinuszos lefutású az idő függvényében. Az eredő 9

10 vektorok (E) tehát mindig a kiindulási vektorokkal azonos egyenesre esnek, esetünkben függőleges egyenesre (1. ábra). E E EP EM EM EP EM E EP EM E EP EP EM E EP E EM 1. ábra. Az elektromos térerősség vektorok helyzetének változása akirális közegben Optikailag aktív közegben a polarizált fény és az anyag között diasztereomer jellegű kölcsönhatás lép fel, ezáltal a jobbra és balra cirkuláló fénykomponensek sebessége eltérő lesz, mivel törésmutatójuk eltér (n M n P ). A közeget elhagyván, sebességük újra megegyezik, de addigra az egyik komponens vektora lemarad a másik vektorhoz képest. A jelenség eredménye, hogy az eredő vektorok által meghatározott egyenes szöget (α) zár be a kiindulási vektorok (függőleges) helyzetéhez képest, tehát a lineárisan poláros fény síkja elfordul. Az elfordulás szöge az optikai forgatás, azaz, az α [fok], amelynek nagysága függ a fénykomponensekre vonatkozó törésmutatók különbségétől (n M - n P ), a hullámhossztól (λ [nm]) és a küvetta hosszától (l [dm]) (2. ábra) [6-9]. l α = konst ( n ) M np λ 2. ábra. Az elektromos térerősség vektorok helyzete királis közegben és az optikai forgatás 10

11 Az optikai rotációs diszperzió (ORD) során a forgatás szögét ábrázoljuk a hullámhossz függvényében. Az adott hullámhosszon mért forgatást szennyezés vizsgálatra, vagy akár kvantitatív meghatározásra is felhasználhatjuk. A módszer alkalmazását a kvantitatív analitikában az Alkalmazott módszerek fejezetben részletezem Cirkuláris dikroizmus (CD) elméleti alapjai Optikailag aktív közegben nem csupán a terjedési sebessége tér el a jobbra és balra cirkuláló fénykomponenseknek, hanem azok abszorbanciája is eltérő. Ezt a jelenséget cirkuláris dikroizmusnak nevezzük, amelynek oka szintén a fénykomponensek és az anyag között kialakuló diasztereomer kölcsönhatás. Eredményként azt tapasztaljuk, hogy az elektromos térerősség vektorok eredői nem egy egyenesre esnek, hanem ellipszist írnak le. A kialakult elliptikusan polarizált fény az ellipszis tengelyeivel jellemezhető, amelyek az abszorbanciák összegével, illetve különbségével egyenlők (ε M + ε P és ε M ε P ) (3. ábra). Az ellipticitást (Ψ [fok]) a kis és nagy tengely hányadosának arcus tangenséből kapjuk meg, amely arányos a koncentrációval (c [g/ml]), az abszorbancia különbséggel ( ε) és a rétegvastagsággal (l [dm]) (3. ábra). Ψ E ε M +ε P ε Ψ = konst c l ε = arctg ε M M ε P + ε P E M E P ε M -ε P 3. ábra. Elliptikusan polarizált fény és az ellipticitás 11

12 A valóságban azonban mindkét jelenség együttesen lép fel, tehát a jobbra és balra cirkuláló fénykomponensek sebessége, és elnyelődése is eltérő optikailag aktív közegben, tehát a fény síkja elfordul, és egyúttal elliptikusan polározottá is válik. Az ellipszis főtengelye az optikai forgatás szögével (α) elfordul a függőlegeshez képest (4. ábra) [8,9]. Ψ α 4. ábra. Elliptikusan polarizált fény, α 0 esetén A fentiekből következik, hogy detektálható ellipticitáshoz nem elegendő, ha a molekula királis, hanem annak, a mérési tartományban való abszorpcióval rendelkező csoporttal is kell rendelkeznie. Centrális kiralitás esetén akkor a legintenzívebb a CD jel, ha a kiralitás centrum a kromofór csoport része. Akkor is mérhető ellipticitás azonban, ha nem királis a kromofór, viszont a kiralitás centrum elég közel helyezkedik el a kromofórhoz, hogy azt királisan zavarja, más szóval perturbálja. Ebben az esetben királisan perturbált kromofór csoportról beszélünk [6-9]. A CD spektroszkópia is alkalmas kvantitatív meghatározásra, a módszert az Alkalmazott módszerek fejezetben részletezem. 12

13 ORD, CD spektrumok és a Cotton-effektus Mind az ORD, mind a CD spektroszkópiában az alkalmazott hullámhossz tartomány megegyezik az UV/Vis (ultraibolya és látható) spektroszkópiában alkalmazottal ( nm). A CD jelenség csak az abszorpciós sáv környezetében észlelhető, azonban az ORD spektrum a távoli hullámhosszaknál is mérhető, mivel fénytörést gyakorlatilag minden hullámhosszúságú fény mutat, és még kis törésmutató különbség is mérhető forgatóképességet jelent. Ez az oka, hogy például a cukrok intenzív ORD jellel rendelkeznek, de ellipticitásuk gyakorlatilag mérhetetlen a fent említett hullámhossztartományban. [7]. Az ORD görbe a λ max -tól távol egyszerű, hiperbolikus lefutású. Az abszorpciós sávnál torzult S alakú, amelyet CD jelenséggel együttesen a francia Cotton után Cotton-effektusnak nevezünk. Cotton volt ugyanis az, aki a két jelenséget legkorábban egyidejűleg észlelte 1886-ban. negatív Cotton-effektusról akkor beszélünk, ha az S első görbülete minimumot (völgy), második görbülete maximumot (domb) mutat, a nagyobb hullámhosszak felöl nézve. Ellenkező esetben pozitív Cotton-effektusról beszélünk. A CD görbe alakja hasonlít az UV spektruméra, azaz Gauss-függvénnyel közelíthető, azonban előjele pozitív és negatív is lehet, mivel abszorbancia különbségekkel arányos értékekről van szó. A CD csúcsok sávjai egybe esnek az UV sávokéval, mivel mindkét jelenség ugyanazzal az elektronátmenettel kapcsolatos. Az UV spektrumok a kromofórok minőségéről, esetenként azok molekulán belüli helyéről adnak felvilágosítást, a CD spektrumok viszont a kromofórok térbeli elhelyezkedéséről is információt nyújtanak. Az UV spektroszkópiában átfedő sávok jobban elkülönülnek, és finomszerkezetük is gyakran láthatóbbá válik a CD spektrumban. A CD spektroszkópia fentiekből következő nagyfokú szelektivitását a későbbiekben még részletezem. A CD spektroszkópia nagy előnye az ORD-hoz képest, hogy az optikailag aktív abszorpciós sávon kívül az ellipticitás zérus, amíg az ORD esetében a görbe a nullát csak közelíti, de sosem éri el, ezért a kiértékelése nehezebb [6,8,9]. 13

14 2.2. Enantiomerek meghatározása, enantiomer tisztaság A fentiek alapján könnyű belátni az enantiomerek meghatározásának, egymástól való elválasztásának, illetve az optikai tisztaság vizsgálatának fontosságát. Akirális anyagokból kiindulva lehet ugyan királis anyaghoz jutni, de minden esetben racemát keletkezik. Ha tiszta enantiomert szeretnénk előállítani, akkor vagy a racemát enantiomerjeit kell egymástól elválasztani valamilyen királis elválasztástechnikai módszerrel, vagy reszolválással lehet hozzájutni a kívánt enantiomerhez. A reszolválás gyakorlatilag enantioszelektív kristályosítást jelent. Harmadik megoldás, ha valamilyen királis molekulával sztereoszelektív színtézist alkalmazva nem racemátokat hozunk létre [8]. Mindegyik megoldásnál szükséges azonban a kapott termék optikai tisztaságának, esetleg enantiomerarányának meghatározása Enantiomerek elválasztása elválasztástechnikai módszerekkel Napjainkban az enantiomerek elválasztására leggyakrabban nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiát (HPLC) és kapilláris elektroforézist (CE) alkalmaznak. A CE módszer előnye a HPLC-hoz képest, hogy relatíve gyors, hatékony és alacsony költség igényű. Aránylag egyszerű a különböző paraméterek megváltoztatása (pl.: királis módosító típusa) stb, azonban az eljárás hátránya, hogy preparatív célra nem alkalmazható [10]. Az enantiomerek folyadékkromatográfiás elválasztása három módszer szerint történhet: 1. királis állófázison; 2. akirális állófázison, az oldószerben oldott királis komplexképző segítségével; 3. akirális állófázison, előzetes királis származékképzővel való diasztereomerpár képzéssel. A közös jellemzője ezen módszereknek, hogy mindhárom esetben valamilyen alkalmas királis szelektor és az elválasztandó molekulák között kialakuló diasztereomer kölcsönhatás az alapja az elválasztásnak [10], amely kölcsönhatást a munka további részében még részletezek. Többféle királis állófázis van forgalomban, amelyeknél a királis szelektor molekulák vagy kovalens kötéssel, vagy fizikai kötőerőkkel rögzülnek a szilikagél 14

15 felületére. Leggyakrabban poliszacharid, zárványkomplexképző és fehérje alapú királis állófázisokat alkalmaznak. A poliszacharid típusú oszlopokról az eredményeink ismertetése során, a zárványkomplexképző alapúakról a Ciklodextrinek gyógyszeranalitikai felhasználása című fejezetben részletesebben is szót ejtek. Eluensben oldott királis komplexképzőként leginkább különböző ciklodextrin származékokat alkalmaznak. Ebben az esetben a kromatográfiás oszlopon belül alakulnak ki a diasztereomer párok. A módszer alkalmazására a Norgesztrelciklodextrin zárványkomplexek az irodalomban című fejezetben hozok példákat. Amennyiben a kromatográfiás elválasztás előtt királis származékképzővel diasztereomereket állítanak elő az enantiomerekből, azok már akirális oszlopon is elválaszthatóak. A módszer hátránya, hogy gyakran nehézkes a meghatározandó molekuláknak a származékképzőtől való elkülönítése [10] Az enantiomer tisztaság és a g-faktor fogalma A fent leírt módszerek célja, hogy enantiomer tiszta anyagot kapjunk, amely esetében a disztomer molekula (nemkívánt enantiomer) szennyezésnek tekintendő. Fontos tehát olyan analitikai módszerek alkalmazása, amellyel akár 0,1% alatti enantiomer szennyezés is kimutatható. Az enantiomer tisztaság fogalmára többféle kifejezést is alkalmaznak. A legelterjedtebb fogalom az enantiomer felesleg (ee = enantiomeric excess [%]): = g ee 100 (1.) max g ahol, g a vizsgált anyag g-faktora, g max a tiszta enantiomer g-faktora [11]. A g-faktor, vagy más néven anizotrópia faktor, a fényspirálok abszorbanciakülönbségének ( Α) és az abszorbanciának (Α) a hányadosából adódik [12], A g = (2.) A 15

16 A g-faktor, tehát gyakorlatilag megegyezik az azonos hullámhosszon mért ellipticitás (Ψ [mfok]) és abszorbancia (A) hányadosával: g = Ψ A (3.) A két enantiomer g-faktor értéke megegyezik adott hullámhosszon, de előjelük ellentétes. A g-faktor meghatározására a legalkalmasabbak azok a műszerek, amelyek a kiroptikai jel mellett az abszorbanciát is képesek szimultán mérni. Feltételezve, hogy mind az ellipticitás, mind pedig az abszorbancia lineárisan változik a koncentráció függvényében, a g-faktor értéke független a koncentrációtól, azonban függ az enantiomerek összetételétől [12]. A g-értékből tehát ki lehet számolni az enantiomerarányt, vagy az enantomer tisztaságot. A g-faktor meghatározásán alapuló enantiomer tisztaság vizsgálat gyors, pontos és érzékeny módszer. Nagy előnye, hogy nem szükséges ismerni a minta koncentrációját. A módszer gyakorlati alkalmazásáról az Alkalmazott módszerek fejezetben még lesz szó. Az enantiomer tisztaságot ritkábban az optikai tisztasággal fejezik ki (op = optical purity), ami a vizsgált oldat és a tiszta enantiomer fajlagos forgatóképességének hányadosaként definiálható, értéke gyakorlatilag megegyezik az enantiomer felesleggel (ee) [13]. A kromatográfiás vizsgálatoknál általában az enantiomer összetétel (ec = enantiomeric composition) kifejezést használják, amely az enantiomerek mólarányával, vagy a feleslegben lévő enantiomer mólszázalékával adható meg [13] Kiroptikai detektálás Az enantiomerek folyadékkromatográfiás meghatározásánál rendkívüli előnyt jelentenek a különböző kiroptikai detektorok alkalmazása, amelyet jelez az is, hogy a kiroptikai detektorok a kiroptikai eljárások legdinamikusabban fejlődő ágát jelentik. A legtöbb kiroptikai detektor alkalmas a kiroptikai jel és az UV jel szimultán detektálására. Léteznek CD detektorok, illetve forgatóképességet mérő, úgynevezett polarimetriás detektorok, azonban a kettő közül inkább az előbbi az előnyösebb, az ORD-nál már említett kiértékelési problémák miatt. 16

17 Az UV/Vis (ultraibolya és látható tartományú) detektorokhoz viszonyítva a kiroptikai detektorok legnagyobb előnye a relatíve nagy szelektivitásuk. A kiroptikai detektorok csak az optikailag aktív anyagok jelenlétét mutatják, az egyéb anyagok nem jelennek meg a kromatogramon. Az egyes csúcsok előjele is eltérhet, így az elúciós sorrend gyakran közvetlenül is meghatározható. A CD detektorok hátránya, hogy általában érzékenységük elmarad az UV/Vis detektorokéhoz képest. A HPLC-CD további előnye, hogy aránylag könnyen megkapható egy keverék adott komponensének CD spektruma is. Ez vagy stop-flow módszerrel, azaz a csúcsban megállított eluensből, az átfolyó küvettában való spektrumfelvétellel történhet, vagy három utas rendszerben, az átfolyós küvettán kívül, a rendszer megállítása nélkül valósítható meg [14]. Empirikus és szemi-empirikus szabályok alkalmazásával az enantiomerek abszolút konfigurációja gyakran megadható [15]. Zsila és munkatársai az N-metil-Daszpartám (NMDA) receptor antagonista ketamin enantiomerek abszolút konfigurációját határozták meg a kromatográfiás csúcsból felvett CD és UV spektrumok alapján, az oktáns szabály alkalmazásával [16]. A kiroptikai detektorok alkalmasak racemizációs reakciók nyomonkövetésére optikailag labilis rendszerben. A benzodiazepinek héttagú gyűrűje, például, gyakran mutat racemizációt, amely CD detektálással jól vizsgálható [17]. A CD-UV/Vis szimultán detektorok egyik legjelentősebb előnye, hogy közvetlenül meghatározható az enantiomer tisztaság, azaz jellemezhető az elválasztás eredményessége. A g-faktor mérésen alapuló módszer jól alkalmazható az enantiomerek folyadékkromatográfiás elválasztása során. Az UV és CD kromatogram hányadosa megadja a g-faktor változását. Egy adott kromatográfiás csúcs valóban csak az egyik enantiomerhez tartozik, ha a csúcshoz tartozó g-érték állandó, és megegyezik a tiszta enantiomer g-faktor értékével. Amennyiben a csúcs nem homogén a két enantiomerre nézve, a g-faktor értéke sem állandó [18]. Módszerfejlesztés során is rendkívül hasznos lehet a CD detektálás, például, ha részleges elválás történik egy enantiomerpár esetében. Ez az UV kromatogramból nem biztos, hogy kiderül, mert a csúcsok koaleszkálnak, ezáltal egy csúcsként jelentkeznek (5. ábra). Ellentétes csúcsok megjelenése a CD detektálta kromatogramon egyértelműen jelzi azonban, hogy a két enantiomer nem teljesen együtt jelenik meg (5. ábra), tehát a 17

18 rendszer optimalizálásával a probléma gyakran megoldható, anélkül, hogy újabb kromatográfiás rendszerrel próbálkoznánk [14]. Ψ A 5. ábra. Enantiomerek részleges elválasztása CD (Ψ = ellipticitás) és UV/Vis (A = abszorbancia) detektálás esetén 18

19 2.3. A fontosabb modellvegyületek analitikájának irodalmi háttere Munkánk során új kiroptikai módszereket kidolgoztunk ki egyes szteroid hormonok, rokonvegyületeik mellett történő meghatározására. Az alábbiakban a szereplő molekulák, molekulacsoportok, szakmai irodalomban szereplő analitikai meghatározási módszereit foglalom össze, kitérve azok előnyeire és hátrányaira, illetve hiányosságaira etiszteron mellett 5 -etiszteron szennyezés meghatározása A 4-3-keto csoporttal rendelkező etiszteron az első szintetikus progesztogén származék, amelyet széleskörűen alkalmaztak, elsősorban menstruációs zavarok javítására, de a belőle levezethető származékok, mint például a noretindron (az etiszteron 19-nor származéka), vagy a norgesztrel (az etiszteron 19-nor, 13-etil származéka) a leggyakrabban alkalmazott progesztogén szerek, mind az összetett, mind a mono-fázisos fogamzásgátló gyógyszerek körében [19]. A vizelethajtó spironolakton szintézisekor köztitermékként is keletkezik etiszteron, a kiindulási vegyület, 4-androszten-3,17-dion, etinilezésekor. A reakció során azonban meglehetősen nagy arányban keletkezik az etiszteron 5 -izomerje ( 5 - etiszteron) is [20]. A reakció sémája a 6. ábrán látható. Bázis, vagy sav katalizálta izomerizációs reakcióval a keletkező 5 -izomer etiszteronná alakítható (6. ábra). A gyártásközi ellenőrzés során szükség volt olyan analitikai módszerre, amivel gyorsan és pontosan megállapítható az izomerek aránya. Nehézséget okoz azonban, hogy a 5 -etiszteron esetében nem tud kialakulni konjugáció, azaz a 4-3-keto kromofór hiányzik, ezért UV detektálással a 5 -izomer nem mérhető. Nagoshi és Kinugasa kifejlesztett egy gázkromatográfiás módszert [20], azonban alkalmazása kérdéses, mivel magas hőmérsékleten a 4-3-ketoszteroidok átalakulhatnak, vagy széteshetnek [21]. Németh és munkatársai, egy, a fenti izomerizációs reakción alapuló, HPLC-s módszert dolgoztak ki [22]. A módszer hátránya, hogy munka és időigényes elválasztástechnikai módszert igényel, ráadásul a 5 -etiszteron meghatározása közvetetten, etiszteronná való átalakítást követően történik, amely UV detektálással már meghatározható. 19

20 O C 2 H 2 ; THF; KOH OH C CH O O 4-Androszten-3,17-dion Etiszteron OH C CH HO C H + ; H + / OH - CH OH C CH O 5 -Etiszteron 6. ábra. Az etiszteron előállítása Dehidroepiandroszteron meghatározási lehetőségei A dehidroepiandroszteron (DHEA) az egyik legfontosabb köztitermékként vesz részt a nemihormonok bioszitézisében, amely során, végső soron tesztoszteron, és az ösztrogének keletkeznek [19]. A DHEA és szulfát konjugátuma (DHEA-S) a legnagyobb koncentrációban előforduló szteroid hormon az emberi keringésben. Központi idegrendszeri, kardiovaszkuláris és immunológiai hatásokkal is rendelkezik. Hatásaiból következően a vér DHEA koncentrációjának változását összefüggésbe hozták, többek között szívbetegségekkel, rákos daganatok kialakulásával, cukorbetegség kialakulásával, AIDS és Alzheimer kór manifesztálódásával [23]. Befolyásolja az endoteliális nitrogén oxidok szintézisét [24], továbbá hat a gamma-amino-vajsav (GABA) receptorokon [25], és az N-metil-D-aszpartám (NMDA) receptorokon [26]. Szükséges tehát specifikus analitikai módszer, amely a hasonló szerkezetű szteroidok mellett is alkalmas a DHEA meghatározására, akár biológiai mintákból. DHEA meghatározására gyors és érzékeny módszer a radio-immun vizsgálat (RIA) [27], azonban kis szelektivitása miatt alkalmazása kérdéses. RIA analízis előtti 20

21 HPLC-s elválasztással a szelektivitás javítható [28]. Tömegspektroszkóppal detektált gázkromatográfiás [29] és folyadékkromatográfiás [30] (GC-MS, LC-MS) módszereket is kidolgoztak a DHEA és rokon molekulák meghatározására. Micelláris elektrokinetikus kromatográfia (MEKC) is alkalmas a DHEA, DHEA-S és rokonvegyületeik közvetlen meghatározására [31]. 21

22 2.4. Enantioszelektív kioldódás, enantioszelektív oldhatóság A bevezetőben már említettem a fontosságát annak, hogy manapság, milyen szigorú szabályozások írják elő egy kutatás alatt lévő királis gyógyszer enantiomerjeinek farmakodinámiás, valamint farmakokinetikai vizsgálatait, és ha lehet, csak tiszta enantiomert tartalmazó gyógyszerek kerülhetnek forgalomba [32,33]. Ennek ellenére még ma is jelentős mennyiségű racém hatóanyagú gyógyszer van forgalomban. Több problémát is felvet, hogy a hatásos enantiomer (eutomer) mellett jelen van a disztomer is, azaz a hatástalan, vagy kisebb hatásért felelős, esetleg mellékhatást okozó, toxikus izomer is [34]. Egyfelől mellékhatást fejthet ki a megfelelő receptorokon való kapcsolódással, másfelől feleslegesen terheljük a szervezetet exogén anyagokkal, amelyek például a metabolizmust vagy az eliminációt végző szerveket károsíthatják, esetleg megváltoztathatják az endogén anyagok, vagy az egyéb hatóanyagok szervezetbeli sorsát. Elképzelhető az is, hogy nem csak a hatásmódban, a metabolizmus vagy az elimináció során van eltérés a két enantiomer között, hanem előfordulhat, hogy már a gyógyszerformából sem azonos mennyiségben szabadul fel a két izomer, vagy nem azonos mennyiségben kerül a keringésbe, esetleg nem egyformán kötik a szérumfehérjék a vérben való szállítás során. A felszívódás során ugyanis valószínűsíthető, hogy az aktív transzportot biztosító, szintén királis szerkezetű fehérjével a két enantiomer eltérő erősségű kapcsolatot létesít, ami szintén megtörténhet a vérben való szállítást biztosító fehérjékkel kapcsolatban is. Az utóbbi két esetre nem igazán lehet hatni külsőleg, azonban a gyógyszerformából történő felszabadulást a segédanyagok befolyásolhatják. A munka további része ezen hatás tanulmányozásával foglalkozik. Királis segédanyag alkalmazása racém hatóanyag mellett, az enantiomerek eltérő biohasznosíthatóságát is eredményezheti, mivel a segédanyag és hatóanyag kölcsönhatása diasztereomer molekulapárokat eredményez, amelyek tulajdonságai alapvetően eltérőek. A gyógyszerkészítmények nagy része tartalmaz királis segédanyagot, gyakran többfélét is, leggyakrabban különféle cellulóz polimereket, keményítőt, dextránt, dextrózt, laktózt, mannitot, alginátokat, újabban különböző ciklodextrin származékokat. Általánosságban elmondható, hogy vízoldékony 22

23 vegyületek esetén vízben nem oldódó, esetleg vízben duzzadó segédanyag szerkezetéből, vagy szerkezetén keresztül történhet az enantioszelektív kioldódás. Vízben rosszul oldódó molekulák esetében akkor valószínűbb nagyobb enantioszelekív hatás, ha a segédanyag vízben jobban oldódik, és komplexképzéssel a vegyület oldhatóságát növeli, ezáltal enantioszelektív oldhatóságot kölcsönöz számára. Királis segédanyagok, a fentiekből következően, végső soron befolyásolhatják a hatóhelyhez jutó gyógyszer enantiomerjeinek az arányát. Adott enantiomerarány esetén akkor a legérzékenyebb a rendszer erre a hatásra, minél nagyobb a különbség az adott enantiomerek hatása között. Így például kis koncentrációkülönbség is jelentős lehet a β-blokkoló propranolol enantiomerjei között, ahol az S izomer százszor hatásosabb az R izomerhez képest [35]. A 90-es évektől napjainkig találhatók közlemények, amelyek foglalkoznak enantioszelektív kioldódással, illetve enantioszelektív oldhatósággal, de számuk meglepően alacsony. A főbb munkák eredményeit az alkalmazott segédanyag típusa szerinti csoportosításban vázolnám az alábbiakban Poliszacharid származékok vizsgálata Leginkább cellulózszármazékokkal történtek próbálkozások, amelyek közül is hidroxipropil-metilcellulózt (HPMC) alkalmaztak elsősorban az esetleges enantioszelektív kioldódás tanulmányozására. A HPMC vízben nem oldódik, vizes közegben duzzad, ezáltal mátrixot képez. Gyógyszerformulálás során lassított hatóanyag leadás céljából alkalmazzák, leggyakrabban oly módon, hogy a hatóanyag a mátrix szerkezetből oldódik ki, vagy a szilárd gyógyszert bevonják a cellulózszármazékkal, így a felszabadulás során kell a hatóanyag(ok)nak átjutniuk a nehezen átjárható gélen. Elsőként Duddu és munkatársai [36] a β-blokkoló racém propranolol HCl sztereoszelektív kioldódását tanulmányozták HPMC mátrixból, és azt tapasztalták, hogy a lassított hatóanyag felszabadulás során, mindig az S izomer oldódott ki nagyobb mértékben. Más szerzők a propranolol HCl kioldódását egyéb cellulózszármazékok segítségével vizsgálták, és úgy találták, hogy az esetek nagy részénél az R enantiomer 23

24 oldódott ki nagyobb arányban [37]. Megfigyelték továbbá, hogy a szilárd segédanyaghatóanyag keverékhez képest nagyobb volt az enantioszelektivitás, ha a gyógyszert nedves granulálással állították elő. A nemszteroid gyulladáscsökkentő racém ketoprofent tartalmazó tablettákból, szintén HPMC hatására enantioszelektív kioldódás figyelhető meg [38,39]. A féregűző hatású rikobendazol enantiomerjei is eltérő arányban oldódtak ki, HPMC mellől [39]. Az utóbbi munkában egy nem királis segédanyagot is alkalmaztak ellenőrzés céljából, név szerint eudragit-rl-t, és a várakozásoknak megfelelően az enantiomerek koncentrációja gyakorlatilag megegyezett. A kálcium-csatorna blokkoló verapamilt tartalmazó, préseléssel bevont tabletta HPMC tartalmú külső héja nem okozott enantiomerarány eltolódást a kioldódás során, azonban pektint, galaktomannánt (galaktóz csoportokat tartalmazó mannóz egységekből felépülő polimer) és szkleroglukánt (1,6-β-D-glukozil csoportokat tartalmazó 1,3-kapcsolt β-d-glukóz egységekből felépülő polimer) alkalmazva enantioszelektív kioldódás figyelhető meg [40]. Aubry és munkatársai két, kereskedelmi forgalomban lévő lassított felszabadulású, szintén racém verapamil hatóanyag tartalmú gyógyszer kioldódását vizsgálták, és mindkét esetben úgy találták, hogy az R enantiomer oldódott ki gyorsabban [41]. Az egyik esetében szacharóz, a másiknál alginát (1-4-kapcsolt β-d-mannuronátból és α-l-guluronátból felépülő polimer) volt a segédanyag. Valamennyi említett munka aránylag kis enantioszelektivitást tapasztalt, számszerint maximum másfél - kétszeres enantomerarányt. Ez azonban in vivo markánsabb is lehet, a már említett szervezeten belüli egyéb királis molekulákkal, például fehérjékkel való másodlagos kölcsönhatások miatt. A jelenségek additíve járulhatnak hozzá az enantiomerek eltérő biohasznosíthatóságához, így a hatóhelyhez jutó enantiomerek koncentrációkülönbsége jelentős lehet. Érdemes megemlíteni továbbá, hogy a fenti szerzők az enantiomerek arányát királis elválasztástechnikai módszerrel, leginkább királis állófázisú HPLC-val határozták meg [36-41]. 24

25 Fehérjék vizsgálata Már számos esettben esett arról szó, hogy a szervezetben előforduló, vagy exogén fehérjék másodlagos kölcsönhatásai a gyógyszermolekulákkal lehetnek enantioszelektívek. Mivel a gyógyszerek vérben való szállításában nagy szerepe van a szérumfehérjéknek, érdemes foglalkozni ezen kölcsönhatások enantioszelektivitásával. Néhány érdekesebb munkát említenék az alábbiakban. Nagy hatékonyságú folyadék affinitás kromatográfiával vizsgálták a ketoprofen humán szérum albuminnal (HSA) való kapcsolatát, ahol immobilizált HSA képezte a királis állófázist. Az enantiomerek sikeres elválasztása bizonyította, hogy kromatográfiás körülmények között az enantioszelektív kölcsönhatás érvényre jut [42]. Májbetegségekben szenvedő betegeken végzett kísérlettel szintén alátámasztották, hogy a racém ketoprofen HSA-hoz való kötődése a vérben, tehát nem kromatográfiás körülmények között, sztereoszelektív. Érdekes módon azt figyelték meg, hogy a HSA koncentráció csökkenésével az enantioszelektivitás nőtt [43]. Más szerzők, a szintén nemszteroid gyulladáscsökkentő ibuprofen in vivo kötődését vizsgálták szérum fehérjékhez, és azt tapasztalták, hogy HSA-hoz az R enantiomer kötődött erősebben, ami a kiürülését is befolyásolta, ugyanis az S izomer szignifikánsan gyorsabban ürült ki [44]. A β-blokkoló alprenolol vérmintákban megfigyelt kötődése az α 1 -savas glikoproteinhez sztereoszelektív volt. A hatás még jelentősebb vesebetegek esetében, ahol a szérumfehérje koncentrációja alacsonyabb [45] Ciklodextrinek alkalmazása Ciklodextrinek szerkezete, tulajdonságai A különböző ciklodextrinek (Cdx-ek), amelyek zárványkomplexet képeznek számos molekulával, szintén jelentős királis segédanyag csoportot képviselnek. A kialakuló komplex tulajdonságai eltérnek a szabad vendégmolekuláétól, aminek köszönhetően számos területen alkalmazzák őket segédanyagként. 25

26 A natív Cdx-ek gyűrűs szerkezetű, térben csonkakúp alakú oligoszacharidok. Három fajtájuk ismert, az α, a β és a γ Cdx, attól függően, hogy 6, 7, vagy 8 D-glukopiranóz egységből épülnek-e fel, amelyek α-(1,4) helyzetben kapcsolódnak egymáshoz [46]. Ezen természetes Cdx-eket különböző baktériumtörzsek állítják elő a ciklodextrin-glukozil-transzferáz enzim segítségével a keményítő lebontása során. A natív ciklodextrinek mellett számos félszintetikus változatuk is megvásárolható, amelyek különböző szubsztituenseket tartalmaznak, amelyeket leginkább a Cdx-ek hidroxil csoportjainak éteresítésével, vagy észteresítésével kapcsolják a gyűrűkhöz [47,48]. Léteznek polimerizált ciklodextrin származékok is, amelyeket kovalens kötéssel összekapcsolt ciklodextrin molekulák alkotnak [49]. A természetes Cdx-ek külseje hidrofil karakterű, mivel a szabad hidroxil csoportok kifelé néznek (7. ábra), ürege azonban kevésbé hidrofil, mivel a kevésbé poláris éteres oxigének az üreg belső felületén helyezkednek el [46,47]. Vizes közegben a ciklodextrinek számos, főként hidrofób molekulával képeznek zárványkomplexet, amely során a vendégmolekula részben, vagy egészében az üregben helyezkedik el, gyakran az apoláris régió belül, a poláris kívül található. A kötődést nem kovalens, azaz másodlagos kötések, elsősorban gyenge van der Waals erők és H-hidak biztosítják. 7. ábra: A β-ciklodextrin térszerkezete (fekete nyíl: szekunder hidroxil csoportok; szürke nyíl: primer hidroxil csoportok) Sok tényezőtől függ, hogy adott körülmények között milyen arányban található egy adott molekula a ciklodextrin üregében, illetve szabad formában. A tényezők közül a sztérikus és a termodinamikai hatások a legfontosabbak. 26

27 A sztérikus hatások a vendégmolekula alakjától és méretéből erednek. Ha az üreg mérete túl kicsi, nem fér bele a vendégmolekula, ha pedig túl nagy, nem tudnak kialakulni az említett másodlagos kötések. Előnyös, ha a molekula hajlamos konformáció változtatásra, így alakját változtatva az üregben a lehetőségekhez képest legjobb másodlagos kötéseket képes létesíteni. Termodinamikailag több tényező is előnyösen befolyásolhatja a zárványkomplex kialakulását. Az üreg enyhén hidrofób mikrokörnyezete energetikailabb kedvezőbb az apoláris molekulák, molekularészek számára, mint a vizes környezet. Komplexképzés során az üregben elhelyezkedő vízmolekulát a vendégmolekula kiszorítja, ami szintén energetikailag kedvező folyamat, mert ezáltal a vízmolekula elhagyja a számára kedvezőtlenebb hidrofób környezetet [50,48]. A leggyakrabban egy ciklodextrin molekula egy vendégmolekulával képez komplexet, azaz a komplex szöchiometriája 1:1, de előfordul 1:2, vagy ennél nagyobb mólarányú komplex is, ha megfelelően nagy a vendégmolekula, és lehetőség nyílik több ciklodextrin molekula ráfűződésére (8. ábra) [48,51]. 8. ábra. A zárványkomplex képződés főbb sémái 27

28 A kapcsolat erősségét a komplexstabilitási állandóval (K c ) jellemezhetjük, ami gyakorlatilag meghatározza, hogy a molekulák hányad része található szabad, illetve komplex formában. Az 1:1-es sztöchiometriájú komplexre a stabilitási állandót a következőképpen írhatjuk fel: [ VCdx] K 1:1 = (4.) [ V ][ Cdx] ahol, [VCdx] a komplex forma koncentrációja, [V] a szabad vendégmolekula koncentrációja, [Cdx] a szabad ciklodextrin koncentrációja [52]. A természetes ciklodextrinek néhány tulajdonságát az 1. táblázat foglalja össze [48]. 1. táblázat. A természetes ciklodextrinek tulajdonságai Tulajdonság α-ciklodextrin β-ciklodextrin γ-ciklodextrin Glukopiranóz egységek száma Molekulatömeg (g/mol) Vízoldhatóság (25 C) (g/100ml) 14,5 1,9 23,2 Külső átmérő (Å) 14,6 15,4 17,5 Üreg átmérő (Å) 5,0 6,3 7,9 Gyűrű magasság (Å) 7,9 7,9 7,9 Üreg térfogat (Å 3 ) Ciklodextrinek alkalmazása Rendkívül széles körben alkalmazzák a természetes és félszíntetikus ciklodextrin származékokat az említett zárványkomplexképző tulajdonságuk miatt. A komplex gyakorlatilag kapszulázott anyagnak fogható fel, így a vendégmolekula egyes kémiai, fizikai tulajdonságai elfedhetők, látszólag megváltoztathatóak. Számos területen alkalmaznak ciklodextrineket, amelyek közül a legfontosabbak a következők [48]: - gyógyszertechnológia - gyógyszeranalitika - élelmiszeripar 28

29 - kozmetikai szerek gyártása - textilgyártás - mezőgazdaság - hadiipar - környezetvédelem A fenti felsorolásból a jelen munka számára a legfontosabb a gyógyszertechnológiai és gyógyszeranalitikai felhasználás, hiszen a kettő ötvözésével juthatunk el az enantioszelektív kioldódás területéhez. Külön alfejezetben ezt a két felhasználási területet részletesebben is kifejtem alább. Főképpen a következő célokra lehet felhasználni a ciklodextrineket, többékevésbe függetlenül a fent felsorolt felhasználási területektől [48]: - oldhatóság növelése - királis megkülönböztetés - fényre, oxigénre érzékeny anyagok stabilizálása - vendégmolekula reaktivitásának megváltoztatása - illékony anyagok illékonyságának csökkentése - folyékony halmazállapotú anyagok szilárddá való átalakítása - anyagok mikroorganizmusok elleni védelme - íz, szag, szín elfedése - mérgező anyagok megkötése, eliminálása Ciklodextrinek gyógyszertechnológiai felhasználása Napjainkban a ciklodextrinek gyógyszertechnológiai felhasználása a legjelentősebb. Néhány kivételtől eltekintve szinte minden esetben a rossz vízoldékonyságú hatóanyag oldhatóságának növelése a cél. Nagy előnye a zárványkomplex képzéssel történő vízoldhatóság növelésnek, hogy ellentétben egyéb módszerekkel (például kémiai módosítás), nem történik hatásbeli csökkenés, ráadásul gyakran nagyobb mértékben javul a biohasznosíthatóság, mint amit az oldhatóság növelés mértékéből várnánk [51]. 29

30 Ahhoz, hogy egy orálisan adott gyógyszer hasson, a hatóanyagnak valamennyire oldódnia kell testnedvekben, és fel kell tudnia szívódni, azaz membránokon kell keresztül jutnia. A kutatás alatt lévő gyógyszerek több, mint 40%-a azért nem felel meg, mert túl rossz a vízoldhatósága. A Food and Drug Administration (FDA) egyéb szabályozó szervezetekkel közösen létrehozott egy biofarmáciai osztályozó rendszert (Biopharmaceutical Classification System), amely a hatóanyagokat 4 csoportba sorolja az oldhatóságuk és permeációs készségük alapján [53,54]: I. Jó oldhatóság, jó permeábilitás II. Rossz oldhatóság, jó permeábilitás III. Jó oldhatóság, rossz permeábilitás IV. Rossz oldhatóság, rossz permeábilitás A rendszer szerint a jó oldhatóság definíciója, hogy adott hatóanyag egyszeri legnagyobb előírt dózisa oldódik 250 ml vízben (ezt FDA féle pohár víznek is hívják). Az összes többi a rossz oldhatóságba sorolandó. Permeábilis az a szer, amelynek (orálisan adva) több mint 90%-a biohasznosul, vagy amelynek több mint 90%-a a vizeletből kimutatható. Az eddig tárgyaltak alapján könnyű belátni, hogy a ciklodextrinekkel történő látszólagos oldhatóság növeléssel leginkább a II. csoportban szereplő problémás gyógyszereken lehet segíteni. Megfelelő Cdx alkalmazásával gyakran elérhető, hogy a II. csoport hatóanyagai I. csoportosként viselkedjenek, tehát jelentősen javuljon a biohasznosíthatóságuk. A IV. osztályba sorolt hatóanyagok biohasznosíthatósága is javulhat Cdx-ek alkalmazásával, de a hatás elmarad a II. csoportéhoz képest [55,56] Ciklodextrinek toxicitása A ciklodextrinek térhódításával párhuzamosan egyre több közlemény látott napvilágot, amelyek a ciklodextrinek egészségkárosító hatásaira próbálta felhívni a tudomány figyelmét. Számos kutatás irányult olyan származékok létrehozásának 30

31 irányába, amelyek nem toxikusak, mégis jól komplexálják a különböző gyógyszermolekulákat. Ma már a természetes ciklodextrinek alkalmazása korlátozott, mert bizonyított tény, hogy parenterálisan nem veszélytelenek. Főképpen az α- és β-cdx-ekre vonatkozóan hamar bizonyosságot nyert vesekárosító hatásuk [57]. Jelenleg egyetlen parenterálisan alkalmazott ciklodextrin tartalmú gyógyszer van forgalomban. Ezt az α- Cdx tartalmú PGE 1 -hatóanyagot tartalmazó szert rendkívül alacsony dózisa miatt alkalmazhatják Japánban és Németországban [52]. Vesekárosító hatásuk arra vezethető vissza, hogy a Cdx-ek, legfőképpen a β- Cdx, a lipid membrán összetevőit, mint például a koleszterint és foszfolipideket nagy affinitással komplexálják. Ezek a lipofil anyagok a vesetubulusokban felhalmozódva kiválhatnak, ezáltal károsíthatják a szervet [58,59]. Hasonlóan rendkívül súlyos hatás a vörösvérsejtekre gyakorolt hemolizáló tulajdonságuk is, aminek oka szintén a membránkárosító hatás. A hemolitikus hatás csak rendkívül nagy dózis esetén figyelhető meg, és a γ-cdx esetében veszélye még alacsonyabb, mivel nagyobb mérete miatt kevésbé köti a membrán összetevőit [48,60]. Izomba adott injekciókor fellépő irritáció is az említett hatásra vezethető vissza, és leginkább α- és β-cdx-ek estében jelentkezik [48]. Orális alkalmazáskor nem toxikusak, mivel a gyomor-bél traktusból a natív Cdxek gyakorlatilag nem szívódnak fel [61]. A bélrendszer emésztő enzimei és a bélflóra bontó enzimei hatására a Cdx-ek cukoregységekre bontódnak, amelyek ilyen formában már képesek felszívódni [62]. További problémát jelenthet, hogy a β-cdx a vesében kiválhat, mivel vízoldhatósága jelentősen rosszabb, mint a másik két természetes Cdx-é (1. táblázat), ami szintén korlátozza parenterális alkalmazását. A legkevésbé toxikus natív Cdx-nek a γ-cdx bizonyult, azonban a γ-cdx vizes oldatban aggregálódásra hajlamos, H-hidas szerkezettel Cdx füzérek jöhetnek létre, amelyek opálossá teszik az oldatot [63]. Parenterális alkalmazása tehát szintén kérdéses. Az említett problémákra megoldást kereső kutatók különböző félszintetikus származékok előállításával próbálkoztak. Olyan Cdx-eket kerestek, amelyek nem toxikusak, jó komplexáló tulajdonságúak és jól oldódnak vízben. Sajnos nem igazán lehet a két első feltételt egyszerre biztosítani, mert ami jól komplexál, az általában a 31

32 koleszterint és egyéb membrán összetevőt is jól köti, azaz toxikus. Például a hidroxipropil-β-cdx (HP-β-Cdx) sokkal kevésbé toxikus, és sokkal vízoldhatóbb, mint a természetes származék, azonban számos esetben problémát jelent, hogy komplexképző tulajdonsága elmarad attól [64]. Az egyik legjelentősebb félszíntetikus Cdx-ek, a szulfoalkiléter-β-cdx-ek. Rendkívül jó vízoldhatóság mellett jó komplexképző tulajdonságúak, ráadásul polianionos jellegükből adódóan kevésbe membránkárosítók [65] Ciklodextrinek gyógyszeranalitikai felhasználása A fentiekben már esett szó arról, hogy a zárványkomplexbe zárt vendégmolekula fizikai és kémiai tulajdonságai megváltoznak. Gyógyszeranalitikai szempontból talán a legjelentősebb, hogy egy adott királis vegyület enantiomerjei eltérő erősségű kapcsolatot hoznak létre a Cdx-nel. Ezen alapulnak a királis elválasztástechnikai módszerek, amelyeknél a Cdx a szilárd fázishoz kovalensen, illetve ionosan van kötve, vagy a mozgó fázisban van oldva [66]. Az elválasztás alapja a diasztereomer molekulapár képződés, amely elsősorban sztérikus okokra vezethető vissza. Az enantiomerek elválasztása gyakorlatilag az enantiomerek adott ciklodextrinnel való eltérő komplexstabilitásának köszönhető [67]. Egy β-ciklodextrin molekula 35 királis centrumot tartalmaz, méretéből eredően komplexáló tulajdonsága a legideálisabb az alap ciklodextrinek közül, ezért királis elválasztásra leggyakrabban β-cdx-t, vagy annak származékát választják. A sztereoszelektív kölcsönhatás feltétele, hogy szoros kapcsolat jöjjön létre a királis komplexképző és a kívánt anyag enantiomerjei között, lehetőleg minél nagyobb számú sztereoszelektív H-híd alakúlhasson ki az anyag és a ciklodextrin üregének peremén elhelyezkedő szabad hidroxil csoportok között [68]. Wainer és Drayer négy, az elválasztandó molekulára vonatkozó szerkezeti szabályt állított fel, amelyek szükségesek az optimális elválasztáshoz [69]: 1. A vendégmolekula legalább részben beleférjen az üregbe. 2. A kiralitás centrum minél közelebb helyezkedjen el az üreg bejáratához. 3. A kiralitás centrum közelében lehetőleg legyen aromás gyűrű. 32

33 4. Tartalmazzon H-híd képzésre alkalmas csoportot. Királis elválasztást leginkább HPLC-s módszerrel végeznek. A leggyakrabban Cdx-nel töltött oszlopot alkalmaznak, amelyekben a Cdx molekulákat kovalensen, vagy ionosan kötött állapotban, rögzítik a szilikagélre. Használhatnak natív, vagy szubsztituált Cdx-eket is, igény szerint [70]. Leggyakrabban fordított fázist alkalmaznak, ekkor viszont számolni kell azzal, hogy a nem túl poláris oldószer összetevőit is komplexálhatja a mindkét oldalán nyitott Cdx [71]. Ez szubsztituált Cdxek használatával részben kivédhető. Ritkábban normál fázisú HPLC rendszert is alkalmaznak, de abban az esetben az oldószer molekulák komplexálása még jelentősebb. Könnyű belátni, hogy a szerves modosítók szerepe fordított fázis esetén nagyon jelentős lehet, mivel ezen molekulák versengenek az elválasztandó anyagokkal a Cdx molekulák üregeiért, ezért az elválasztást jelentősen befolyásolhatják [68]. A Cdx tartalmú állófázis hátránya, hogy könnyen telíthető, mivel nagy helyigényének köszönhetően a felületegységre jutó Cdx mennyisége aránylag kevés. Figyelni kell továbbá arra, hogy az injektált anyag, vagy az oldószer minél kevesebb szennyezést tartalmazzon, mert ezeket a szennyezéseket is komplexálhatja a Cdx, így az effektív molekulaszám még inkább lecsökken. Sok esetben, például biológiai mintáknál, előnyös lehet valamilyen extrakciós módszerrel, például folyadék-folyadék, vagy folyadék-szilárd extrakcióval tisztítani a mintát injektálás előtt [72,73]. Mozgó fázisban oldott Cdx-eket királis elválasztásra ritkábban alkalmaznak, mert a módszer reprodukálhatósága gyakran nehézkes, viszont nem igényli drága királis oszlop vásárlását, ezért elővizsgálatokra jól alkalmazható [66,74,75]. Az elválasztás elsősorban szintén az enantiomerek eltérő komplexstabilitásából ered, mivel a résztvevő molekulák, azaz a két enantiomer komplexei, a szabad enantiomerek és a szabad ciklodextrin eltérő retenciós idővel eluálódik, tehát a két enantiomer egymástól elválik. A módszer hátránya, hogy nagy Cdx koncentráció szükséges, ami viszont oldhatóságbeli problémákhoz vezet. Jó oldhatóságú Cdx-eket lehet alkalmazni a probléma kiküszöbölésének érdekében, például metilezett-β-cdx-t, vagy kationos Cdxeket [33]. 33

34 Meg kell említeni továbbá, hogy a HPLC módszer mellett a kapilláris elektroforézis (CE) technikánál is leggyakrabban Cdx-eket alkalmaznak királis elválasztásra. Az elválasztás alapját, ebben az esetben is, az enantiomerek eltérő komplexstabilitása okozza, ugyanis az enantiomerek mozgékonysága függ attól, milyen gyakorisággal van komplex, illetve szabad formában [66] Enantioszelektív kioldódás tanulmányozása ciklodextrinekkel Láthattuk, hogy a Cdx-ek rendkívül alkalmasak a gyógyszermolekulák oldhatóságának növelésére, amit alkalmazásuk gyakorisága is alátámaszt. Tudjuk továbbá, hogy az analitikusok előszeretettel használják királis megkülönböztetés céljából. Felmerülhet a gondolat, hogy vajon alkalmasak-e a Cdx-ek, mint segédanyagok, enantioszelektív kioldódás biztosítására. Érdemes tehát vizsgálatokat tenni arra, hogy az oldhatóság növelésen túl elérhetjük-e Cdx-ek segítségével, hogy a gyógyszerformulából kioldódó anyag a hatásos enantiomerből többet tartalmazzon. A szakirodalomban feltűnően kevés munka foglalkozik ezen téma vizsgálatával. A fontosabbakat az alábbiakban vázolnám. Duddu és munkatársai a propranolol-hidroklorid β-ciklodextrin zárványkomplexből történő kioldódását tanulmányozták [36], de nem sikerült enantioszelektivitást kimutatniuk, mivel a kialakított ciklodextrin komplex jól oldódik, ezért a propranolol hidroklorid nem hagyta el az üreget az oldódás során, tehát az enantiomerek közötti esetleges komplexstabilitásbeli különbség nem juthatott érvényre. Más szerzők HP-β-Cdx is alkalmaztak β-cdx mellett a racém verapamilhidroklorid lassított felszabadulású mátrixtabletták formulálásakor [40]. A mátrix szerkezetet hidroxipropil-metilcellulózzal (HPMC) biztosították, hogy elkerüljék az előbbi munkában tapasztalt rendkívül gyors kioldódást [36]. Sajnos a munka szintén eredménytelen volt, mert nem sikerült kimutatni a kioldódás során enantiomerarány eltolódást sem β-, sem HP-β-Cdx vonatkozásában. Szintén eredménytelen volt az a kísérlet, amelyben a hörgőtágító racém szalbutamol-szulfát hatóanyag kioldódását vizsgálták HP-β-Cdx és 2,6-dimetil-β-Cdx mellől [76]. 34

35 A fenti példákból is következik, hogy amennyiben a hatóanyag is, és a komplex maga is jól oldódik vízben, akkor nem lehet enantioszelektivitást kimutatni, mert végeredményben a teljes racém hatóanyag oldatba jut, függetlenül attól, hogy milyen arányban képeznek az enantiomerek komplexet. Ésszerűbb lenne olyan racém hatóanyagot választani, ami rosszul oldódik vízben, és Cdx-hatására nem a teljes szilárd anyagmennyiség oldódna, így elérhető lenne, hogy az egyik enantiomerből több oldódjon fel, mint a másikból. Másik racionális lehetőség lehetne olyan Cdxszármazékokat alkalmazni, amelyek nem, vagy rosszabbul oldódnak vízben, így a kialakult komplexből, mint szilárd közegből történne a kioldódás, azaz az oldatba jutó vízoldhatóbb hatóanyag csakis szabad formában lenne jelen. Az előbbi megoldásra egyetlen példát találtam a szakirodalomban. A rosszul oldódó ibuprofen vizes szuszpenziójából HP-β-Cdx oldat segítségével próbáltak enantioszelektív oldódást kimutatni [77]. Ígéretes kísérleteikkel, azonban nem sikerült bizonyítani az enantioszelektív hatást. Az utóbbi megoldást választotta egy kanadai kutatócsoport, akik rosszul oldódó Cdx-t, névszerint 2,6-dietil-β-Cdx-t alkalmaztak [78]. Nedves gyúrással alakították ki a tiaprofénsav Cdx komplexeket, amelyeket aztán liofilizálással szárítottak. A szilárd komplexből vizes oldatban végezték a kioldást. A kioldott anyagmennyiséget kvantitatíve szerves fázisba rázták át, és bepárolták. Az újra oldatba vitt anyag enantiomerarányát származékképzés után HPLC módszerrel határozták meg. Tapasztalataik szerint ph 1,5-nél nincs, de ph 3-nál van kimutatható enantioszelektivitás a nemszteroid gyulladáscsökkentő triaprofénsav esetében. Érdemes megemlíteni továbbá, hogy valamennyi említett munkában az enantiomerek arányát királis elválasztástechnikai módszerekkel (HPLC és CE) határozták meg A komplexstabilitási állandó meghatározásának lehetőségei Enantioszelektív kölcsönhatás ciklodextrin és racém vendégmolekula között akkor jöhet létre, ha a két enantiomer komplexstabilitása eltérő az alkalmazott ciklodextrinnel. Számtalan módszer állhat rendelkezésre, hogy a komplexek egyensúlyi 35

36 állandóját meghatározzuk, hisz elvileg minden mérési módszer alkalmas, amelyik alkalmazása során a mért értékek változást mutatnak a komplexképzés során, az eredeti anyagok külön-külön (vendégmolekula, ciklodextrinek) mért értékeihez képest. Gyakorlatilag azonban a vizsgált komplexek, illetve az azokat alkotó molekulák tulajdonságai miatt a választható módszerek száma jelentősen lecsökken. Az alábbiakban összefoglalom, hogy mely módszereket alkalmazzák leginkább ciklodextrinkomplexek stabilitásának meghatározására UV spektrofotometriás módszerek Ciklodextrinnel való komplexképzés során a vendégmolekula UV/Vis spektruma torzulhat, mivel az üregbe kerülő molekula könnyen gerjeszthető elektronjainak kémiai környezete megváltozik. Például a daganatellenes klorambucil 255 nm-nél jelentkező intenzív maximuma metil-β-cdx hatására batokróm és hiperkróm eltolódást szenved [79]. A vendégmolekula abszorbanciaváltozásának észlelését megkönnyíti, hogy a természetes Cdx-ek és a legtöbb félszintetikus ciklodextrinszármazék UV elnyelése gyakorlatilag zérus az analitikai ultraibolya tartományban (185 nm felett). A kapott abszorbanciaváltozás értékekből különböző lineáris és nem lineáris matematikai modellek segítségével számolható a stabilitási konstans értéke [79]. Az egyik legismertebb lineáris modell az úgynevezett Benesi-Hildebrand modell [80]. A módszer során az adott hullámhosszon mért abszorbanciaváltozás reciprokát ábrázoljuk a hozzáadagolt, egyre növekvő koncentrációjú vendégmolekula koncentrációjának reciproka függvényében. Amennyiben 1:1 a komplex aránya, egy egyenest kapunk, amelynek tengelymetszetét elosztva a meredekségével az egyensúlyi állandót kapjuk eredményül. A számításhoz természetesen ugyanazon hullámhosszon mért abszorbancia adatokat kell használni. Ez bármely hullámhossz lehet, azonban érdemes azt a hullámhosszt választani, ahol a legnagyobb az abszorbanciaváltozás. A módszer hátránya, hogy csak akkor alkalmazható, amennyiben a Cdx hatására az UV spektrum számottevő változást szenved. További hátránya, hogy a vendégmolekulának minimális mértékben, de oldódnia kell komplexképző jelenléte nélkül is az adott oldószerben, hogy az eredeti abszorbanciát meghatározhassuk. 36

37 Elválasztástechnikai módszerek (HPLC, CE) A fordított fázisú HPLC módszerrel történő komplexstabilitási állandó meghatározásának legegyszerűbb módja, hogy az oldószerbe juttatott Cdx koncentrációját egyre növeljük, és a különböző koncentrációkhoz tartozó kapacitásfaktort (k ) külön-külön meghatározzuk, majd az úgynevezett Scott egyensúly (5. egyenlet) alapján a stabilitási állandót kiszámolhatjuk, 1 k' K c = [ Cdx] + (5.) K D 1 K D ahol, K c a stabilitási állandó, K D a fázis konstans, [Cdx] a ciklodextrin koncentrációja [81]. Kapilláris elektroforézis (CE) módszerrel is meghatározható a komplexstabilitási állandó, az alábbi egyenlet alapján, K c 1 u = [ Cdx] u V eff, V u u eff, V VCdx ha ismerjük a szabad vendégmolekula mobilitását (u V ), a ciklodextrin komplex mobilitását (u VCdx ), illetve a vendégmolekula effektív mobilitását (u eff,v ) és a Cdx koncentrációt [82]. (6.) Fázis-oldhatósági módszer Az egyik legalkalmasabb és legszéleskörűbben alkalmazott módszer, a Cdx komplexek stabilitási állandóinak meghatározására, az úgynevezett fázis-oldhatósági, vagy más néven Higuchi-Connors módszer [83]. Ennek során azonos mennyiségű szilárd vendégmolekulát juttatunk különböző koncentrációjú, azonos térfogatú Cdx oldatokba, ügyelve arra, hogy a vendégmolekula az összes mintában feleslegben legyen. Az egyensúly beállása után egy alkalmas módszerrel meghatározzuk az oldatok teljes vendégmolekula koncentrációit, és azokat ábrázoljuk a Cdx koncentrációjának függvényében. A kapott függvény meredekségéből és tengelymetszet értékéből a stabilitási állandó kiszámítható [83-85]. A módszer egyik előnye, hogy közvetlenül megállapítható, hogy a komplex szöchiometriája 1:1-es, vagy attól eltérő. További 37

38 előnye, hogy a tengelymetszet megadja a számoláshoz szükséges vendégmolekula oldhatóságát, komplexképzőt nem tartalmazó, azaz a tiszta oldószerben, például vízben, amelynek meghatározása sok esetben nehézkes, például rosszul oldódó vegyületeknél, mint amilyenek a szteroidok [86]. A módszer gyakorlati alkalmazásáról és számítási elvéről az Alkalmazott módszerek című fejezetben még teszek említést Egyéb módszerek Az egyensúlyi állandó meghatározása fluoreszcenciás módszerrel is megoldható, amely módszer rendkívül hasonlít a fent említett UV spektroszkópiás módszerekre. Ebben az esetben az emisszió energiája szenved változást, például rutin esetében Cdx komplexképzés hatására hipszokróm eltolódás figyelhető meg [87]. A stabilitási konstans (K c ) az alábbi egyenlet alapján határozható meg: 1 f V / f c VCdx = K c φ + φ VCdx V ε ε VCdx V K ahol, f V és f VCdx a szabad vendégmolekula és a komplex fluoreszcencia intenzitása, c a Cdx koncentrációja, φ V és φ VCdx a vendégmolekula és komplex kvantumhasznosítási tényezője, ε V és ε VCdx a vendégmolekula és komplex moláris abszorbanciája a gerjesztés hullámhosszán [87]. Potenciometriás titrálással is jól meghatározhatóak a ciklodextrin komplexek stabilitási állandói, amennyiben a vendégmolekula tartalmaz minimum egy savas, vagy bázikus csoportot. A komplexképzés során ugyanis változik a kapott disszociációs állandó értéke a szabad molekuláéhoz képest [88]. Minél nagyobb a Cdx koncentráció, annál nagyobb a változás. A fent említett Benesi-Hildebrand módszer alapján mind a protonált, mind a protonálatlan forma komplexstabilitási állandója meghatározható [89]. A mágneses magrezonancia spektroszkópiás (NMR) módszer alapja, hogy a komplexképzés hatására a Cdx, illetve a vendégmolekula egyes protonjainak kémiai környezete megváltozik, ezáltal a kémiai eltolódásuk is változást szenved. A kémiai eltolódás változásokból különböző matematikai modellek alapján a komplexstabilitási c ( f V / f VCdx ) (7.) 38

39 állandó kiszámolható [90,91]. Minél több, a komplexképzésben résztvevő magot veszünk figyelembe, annál pontosabb a módszer. Az említett módszereken kívül gyakran alkalmazzák még a komplexképzés során bekövetkező vezetőképesség változásán alapuló konduktometriás titrálásokat is. A vendégmolekulát tartalmazó oldat vezetőképessége csökken semleges Cdx-ekkel történő komplexképzés következtében. A változás a fentiekhez hasonlóan felhasználható a stabilitási állandó meghatározására [92] Norgesztrel-ciklodextrin zárványkomplexek az irodalomban A norgestrel progesztogén hatású, rendkívül rossz vízoldhatóságú szteroid gyógyszer. Mind a racém formája, mind, pedig a hatásos enantiomer, azaz a levonorgesztrel hivatalos az érvényben lévő (2007. február) európai és amerikai gyógyszerkönyvekben [93,94]. Racémként és levonorgesztrelként egyaránt alkalmazzák, elsősorban különböző összetett és monofázisos fogamzásgátló készítményekben [95]. Már a hetvenes évek végén ismert volt, hogy a levonorgesztrel tartalmú szer dupla olyan hatékony, mint a racém formában alkalmazott, azaz a disztomer molekula teljes mértékben hatástalan [96]. A norgesztrel enantiomerjeinek elválasztására alkalmasak az egyes natív és félszintetikus Cdx-ek. Számos munka szerint a fordított fázisú HPLC rendszer mobil fázisában oldott γ-cdx a legalkalmasabb a természetes Cdx-ek közül az enantiomerek elválasztására [74,75,97,98], mivel a szteroidok leginkább a legnagyobb méretű üreggel rendelkező γ-cdx-nel alkotnak zárványkomplexet [86]. Aigner és munkatársai különböző Cdx származékokat alkalmaztak a norgesztrel vízoldhatóságának növelésére, és azt tapasztalták, hogy a γ-cdx a legalkalmasabb erre a célra [99]. Gazdag és kutatócsoportja bizonyította, hogy az α-cdx egyáltalán nem képez komplexet norgesztrellel [74]. β-cdx esetében kialakulnak ugyan zárványkomplexek, de a kialakuló kölcsönhatás az enantiomerek elválasztására nem igazán alkalmas [75,97,100]. Ezen eredmény nem csupán az üreg méretéből ered, hanem annak is 39

40 köszönhető, hogy a β-cdx vízoldhatósága jóval alul marad a γ-cdx-éhez képest, ezért abból jóval kisebb koncentrációjú oldat készíthető. HP-β-Cdx oldhatósága többszöröse a natív molekulához képest. Norgesztrel enantiomerek elválasztásakor alapvonal elválasztás érhető el HP-β-Cdx-nel, ha a komplexképző koncentrációja 25 mm az eluensben [101]. A hidroxi-propil csoport nem csupán az oldhatóságot növeli, de többlet kölcsönhatást is biztosít, ami előnyös a királis felismerés során [102]. CE módszerrel is elválaszthatóak a norgesztrel enantiomerek, például natriumdodecilszulfát micellaképző és γ-cdx királis szelektor alkalmazásával [103]. 1 H-NMR módszerrel jól jellemezhetőek a norgestrel enantiomerek Cdx-ekkel való kölcsönhatásai. Az NMR módszerrel kapott komplexstabilitási értékek egyezést mutattak a HPLC-ás adatokkal [95,104]. NMR módszerrel, γ-cdx-t alkalmazva, az enantiomerek elválasztása nélkül meg lehet határozni a levonorgesztrel enantiotisztaságát [105]. 40

41 2.5. Enantioszelektív folyadék-folyadék fázishatár transzport A királis segédanyag racém hatóanyag kölcsönhatását folyadák-folyadék fázishatár transzport kísérletekkel is tanulmányozták. A vizsgálatok során a két, vagy több fázisú rendszer anyagtranszportjának enantioszelektivitását vizsgálták. A mérések során a királis segédanyagot, vagy karrier molekulát, annak lipofilitásától függően vagy a vizes, vagy a szerves fázis tartalmazza. Amennyiben két vizes fázist egy szerves fázis választ el, úgynevezett folyadék-membrán modellről beszélünk, de előfordul, hogy az egyik szerves fázisból egy karrier molekulákat tartalmazó vizes fázison keresztül jut át a molekula a másik szerves fázisba. Enantioszelektív transzportot figyeltek meg etil-acetát/vizes β-cdx oldat/etilacetát rendszerben, a vizelethajtó racém klórtalidon esetében [106]. Azt tapasztalták továbbá, hogy az enantioszelektivitás fokozható, amennyiben több, a fentihez hasonló, hármas rendszert csatolnak sorba, ami által úgynevezett többszörös folyadék-membrán keletkezik. Racém ketoprofen és racém ibuprofen esetében ugyancsak eltérés mutatkozott az enantiomerek transzportjában különféle szérum albumint alkalmazva, olaj/víz/olaj rendszerben, ahol szerves fázisként n-oktán és n-dekánt használtak [107]. A hatás többszörös membránt alkalmazva szintén fokozható volt. Szerves fázisban oldott királis korona éterekkel ugyancsak enantioszelektív transzportot sikerült kimutatni amino-savak kálium és nátrium sóival víz/kloroform/víz rendszerekben [108,109]. Elvileg elképzelhető lenne, hogy például a vizes Cdx komplexből szerves fázisba kerül át az anyag enantioszelektíven egy kétfázisú rendszerben, de erre nem találtam példát a szakirodalomban. 41

42 3. CÉLKITŰZÉSEK Amikor a Gyógyszerészi Kémiai Intézet kiroptikai kutatócsoportjába kerültem, a csoport tagjai, a Jasco 720 spektropolariméter segítségével, már számos feladatot eredményesen megoldottak. Ezen, műszer és kutató közötti kapcsolat rövid ideje alatt született négy Ph.D. munka, a dissziciációs állandó (pk a ) CD spektroszkópiás meghatározásától kezdve, az abszolút konfiguráció meghatározásán és kromatográfiás csúcshomogenitás, illetve dekonvolución át, egészen az oxim képzéssel történő szteroid- és morfinszármazékok meghatározásáig bezárólag sokféle témában. A fenti munkákkal kapcsolatos főbb közleményeket az irodalomjegyzékben felsoroltam [ ]. Természetesen számos együttműködéses munka is kibontakozott különféle intézetekkel és kutatócsoportokkal. Egyik legfontosabb eredményünk, hogy Magyarországon elsőként és nemzetközi viszonylatban is az elsők között oldottuk meg a nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (HPLC) és a cirkuláris dikroizmus (CD) spektroszkópia detektorként való összekapcsolását. Célkitűzéseink, hasonlóan a korábbi törekvésekhez, két fő vonalon helyezkedtek el. Egyfelől új, vagy részben új kiroptikai gyógyszeranalitikai módszerek kidolgozásán, másfelől a már meglevő, elsősorban kutatócsoportunk által kidolgozott analitikai módszereink alkalmazásának kiterjesztésén. Természetesen e két irányvonal nem határolható el egymástól teljes mértékben, ezért fő törekvésünk olyan munkákat végezni, amelyek új területeket jelentenek magunk és módszereink számára, miközben elengedhetetlen feladat a módszerfejlesztés. Gyakorlatilag minden terület számításba jöhet, ami kapcsolatos királis gyógyszermolekulák, illetve optikai izomerek analitikájával, azonban csoportunk szteroid hormonok iránti érdeklődése már-már hagyománynak tekinthető, így fő csapásvonalunkat a továbbiakban is e vegyülettípus határozta meg elsősorban. Érdekes kihívásnak tekintettük a progesztogén 4 -etiszteron és 5 -etiszteron egymás mellett történő meghatározásának kiroptikai spektroszkópiás kidolgozását. Nehézséget okozott ugyanis a gyártásközi ellenőrzés során, hogy az alkalmazott HPLC- UV módszer szerint az UV inaktív 5 -etiszteront, előzetesen a kromofór csoportot tartalmazó 4 -etiszteronná kellett alakítani. A kérdéses kettős kötés helyzetétől függően 42

43 várhatóan eltér a két izomer CD spektruma, ami alapjául szolgálhat egy egyszerűbb, új CD spektroszkópiás módszer kidolgozásához. A dehidroepiandroszteron (DHEA) rokonvegyületei mellett történő CD spektroszkópiás, illetve HPLC-CD módszeres meghatározásának kidolgozását is célul tűzte ki kutatócsoportunk. A módszer választásának oka, ebben az esetben is, a kiroptikai módszerek nagyfokú szelektivitása. Egyik legfőbb törekvésünk volt annak elérése, hogy egy adott racém gyógyszervegyület enantiomerjei ne azonos mennyiségben oldódjanak ki a gyógyszerformából. Végeredményben tehát célunk volt befolyásolni a hatóhelyhez jutó, racém formában alkalmazott gyógyszerek enantiomerarányát. Ezen enantioszelektív kioldódást, illetve oldhatóságot terveink szerint különféle királis segédanyagokkal, elsősorban ciklodextrinek segítségével kívántuk elérni. Elképzelésünk alapját a jól ismert diasztereomer kölcsönhatás jelentette, ami az enantiomerek kromatográfiás elválasztásának alapját is képezi. A kapott minták enantiomerarányát a kutatócsoport által kidolgozott, g-faktor mérésén alapuló módszerrel kívántuk meghatározni. Terveztük továbbá az enantiomerek komplexstabilitásbeli különbségének meghatározását is, amelytől a kialakuló enantiomerarány a leginkább függ. Céljaink között szerepelt az enantiomerek ciklodextrin zárványkomplexekből történő fázishatár transzportjának, illetve az anyagátmenet enantioszelektivitásának vizsgálata is. A komplexeket tartalmazó vizes oldatból szerves oldószerbe, elsősorban oktanolba történne a transzport, az oktanolos fázis enantiomerarányának nyomonkövetésével. A vizsgálat célja, hogy in vitro modellezzük, hogy történik-e enantiomerarány eltolódás a felszívódás során, ha az enantiomereknek a transzport során el kell hagyniuk a ciklodextrin üregét. 43

44 4. ALKALMAZOTT MÓDSZEREK 4.1. Alkalmazott kiroptikai módszerek A CD és az ORD spektroszkópia kvantitatív analitikai alkalmazása Az Irodalmi áttekintés fejezet, Kiroptikai spektroszkópia című részében a CD és ORD spektroszkópia elméleti alapjait tárgyaltam. Mindkét módszer alkalmas szerkezet felderítésre és kvantitatív meghatározásra is. A mért ellipticitás (Ψ [fok]), az abszorbanciához hasonlóan normál mérési körülmények között (híg oldatban, molekula asszociátumoktól mentes körülmények között stb.) lineárisan változik a koncentrációval adott hőmérsékleten, adott oldószerben. Az UV spektrofotometriában alkalmazott Lambert-Beer törvény az ellipticitásra is felírható, Ψ = [ Ψ] c l (8.) ahol, [Ψ] az adott oldószerre, hullámhosszra és hőmérsékletre érvényes fajlagos ellipticitás (10-1 fok cm 2 g -1 ), c a koncentráció (g/ml), l a rétegvastagság (dm) [7,8]. használják, A szakirodalomban inkább a moláris ellipticitást [Θ] (10 fok cm 2 mol -1 ) [ Ψ] M [ Θ] = = 3300 A (9.) 100 ahol, M a molekulatömeg (g/mol), Α a fényspirálok abszorbancia különbsége. Tehát mind a fajlagos ellipticitás, mind a moláris ellipticitás, mind pedig az abszorbancia különbség egymásba átszámolhatók [7,8]. Az ORD-nél kapott forgatási szög is arányos a koncentrációval. Felírható az adott oldószerre, hullámhosszra és hőmérsékletre érvényes fajlagos forgatás [α] (10-1 fok cm 2 g -1 ) és moláris forgatás [Φ] (10 fok cm 2 mol -1 ), [ α] = α l c [ α] M [ Φ] = 100 ahol, α a mért optikai forgatás (fok) [7,8]. (10.) (11.) 44

45 Hasonlóan az UV spektroszkópiához, az ellipticitás és az optikai forgatás koncentrációfüggésének linearitását is mindig vizsgálni kell az alkalmazott koncentráció intervallumban Enantiomerarány meghatározása g-faktor alkalmazásával A fentiekben már esett szó az anizotrópia faktor, vagy más néven g-faktor értékéről, és arról, hogy segítségével az enantiomerarány meghatározható. Akkor mérhető jól a g-faktor, ha a kiroptikai jel nagy intenzitású, az abszorbancia pedig az optimális mérési tartományba esik [14]. Érdemes kalibrációs egyenest szerkeszteni különböző, de ismert enantiomerarányú minták mérési adataiból. A g-faktort ábrázolva az enantomerarány függvényében, normál körülmények között egyenest kapunk. Az egyenes egyenlete alapján az ismeretlen minta, azonos hullámhossznál és azonos körülmények között (hőmérséklet, oldószer, küvettahossz stb.) meghatározott g-faktora alapján az enantiomerarány megkapható. A kalibrációs egyenes megszerkesztéséhez elegendő, ha csak az egyik enantiomer és a racemát áll rendelkezésre, mivel a g-faktor értékek ugyanarra az egyenesre esnek, mindkét enantiomer feleslege esetén. Az egyenes a g-faktor = 0 értéket az 50-50%-os enantiomeraránynál, azaz a racemátnál éri el [12] A norgesztrel enantiomerarányának meghatározási nehézségei Munkánk során a g-faktor (anizotrópia faktor) mérésén alapuló enantiomerarány meghatározást a racém norgesztrel enantioszelektív oldhatóságának vizsgálata során alkalmaztuk. A kísérlet során különböző ciklodextrinek vizes oldatával végeztük a gyakorlatilag vízoldhatatlan szteroid oldhatóságának növelését. A kapott oldatok enantiomerarányának meghatározása azonban a norgesztrel fizikai tulajdonságai miatt nehézségekbe ütközött. 45

46 Az egyik problémát az okozta, hogy a 4-3-ketocsoport n π* elektronátmenet sávjánál (λ max 310 nm), ahol a CD csúcs intenzitása a legmegfelelőbb, az UV elnyelés jelentéktelen, azonban az UV spektrum π π* átmenethez tartozó maximumánál (λ max 245 nm) a CD jel intenzitása nem megfelelő. A g-faktort ezért úgy határoztuk meg, hogy az ellipticitást és az abszorbanciát eltérő hullámhossz értékeknél mértük (módosított anizotrópia faktor). Ezt csak akkor tehetjük meg, ha a módosított anizotrópia faktor kalibrációs egyenesét is ugyanezen a két hullámhosszon mért értékek hányadosából szerkesztjük meg. Problémát okozott az is, hogy vizes ciklodextrin oldatban a komplexképzés miatt mind az UV, mind a CD spektrum torzulhat [79, 118], ezért azt figyelmen kívül hagyni nem lehet. A torzulás mértékének meghatározása nem lehetséges közvetlenül, mivel a norgesztrel olyannyira rosszul oldódik vízben, hogy a tiszta vizes rázadékának sem abszorbanciája, sem elipticitása nem mérhető. Ismert norgesztrel koncentrációjú ciklodextrines oldatot sem sikerült előállítani, mert mérhető oldott norgesztrel koncentráció elérésekor mindig maradt szilárd anyag az oldatban. Azt a megoldást választottuk, hogy az oldatba jutó norgesztrel tartalmat vízzel nem, vagy csak részben elegyedő szerves oldószerbe ráztuk át kvantitatíven. Erre a célra az oktanolt választottuk, ami lehetőséget adott arra is, hogy tanulmányozzuk a vízoktanol fázishatár transzportot. Az oktanolban való spektrofotometriás meghatározás egyik hátránya, hogy az oktanol UV abszorpciós cut-off pontja aránylag magas hullámhossznál, kb. 240 nm-nél van. A norgesztrel oktanolban 240 nm-nél lévő abszorpciós sávja azonban aránylag széles csúcsot mutat, így nem okoztunk túl nagy érzékenységbeli csökkenést azzal, hogy 240 nm helyett 250 nm-nél mértük az abszorbanciát. Az ellipticitást az oktanolban felvett CD spektrum maximumánál, 321 nm-en mértük. Természetesen mindkét hullámhossz értéknél ellenőriztük a koncentrációfüggés linearitását mind az abszorbancia, mind az ellipticitás viszonylatában. 46

47 4.2. Fázis-oldhatósági vizsgálatok gyakorlata Az A komplexstabilitási állandó meghatározásának lehetőségei című fejezetben tárgyaltam a fázis-oldhatósági módszer irodalmi és elméleti hátterét. Bátran állíthatjuk, hogy ez a módszer a ciklodextrin komplexek stabilitási állandóinak meghatározására a leggyakrabban alkalmazott eljárás. Gyakorlati alkalmazásakor azonban figyelembe kell venni a módszer korlátait. A fázis-oldhatósági diagram nem más, mint a kapott teljes vendégmolekula mol/l-ben kifejezett koncentrációja, a komplexképző mol/l-es koncentrációjának függvényében. Úgynevezett A-típusú (A L, A P, A N ) görbét kapunk, ha a kialakuló komplex oldódik a közegben (9. ábra) [83]. 9. ábra. A fázis-oldhatósági diagramok típusai A leggyakoribb esetben a szöchiometria 1:1-es, tehát egy vendégmolekula egy ciklodextrinnel képez komplexet, ilyenkor egyenest kapunk, azaz A L -típusú ( L = lineáris) a diagram. Ebben az esetben a komplexstabilitási állandó a meredekségből és a tengelymetszetből megkapható [83]: K 1:1 a = (12.) C0 (1 a) 47