DOKTORI (PhD) ÉRTEKEZÉS ALBERT RÉKA

Átírás

1 DOKTORI (PhD) ÉRTEKEZÉS ALBERT RÉKA MOSONMAGYARÓVÁR 2019

2

3 SZÉCHENYI ISTVÁN EGYETEM MEZŐGAZDASÁG- ÉS ÉLELMISZERTUDOMÁNYI KAR NÖVÉNYTUDOMÁNYI TANSZÉK WITTMANN ANTAL NÖVÉNY-, ÁLLAT- ÉS ÉLELMISZER- TUDOMÁNYI MULTIDISZCIPLINÁRIS DOKTORI ISKOLA HABERLANDT GOTTLIEB NÖVÉNYTUDOMÁNYI DOKTORI PROGRAM DOKTORI ISKOLAVEZETŐ: DR. ÖRDÖG VINCE DSC EGYETEMI TANÁR PROGRAMVEZETŐ: DR. ÖRDÖG VINCE DSC EGYETEMI TANÁR TÉMAVEZETŐ: DR. KIRÁLY LÓRÁNT Ph.D. TUD. FŐMUNKATÁRS A SZUPEROXID - SZABADGYÖK SZEREPE TÜNETMENTES NÖVÉNYI BETEGSÉGREZISZTENCIÁKBAN KÉSZÍTETTE: ALBERT RÉKA MOSONMAGYARÓVÁR 2019

4

5 A szuperoxid - szabadgyök szerepe tünetmentes növényi betegségrezisztenciákban Írta: ALBERT RÉKA Készült a Széchenyi István Egyetem Mezőgazdaság- és Élelmiszertudományi Kar Wittmann Antal Növény-, Állat- és Élelmiszer- tudományi Multidiszciplináris Doktori Iskola Haberlandt Gottlieb Növénytudományi Doktori Programja keretében Témavezető: Dr. Király Lóránt Elfogadásra javaslom (igen / nem) A jelölt a doktori szigorlaton %-ot ért el, (aláírás) Mosonmagyaróvár, Az értekezést bírálóként elfogadásra javaslom (igen/nem) Első bíráló (Dr. ) igen/nem.. a Szigorlati Bizottság Elnöke Második bíráló (Dr. ) igen/nem Esetleg harmadik bíráló (Dr. ) igen/nem (aláírás) (aláírás) (aláírás) A jelölt az értekezés nyilvános vitáján %-ot ért el. Mosonmagyaróvár, Doktori (PhD) oklevél minősítése A Bírálóbizottság elnöke Az EDT elnöke

6

7 KIVONAT Háromféle kórokozó-növény kölcsönhatásban vizsgáltuk a betegségrezisztencia különböző típusait kísérő biokémiai és genetikai változásokat. A burgonya Rx1 rezisztenciagénje a burgonya X vírussal (Potato virus X, PVX) szembeni tünetmentes extrém rezisztenciát (ER) határozza meg. Kimutattuk, hogy az Rx1 gént kifejező dohány (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN Rx1) a hazai PVX Ny törzzsel szemben is ER-t ad. A vírusreplikáció korai gátlása miatt az ER-nél nincs idő a HR tünetek (hiperszenzitív lokális nekrózis) kialakítására, de a vírusgátlás mechanizmusa tisztázatlan. Egy reaktív oxigénfajta (reactive oxygen species: ROS), a szuperoxid (O.- 2 ) felhalmozódása az ER-t mutató Rx dohányban jól korrelált a PVX rezisztenciával. A PVX-szel fertőzött Rx dohányban a szuperoxid szintjének mérsékelése (antioxidáns infiltrálás, keresztezés ROS-termelésben gátolt dohánnyal) az ER-t megtörte így hiperszenzitív reakció (HR) szerű lokális nekrózis alakult ki, és a PVX - titer megnőtt. PVX-re fogékony dohányban (cv. Samsun NN) egy szuperoxidképző ágenssel (riboflavin/metionin) történő kezelésre részleges PVX - rezisztencia alakult ki: a HR-szerű lokális nekrózis megjelenésével a vírusszint is alacsonyabb volt. A PVX-szel szembeni tünetmentes (ER) és a dohány mozaik vírussal (Tobacco mosaic virus, TMV) szembeni HR típusú rezisztenciát az Rx dohányban összehasonlítva kimutattuk, hogy az ER során a HR-nél aktív növényi védekezési folyamatok (pl. sejthalál-, ill. ROS-szabályozó gének, antioxidánsok működése) alig észlelhetők. A növényi betegségrezisztencia kertészeti oltással is átvihető, de a rezisztencia átvitelének élettani háttere nem ismert. Egy paprikalisztharmatra (Leveillula taurica) fogékony étkezési paprika (Capsicum annuum cv. Totál) rezisztenssé vált, ha ellenálló cseresznyepaprikára (C. annuum var. cerasiforme cv. Szentesi) oltottuk. Az oltással átvihető, tünetmentes (HR nélküli) lisztharmat rezisztencia jól korrelált a szuperoxid - felhalmozódással és a NADPH-oxidáz aktivitással. Emelett több más védekezési folyamat működése is előrejelezte: magas szabad szalicilsavszint, spontán sejtelhalások, magas CaPR-1, CaPR-2, alacsony CaMlo1, CaMlo2 génexpresszió. A lisztharmat rezisztencia néhány biokémiai markere (fokozott NADPH-oxidáz aktivitás, magas CaPR-1, CaPR-2, alacsony CaMlo1, CaMlo2 expresszió) az oltott, rezisztens paprikák

8 utódainak felében öröklődött. A markerek közül négy (fokozott NADPH oxidáz - aktivitás, magas CaPR-1 és CaPR-2, alacsony CaMlo2 expresszió) feltehetően kapcsoltan öröklődik, nagyrészt ugyanazokban az utódokban fordult elő. Három marker (fokozott CaPR-1 és CaPR-2 génexpresszió, alacsony CaMlo2 expresszió) a keresztezett saját gyökerű fogékony és rezisztens paprika F 1 utódainak [Totál ( ) x Szentesi ( )] felében szintén kapcsoltan öröklődött. Egy fontos növényi ROS, a szuperoxid felhalmozódása meghatározó tényezője két, tünetmentes (HR nélküli) rezisztenciának: dohányban a PVX-szel szembeni extrém rezisztenciának és paprikában a lisztharmattal szembeni, oltással átvihető ellenállóságnak.

9 ABSTRACT Accumulation of the plant reactive oxygen species (ROS), superoxide (O 2 ) contributes to symptomless (no HR-type necrosis) resistance: in tobacco, extreme resistance (ER) to Potato virus X (PVX) and in pepper, graft-transmissible resistance to powdery mildew (PM, Leveillula taurica). Reduction of O 2 (ROS) accumulation during ER to PVX partially breaks ER, while elevation of O 2 levels in PVX susceptible tobacco confers partial PVX resistance: HR-necrosis appears and PVX titers decrease. In PM-resistant pepper ( Szentesi, Szentesi+Totál grafts) O 2 accumulation correlates with NADPH oxidase activity and graft-transmissible PM resistance. Biochemical markers of graft-transmissible PM resistance (NADPH oxidase activity, high CaPR1, CaPR2, low CaMlo1, CaMlo2 expression) are inherited in progeny of resistant pepper. Further research should clarify function(s) of O 2 in symptomless plant disease resistance.

10 TARTALOMJEGYZÉK oldal 1.BEVEZETÉS ÉS CÉLKITŰZÉS SZAKIRODALMI ÁTTEKINTÉS A növényi betegségrezisztencia legfontosabb formái Általános (nem-specifikus) rezisztencia Nem rassz-specifikus mlo-rezisztencia Kvantitatív rezisztencia Specifikus (gén-génnel szembeni) rezisztencia Extrém rezisztencia és immunitás Az általános (nem-specifikus) és specifikus rezisztencia közötti kapcsolat a növények két védelmi vonala Szerzett rezisztencia A növényi betegségrezisztencia fontosabb biokémiai faktorai Reaktív oxigénfajták, antioxidánsok, növényi betegségrezisztencia A NADPH-oxidázok szerepe a ROS-képződésben és a növényi betegségrezisztenciában A patogenezissel kapcsolatos fehérjék és a növényi betegségrezisztencia A szalicilsav jelentősége a növényi betegségrezisztenciában Növénykórokozó vírusok Burgonya X vírus (Potato virus X, PVX) Az Rx gének által meghatározott, tünetmentes (extrém) vírusrezisztencia Dohány mozaik vírus (Tobacco mosaic virus, TMV) Az N gén által meghatározott, lokális sejt/szöveti elhalással (HR) járó vírusrezisztencia Lisztharmatgombák A paprikalisztharmat (Leveillula taurica) jelentősége A kertészeti oltással átvihető növényi betegségrezisztencia ANYAG ÉS MÓDSZER A kísérletekhez felhasznált növények A kísérletekhez felhasznált növényi kórokozók A szuperoxid kimutatása Sejthalál festés paprika levélszövetekben PVX fogékonyság kialakítása rezisztens dohányban antioxidáns enzimek (SOD és CAT) infiltrálásával PVX rezisztencia kialakítása fogékony dohányban szuperoxid (ROS) képző ágens infiltrálásával Génkifejeződési vizsgálatok, a PVX és TMV RNS-szintű és a paprika lisztharmat (Leveillula taurica) DNS-szintű kimutatása Felhasznált primerek Szabad és kötött szalicilsav mérése paprikanövényekben NADPH-oxidáz enzim aktivitásának mérése paprika szövetekből Glutation mennyiségének meghatározása TMV-vel, valamint PVX-szel fertőzött dohánynövényben spektrofotometriás módszerrel Glutation-reduktáz és glutation-s-transzferáz enzim aktivitásának mérése TMV-vel, illetve PVX-szel fertőzött dohány növényben spektrofotometriás módszerrel Glutation-reduktáz aktivitásának mérése Glutation-S-transzferáz aktivitásának mérése EREDMÉNYEK A szuperoxid hozzájárulása az Rx1 rezisztenciagén által burgonya X vírus (PVX) ellen biztosított tünetmentes (extrém) rezisztenciához, dohányban Az Rx1 rezisztenciagén működésének kimutatása transzgenikus dohányban Az Rx1 gén által meghatározott, PVX-szel szembeni extrém rezisztencia kimutatása dohányban A szuperoxid korai felhalmozódásának mérése NBT - szövetfestéssel a PVX-szel szemben extrém rezisztens Rx1 dohányban Az NBT - szövetfestés dohányban specifikus a szuperoxidra Antioxidáns enzimek (SOD és CAT) infiltrálásának hatása a PVX-szel szembeni extrém rezisztenciára Rx1 dohányban A ROS - képződés gátlásának hatása a PVX-szel szembeni extrém rezisztenciára Rx1 dohányban PVX - rezisztencia kialakítása fogékony dohányban (cv. Samsun NN) szuperoxidot (ROS) képző ágens infiltrálásával

11 4.2. A PVX-szel szembeni tünetmentes, extrém rezisztencia és a TMV által kiváltott, lokális nekrózissal (HR) járó ellenálló képesség összehasonlítása dohányban - védekezéssel kapcsolatos gének és antioxidánsok aktivitása Védekezéssel kapcsolatos gének expressziója a tünetmentes ER és a HR során Glutation felhalmozódásának meghatározása a tünetmentes ER és a HR során Glutation-reduktáz és glutation-s-transzferáz enzimek aktivitása a tünetmentes ER és a HR során A paprika lisztharmattal szembeni, oltással átvihető tünetmentes rezisztenciája cseresznyepaprikában élettani háttér, a szuperoxid felhalmozódás szerepe A cseresznyepaprika oltással átvihető lisztharmat - rezisztenciája együtt jár-e a kórokozó gátlásával? A szuperoxid - felhalmozódás és a NADPH-oxidáz aktivitásának szerepe a Szentesi cseresznyepaprika oltással átvihető lisztharmat - rezisztenciájában A szuperoxid - felhalmozódás és a NADPH-oxidáz aktivitásának összefüggése cseresznyepaprikaalanyok oltással átvihető lisztharmat - rezisztenciájával Védekezési folyamatok a Szentesi cseresznyepaprika oltással átvihető lisztharmat - rezisztenciájában: szalicilsav - felhalmozódás és spontán sejtelhalások Védekezési folyamatok a Szentesi cseresznyepaprika oltással átvihető lisztharmat - rezisztenciájában: patogenezissel kapcsolatos és sejthalált szabályozó gének kifejeződése Az oltással átvihető lisztharmat - rezisztencia biokémiai markereinek öröklődése paprikában, az oltott rezisztens növények utódaiban Az oltással átvihető lisztharmat - rezisztencia biokémiai markereinek öröklődése paprikában, a keresztezett saját gyökerű rezisztens és fogékony növények utódaiban KÖVETKEZTETÉSEK ÉS JAVASLATOK ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁS KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Ábrák-, táblázatok jegyzéke IRODALOMJEGYZÉK Publikációs lista

12 1. BEVEZETÉS ÉS CÉLKITŰZÉS A növények általában sikeresen védekeznek az őket támadó kórokozók fertőzésével szemben, de ez olykor mellékhatásokkal is járhat, pl. a megtámadott növényi szövetek elhalásával, vagy lassabb növekedéssel. A betegségek elleni védekezés (rezisztencia) akkor hatékony, ha gyors lefolyású, a kórokozót hamar hatástalanítja, és így a növényi szervezet erőforrásait kevésbé köti le. Ilyenkor a gazdanövény általában tünetmentesen képes az adott kórokozó fertőzésének ellenállni. A növénynemesítés, ill. a mezőgazdasági gyakorlat számára ezért fontos lehet az olyan termesztett növényfajták előállítása, amelyek egy vagy több kórokozóval szemben tünetmentesen képesek védekezni. A növényi betegségrezisztencia kialakulása számos élettani folyamattal kapcsolatos: Ilyenek pl. az antimikrobiális vegyületek felhalmozódása, a sejtfal megerősítése, a lokalizált sejt- és szövetelhalás (HR), valamint a reaktív oxigénfajták (reactive oxygen species: ROS) felhalmozódása. A ROS, azon belül is a szuperoxid (O 2 ) és hidrogén-peroxid (H 2 O 2 ) kettős szerepet játszanak a növényi betegségrezisztenciában: kis koncentrációban a rezisztencia jelátvivői, míg nagy mennyiségben a gazdanövényt és a kórokozót is károsíthatják. Az Rx1 gén által a burgonya X vírus (Potato virus X, PVX) ellen biztosított ún. extrém rezisztencia tünetmentes, azaz hiperszenzitív reakció (HR, lokális sejt- és szövetelhalás) nélküli extrém ellenálló képesség nyilvánul meg burgonyában és dohányban (Bendahmane et al., 1999). Ennek az extrém rezisztenciának az okát a kutatók abban látták, hogy a vírusreplikáció gátlása olyan korán következik be, hogy nincs idő 3

13 a hiperszenzitív tünetek kialakítására. A vírusgátlás mechanizmusa azonban mind ez idáig ismeretlen. Az MTA ATK Növényvédelmi Intézetében végzett előkísérleteink szerint a PVX fertőzésre extrém rezisztens dohányban (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN Rx1) kismértékben megemelkedik a szuperoxid mennyisége, a fogékony növényekhez képest. Ezek szerint a PVX-szel szembeni tünetmentes, extrém rezisztencia egyik oka az Rx gén által biztosított nagyon korai szuperoxid (ROS) felhalmozódás lehet, amely a vírus replikációját gátolhatja. A kertészeti oltással átvitt betegségrezisztenciát újabban a zöldségnövényeknél is egyre gyakrabban alkalmazzák, elsősorban a talaj eredetű kórokozók ellen (Louws et al., 2010; Al-Mawaali et al., 2012; Guan és Zhao, 2012). Az oltással átvitt rezisztencia pontos élettani, biokémiai és genetikai háttere azonban jelenleg tisztázatlan. Az MTA ATK Növényvédelmi Intézetében és a Szegedi Tudományegyetem Mezőgazdasági Karán végzett előzetes megfigyeléseink szerint a paprikalisztharmat (Leveillula taurica) gombával szemben rezisztens cseresznyepaprika (Capsicum annuum var. cerasiforme), mint alany, átadhatja rezisztenciáját a ráoltott fogékony étkezési paprikának (C. annuum). A fokozottan lisztharmatrezisztens (tünetmentes) Szentesi cseresznyepaprikában, ill. a ráoltott, eredetileg fogékony fajtában viszont jóval nagyobb mértékű a szuperoxid-felhalmozódás, mint a saját gyökerű fogékony paprikában. 4

14 Doktori munkám fő célkitűzései a következők voltak: 1. Dohányban az Rx1 gén által a burgonya X vírus (PVX) ellen biztosított tünetmentes, ún. extrém rezisztenciában van-e tényleges szerepe a fertőzés utáni korai szuperoxid felhalmozódásnak? Hogyan befolyásolja az extrém rezisztenciát, ha a növényi szuperoxid (ROS) mennyiségét csökkentjük (antioxidánsok infiltrálásával, ill. ROS-termelésben gátolt dohánnyal történő keresztezéssel)? Kialakítható-e a PVX - rezisztencia, ha fogékony növényekben ROS-képző ágensek segítségével a szuperoxid mennyiségét növeljük? A PVX-szel szembeni tünetmentes extrém rezisztenciában hogyan változik egyes védekezéssel kapcsolatos növényi gének expressziója, összehasonlítva a dohány mozaik vírus (TMV) fertőzésére kialakuló hiperszenzitív (HR, lokális sejt- és szövetelhalás) típusú ellenálló képességgel? 2. Cseresznyepaprikában (Capsicum annuum var. cerasiforme) a paprikalisztharmat-gomba (Leveillula taurica) fertőzésével szembeni, oltással átvihető tünetmentes rezisztencia élettani hátterének feltárása. A cseresznyepaprika oltással átvihető lisztharmat rezisztenciája együtt jár-e a kórokozó gátlásával? A lisztharmatrezisztens növények nagy szuperoxid - tartalma milyen összefüggésben áll a rezisztenciával, ill. a növény védekezési folyamataival? 5

15 A szuperoxid felhalmozódásához kapcsolódó génexpressziós, ill. enzimaktivitás - változások, mint rezisztenciamarkerek, öröklődnek-e a rezisztens saját gyökerű, ill. oltott paprikák utódaiban? 6

16 2. SZAKIRODALMI ÁTTEKINTÉS 2.1. A növényi betegségrezisztencia legfontosabb formái A gazdanövény - kórokozó kapcsolatok alapvetően kétfélék lehetnek: kompatibilisek (fogékonyak) vagy inkompatibilisek (rezisztensek). A növényekben az evolúció során sokféle rezisztenciaforma alakult ki az őket támadó kórokozókkal szemben. A rezisztenciaformák két alapvető csoportja a veleszületett (innate) valamint a szerzett (acquired) rezisztencia. A veleszületett rezisztencián belül megkülönböztethető az ún. általános vagy nem-specifikus, és a specifikus ellenálló képesség Általános (nem-specifikus) rezisztencia Az általános ellenálló képességre jellemző, hogy minden, a növény számára idegen organizmus szaporodását gátolja. A növényvilágban a legáltalánosabb, nem specifikus ellenállóság az ún. nemgazdanövényrezisztencia (Heath, 2000; Nürnberger és Lipka, 2005; Gill et al., 2015; Lee et al., 2017), amikor egy adott növényfaj minden egyede rezisztens a legtöbb kórokozó faj minden törzsével (rasszával) szemben. Ez a többnyire tünetmentes (sejt- és szövetelhalás nélküli), esetenként lokális szövetelhalással hiperszenzitív reakcióval (HR) kísért védekezés az élővilágban leginkább elterjedt és egyik leghatékonyabb és legtartósabb növényi rezisztenciaforma, hiszen a legtöbb növény a legtöbb kórokozóval szemben ellenálló (Mysore és Ryu, 2004; Schulze-Lefert és Panstruga, 2011). 7

17 Dolgozatom témaválasztása miatt külön megemlítendő az általános (nem specifikus) ellenálló képesség két tünetmentes (látható szövetelhalás nélküli) formája: a nem rassz-specifikus mlo rezisztencia és az ún. kvantitatív rezisztencia Nem rassz-specifikus mlo-rezisztencia Ezt a szabad szemmel tünetmentes rezisztenciaformát árpában fedezték fel, amely az árpa - lisztharmatgomba (Blumeria graminis f. sp. hordei) különböző patogén rasszai ellen hatásos és az Mlo gén recesszív mutáns alléljei (mlo) kódolják. Az mlo mutációk által meghatározott rezisztencia egy tartós, nem rassz-specifikus, szabad földön is hatásos lisztharmatellenállóságot biztosít számos termesztett tavaszi árpafajtában már hosszú évtizedek óta (Jørgensen, 1992). Az mlo-rezisztens növényekben a lisztharmat által megtámadott, de ellenálló epidermisz sejt ún. papillákat (sejtfal-vastagodásokat) képez, amely feltételezhetően gátolja a fertőző gomba növekedését (Koga et al., 1990; Hückelhoven et al., 1999). Az Mlo gén terméke egy transzmembrán fehérje, amelyet a lisztharmat-rezisztencia, ill. a növényi sejthalál negatív regulátorának tekintenek (Büschges et al., 1997), és az árpán kívül több más egy- és kétszikű növényben is megtalálható, többek között búzában, paradicsomban és paprikában (Consonni et al., 2006; Zheng et al., 2013a; Acevedo-Garcia et al., 2014). Ezek szerint az mlo mutációk által meghatározott, nem rassz-specifikus rezisztencia a növényvilágban elvileg egy meglehetősen általánosnak tekinthető lisztharmatellenállósági forma lehet. 8

18 Kvantitatív rezisztencia Ez az általános (nem specifikus) rezisztenciaforma voltaképpen egy lassú sporulációt előidéző vagy csak enyhe fogékonysági tünetekben megnyilvánuló (rate-limiting) ellenállóképesség. Hangsúlyozandó, hogy ilyenkor a rezisztenciának nincs szabad szemmel látható, nyilvánvaló tünete. A kvantitatív rezisztenciát (lassú sporuláció) rozsdabetegségeknél és pl. a burgonya fitoftórás betegsége esetében írták le (Song et al., 2003). A védekezési folyamat sejtszintű és molekuláris mechanizmusa is tisztázatlan Specifikus (gén-génnel szembeni) rezisztencia Az ún. gén-génnel szembeni (gene for gene) specifikus ellenálló képesség (gazda-rezisztencia) talán a legismertebb és leginkább kutatott növényi rezisztenciaforma, amely csak genetikailag meghatározott kórokozó - növény kapcsolatokban működik, és sok esetben a megtámadott növényi sejtek/szövetek és a kórokozó halálával (programozott sejthalál) jár együtt (hiperszenzitív /túlérzékenységi/ reakció, HR) (Klement, 1982; Goodman és Novacky, 1994). E rezisztenciaforma felhasználásával sikeresen előállíthatók rezisztens növényfajták, de az ellenálló képesség egy adott kórokozónak csak egyetlen vagy néhány törzsével (rasszával) szemben érvényesül, és a kórokozó új törzsek (rasszok) kialakításával hamar le tudja törni ezt a típusú növényi védekezést (Flor, 1971; Jones és Dangl, 2006; Bent és Mackey, 2007). 9

19 Dolgozatom témaválasztása miatt külön megemlítendő, hogy a specifikus (gén-génnel szembeni) ellenálló képességnek léteznek tünetmentes (HR nélküli) típusai is, az ún. extrém rezisztencia, ill. immunitás Extrém rezisztencia és immunitás A specifikus (gén-génnel szembeni) rezisztencia különleges formája az extrém ellenállóképesség, amelyet régebben immunitás -nak vagy immunis válasz -nak neveztek. Itt nem fejlődik ki a HR, azaz nincsenek lokális sejt- és szöveti elhalások az immunis növény megtámadott szervein. Az extrém rezisztencia elsősorban vírusfertőzésekkel szemben érvényesül. A legalaposabban jellemzett extrém rezisztencia a burgonya X vírus (Potato virus X, PVX) ellen érvényesül, a rezisztenciát a burgonya Rx1 vagy Rx2 génje irányítja (Bendahmane et al., 1999, 2000). Ez egy tipikus gén-génnel szembeni rezisztenciamechanizmus, amely gyorsan kialakul, és emiatt nem teszi lehetővé a HR kifejlődését. Ehhez formailag hasonló immunis gyors válasz észlelhető bizonyos búzafajtáknál a szárrozsda (Puccinia graminis f. sp. tritici) néhány törzsével (rasszával) szemben (Stakman et al., 1944). A növényi extrém rezisztencia, ill. immunitás pontos élettani-biokémiai háttere jelenleg nem ismert, így az sem, hogy mi öli meg vagy mi gátolja a vírust, ill. gombát az extrém módon ellenálló növényben Az általános (nem-specifikus) és specifikus rezisztencia közötti kapcsolat a növények két védelmi vonala Az utóbbi évek kutatásai szerint a növényekben az általános és specifikus rezisztencia folyamatai egymásra épülnek (Tsuda és Katagiri, 2010; 10

20 Spoel és Dong, 2012; Gassmann és Bhattacharjee, 2012; Dangl et al., 2013). A növények első védelmi vonala az általános, nem-specifikus rezisztencia, amelyet döntően a kórokozó és nem kórokozó mikroorganizmusok sejtfelszíni molekuláris mintázatai (microbeassociated molecular pattern, MAMP; pathogen-associated molecular pattern, PAMP) váltanak ki, amikor ezeket felismerik a növények kórokozó-felismerő receptor fehérjéi (pathogen recognition receptor, PRR). Ez az ún. alap (bazális) rezisztencia, amely tünetmentes és valamennyi kórokozóval szemben megnyilvánul (Jones és Dangl, 2006; Boller és Felix, 2009; Lacombe et al., 2010). Egyes kórokozók viszont képesek gátolni ezt a nem-specifikus rezisztenciát, mivel olyan, ún. effektor fehérjéket juttatnak a növénybe, amelyek elősegítik a kórokozó bejutását, terjedését, így kialakul a fogékonyság. Bizonyos növényekben azonban ilyenkor működésbe lép egy második védelmi vonal, amely az adott növényfajtára és kórokozó törzsre (rasszra) specifikus ellenálló képességet (gén-génnel szembeni vagy gazda-rezisztenciát) eredményez, ugyanis egy adott növényi rezisztenciagén fehérjeterméke (R fehérje) közvetlenül vagy közvetve felismeri a kórokozó megfelelő effektorát (avirulencia /Avr/ fehérjéjét) (Flor, 1971; Gassmann és Bhattacharjee, 2012; Dangl et al., 2013). A gén-génnel szembeni vagy gazdarezisztencia többnyire sejt-, ill. szöveti elhalással (HR) jár, míg a nemgazda-rezisztencia általában tünetmentes (nincs HR), tehát lényegében azonos a PAMP-indukálta, nem-specifikus (alap) rezisztenciával. A tünetmentes (I-es típusú) nemgazda-rezisztencia (Mysore és Ryu, 2004; Senthil-Kumar és Mysore, 2013) egyik lehetséges oka a gazda-, és a nemgazdanövény közötti 11

21 viszonylag nagyobb rendszertani távolság (pl. dohány és árpa), feltehetően azért, mert a kórokozó effektorai nem találják a fogékonyság kialakításához szükséges növényi célfehérjéket, de a gazdarezisztencia indukálásához szükséges R fehérjéket sem. Ugyanakkor bizonyos esetekben a nemgazda-rezisztencia is járhat HR-rel (II-es típus), általában akkor, ha a gazda- és a nemgazdanövény közeli rokonok (pl. dohány és paprika) és ezért a kórokozó effektorok növényi célfehérjéi is hasonlók (Schulze-Lefert és Panstruga, 2011) Szerzett rezisztencia A szerzett rezisztencia során egy többnyire sejt- és szöveti elhalással járó elsődleges fertőzés után a növény rezisztens lesz későbbi fertőzésekre, ill. abiotikus stresszekkel szemben (Kuć, 1982; Ryals et al., 1996; Fu és Dong, 2013). Ilyenkor a szerzett rezisztencia az első fertőzés környékén (lokálisan) vagy egészen távoli növényi szervekben (szisztemikusan) is kialakulhat (Ross, 1961a, b). Ez a rezisztenciatípus tehát nem specifikus, és ez azt is jelenti, hogy általában az indukált rezisztenciát kiváltó aktivátorok sem specifikusak, rendszertanilag egymástól távol álló növényekben is működnek, és kémiailag egymástól eltérő vegyületek. A szalicilsav (SA) az első olyan vegyületek egyike, amelyről kimutatták, hogy növényi betegség ellenállóságot vált ki. A szerzett rezisztenciában a SA felhalmozódása az első fertőzés után a távoli levelekben is megfigyelhető (Malamy et al., 1990; Métraux et al., 1990), de nem ez a vegyület a szisztemikus jelátvivő, hanem többek között a SA metilált származéka (MeSA) és egyéb vegyületek (pl. azelainsav, pipekolinsav, 12

22 glicerin-3-foszfát, DIR1 lipid transzfer protein) (Park et al., 2007; Ádám et al., 2018) A növényi betegségrezisztencia fontosabb biokémiai faktorai A növények különféle élettani-biokémiai mechanizmusokon alapuló stratégiákkal igyekeznek védekezni a kórokozók támadása ellen. Ilyen védekezési stratégiák az antimikrobiális vegyületek (pl: fitoalexinek) felhalmozódása, a sejtfal megerősítése (papillaképződés), lokalizált sejtés szövetelhalás (hiperszenzitív reakció, HR), reaktív oxigénfajták felhalmozódása (Goodman et al., 1986; Jones és Dangl 2006; Torres, 2010; Spoel és Dong 2012; Lehmann et al., 2015). Dolgozatom témaválasztásához kapcsolódóan elsősorban 1) a reaktív oxigénfajták és az azokat semlegesítő antioxidánsok, 2) az ún. patogenezissel kapcsolatos (PR) fehérjék, ill. kódoló génjeik (PR gének), valamint 3) egy fontos hormonvegyület, a szalicilsav (SA) növényi betegségrezisztenciában betöltött szerepe kerül ismertetésre Reaktív oxigénfajták, antioxidánsok, növényi betegségrezisztencia A növények különböző stresszekre (pl. szárazság, hőmérsékletváltozás, kórokozó fertőzése) adott válasza többek között az ún. reaktív oxigénfajták (reactive oxygen species: ROS) felhalmozódása, amely oxidatív stresszhez vezethet. Bizonyos mértékű állandó ROSfelhalmozódás eukarióta (növényi) szervezetekben normálisnak tekinthető (pl. fotoszintézis és légzési lánc elektrontranszportja), de a növények aktívan is képesek ROS előállítására kórokozók támadása (és 13

23 egyéb stresszek) esetén. Oxidatív stressz során viszont a növényben felborul a ROS (prooxidánsok) és az antioxidánsok közötti egyensúly a ROS javára. A reaktív oxigénfajták közé tartoznak a párosítatlan elektronnal rendelkező oxigén - szabadgyökök, pl. a szuperoxid (O 2 ), hidroxilgyök (OH ), valamint olyan molekulák, mint a hidrogén-peroxid (H 2 O 2 ) és a szinglett oxigén ( 1 O 2 ), melyekből reakcióik során szabad gyökök képződnek. A szuperoxid (O 2 ) molekuláris oxigénből egyelektronos redukcióval keletkező, mérsékelten reakcióképes, rövid életidejű forma. Nem képes a membránokon keresztüli diffúzióra, de protonált formája, a hidroperoxil (perhidroxil) - gyök (HO 2 ), lipidoldékonyabb. A szuperoxid - és a hidroperoxil - gyök az élő sejtekben sav - bázis egyensúlyt alkot. A szuperoxid közvetlenül hidrogén-peroxiddá redukálódik, ez általában spontán (enzimes katalízis nélküli) folyamat, de szuperoxid-dizmutáz (SOD) segítségével is lejátszódhat (Elstner, 1982; Cadenas, 1989; Sutherland, 1991; Apel és Hirt, 2004; Halliwell és Gutteridge, 2015). A szuperoxid-dizmutázok a bennük található fémek alapján három különböző csoportba sorolhatók: vas szuperoxid-dizmutázok (FeSOD), mangán szuperoxid-dizmutázok (MnSOD) és réz-cink szuperoxiddizmutázok (Cu-ZnSOD). Számos növényi sejtszervecske, mint a kloroplasztisz, a mitokondrium, a peroxiszóma, a citoplazma és az intercelluláris tér is mind tartalmaznak szuperoxid-dizmutázt (Alscher et al., 2002; Miller, 2012). A vas szuperoxid dizmutázokra (FeSOD) jellemző, hogy a növényi sejt kloroplasztiszaiban fejtik ki hatásukat. A MnSOD enzimek eukarióta sejtek mitokondriumaiban és peroxiszómáiban találhatóak meg. A réz-cink szuperoxid dizmutázok 14

24 (Cu-Zn SOD) aktivitását a citoplazmában, a periplazmatikus térben, illetve a kloroplasztiszokban és az extracelluláris térben figyelték meg. A citoplazmában található Cu-Zn SOD izoenzimek a sejtmagban is előfordulhatnak (Ogawa et al., 1996). A kloroplasztiszok és a citoplazma Cu-Zn SOD-ot kódoló génjei az intronok száma és pozíciója alapján különböztethetők meg (Kliebenstein et al., 1998). Az oxigén többi aktív formája (ROS) rövid időn belül hidrogénperoxiddá (H 2 O 2 ) alakul, amely a többi ROS-hoz képest aránylag stabil molekula, elektromosan semleges, emiatt kevésbé reakcióképes (Halliwell, 2006; Halliwell és Gutteridge, 2015). A H 2 O 2 keletkezésének egy másik lehetősége a ph-függő sejtfal peroxidázok által katalizált reakció (Bolwell és Wojtaszek, 1997; O Brien, 2012). A H 2 O 2 aquaporinok közvetítésével képes áthatolni a sejtmembránokon, ezáltal a növényi apoplasztból (sejtfalból) bejutni a sejt belsejébe, a citoszolba (Pastori és Foyer, 2002). A sejtekben levő H 2 O 2 spontán vagy kataláz enzim segítségével vízzé (H 2 O) és molekuláris oxigénné (O 2 ) alakul át (Elstner, 1982; Cadenas, 1989; Sutherland, 1991; Halliwell, 2006). A reaktív oxigénfajták közül a szuperoxid (O 2 ) HR tünetekkel (lokalizált sejt/szövetelhalás) együtt járó növényi gazdarezisztenciában játszott lehetséges szerepére vírusos- (dohány mozaik virus, Tobacco mosaic virus, TMV) és oomicétás (Phytophthora infestans) fertőzéseknél már közel 30 éve felhívták a figyelmet (Doke, 1983a, b; Galal et al., 1993; Doke és Ohashi, 1988). A NADPH-oxidáz enzim által termelt szuperoxid a megtámadott növényi sejtek plazmamembránjában halmozódott fel, de csak a HR-t mutató rezisztens növényekben. Hasonlót tapasztaltak baktériumos fertőzésre HR-típusú nemgazda- 15

25 rezisztenciát mutató dohányban is (Ádám et al., 1989). Később többen is rámutattak arra, hogy a HR tünetekkel együtt járó nemgazdarezisztenciában többféle ROS-nak így a szuperoxidnak és hidrogénperoxidnak is szerepe lehet (Bestwick et al., 1998; Zurbriggen et al., 2009; Kwak et al., 2009). Az in planta O 2 -termelésért felelős gének (NADPH-oxidáz és Rac GTPáz) inaktiválása a baktériumos- és oomicétás fertőzésekkel szembeni HR-típusú nemgazda-rezisztencia visszaszorulásával járt (Yoshioka et al., 2003; Moeder et al., 2005; An et al., 2017). Újabb kutatások szerint egyes ROS vegyületek, többek között a szuperoxid, a tünetmentes gazdaés nemgazda-rezisztenciában egyaránt fontos tényező lehet, feltehetően azért, mert a megtámadott növényi sejtekben célzottan termelődő ROS időben gátolja a kórokozót és megakadályozza a HR-re jellemző lokális sejt- és szövetelhalást (Bendahmane et al., 1999; Király et al., 2013; Künstler et al., 2018). A hidrogén-peroxid (H 2 O 2 ) a HR-típusú nemgazda és gazdarezisztencia egyik meghatározó faktora különböző Pseudomonas syringae patovarokkal fertőzött szójában, salátában és dohányban (Levine et al., 1994; Bestwick et al., 1998; Yoda et al., 2009). Egy hidrogén-peroxidot bontó enzim, a kataláz túltermeltetése dohányban a TMV-vel szembeni HR-típusú gazda-rezisztencia csökkenését eredményezte (Talarczyk et al., 2002). Az árpa lisztharmattal szembeni gazda- és nemgazdarezisztenciája során a megtámadott epidermiszsejtekben hidrogénperoxid halmozódik fel (Hückelhoven et al., 1999, 2001). Hasonló lokalizált H 2 O 2 - felhalmozódást tapasztaltak tehénborsóban, amely tünetmentes nemgazda-rezisztenciával reagált az Erysiphe 16

26 cichoracearum lisztharmatgomba fertőzésére. A rezisztencia azonban részlegesen visszaszorult, ha a leveleket katalázzal kezelték, feltehetően a H 2 O 2 lebomlása miatt (Mellersh et al., 2002). A reaktív oxigénfajták és az antioxidánsok növényi kórfolyamatban játszott szerepe alapvetően különbözhet az ún. biotróf és nekrotróf kórokozók fertőzése esetén. A biotróf kórokozóknak (gombák: lisztharmatok, peronoszpórák, rozsdák, valamint a vírusok, és fitoplazmák) élő növényi sejtekre van szükségük, hogy a gazdaszervezet tápanyagait felhasználhassák. Biotróf kórokozók fertőzésekor fogékony növényekben magas antioxidáns (pl. SOD, aszkorbát-peroxidáz, glutation, aszkorbinsav) kapacitás mérhető, viszont jelentősen csökken a ROS-felhalmozódás és így feltehetően a kórokozógátlása is (El-Zahaby et al., 1995; Vanacker et al., 1998; Mittler et al., 1998; Harrach et al., 2008). Ezzel szemben a nekrotróf kórokozók (pl. Botrytis cinerea, Fusarium culmorum) fitotoxinjaik és sejtfalbontó enzimjeik segítségével többek között ROS - termelést és csökkenő antioxidáns kapacitást indukálnak és roncsolják a növényi sejteket, hogy így a szükséges tápanyagokhoz hozzájussanak (Govrin és Levine, 2000; Able, 2003; Barna et al., 2012; Harrach et al., 2013; Spanu és Panstruga, 2017). A reaktív oxigénfajták alapvetően kettős szerepet játszanak a növénykórokozó kölcsönhatásokban. Egyrészt korlátozzák a kórokozók terjedését, ennek következtében a fertőzés helyén lokális sejtelhalást (HR) is előidézhetnek, másrészt alacsonyabb koncentrációban jelátvivőként indukálják az antioxidánsok és a patogenezissel kapcsolatos (PR) gének/fehérjék általi védekezési válaszokat az érintett területeket körülvevő sejtekben (Levine et al., 1994; Torres et al., 2005; Pogány et 17

27 al., 2009). Állandóan nagy mennyiségű hidrogén-peroxidot termelő transzgenikus dohány-, burgonya- és káposztanövények rezisztenssé váltak különféle növénykórokozó baktériumokkal szemben, elsősorban a baktériumok hatékony gátlása és/vagy elölése miatt (Chamnongpol et al., 1998; Wu et al., 1995; Lee et al., 2002). A kutatások azt is igazolták, hogy biotróf kórokozókra (pl. lisztharmatok, vírusok) fogékony növényekben rezisztencia indukálható, ha a leveleket a fertőzés után 24 órán belül mm hidrogén-peroxiddal vagy H 2 O 2 -, ill. szuperoxidtermelést előidéző vegyületekkel (riboflavin és metionin, xanthin és xanthin-oxidáz, glükóz és glükóz-oxidáz) kezelték (Jordan et al., 1992; Hafez és Király, 2003; El-Zahaby et al., 2004; Bacsó et al., 2011). Ezek szerint az egyes reaktív oxigénfajták patogéngátló hatása nagymértékben hozzájárulhat a növényi betegségrezisztenciához. A ROS hatásai fokozottan érvényesülhetnek vírusos fertőzéseknél, hiszen ezek a biotrófnak tekinthető kórokozók a baktériumok és gombák többségével ellentétben bejutnak a gazdasejtek intracelluláris terébe, ahol a citoszollal és a sejtalkotókkal érintkeznek. Ezek alapján logikusnak tűnik, hogy az antivirális védekezési válaszok nagymértékben támaszkodnak a sejten belüli, ROS-termeléssel kapcsolatos biokémiai folyamatokra (Hernández et al., 2015; Künstler et al., 2015) A NADPH-oxidázok szerepe a ROS-képződésben és a növényi betegségrezisztenciában A szuperoxid (O 2 ) képződése eukarióta szervezetekben nagyrészt a NADPH-oxidáz enzim közreműködésével történik. A NADPH-oxidáz a sejtek plazmamembránjában található, leginkább stresszek és kórokozók 18

28 hatására aktiválódik, az általa generált ROS (O 2 ) a kórokozó likvidálásában és a (növényi) betegségrezisztencia jelátvitelében játszik szerepet. Doke és munkatársai (Doke, 1985; Doke és Miura, 1995) növényekben elsőként mutatták ki egy NADPH-függő szuperoxidgeneráló enzim működését Phytophthora infestans-szal fertőzött rezisztens burgonyagumók plazmamembrán frakciójában. A NADPHoxidáz ún. kalcium-függő enzim, a sejtekben lévő kalcium (Ca 2+ ) is indukálja. Dohányban és lúdfűben (Arabidopsis thaliana) a szuperoxid termeléséért felelős NADPH-oxidázt a Ca 2+ közvetlenül és egy Ca 2+ - függő proteinkinázon (CPK5) keresztül közvetve is képes aktiválni (Keller et al., 1998; Sagi és Fluhr, 2006; Dubiella et al., 2013; Gilroy et al., 2014). Ezek szerint növényekben a Ca 2+ kulcsszerepet játszhat a ROS vegyületek (O 2 és H 2 O 2 ) képződésében, és a növény ROS koncentrációja a Ca 2+ - szint biokémiai indikátora lehet. A növényi NADPH-oxidáz enzimeket és kódoló génjeieket az emlősök fagocitáiban található, az ún. respiratory burst ( légzési robbanás ) folyamatában (kórokozók elminálása) részt vevő NADPH-oxidáz alegységgel (gp91phox) való hasonlóság alapján fedezték fel (Groom et al., 1996; Keller et al., 1998; Torres et al., 1998). A növényi NADPHoxidázok a kórokozó fertőzési jellegétől és az aktiválódás módjától függően eltérő módon járulnak hozzá a ROS-képződéshez és betegségrezisztenciához (Suzuki et al., 2011; Marino et al., 2012). Nicotiana benthamiana-ban pl. két NADPH-oxidáz (RBOH) gént írtak le: az NbRBOHA konstitutívan, de csak kismértékben fejeződik ki, míg az NbRBOHB gént a P. infestans INF1 elicitora indukálja, de mindkét gén működése szükséges a kórokozóval szembeni rezisztenciához 19

29 (Yoshioka et al., 2003). Alternaria brassicicola-val fertőzött lúdfűben az AtRBOHD gén, ill. a kódolt enzimfehérje kettős szerepet játszik: a gomba által károsított növényi sejtek elhalását idézi elő, míg a szomszédos sejtekben gátolja az elhalást (Pogány et al., 2009). Általában a NADPHoxidáz (RBOH) gének expressziójának hiánya fokozza a növény fogékonyságát biotróf kórokozókkal (pl. lisztharmatok) szemben, ezt több gazdanövény lisztharmat-kapcsolatban is kimutatták, többek között lúdfű/golovinomyces cichoracearum (Berrocal- Lobo et al. 2010) és árpa/blumeria graminis f. sp. hordei (Proels et al. 2010) kombinációkban. Ezek szerint a növényi NADPH-oxidáz-függő ROStermelés ténylegesen szerepet játszhat ezen kórokozók gátlásában, amelyhez hozzájárulhat a növényi lokális sejt/szöveti elhalás (HR) (Király et al. 1993; El-Zahaby et al., 2004), ill. a megtámadott gazdasejtek papillaképzése (sejtfalvastagodások) (Proels et al. 2010). Ugyanakkor a NADPH-oxidáz-mutáns növények fertőzése nekrotrófokkal gyakran fokozza a rezisztenciát. Ezt tapasztalták pl. A. brassicicola-val fertőzött lúdfűben és Botrytis cinerea-val fertőzött N. benthamiana-ban (Asai és Yoshioka, 2009; Pogány et al., 2009). A NADPH-oxidázok által termelt ROS ezek szerint elősegítheti a növény nekrotrófok általi kolonizációját, vélhetően a megtámadott gazdasejtek elhalásának elősegítésével (Govrin és Levine, 2000; Barna et al., 2012) A patogenezissel kapcsolatos fehérjék és a növényi betegségrezisztencia Az ún. patogenezissel kapcsolatos (PR) fehérjék egészséges növényekben általában nem halmozódnak fel. A PR fehérjék 20

30 termelődését, ill. a kódoló gének indukcióját kórokozó fertőzés, valamint abiotikus stressz indukálja (Van Loon et al., 2006). A PR fehérjék és gének korai, erős aktiválódása az inkompatibilis növény kórokozó kölcsönhatások (azaz rezisztencia) jellemzője (Bell et al., 1986; Van Loon et al., 2006). A kompatibilis kölcsönhatásoknál (azaz fogékonyságnál) azonban inkább a patogenezis késői szakaszában észlelhető PR gén/fehérje indukció, amikor a fertőzött növény már láthatóan károsodott (Reiss és Bryngelsson 1996; Manandhar et al., 1999; Schultheiss et al., 2003; Yeom et al., 2011). Ezek alapján feltételezhető, hogy egyes PR fehérjék megfelelő időben és helyen felhalmozódva szerepet játszhatnak a betegség elleni rezisztencia kialakításában. A PR gének kifejeződését elsőként dohány mozaik vírussal (TMV) fertőzött növényben mutatták ki (Van Loon és Van Kammen, 1970; Gianinazzi et al., 1970). PR géneket konstitutívan kifejező transzgenikus dohányok vizsgálata azonban egyértelműen bizonyította, hogy legalább három PR génnek, ill. fehérjének nincs tényleges szerepe a vírusfertőzésekkel szembeni rezisztenciában (Cutt et al., 1989; Linthorst et al., 1989). Vírusfertőzések esetén csak egy PR gén hozható közvetlenül kapcsolatba az ellenálló képességgel. A PR-10 gének ribonukleázt kódolnak, és paprikában a PR-10 génnek, ill. fehérjének közvetlen szerepe van a TMV-vel szembeni rezisztenciában, a vírus genomi RNS-ének lebontása révén (ribonukleáz aktivitás) (Park et al., 2004). A PR-10 fehérjék funkcionális jelentőségét paprikában és dohányban nekrotróf kórokozó gombákkal szembeni rezisztenciában is kimutatták és a PR-10 ribonukleáz aktivitásával, ill. a citokinin felhalmozódás serkentésével hozták összefüggésbe (Soh et al., 2012; 21

31 Agarwal et al., 2016). Bakteriális fertőzéseknél sem egyértelmű a PR fehérjék szerepe a rezisztenciafolyamatokban. Rayapuram et al. (2008) szerint a PR-13 fehérje antimikrobiális hatást fejt ki Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000-el fertőzött Nicotiana attenuata-ban, azonban egy másik PR fehérje, a PR-1 nem rendelkezik antimikrobiális aktivitással, csupán a rezisztencia markere. Ugyanakkor egy kitinázt kódoló dohány PR-3 gén (NtPR-Q) túltermeltetése fokozta a Ralstonia solanacearum-mal szembeni rezisztenciát (Tang et al., 2017). Növénykórokozó gombákkal fertőzött rezisztens növényekben már a 90- es években rámutattak a PR fehérjék lehetséges funkciójára. Egy babból származó kitinázt kifejező transzgenikus dohány fokozottan ellenállt a Rhizoctonia solani fertőzésével szemben (Brogue et al., 1991). Feltételezhető, hogy a nagy mennyiségben termelt kitináz hatékonyan bontja a kórokozók sejtfalában található kitint. Később további eredmények bizonyították, hogy a Phytophthora infestans, Uromyces fabae, és a Rhizoctonia solani kórokozókkal szembeni rezisztenciában közvetlen szerepe lehet egyes PR géneknek, ill. fehérjéknek (Vigers et al., 1992; Rauscher et al., 1999; Liu et al., 2011). Az eredmények szerint a PR-1 és PR-5 fehérje közvetlenül gátolja a gomba hifáinak növekedését és differenciálódását. A PR-1 fehérjéről újabb kutatások kiderítették, hogy a kórokozó gombákat többféle élettani-biokémiai mechanizmus segítségével is képes gátolni: a gombasejtfalban levő szterolvegyületeket megköti, védekezési szignálpeptidként működik és a kórokozó effektorainak egyik célfehérjéje (lásd Breen et al., 2017). Néhány PR fehérje olyan enzimaktivitással rendelkezik, amely alapján védekezési funkciójuk (kórokozókra kifejtett gátló hatásuk) közvetlenül 22

32 összefügg a növény ROS termelésével. A dohány PR-9 fehérjéjéról kimutatták, hogy egy ligninképző peroxidáz, amely kórokozó fertőzésnél feltehetően részt vesz a megtámadott növényi sejtek papillaképzéséhez szükséges H 2 O 2 termelésében (Lagrimini et al., 1987). Az árpa PR-15 és PR-16 fehérjék oxalát-oxidáz, ill. oxalát-oxidáz-szerű (szuperoxiddizmutáz) enzimaktivitása pedig H 2 O 2 -t halmoz fel a lisztharmattal (B. graminis f. sp. hordei) szemben rezisztens növényben (Zhang et al., 1995; Wei et al., 1998). A növényi PR fehérjék, sokoldalú biokémiaiélettani hatásaik révén, egyes gazda kórokozó kapcsolatokban közvetlenül felelősek lehetnek a rezisztenciáért, bár a fertőzés előrehaladott fázisában fogékonysági faktorokként is hathatnak, és a szöveti nekrózissal és/vagy kórokozó felhalmozódásával együtt járó stressz markerei lehetnek A szalicilsav jelentősége a növényi betegségrezisztenciában A szalicilsav (SA) egy kulcsfontosságú szabályozó növényi hormon a vírusokkal, gombákkal, baktériumokkal szembeni rezisztencia többek között az ún. szerzett rezisztencia (lásd korábban) kialakításában (Vlot et al., 2009). A SA a fertőzés helyén felhalmozódva egy transzkripciós kofaktort, az NPR1 gén (Nonexpressor of PR Genes 1) fehérjetermékét aktiválja (Mou et al., 2003; Spoel és Dong, 2012). Ezt követően elsősorban PR fehérjéket és antioxidáns enzimeket kódoló védekezési gének indukálódnak a fertőzés helye körül és a távoli szövetekben egyaránt, kialakítva a lokális, ill. szisztemikus szerzett rezisztenciát. Az SA betegségrezisztenciában játszott szerepének egyik közvetlen bizonyítékul szolgálnak az SA szintézisére, ill. felhalmozására képtelen 23

33 transzgenikus növényekben végzett fertőzéses kísérletek. Ezek a dohányés lúdfűnövények fokozottan fogékonyak voltak többféle kórokozóra (nem tudtak szerzett rezisztenciát kialakítani egy későbbi fertőzésre) (Gaffney et al., 1993; Delaney et al., 1994; Wildermuth et al., 2001; Vlot et al., 2009). A növényekben in vivo szintetizált SA általában valamilyen raktározott formává alakul át, ez leggyakrabban a szalicilsav 2-O-ß-Dglükozid (SAG) (Lee és Raskin, 1999; Song, 2006). A szalicilsavglükozidok biológiai funkciója nem ismert (Hennig et al., 1993), de mivel lebomlásukból szabad SA keletkezik, közvetetten szerepet játszhatnak növényi betegségrezisztenciában (Yao et al., 2007; Pastor et al., 2013). A szalicilsav növényekben továbbalakulhat a rezisztencia szisztemikus jelátvitelében részt vevő metilszalicilsavvá (MeSA) (Park et al., 2007), melynek szintén létezik glükozilált formája (MeSAG) (Dean et al., 2003). Növényekben a ROS termelés szorosan összefügg a szalicilsav metabolizmusával, ill. hatásával. A ROS vegyületek (pl. H 2 O 2 ) kiválthatják a SA felhalmozódását (Neuenschwander et al., 1995; Leon et al., 1995). Ugyankkor a SA fokozhatja a H 2 O 2 akkumulációját, többek között azért, mert közvetlenül gátolja több H 2 O 2 -lebontó (antioxidáns) enzim aktivitását. Ilyen enzimek pl. a kataláz, aszkorbát-peroxidáz, glutation-peroxidáz vagy glutation-s-transzferáz (Chen et al., 1993; Durner és Klessig, 1995; Manohar et al., 2015). A szerzett rezisztencia során azonban a megnövekedett SA szint végső soron elősegíti az antioxidánsok (glutation, aszkorbát) és antioxidáns enzimek (glutation-stranszferáz, glutation-peroxidáz, aszkorbát-peroxidáz) szintézisét, ill. aktivitását (Fodor et al., 1997; Urbanek Krajnc et al., 2011). Ennek 24

34 fontosságát igazolja, hogy egy szalicilsav-felhalmozásra és normális vírus (TMV) rezisztenciára képtelen transzgenikus dohányban az antioxidánsok aktivitása is visszaszorul (Király et al., 2002b). A ROS vegyületek és a SA a rezisztens növényekben kölcsönhatnak a redukált glutationnal (GSH) is. Kimutatták, hogy a H 2 O 2 növeli a sejten belüli GSH-szintet, amely aktiválja a szalicilsavas jelátvitelt az abiotikus (oxidatív) stressz és a kórokozók elleni védekezésben egyaránt (Ghanta et al., 2011; Han et al., 2013; Herrera-Vásquez et al., 2015). Általánosan elfogadott, hogy a SA a biotróf kórokozók elleni rezisztenciát indukálja, míg egy másik növényi hormon, a jázmonsav (JA) a nekrotrófok és a sebzések (pl. rovar kártétel) elleni védekezésért felelős (Glazebrook, 2005; Grant és Lamb, 2006; Barna et al., 2012). A SA elsősorban a PR gének indukálásán keresztül fejti ki hatását, míg a JA más típusú védekezési géneket/fehérjéket aktivál (pl. Jasmonate inducible protein JIP gének). A SA és JA által indukált jelátvitel, ill. rezisztenciafolyamatok kölcsönösen elnyomják egymást (antagonista hatás). Spoel és munkatársai (2007) kimutatták, hogy lúdfű (A. thaliana) fertőzése biotróf gombával aktiválja a SA jelátvitelt és elnyomja a JAindukálta védekezést, és feltehetően emiatt nőhet meg a fogékonyság egy nekrotróf későbbi fertőzésével szemben. A SA és JA által indukált rezisztencia közötti kölcsönhatás azonban több mint egyszerű antagonizmus: pl. Abd El Rahman és munkatársai (2012) szerint a nekrotróf Botrytis cinerea a SA-jelátvitel aktiválásával teszi fogékonyabbá a paradicsomot saját fertőzésével szemben. Ugyanakkor baktériummal (Pseudomonas syringae pv. tomato) fertőzött lúdfűben a kórokozó egy JA-hatást utánzó toxin segítségével nyomja el a SA 25

35 jelátvitelt, így indukálva fogékonyságot a növényben (Laurie-Berry et al., 2006) Növénykórokozó vírusok A vírusok lényegében fertőző genetikai információk. Felépítésüket tekintve nukleoproteinek, genomjuk egy- vagy kétszálú DNS-ből (dezoxiribonukleinsav) vagy RNS-ből (ribonukleinsav) áll, amelyet köpenyfehérje véd. Az RNS vírusoknál a genom a kódoló információ szempontjából lehet pozitív (+) vagy negatív (-) irányultságú (sense) RNS (Horváth és Gáborjányi, 1999; Hull, 2014). A vírusok csak élő szervezetekben képesek fejlődni és sokszorozódni (replikálódni), mivel önálló anyagcserével nem rendelkeznek (biotrófok, obligát paraziták). Replikációjukhoz a gazdasejt fehérje- és nukleinsav-szintetizáló rendszerét programozzák át, hogy a parazitált sejt anyagait és organellumait (riboszómáit) hasznosítva építsék fel magukat és sokszorozódjanak. A növénykórokozó vírusok komoly, akár világszintű járványokat is okozhatnak, éves szinten ez kb. 30 milliárd USD-nek megfelelő terméskiesést jelent (Nicaise, 2014). A mezőgazdasági gyakorlatban a növényi vírusrezisztencia leginkább a megfelelő rezisztenciagének használatával, ill. a vírusvektorok elleni vegyszeres növényvédelemmel oldható meg. Dolgozatom témaválasztása miatt az alábbiakban két növénykórokozó vírus (PVX és TMV) jelentőségét tárgyalom röviden. 26

36 2.3.1.Burgonya X vírus (Potato virus X, PVX) A burgonya X vírus (Potato virus X, PVX) a potexvírusok családjába tartozó, elsősorban burgonyát fertőző virus, de PVX-re fogékonyak a Solanaceae növénycsalád más fajai is (pl. a termesztett dohány, Nicotiana tobacum). Jelentősége, hogy valamennyi burgonyát termesztő országban előfordul, a fertőzöttség által előidézett termésveszteség 10-20% körüli (Horváth és Gáborjányi, 1999; Hull, 2014). Bár a PVX-szel való fertőzés önmagában csak enyhébb mozaikosodást, levélszél fodrosodást okoz, gyakran más vírusokkal együtt, komplex formában lép föl, ilyen esetekben a kártétel lényegesen súlyosabb. Dohánynövényekben a leginkább tanulmányozott, PVX-szel szinergizmusra képes vírus a potyvírusok csoportjába tartozó burgonya Y vírus (Potato virus Y, PVY). A két vírussal egyszerre megfertőzött növényekben a szisztemikus tünetek jóval erőteljesebbek, és a PVX szintje is többszörösére nő (a PVY mennyisége változatlan marad, vagy inkább csökken) azokhoz a növényekhez képest, amelyek csak az egyik vírussal voltak fertőzve (Goodman és Ross, 1974; Vance, 1991). A PVX fonálszerű, flexibilis virion, nukleinsava egykomponensű, egyszálú +RNS. A vírus genomjában kódolt öt fehérje egyike a vírus köpenyfehérjéje (coat protein: CP), amely a vírus replikációjáért, sejtről sejtre való terjedéséért és enkapszidációjáért ( becsomagolódásáért ) felel (lásd pl. Chapman et al., 1992). Reverz genetikai kísérletek igazolták, hogy az Rx rezisztenciagének által meghatározott védekezési mechanizmus is a PVX köpenyfehérjéjét ismeri fel, mint effektort (avirulencia fehérjét) (Goulden et al., 1993; Bendahmane et al, 1995). Egy másik, köpenyfehérjével kapcsolatos védekezési rendszer a CP által 27

37 közvetített rezisztencia, ennek lényege, hogy a növény nagy mennyiségben termeli a vírus eredetű CP-t, ezért a fertőzés során a növény sejtjeibe jutó vírusrészecskék (virionok) rezisztenciagén(ek) működése nélkül is gátlódnak. Ezt a jelenséget először a dohány mozaik vírus esetében írták le. Azok a transzgenikus dohánynövények, melyek rendelkeztek a TMV köpenyfehérje génjével, rezisztenssé váltak a TMV és a vele közeli rokonságban álló vírusok fertőzésével szemben (Powell-Abel et al., 1986). Ugyanilyen CP által közvetített rezisztenciát leírtak PVX esetében is (Hemenway et al., 1988; Spillane et al., 1997) Az Rx gének által meghatározott, tünetmentes (extrém) vírusrezisztencia A gén-génnel szembeni (specifikus) rezisztencia tünetmentes is lehet, ilyen pl. az ún. extrém rezisztencia, a gazdanövények rendkívül gyors és hatékony ellenálló képessége, amely többféle vírussal szemben is megnyilvánulhat (pl. PVX, szója mozaik vírus /Soybean mosaic virus, SMV/ vagy tarlórépa göndörödés vírus /Turnip crinkle virus, TCV/) (Bendahmane et al., 1999; Cooley et al., 2000; Hajimorad és Hill, 2001). A vadburgonya (Solanum) fajokból származó Rx rezisztenciagének (Rx1 és Rx2) által meghatározott, PVX-szel szembeni ellenállóság is egy hiperszenzitív reakció (lokális sejt/szöveti elhalás, HR) nélküli, tünetmentes (extrém) rezisztencia, amely burgonyában és dohányban egy kivételével valamennyi ismert PVX törzs ellen hatásos (Goulden et al., 1993; Bendahmane et al., 1999, 2000). Annak ellenére tehát, hogy az Rx fehérjék szerkezete hasonlít a HR-rel járó rezisztenciát meghatározó gének fehérjetermékeihez, az Rx által közvetített extrém rezisztencia nem 28

38 jár hiperszenzitív reakcióval. Az extrém rezisztencia működése arra enged következtetni, hogy a fertőzés helyén fellépő sejt-, ill. szöveti nekrózis, és a patogén terjedésének gátlása egymástól független válaszok a növényekben, ugyanis a két folyamat (nekrotizáció és rezisztencia) élettani és genetikai szempontból is szétválasztható, vírusos-, gombás- és baktériumos fertőzéseknél egyaránt (Király et al., 1972; Yu et al., 1998; Bendahmane et al., 1999; Cole et al., 2001; Coll et al., 2010; Künstler et al., 2016). A PVX-szel, ill. más vírusokkal (pl. TCV) szembeni extrém rezisztencia olyan gyorsan kialakul (a kórokozó azonnal gátlódik), hogy nincs lehetőség a HR (növényi sejt/szöveti elhalás) kifejlődésére (Bendahmane et al., 1999; Cooley et al., 2000). Az extrém ellenálló képesség pontos mechanizmusa azonban tisztázatlan. Elképzelhető, hogy a PVX-szel szembeni tünetmentes, extrém rezisztencia egyik oka a nagyon korai szuperoxid-felhalmozódás, amely a vírus replikációját gátolhatja (Bendahmane et al., 1999). Előkísérleteink szerint a PVX fertőzésre extrém rezisztens dohányban (N. tabacum cv. Samsun NN Rx1) kismértékben megemelkedik a szuperoxid (O 2 ) mennyisége a fogékony növényekhez képest Dohány mozaik vírus (Tobacco mosaic virus, TMV) Adolf Mayer 1886-ban igazolta, hogy a dohány mozaikos betegsége átvihető fertőző dohánynövény szövetnedvével. A TMV-t, egyben az első vírust, Dmitrij Ivanovszkij fedezte fel 1892-ben a dohány mozaikbetegségének tanulmányozása során. A TMV a növények széles körét fertőzi, de gazdanövényei elsősorban a Solanaceae családból származnak. A vírus szabályos pálcika formájú, merev, helikális 29

39 szimmetriájú, szerkezete egy cső formájú köpenyfehérjéből (kapszid), és egy benne elhelyezkedő vírusgenomból áll. A vírusgenom pozitív, lineáris lefutású egyszálú RNS. A vírus fertőzése vektor nélkül, mechanikailag történik (lásd pl. Horváth és Gáborjányi, 1999). Nem steril körülmények között, szobahőmérsékleten a TMV extrém stabil szerkezete miatt akár 50 évig is megőrzi fertőzőképességét, a csupasz genom stabilitása azonban nem nagyobb, mint bármely más egyszálú RNS-é (lásd pl. Hull, 2014) Az N gén által meghatározott, lokális sejt/szöveti elhalással (HR) járó vírusrezisztencia A gén-génnel szembeni (specifikus) gazda rezisztencia egyik legismertebb modellje a Nicotiana glutinosa-ból származó N (nekrózis) rezisztenciagént hordozó dohánynövények és a TMV kölcsönhatása (Holmes, 1938). Az N gén a TMV mellett a többi rokon tobamovírussal szemben is ellenálló képességet biztosít, kivéve az Óbuda paprika vírust (Óbuda pepper virus, ObPV), amely képes áttörni ezt a rezisztenciát (Tóbiás et al., 1982; Csilléry et al., 1983). A TMV az N gént vagy más rezisztenciagént nem hordozó növényekben szisztemizálódik és mozaikos tüneteket okoz, de az N gént kifejező gazdában a vírus kb. 2 napon belül a fertőzési helyek körül kialakuló HR-típusú léziókban (sejt/szöveti elhalás), ill. azok környékén lokalizálódik (Goodman és Novacky, 1994). Az N gén fehérjetermékének szerkezete hasonlít a tipikus rezisztencia gének fehérjéihez (TIR-NBS-LRR, azaz ún. Toll interleukin 1 típusú receptor, nukleotid kötőhellyel és leucinban gazdag ismétlődésekkel) (Whitham et al., 1994; Marathe et al., 2002). Az N 30

40 fehérje a TMV replikáz fehérjéjének helikáz régióját (a vírus Avr faktorát, azaz effektorát) ismeri fel, ez a kölcsönhatás indukálja a HR-t (Padgett és Beachy, 1993). Feltételezhető azonban, hogy ezt a HR-típusú rezisztenciát (vírusgátlást) elsősorban nem a sejt/szöveti elhalás okozza. Egyrészt a TMV néhány N gént hordozó Nicotiana fajban viszonylag alacsony hőmérsékleten (18-20 o C) képes a szisztemikus terjedésre, és ilyenkor szisztemikus nekrózis alakul ki (Zaitlin, 1962). Másrészt a vírus a HR léziók körüli élő sejtekben még akkor is megtalálható, mikor a lézió terjedése már megállt (Da Graça et al., 1976; Wright et al., 2000) Lisztharmatgombák A világszerte elterjedt, közel 700 fajt számláló lisztharmatgombák (Erysiphales) a gazdasági szempontból legjelentősebb károkat okozó biotróf növénykórokozók közé tartoznak. Gazdanövényeik között túlnyomórészt kétszikű növényfajokat tartanak számon (lásd pl. Braun, 2011), és ezek között jelen van a termesztett növényfajok túlnyomó többsége is, pl. gabonafélék, zöldség- és gyümölcsfajok, dísznövényként termesztett fás- és lágyszárú fajok, valamint más haszonnövények is, ami arra utal, hogy ezek a kórokozók komoly kihívást jelentenek a növényvédelem számára. Az 1990-es években a legnagyobb mennyiségű fungicidfelhasználás a termesztett növények lisztharmatgombákkal megfékezésére irányult (Hewitt, 1998). A lisztharmatgombák vegetatív tenyészteste a tömlősgombákra jellemző álharántfalas micélium, ennek elhelyezkedése a legtöbb nemzetségnél epifitikus. Ivartalan szaporodásuk az egysejtű, ovális alakú, színtelen, 31

41 konídiumokkal történik, amelyek (nemzetségtől függően) különféle típusú konídiumtartókon jönnek létre. Ivaros alakjaikra a kleisztotécium (újabb szóhasználattal: kazmotécium) jellemző, amelyben egy vagy több aszkusz (tömlő), azokban pedig aszkospórák találhatók (Glits és Folk, 2000; Heffer et al., 2006). A lisztharmatgombák elleni biológiai növényvédelem legfontosabb eszköze a rezisztens fajták nemesítése és termesztése. Ezek számos esetben megfelelő védelmet nyújtanak a kórokozó ellen. A növénytermesztési gyakorlatban évtizedek óta leginkább az mlo gének által meghatározott rezisztencia biztosít tartós, nem rassz-specifikus, szabad földön is hatásos ellenállóságot árpalisztharmattal (B. graminis f. sp. hordei) szemben számos termesztett tavaszi árpa fajtában (Jørgensen, 1992). Az mlo rezisztenciát újabban búzalisztharmat ellen is sikerült létrehozni úgy, hogy a búza három, MLO fehérjét kódoló homeoalléljában célzott génszerkesztéssel mutációkat indukáltak (Wang et al., 2014). Dolgozatom témaválasztása miatt az alábbiakban a paprikalisztharmat (Leveillula taurica) jelentőségét ismertetem röviden A paprikalisztharmat (Leveillula taurica) jelentősége A világ számos országában, ahol intenzív paprikatermesztés folyik, leírták már ezt a lisztharmatgombát (Leveillula taurica, anamorf: Oidiopsis taurica). Gazdanövénykörét tekintve fertőzése leginkább az étkezési paprikán (Capsicum annum) észlelhető, de megjelenése nem zárható ki más paprikafajokon sem (pl. Capsicum chinense). Ismeretes még a Solanaceae család egyéb fajain történő károsítása, mint a 32

42 paradicsom, tojásgyümölcs vagy petúnia. Külföldi adatok alapján a kórokozó támadja még az uborkát, hagymát, articsókát, gyapotot, emellett számos vad növényfajon is leírták előfordulását (Braun és Cook, 2012). A paprikalisztharmat a mérsékelt égövi klímán csak mesterséges hajtató rendszerekben üvegházban, fóliasátorban fordul elő és a leveleken okoz tüneteket (trópusi éghajlaton a termést is megfertőzi). Ha korán, a hajtatás kezdetén jelentkezik a levélfertőzés, az akár 30% termésvesztést is okozhat. A paprikalisztharmat Magyarországon óta van jelen, leginkább a paprikahajtatásban okoz gazdasági károkat, szabadföldi termesztésben - eddigi ismereteink szerint - nem fordul elő (Glits és Folk, 2000). Fontos megemlíteni, hogy a Leveillula nemzetségen belül a fajok elkölönítése nem egyértelmű, a L. taurica elnevezés valójában egy fajkomplexet jelöl, amelyhez több biológiai faj tartozik (lásd pl. Zheng et al., 2013b). A paprikalisztharmat életmódja több szempontból is eltér a többi lisztharmafajétól. A levél gázcserenyilásain hatol be a növénybe, majd a sejt közötti járatokban terjed, ezt követően mintegy napos lappangási idő után a levél fonákján a gázcserenyílásokon át megjelennek a konídiumtartók, rajtuk a konídiumokkal (hemiendofitikus életmód). A jól ismert lisztharmatfajok (pl: búza-, árpa-, paradicsomlisztharmat) micéliuma (gombafonál) kizárólag a megfertőzött levelek felszínén képez fehéres, lisztes bevonatot. Paprikáin viszont a lisztharmat a levélfonákon alakul ki, ami jóval nehezebben észlelhető. Kritikus tényező tehát a betegség korai felismerése, ugyanis ilyenkor a növényállomány akár fele már fertőzött lehet (Elad et al., 2007; Zheng et al., 2013a). A hajtatás során először főleg az idősebb (alsó) leveleken jelentkeznek a tünetek, 33

43 amelyek később a fiatal leveleken is megjelennek. A fertőzés terjedésével a levél felszínén is jelentkezhetnek tünetek, sárga foltok formájában (klorózis). Erős fertőzés esetén a konídiumtelepek (lisztharmat) is megjelennek a levél felszínén. Később a levelek elbarnulnak (nekrotizáció), kanalasodnak majd elszáradnak. A levélvesztés hatására csökken az asszimilációs felület, így virágvesztés, rossz terméskötődés, illetve termésvesztés is kialakulhat. Erős fertőzés hatására 2-4 kg/m 2 termésveszteség is jelentkezhet intenzív hajtatás során (Cerkauskas és Buonassisi, 2003; Zheng et al. 2013a). A felborult biológiai ciklus hatására a növények hamarabb öregednek, így a betakarításra is korábban kerül sor. Az ilyen növények kalciumfelvétele akadályozottá válik, így a bogyókon jelentkezhet a kalciumhiány tipikus tünete (csúcsrothadás, a bogyók vége megbarnul), ezáltal a termés piaci értéke jelentősen csökken. A paprikalisztharmattal szembeni rezisztenciával feltehetően összefügg a növények megfelelő kalciumfelvétele, ill. kalciumellátottsága. Egy hazai cseresznyepaprika (C. annum var. cerasiforme) fajtának (cv. Szentesi) ugyanis nemcsak a kalciumfelvétele jó (Lantos, 2011), de hajtatásban a fertőzés tünetei is nem vagy alig jelentkeznek (Lantos et al., 2012). A gyakorlatban a paprikalisztharmattal szemben leginkább intenzív fungicides kezelésekkel védekeznek. A rezisztencia (R) gének használata nem tűnik hatásosnak, feltehetően azért, mert ezt az oligogénes rezisztenciát a megjelenő új kórokozó rasszok viszonylag hamar le tudják törni. A recesszív mlo gének (mutációk) által a paprikalisztharmattal szemben biztosított tartós, nem rassz-specifikus rezisztencia viszont a jövőben ígéretes lehet, mivel a paprikában két 34

44 működő Mlo gént is leírtak, amelyek hozzájárulnak a lisztharmatfogékonysághoz (lásd pl. Zheng et al. 2013a) A kertészeti oltással átvihető növényi betegségrezisztencia A hazai hajtatási gyakorlatban egyes zöldségnövények kertészeti oltásának alkalmazása az elmúlt évtizedek fejleménye. A fás szárú növények példáját követve a zöldségnövények oltását a szaporításhoz sorolják a magyar szakkönyvek, pedig az oltás jelenleg alkalmazott formájánál kicsit anakronisztikus szaporításról (a termesztett növények életfolyamatainak újrakezdésére irányuló tevékenységről) beszélni, hiszen két magból állítunk elő egy növényt. Talán helyesebb lenne az oltást fitotechnikai műveletetként (közvetlenül a növényekkel végzett, a növények egyedi kezelésével járó tevékenységként) értelmezni. Az oltás széles körű elterjedését tápanyag-hasznosítási, valamint növényvédelmi problémák indokolják. Leginkább a kabakosok és a paradicsom oltása került előtérbe az utóbbi években, az oltott paprika hajtatása világviszonylatban is csak kevés területet fed le. Az alanyválasztásnál fontos követelmény a jó adaptációs készség, a kiváló víz- és tápanyaghasznosító képesség, valamint a betegségrezisztencia (Ombódi, 2005; Warschefsky et al., 2016). Az oltás elősegítheti bizonyos genotípusos és fenotípusos tulajdonságok átvitelét az alanyról a a ráoltott nemes növényre, ilyen például a RAPD DNS-profil, valamint a termés formája és színe (lásd pl. Taller et al., 1998, 1999; Tsaballa et al., 2013). Paprikában és más Solanaceae fajokban (paradicsom, tojásgyümölcs) azt is kimutatták, hogy két 35

45 növényfaj egyedeinek egymásra oltása a nemes részben a DNS metilációs mintázatokat is megváltoztatja és ezek a változások öröklődnek (Wu et al., 2013; Warschefsky et al., 2016). Rengeteg adat létezik az oltással átvihető növényi betegségrezisztenciával kapcsolatban is, de ezek a munkák leginkább a talajban, a gyökérzetet károsító betegségek elleni védekezésről számolnak be (King et al., 2008; Louws et al., 2010; Al- Mawaali et al. 2012; Guan és Zhao 2012). A két legismertebb ilyen eset az európai szőlő (Vitis vinifera) ráoltása északamerikai vad alanyokra (Vitis labrusca és más fajok), a szőlőgyökértetű (Phylloxera vitifoliae) által kiváltott filoxéra járvány megfékezésére (lásd pl. Mudge et al., 2009) valamint citrusfélék ráoltása narancsra a fitoftórás gyökérbetegség kivédésére (Wutscher, 1979). Vírusos és baktériumos fertőzésekkel szembeni rezisztenciának oltással történő átvitelére is vannak példák (Süle és Burr, 1998; Vulić et al., 2013; Zhao és Song, 2014). Újabb kutatások szerint azonban néhány, a leveleket károsító gombás betegséggel szemben is hatásos lehet az oltással átvitt rezisztencia, pl. uborkában lisztharmat (Podosphaera xanthii) és peronoszpóra (Pseudoperonospora cubensis) ellen is (Louws et al., 2010; Sakata et al., 2006). Ezek az eredmények olyan, oltással átvihető szignálmolekulák jelenlétére utalnak, amelyek a ráoltott növényi részben betegségrezisztenciát indukálhatnak. A jelenség lehetséges biokémiai/genetikai mechanizmusa azonban lényegében ismeretlen, bár a cseresznyének oltással átvihető vírusrezisztenciájában igazolták a vírus eredetű kis interferáló RNS-ek (sirns) szerepét (Zhao és Song, 2014). A növényi betegségek elleni védekezésben fontos szerepet játszó 36

46 fenilalanin-ammónia-liáz enzimmel kapcsolatban viszont kimutatták, hogy a szubsztrát növényi fenolvegyületek koncentrációja nem mindig korrelál az oltással átvitt betegségrezisztenciával (Guan és Zhao, 2012; Wallis et al., 2013). Ugyanakkor oltott zöldségnövényekben (pl. paradicsom, tojásgyümölcs, uborka) az abiotikus stresszekkel szembeni fokozott ellenálló képesség nagyobb antioxidáns enzimaktivitásokkal jár együtt, mint a sajátgyökerű növényekben (He et al. 2009; Wei et al. 2009; Guan and Zhao 2012; Shu et al., 2016). A fentiek alapján feltételezhető, hogy a ROS felhalmozódás is hozzájárulhat az oltott növények fokozott stressztűréséhez, ill. betegség ellenállóságához. Előzetes eredményeink szerint egy hazai cseresznyepaprika (C. annum var. cerasiforme) fajtán (cv. Szentesi) a lisztharmatos fertőzés tünetei gyakorlatilag nem jelentkeznek és ez az ellenálló képesség oltással átvihető egy fogékony étkezési paprikára (cv. Totál) (Lantos et al., 2012). Elképzelhető, hogy ebben a jelenségben egyes ROS vegyületeknek is lehet tényleges szerepe. Előkísérleteink szerint ugyanis a Szentesi cseresznyepaprikában, ill. a ráoltott, eredetileg fogékony fajtában (cv. Totál) egyaránt jóval nagyobb mértékű a szuperoxid (O 2 ) felhalmozódása, mint a saját gyökerű fogékony paprikában. 37

47 3. ANYAG ÉS MÓDSZER 3.1. A kísérletekhez felhasznált növények Nicotiana tabacum cv. Samsun Rx1 és N rezisztenciagént együttesen hordozó vonala (Bendahmane et al., 1999) valamint két, a lucerna ferritinjét túltermelő dohányvonal (cv. SR1): C8 és F9 (Deák et al., 1999). A növények üvegházi körülmények között voltak nevelve, 8 héten át. Az egyes dohányvonalak keresztezését (F 1 utódok nyerése reciprok keresztezésekkel) szintén üvegházi körülmények között végeztük. Capsicum annuum cv. Totál, töltenivaló étkezési paprika, Capsicum annuum var. cerasiforme cv. Szentesi cseresznyepaprika, Kalocsai A, Kalocsai M, Globál, Koral, Garai Fehér, Óriás (ezek szintén cseresznyepaprika fajták), illetve a Totál és Szentesi cseresznyepaprikák oltványai (Szentesi alanyra oltott Totál) és keresztezett F 1 utódai [Totál ( ) x Szentesi ( )]. A növények üvegházi körülmények között voltak nevelve 14 héten át. A paprikakeresztezéseket szintén üvegházi körülmények között végeztük. Az oltás 8 hetes növényeken történt. Az alany és nemes növényeket sziklevél fölött 45 fokos szögben borotvapenge segítségével elvágtuk, majd az egyszerű párosítás elvét követve a Szentesi cseresznyepaprika gyökér részét (sziklevéllel) és a Totál növény sziklevél fölötti részét egy oltó klipsz segítségével egymásba helyeztük (lásd 20. ábra). A kéthetes edzetési folyamatot (25 C, 90% relatív páratartalom) követően az oltási eredés kb. 65%-os volt. 38

48 3.2. A kísérletekhez felhasznált növényi kórokozók Dohány mozaik vírus (Tobacco mosaic virus, TMV, U1 törzs) Burgonya X vírus (Potato virus X, PVX, Ny izolátum) (Ahmadvand et al., 2012) Paprikalisztharmat (Leveillula taurica) A vírusok fenntartása fogékony dohánygazdanövényen (TMV: Nicotiana tabacum cv. Samsun nn, PVX: Nicotiana tabacum cv. Xanthi NN) történt üvegházban (TMV), illetve Panasonic MLR-352 növénynevelő kamrában (PVX). A növénynevelő kamrában a növények 16 órás hosszúnappalos fotoperiódus szerint nőttek, 110 µe m 2 s -1 nappali fényerősség mellett, a hőmérsékletet nappal 25 o C, éjszaka 22 o C-on tartottuk. A vírusos inokulációhoz a fertőzött fogékony növények felső leveleit mozsárban, csapvízzel, abrazívum (karborundum) hozzáadásával dörzsöltük el (kb. 1 g levél / 10 ml csapvíz). Az így nyert inokulummal mechanikai úton (levelek bedörzsölése) fertőztünk. A kontrollinokulálást (mock inokulálás) karborundumos csapvízzel végeztük. A paprikalisztharmatot (Leveillula taurica) egy Szentesi parikatermesztő üvegházban izoláltuk és fogékony paprika gazdanövényen (cv. Totál) tartottuk fenn Panasonic MLR-352 növénynevelő kamrában, a dohánynál említett körülmények között. A lisztharmattal történő mesterséges fertőzést a Zheng és munkatársai által (2013a, b) leírtak szerint végeztük, kivéve, hogy a paprika levelekre a lisztharmat-szuszpenziót ( konídium/ml) egy finom ecsettel vittük fel. 39

49 3.3. A szuperoxid kimutatása A szuperoxid-szabadgyök mérése nitro blue tetrazoliu klorid (NBT) (Sigma-Aldrich, Németország) segítségével történt. A szuperoxid reakcióba lép az NBT-vel, és sötétkék színű formazán képződik, amely szabad szemmel érzékelhető. A méréshez 1 mg/ml koncentrációjú NBT-oldatot használtunk 10 mm-os kálium-foszfát pufferben (ph=7,8) feloldva. Az oldatot vákuuminfiltrálással juttattuk a levelekbe (Ádám et al., 1989). A leveleket 15 percig erős fény alatt megvilágítottuk, majd színtelenítő oldatba (0,15 w/v % triklórecetsav, etanol és kloroform 4:1 arányú elegyében) helyeztük két napra (Hückelhoven és Kogel, 1998). Az elszíntelenedett leveleket ezután glicerin és desztillált víz 1:1 arányú elegyében tároltuk, majd a leveleket fóliára kiterítve az eredményeket digitálisan dokumentáltuk ( szkennelés ). Az NBT festést a nyilvánosan hozzáférhető ImageJ számítógépes program ( segítségével mennyiségileg értékeltük Sejthalál festés paprika levélszövetekben Paprika levélszövetekben az elhalt sejteket laktofenolos Tripánkékfestéssel hívtuk elő, Pogány et al. (2009) módszere szerint, kis változtatással. A festő-törzsoldatot (10 g fenol, 10 ml glicerin, 10 ml tejsav, 10 ml desztillált víz és 0,02 g Tripánkék /Sigma-Aldrich, Németország/) 96%-os etanolban higítottuk 1:2 arányban majd a hígított festékben a leveleket 1 percig főztük és 4 napig inkubáltuk. Ezt követően 40

50 a paprikaleveleket telített klorál-hidrát [Cl₃CCH(OH)₂] oldatban (1 kg klorál-hidrát 400 ml desztillált vízben feloldva) színtelenítettük PVX fogékonyság kialakítása rezisztens dohányban antioxidáns enzimek (SOD és CAT) infiltrálásával Rezisztens (cv. Samsun NN Rx1) és fogékony (cv. Samsun NN) kontroll dohánynövények PVX-szel fertőzött leveleinek egyik felét a vírusfertőzés után közvetlenül 10 mm kálium-foszfát pufferben (ph=7,8) feloldott szuperoxid-dizmutáz (SOD, 3000 U/ml) és kataláz enzimekkel (CAT, 5000 U/ml) infiltráltuk, injekciós tű és fecskendő segítségével. A másik (kontroll) levélfelet 10 mm kálium-foszfát pufferrel infiltráltuk PVX rezisztencia kialakítása fogékony dohányban szuperoxid (ROS) képző ágens infiltrálásával PVX fertőzésre fogékony dohány (cv. Samsun NN) vírusfertőzött leveleinek egyik felét a vírusfertőzés után 2 órával szuperoxidot (O.- 2 ) képző ágenssel (66 µm riboflavin, 10 mm L-metionin) infiltráltuk, injekciós tű és fecskendő segítségével, a korábban leírtak (Bacsó et al., 2011) szerint. A másik (kontroll) levélfelet pufferrel (10 mm káliumfoszfát, ph= 7,8) infiltráltuk. 41

51 3.7. Génkifejeződési vizsgálatok, a PVX és TMV RNS-szintű és a paprika lisztharmat (Leveillula taurica) DNS-szintű kimutatása Dohányból és paprikából (egészséges, ill. PVX-, TMV vírusokkal és paprikalisztharmattal fertőzött levelek) teljes növényi RNS-t vontunk ki. A folyékony nitrogénben lefagyasztott leveleket mozsárban eldörzsöltük, majd az eldörzsölt szövetből szilikagélmembrán-oszlopos módszerrel (Plant Total RNA Extraction Miniprep System, Viogene, USA, ill. SV Total kit, Promega), a készletekhez mellékelt utasításoknak megfelelően vontuk ki az RNS-t. A kapott RNS mennyiségét és tisztaságát spektrofotométeren (NanoDrop ND-1000) ellenőriztük. Az RNS (és DNS) elnyelési maximuma 260 nm hullámhossznál van. Az RNS mennyiségét a mintákban az A 260 értékkel határoztuk meg: RNS koncentráció =A 260 hígítás/25 (moláris kioltási együttható). Az A 280 érték pedig a fehérjével való szennyezettségre utalt. Az A 260 /A 280 arányt 1,6 és 2,0 szélsőértékek között fogadtuk el megfelelőnek. Ezt követően a mintákat megfuttattuk 1%-os formaldehid-agaróz-gélen, és az elektroforézis után a kivont RNS koncentrációját és épségét etídiumbromidos festéssel UV-fényben ellenőriztük. A génkifejeződés vizsgálatához reverz transzkripcióval egybekötött nukleinsavsokszorosítást (RT-PCR: reverse transcription polymerase chain reaction) használtunk. Először a hírvivő (messenger) RNS-t szaporítottuk fel (RT lépés, azaz cdns szintézis), oligodt indítószekvencia (primer) segítségével, a reagenst gyártó leírását követően (RevertAid H Minus First Strand cdna Synthesis Kit, Fermentas, Litvánia). A következő lépésben az adott génnek megfelelő 42

52 cdns-t sokszorosítottuk (PCR), a készletet gyártó (KAPA Biosystems, USA) utasításai szerint. A PCR-t még a folyamat exponenciális fázisában állítottuk le, tehát minden vizsgált génnél olyan, külön-külön beállított ciklusszámmal dolgoztunk, ahol még megmaradtak a különbségek a különböző átíródási szintek között. Az RT-PCR-t követően a génexpressziós különbségek kimutatásához a mintákat UV-fényben fluoreszkáló GelRed (GelRed Nucleic Acid Gel Stain, X, Biotium Inc., USA) festékkel festett, 1%-os agarózgélen futtattuk meg, referenciának (konstitutív kontroll) dohánynál és paprikánál egy-egy aktin gén expresszióját tekintettük. Az agarózgélt gélkiértékelő rendszerben (AlphaImager EP), UV-fényben (λ = 302 nm) lefotóztuk. Ezzel a módszerrel a génkifejeződés szemikvantitatív módon mérhető. A génkifejeződés érzékenyebb, kvantitatív kimutatásához az ún. valós idejű (real time) kvantitatív RT-PCR módszert használtuk, a reagenst gyártó (KAPA Biosystems, USA) útmutatása szerint. A PCR-t követően az adatokat a műszert (BIO RAD CFX 96) gyártó cég (Bio-Rad Laboratories, USA) által fejlesztett számítógépes programmal (CFX Manager TM 2.1), Excel táblázatkezelő segítségével értékeltük ki. A génkifejeződés különbségeinek számszerűsítéséhez az ún. 2 - CT módszert (Livak és Schmittgen, 2001; Schmittgen és Livak, 2008) alkalmaztuk, belső referenciaként a korábban említett gének (dohány és paprika aktingénjei) szolgáltak. PCR-hoz az alábbi génekre specifikus indítószekvencia-párokat (primereket) használtuk (lásd 3.7.1). A fent említett génkifejeződést mérő módszerek segítségével detektáltuk RNS szinten a két, dohányt fertőző vírus (PVX és TMV) felhalmozódását is, a 43

53 vírus köpenyfehérjegénekre tervezett indítószekvenciák (primerek) segítségével (lásd 3.7.1). Leveillula taurica kimutatásához a fertőzött növényekből, valamint a kontrollként használt egészséges növényekből teljes növényi DNS-t vontunk ki. A folyékony nitrogénben lefagyasztott leveleket mozsárban eldörzsöltük, majd az eldörzsölt szövetből szilikagélmembrán-oszlopos módszerrel vontuk ki a DNS-t (REDExtract-N-Amp TM Plant PCR Kit, Sigma Aldrich, Németország). A kivont DNS-ből szemikvantitatív polimeráz láncreakció (Polymerase Chain Reaction, PCR) módszerrel (KAPA Taq PCR Kit, KAPA Biosystems, USA) felszaporítottuk a gomba egyik specifikus ITS szekvenciájának (LtLV) egy szakaszát. Növényi referenciagénként a paprika aktingénjét használtuk, ehhez a génhez, mint referenciához hasonlítottuk a gomba LtLV DNS mennyiségét. A fertőzött növényekben így lényegében a gomba-dnsnek a növényi DNS-hez viszonyított mennyiségét, ezáltal a gomba felhalmozódását határoztuk meg. A kapott PCR terméket UV-fényben fluoreszkáló GelRed festékkel festett 1%-os agarózgélen futattuk meg. Az agarózgélt gélkiértékelő rendszerben (AlphaImager EP), UV-fényben (λ = 302 nm) lefotóztuk. Ezzel a módszerrel adott DNS mennyisége szemikvantitatív módon mérhető. A mintákban a gombamennyiségek közötti különbségek számszerűsítésére az érzékenyebb valós idejű (real time) kvantitatív PCR módszert alkalmaztuk, a reagenst gyártó (KAPA SYBR FAST Universal qpcr Kit, KAPA Biosystems, USA) útmutatása szerint. A reakciót egy BIO RAD CFX 96-os real time PCR készülékben végeztük el. A PCR-t követően az adatokat a műszert gyártó cég (Bio-Rad Laboratories, USA) által fejlesztett számítógépes 44

54 programmal (CFX Manager TM 2.1), Excel táblázatkezelő segítségével értékeltük ki. A gomba-dns-mennyiség különbségeinek számszerűsítéséhez az ún. 2 - CT módszert (Livak és Schmittgen, 2001; Schmittgen és Livak, 2008) vettük alapul, belső referenciaként a korábban említett paprika aktingén DNS mennyisége szolgált Felhasznált primerek Gén neve, génbanki Előre- (forward) és visszainduló (reverse) primer nukleinsav-sorrendje azonosító száma NtAct 5 - CGGAATCCACGAGACTACATAC 3 X GGGAAGCCAAGATAGAGC 3 CaAct 5 ATCCCTCCACCTCTTCACTCTC 3 AY GCCTTAACCATTCCTGTTCCATTATC 3 TMVcp 5 ACCCTCGCCGACTACAACAT 3 AF CAGTAGTGGCGGTCGAAGTG 3 PVXcp 5 GGCATCAGCAGAGCTAGACTG 3 X CGGGGATCCTCGAGAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTT 3 LtLV 5 AGCCGACTAGGCTTGGTCTT 3 MF GCGGGTATCCCTACCTGATT 3 St1Rx1RT 5 GGAGAAATCCTGCAATATAAT 3 AJ CGACCGAACTTACATTTTCCC 3 NtAOX1-2 5 GAAACAGTGGCTGCAGTGCC 3 S71335, 5 GTGATACCCAATTGGTGC 3 X79768 NtBI-1 5 GCGACACCTCTGTATGAA 3 AF ATGAAAGAAGACCTCCAA 3 NtCAT1 5 TCCGCTTGATGTGACTAAA 3 AF TCCACCCACCGACGAATA 3 NtGSTphi1 5 CTGGKGAWCACAAGAAGC 3 AY GCCAARATATCAGCACACC 3 Primer kapcsolódási hőmérséklet (annealing temperature, T a) T a = 60 o C T a = 60 ºC T a = 60 o C T a = 55 C T a = 60 ºC T a = 60 ºC T a = 57 ºC T a = 48 o C T a = 48 ºC T a = 50 ºC NtPR-1a 5 GCAGATTGTAACCTCGTA 3 T a = 60 ºC 45

55 D CAATTAGTATGGACTTTCG 3 NtPRB-1b X GGGATACTCCACAACATTAG 3 5 CACATACATATACACACCTC 3 CaPR-1 5 GTTGTGCTAGGGTTCGGTGT 3 AF CAAGCAATTATTTAAACGATCCA 3 CaPR-2 (GLU) 5 ACAGGCACATCTTCACTTACC 3 AF CGAGCAAAGGCGAATTTATCC 3 CaMlo1 5 CAAACATCATTCAAATCCAGCAACACCA 3 AY AATTTGATGCATATGGGACGGCGAAGAA 3 CaMlo2 5 CTGGCACAATACAGCGAAAA 3 JN TTCATTAGCCCAGCCTTCAT 3 T a = 57 ºC T a = 56 ºC T a = 56 ºC T a = 60 ºC T a = 60 ºC 3.8. Szabad és kötött szalicilsav mérése paprikanövényekben Szabad és kötött (savasan hidrolizálható) szalicilsav méréséhez a Meuwly és Métraux (1993), ill. Cole et al. (2004) által leírt módszert alkalmaztuk. A méréseket Dr. Szalai Gabriella és munkacsoportja (MTA ATK Mezőgazdasági Kutatóintézete, Martonvásár) végezte. A kivonáshoz vivőanyagként para-hidroxibenzoesavat, belső standardként 2-metoxibenzoesavat használtak. Az elsődleges feltárás során a növényi mintát 8000 g-n centrifugálták 20 percig, a felülúszót félretették, utána az üledéket reszuszpendálták 90%-os (v/v) metanolban, és újracentrifugálták a már leírt paraméterekkel. A két felülúszó frakciót kombinálva a metanolt szobahőmérsékleten, vákuumcentrifugában elpárologtatták, majd 1 ml 5%-os (w/v) triklórecetsavat adtak a mintához és lecentrifugálták (8000 g, 10 perc). A felülúszót kétszer extrahálták etilacetát:ciklohexán 1:1 arányú keverékével. A szabad szalicilsav meghatározásához a felső, szabad fenolvegyületeket tartalmazó szerves réteget -20 ºC-on tárolták, a kötött szalicilsav meghatározásához pedig az alsó vizes fázist hidrolizálták sósavval, majd centrifugálás (6000 g, 10 46

56 perc) után a felülúszót kétszer szerves extrakciónak vetették alá a fent leírt módon. Az így kapott szerves frakciót tárolták -20 ºC-on. Magát a szalicilsavmérést nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával (high performance liquid chromatography, HPLC), deaktivált, reverz fázisú oszlop segítségével, fluorometriás detektorral végezték, Meuwly és Métraux (1993) leírása szerint NADPH-oxidáz enzim aktivitásának mérése paprika szövetekből A NADPH-oxidáz enzim aktivitásának mérését a korábban leírtak szerint (Ádám et al., 1997 és Xia et al., 2009) végeztük, néhány módosítással. A kivonáshoz nyolcszoros térfogatú kivonó puffert (50 mm Tris-HCL, ph 7,5, 0,25 M száharóz, 1 mm Na 2 S 2 O 5, 1 mm EDTA, 0,6% PVP) használtunk. Az eldörzsölt, tisztított levélmintákat g-n ( rpm) centrifugáltuk 30 percig, 4 C-on, ultracentrifugában (BECKMAN L7-55) (sejtmembrán frakció izolálása). A centrifugálás végén kapott csapadékot 0,5 ml kivonó pufferben újraszuszpendáltuk, és a szuszpendált csapadékot használtuk fel azonnal a NADPH-oxidáz aktivitásának megállapításához. A fotométeres meghatározás során a reakcióelegybe (100 mm HEPES ph 6,8, 0,2 mm NADPH, 0,3 mm NBT) 50 µl szuszpendált csapadékot adtunk. A NADPH-oxidáz aktivitásának specifikus méréséhez a reakcióelegybe tettünk 40 unit/ml SOD-ot (szuperoxid-dizmutáz) (Sigma-Aldrich, Németország). Az enzimaktivitás kimutatásához ugyanazt a mintát lemértük SOD nélkül és SOD-dal, a két érték különbsége adta az enzimaktivitást (Ádám et al. 1997). 47

57 3.10. Glutation mennyiségének meghatározása TMV-vel, valamint PVX-szel fertőzött dohánynövényben spektrofotometriás módszerrel A glutation mennyiségét a fertőzések után 4 nappal vizsgáltuk, a korábban leírt módszer szerint (Griffith, 1980). A dohánylevelek egy része TMV-vel, másik részük PVX-szel volt fertőzve. A fertőzött növényeken kívül kontroll-inokulált (mock), valamint egészséges növényeket is bevontunk a mérésbe. A glutation mennyiségének meghatározásához a mintaszedést követően -70 o C tárolt 0,5 g növényi szövetet folyékony nitrogénben eldörzsöltünk. Az eldörzsölt növényi szövetet 2 ml 6 w/v %-os metafoszforsavval homogenizáltuk, majd a mintákat centrifugáltuk ( g, 20 perc, 4 o C). A méréshez a kapott felülúszót használtuk fel. A glutation mérése két formában történt. Egyrészt meghatároztuk az összes glutation-mennyiséget (redukált és oxidált együtt), másrészt az oxidált glutation-szintet (GSSG). A kettő különbségéből pedig megkaptuk a redukált glutation (GSH) mennyiségét. A méréshez 100 µl metafoszforsavas felülúszót 1,5 ml-es Eppendorfcsőbe pipettáztunk, majd a ph-ját 1,5 M-os trietanol-aminnal (TEA) 5,5 és 6,5 közé állítottuk. Az összes glutation mennyiségét az így előkészített oldatban mértük. Az oxidált glutation mennyiségének meghatározásához szintén 100 µl felülúszót mértünk ki, majd a ph stabilizálás után a mintákhoz 4 µl 2-vinilpiridint adtunk, mely megköti a redukált glutationt. A mintákat erőteljesen összeráztuk a vinilpiridinnel, melynek következtében fehér csapadék képződött (megkötődött a redukált glutation), majd az így kapott oldatot mérés előtt szobahőmérsékleten egy órán át állni hagytuk. Az előkészített mintaoldatokban a glutation 48

58 mennyiségének 2:30 perces kinetikáját spektrofotométer segítségével (Shimadzu, UV-160A), 412 nm-en mértük. A küvettába a mintákhoz a méréshez szükséges reagens oldatokat közvetlenül a mérés előtt adtuk hozzá Glutation-reduktáz és glutation-s-transzferáz enzim aktivitásának mérése TMV-vel, illetve PVX-szel fertőzött dohány növényben spektrofotometriás módszerrel Enzimaktivitást 4 nappal a TMV, illetve PVX vírusfertőzés után, valamint kontroll-inokulált (mock) és egészséges növények levélszöveteiben mértünk. A 0,5 g frissen szedett levélszövetmintákat 3 ml, 1 mm EDTA-Na 2 -t és 2,5 w/v % oldható polivinilpirrolidont (PVP) tartalmazó, 50 Mm TRIS-HCl pufferben (ph = 7,8) homogenizáltuk, lehűtött mozsarakban eldörzsölve. A mintákat centrifugáltuk ( g, 20 perc, 4 o C), a mérésekhez a felülúszót használtuk Glutation-reduktáz aktivitásának mérése A glutation-reduktáz (GR) aktivitását a NADPH fogyását mérve határoztuk meg spektrofotométer segítségével (Shimadzu, UV-160A, Japán), 340 nm-en. A GR enzim 1:30 perces kinetikájának vizsgálata során az enzim által katalizált reakcióban az oxidált glutation (GSSG) redukálódik a NADPH oxidációja következtében (Klapheck et al., 1990). A kontrollmintákhoz nem adtunk oxidált glutationt, így az összes, nem csak a GR enzim által katalizált reakciókban végbemenő NADPH fogyás mérhető a növényi kivonatokban. Az enzimet tartalmazó minták 49

59 abszorbanciaértékéből kivontuk a kontrollmintáknál mért abszorbanciát, majd a kapott különbségből számoltuk ki az enzimaktivitást. Az enzimaktivitás mértékegysége µmol NADPH/ g friss növényi szövet/ perc. A vizsgálathoz három független kísérletet végeztünk. Kísérletenként a méréseket két technikai ismétléssel végeztük Glutation-S-transzferáz aktivitásának mérése A redukált glutation (GSH) konjugációs reakcióit a glutation-stranszferáz (GST) enzimek katalizálják. A vizsgálat során az enzim aktivitását a glutation-konjugációs reakció termékeinek képződésével határoztuk meg spektrofotmetriás módszer segítségével, 340 nm-en. Az enzim szubsztrátjaként 1-klór-2,4-dinitro-benzol (CDNB) szolgált. Mintánként egy reakció mérési ideje 1:30 perc volt. Kontrollként a vak mintához a növényi felülúszó helyett, az azzal azonos mennyiségű puffert mértük az oldatba. A növényi felülúszót tartalmazó oldat abszorbanciaértékéből kivontuk a vak minta abszorbanciáját, majd az így kapott különbségből számoltuk ki a GST enzim aktivitását. Az enzimaktivitás mértékegysége µmol konjugátum/ g friss növényi szövet/ perc (Mauch és Dudler, 1993). 50

60 4. EREDMÉNYEK 4.1. A szuperoxid hozzájárulása az Rx1 rezisztenciagén által burgonya X vírus (PVX) ellen biztosított tünetmentes (extrém) rezisztenciához, dohányban A burgonyában a burgonya X vírus (Potato virus X, PVX) elleni extrém ellenállóságot az Rx gének (Rx1 és Rx2) biztosítják. Ez az ellenálló képesség olyan hatásos, hogy a szokványos rezisztenciára jellemző HR típusú nekrotikus léziók sem jelennek meg a fertőzött rezisztens leveleken, vagyis a növény tünetmentes. Bendahmane et al. (1999) feltételezte, hogy a HR nekrotikus foltok azért nem jelennek meg az extrém rezisztencia esetében, mert az Rx gének hatására a kórokozó vírust a növény igen korán gátolja, emiatt korai tünetmentesség áll elő, azaz nincs idő a hiperszenzitív tünetek kialakítására. A vírusgátlás pontos mechanizmusa mindezidáig ismeretlen, azonban a PVX elleni extrém rezisztencia (ER) az Rx1 gént kifejező transzgenikus dohányban is hatásos és Bendahmane et al. (1999) szerint ennek egyik oka a reaktív oxigénfajták, elsősorban a szuperoxid (O.- 2 ) korai felhalmozódása lehet. Doktori munkám egyik fő célkitűzése volt annak tisztázása, hogy az Rx1 gént kifejező transzgenikus dohányban a PVX - fertőzésre kialakuló extrém rezisztenciában van-e tényleges szerepe a fertőzés utáni korai szuperoxid - felhalmozódásnak? 51

61 Az Rx1 rezisztenciagén működésének kimutatása transzgenikus dohányban A Nicotiana tabacum cv. Samsun NN Rx1 transzgenikus dohánynövények ( Rx ) a burgonya Rx1 rezisztenciagénjét saját promoter segítségével fejezik ki. Ezek a növények a burgonya X vírus (Potato virus X, PVX) fertőzéssel szemben extrém rezisztensek (Bendahmane et al., 1999), ellentétben az Rx1 gént nem tartalmazó kontrolldohánnyal (cv. Samsun NN, SNN ), melyben a PVX akadálytalanul replikálódik és szisztemizálódik, bár látható tüneteket (enyhe sárgulás, ill. mozaik) alig okoz. Ellenőriztük, hogy az általunk használt Rx1 transzgenikus dohányvonalban tényleg kifejeződik-e az Rx1 gén. A génexpressziót a fertőzés után különböző időpontokban mérve (kvantitatív RT-PCR) a várakozásoknak megfelelően a nem-transzgenikus (vadtípusú) növényekben nem kaptunk jelet, míg az Rx1 növényekben igen. Az Rx1 génexpresszió az egészséges Rx1 növényekben is megnyilvánult és érdekes módon mechanikai stressz (kontroll /mock/ inokulálás) hatására is, azonban ilyenkor a génexpresszió az idő függvényében kicsit lassabban emelkedett, mint a PVX-szel fertőzött növényekben, ahol az Rx1 expressziója már a vírusfertőzés után 6 órával jelentősen megnőtt (1. ábra). Ezek szerint az Rx1 rezisztenciagén különféle stresszhatásokra is indukálódhat, de a PVX fertőzésére reagál a leggyorsabban, ami az extrém rezisztencia kialakulásának első lépése. 52

62 1. ábra: Az Rx1 rezisztenciagén működésének kimutatása transzgenikus dohányban (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN Rx1) és az Rx1 gént nem tartalmazó kontrollnövényekben (N. tabacum cv. Samsun NN), kvantitatív RT-PCR-rel (relatív génexpresszió), a burgonya X vírus (Potato virus X, PVX) fertőzés, ill. kontrollinokuláció ( mock ) után különböző időpontokban (3, 6, 11 és 24 óra). 0 h: fertőzetlen növények. A génexpresszió normalizálásához egy dohány aktingén (NtAct) expresszióját használtuk Az Rx1 gén által meghatározott, PVX-szel szembeni extrém rezisztencia kimutatása dohányban Az általunk használt PVX - izolátum (Ny) az Rx1 gént kifejező burgonyában extrém rezisztenciát vált ki (Ahmadvand et al., 2012). Az Rx1 gént tartalmazó dohányt PVX-Ny-el fertőzve nem kaptunk szabad szemmel látható tüneteket sem az inokulált, sem a felső leveleken, ami az extrém rezisztencia kialakulására utal. A PVX felhalmozódását az extrém rezisztens (ER) és fogékony dohányokban a vírus köpenyfehérjegénjére tervezett specifikus indítószekvenciák (primerek) segítségével, RT-PCRrel követtük nyomon. A növényekről a fertőzés után különböző időpontokban szedett levélmintákban a PVX CP génjének (CP = vírus köpenyfehérje) expressziója az ER-t mutató növényekben a vírusfertőzés utáni 6. órától meredeken csökkent, míg a fogékony növényekben a vírusszint folyamatosan emelkedett (szemikvantitatív RT-PCR, 2. ábra). A PVX felhalmozódás különbségeinek pontosabb kimutatásához 53

63 kvantitatív RT-PCR-t használva kimutattuk, hogy az extrém rezisztens dohányokban a fertőzés utáni 5. napra a PVX szintje a fogékony növényekhez képest közel egy nagyságrenddel kisebb (3. ábra). 2. ábra: Burgonya X vírus (Potato virus X, PVX) felhalmozódása az Rx1 extrém rezisztenciagént kifejező dohányban (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN Rx1) és a fogékony kontrollnövényekben (N. tabacum cv. Samsun NN), a vírusfertőzés után különböző időpontokban (1, 3 és 6 óra, 1 és 2 nap), szemikvantitatív RT- PCR-rel mérve (PVX CP génexpresszió). Referenciaként egy dohány-aktingén (NtAct) expresszióját tekintettük. 0 hpi = egészséges, fertőzetlen növények. (hpi, ill. dpi: a fertőzéstől eltelt órák, illetve napok) 3. ábra: Burgonya X vírus (Potato virus X, PVX) felhalmozódása az Rx1 extrém rezisztenciagént kifejező dohányban (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN Rx1) és a fogékony kontrollnövényekben (N. tabacum cv. Samsun NN), a vírusfertőzés után különböző időpontokban (1, 3 és 6 óra, 1, 2 és 5 nap), kvantitatív RT-PCRrel mérve (PVX CP relatív génexpresszió). A génexpresszió normalizálásához egy dohány-aktingén (NtAct) expresszióját használtuk. 54

64 A szuperoxid korai felhalmozódásának mérése NBT - szövetfestéssel a PVX-szel szemben extrém rezisztens Rx1 dohányban A szuperoxid (O.- 2 ) felhalmozódásának kimutatásához az extrém rezisztens és fogékony dohányok PVX-szel fertőzött leveleit nitroblue - tetrazolium - kloriddal (NBT) festettük, a vírusfertőzés után 1, 2, 3, 6 és 48 órával (HPI). Eredményeink szerint a szuperoxid az extrém rezisztenciát mutató levelekben a PVX-fertőzés utáni korai időpontokban (elsősorban 1 és 2 óra múlva) halmozódik fel intenzívebben, a fogékony növényekhez képest (4. ábra). A szuperoxidszint különbségeinek pontosabb kimutatásához az NBT - festést számítógépes program (Image J) segítségével kvantifikáltuk. A mérések alapján egyértelműnek tűnik, hogy a vírusfertőzés után 48 órára a szuperoxid mennyisége az ER-t mutató Rx1 dohánylevelekben a fertőzetlen, ill. PVX-re fogékony növényekre jellemző szintre esik vissza (5. ábra). Érdekes, hogy az ER során a szuperoxid a fertőzés utáni első 6 órában halmozódik fel, és a PVX mennyisége csak ezt követően csökken jelentősen (3. és 5. ábra). Mindez arra enged következtetni, hogy az ER során a szuperoxid közvetlenül hozzájárulhat a fertőző vírus (PVX) gátlásához. 55

65 4. ábra: Szuperoxid (O 2.- ) felhalmozódása (amire a kék szín utal) az Rx1 extrém rezisztenciagént kifejező dohányban (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN Rx1) és a fogékony kontroll növényekben (N. tabacum cv. Samsun NN), burgonya X vírussal (Potato virus X, PVX) történő fertőzés után 1, 2, 3 és 6 órával (0 HPI = fertőzetlen növények). A szuperoxidot NBT (nitroblue - tetrazolium - klorid) festéssel detektáltuk. Az alsó ábrarész a PVX-szel szembeni extrém rezisztencia meglétét szemlélteti a vizsgált növényekben, hasonlóan a 2. ábrához. 56

66 5. ábra: Szuperoxid (O 2.- ) felhalmozódás mérése az Rx1 extrém rezisztenciagént kifejező dohányban (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN Rx1) és a fogékony kontrollnövényekben (N. tabacum cv. Samsun NN), a burgonya X vírussal (Potato virus X, PVX) történő fertőzés után 1, 2, 3, 6 és 48 órával (0 h = fertőzetlen növények). A szuperoxidot NBT (nitroblue tetrazolium klorid) festéssel detektáltuk, az NBT szövetfestés kvantifikálása Image J számítógépes program segítségével történt Az NBT - szövetfestés dohányban specifikus a szuperoxidra A vírusfertőzés után 1 és 2 órával (HPI) az Rx1 dohányban tapasztalt intenzív NBT festődés jelentős mértékben csökkent, ha a leveleket az NBT mellett szuperoxid-dizmutázzal (SOD, 3000 U/ml) és katalázzal (CAT, 5000 U/ml) is infiltráltuk (6. ábra). A SOD a szuperoxidot hidrogén-peroxiddá (H 2 O 2 ) alakítja, míg a CAT a H 2 O 2 -t bontja le. Igazoltuk tehát, hogy PVX fertőzés során az általunk használt dohányokban az NBT szövetfestés valóban specifikus a szuperoxidra. 57

67 6. ábra: Az NBT (nitroblue - tetrazolium - klorid) szövetfestés a burgonya X vírusra (Potato virus X, PVX) extrém rezisztens dohányban (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN Rx1) specifikus a szuperoxidra (O 2.- ). A baloldali leveleket a PVX-szel történő fertőzés után 1, ill. 2 órával (HPI) a szuperoxid - felhalmozódás kimutatására NBT-vel infiltráltuk, míg a jobboldali leveleket ugyanezekben az időpontokban NBT-vel, valamint szuperoxid-dizmutázzal (SOD, 3000 U/ml) és katalázzal (CAT, 5000 U/ml) infiltráltuk Antioxidáns enzimek (SOD és CAT) infiltrálásának hatása a PVXszel szembeni extrém rezisztenciára Rx1 dohányban Ha az Rx1 gént kifejező dohányban a PVX fertőzésénél tapasztalt korai szuperoxid (O.- 2 ) felhalmozódás ténylegesen hozzájárul az extrém.- rezisztenciához, akkor a O 2 szint csökkentése antioxidánssal való kezelésekkel megtörheti a rezisztenciát (azaz a rezisztens Rx1 dohányban legalább részleges fogékonyság alakul ki a PVX fertőzésével szemben). A hipotézis bizonyításához Rx1 és fogékony kontrolldohánynövények PVX-szel fertőzött leveleinek egyik felét a vírusfertőzés után közvetlenül szuperoxid-dizmutázzal (SOD, 3000 U/ml) és katalázzal (CAT, 5000 U/ml) infiltráltuk (a másik levélfelet 58

68 pufferrel infiltráltuk). Az Rx1 dohányok extrém rezisztensnek bizonyultak a PVX-re, de a vírusfertőzés utáni 7. napra a levelek közel felében az antioxidáns enzimekkel infiltrált levélfélben (SC) szabad szemmel látható, hiperszenzitív lokális nekrózisra (HR) emlékeztető tünetek alakultak ki és ezzel együtt a PVX mennyisége is jelentősen megnőtt a hasonló, de tünetmentes levélfélhez képest (7. ábra). Feltételezhető, hogy az extrém vírusrezisztencia lassítása ilyenkor HR típusú rezisztenciát eredményez, amely már nem képes olyan hatékonyan visszaszorítani a kórokozó vírus replikációját (ld. Bendahmane et al., 1999). A HR-tünetekkel járó szöveti nekrózis megjelenésével jól korrelált az NtPR-1a gén expressziója, ez a PVX fertőzés után már 2 nappal észlelhető enyhébb HR-szerű tüneteket mutató levélfelekben is egyértelmű volt (8. ábra). Egyes PR gének, ill. fehérjék (pl. PR-1a) ugyanis vírusfertőzések során a rezisztenciával járó szöveti stressz (HRnekrózis) markerei, bár a rezisztenciában nincs tényleges szerepük (Cutt et al., 1989; Linthorst et al., 1989). 59

69 7. ábra: Antioxidáns enzimek hatása a burgonya X vírussal (Potato virus X, PVX) szembeni extrém rezisztenciára dohányban (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN Rx1), a PVX fertőzés után 2 és 7 nappal (DPI). SC = az inokulált levelek bal felének infiltrálása szuperoxid-dizmutázzal (SOD, 3000 U/ml) és katalázzal (CAT, 5000 U/ml); puffer = az inokulált levelek jobb felének infiltrálása 10 mm kálium-foszfáttal (ph=7,8). A grafikonokon az SC és puffer jelzésű oszlopok a PVX felhalmozódását reprezentálják egy adott inokulált levél bal, ill. jobb felében. A baloldali grafikon utolsó négy oszlopa van kinagyítva jobbra fent. HR = hiperszenzitív lokális nekrózisra (HR) emlékeztető tünetek az inokulált levelek bal felében. Rx és SNN: extrém rezisztens és fogékony kontroll dohányvonalak. A PVX felhalmozódását (PVX CP relatív génexpresszió) kvantitatív RT-PCR-rel követtük. A génexpresszió normalizálásához egy dohány-aktingén (NtAct) expresszióját használtuk. 60

70 8. ábra: Antioxidáns enzimek hatása a burgonya X vírussal (Potato virus X, PVX) szembeni extrém rezisztenciára (ER) dohányban (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN Rx1), a fertőzés után 2 és 7 nappal (DPI): az ER csökkenése korrelál a HR megjelenésével és az NtPR-1a gén fokozott kifejeződésével (kvantitatív RT- PCR, relatív génexpresszió, a normalizálásához egy dohány aktin gén (NtAct) expresszióját használtuk). SC= az inokulált levelek bal felének infiltrálása szuperoxid-dizmutázzal (SOD, 3000 U/ml) és katalázzal (CAT, 5000 U/ml); puffer = az inokulált levelek jobb felének infiltrálása 10 mm kálium-foszfáttal (ph=7,8). A grafikonokon az SC és puffer jelzésű oszlopok az NtPR-1a gén kifejeződését reprezentálják egy adott inokulált levél bal, ill. jobb felében. HR = hiperszenzitív lokális nekrózisra (HR) emlékeztető tünetek. Rx és SNN: extrém rezisztens és fogékony kontroll dohányvonalak A ROS - képződés gátlásának hatása a PVX-szel szembeni extrém rezisztenciára Rx1 dohányban Amennyiben dohányban PVX - fertőzésnél a korai ROS (szuperoxid) - felhalmozódás ténylegesen hozzájárul az extrém (Rx1) rezisztenciához, akkor a ROS képződés gátlása megtörheti a rezisztenciát. Egy lucernaferritint túltermelő dohányvonalban az egyik leginkább reakcióképes ROS, a hidroxilgyök (OH. ) termelése visszaszorul (a ferritin megköti a ROS - képződéshez szükséges vasat, ld. Deák et al., 1999). Az Rx1 gént kifejező dohányvonalat a ferritint túltermelő növényekkel keresztezve feltételezhető, hogy az F 1 utódokban csökken a 61

71 ROS képződés és így az extrém (Rx1) rezisztencia helyett legalább részleges fogékonyság alakulhat ki a PVX fertőzésével szemben. Az Rx1 dohányokat két ferritin túltermelő dohánnyal (cv. SR1) kereszteztük: a C8 vonalban a lucerna ferritinfehérje szignálpeptid nélküli, rövidebb formája termelődik, míg az F9 vonal a teljes fehérjét fejezi ki (Deák et al., 1999). A keresztezéseknél először az Rx1 dohány volt az anya és a C8, ill. F9 vonal az apa (Nt cv. Samsun NN Rx1 X Nt cv. SR1 C8, ill. Nt cv. Samsun NN Rx1 X Nt cv. SR1 F9 ). A keresztezésekből kapott F 1 utódnövényekben a transzgének (Rx1, ill. a C8 és F9 lucerna-ferritingén) működését RT-PCR-rel ellenőriztük. A PVX felhalmozódását mérve megállapítható, hogy az F 1 utódnövényekben az extrém rezisztencia részlegesen megtört, azaz az inokulált levelekben a vírusszint jelentősen nagyobb volt az Rx1 dohányokhoz képest, de csak a fertőzés utáni első 2 napban (9. ábra). Érdekes, hogy az F 1 növények nagy részében a PVX inokuláció után 5 nappal a fertőzött leveleken szabad szemmel látható, hiperszenzitív lokális nekrotikus léziók (HR) alakultak ki (10. ábra). Feltételezhető, hogy a ROS képződésének gátlásával az extrém vírusrezisztencia sérül (lassul), és ez eredményezi a HR típusú rezisztenciát, amely kevésbé képes visszaszorítani a PVX replikációját (ld. Bendahmane et al., 1999). A reciprok-keresztezéseket elvégezve (Nt cv. Samsun NN Rx1 X Nt cv. SR1 C8, ill. Nt cv. Samsun NN Rx1 X Nt cv. SR1 F9 ) hasonló eredményeket kaptunk: az Rx1 és a ferritint túltermelő dohányok keresztezéséből kapott F 1 növényekben az extrém rezisztencia (ER) részlegesen megtört, de csak a fertőzés utáni első 2 napban (11. ábra), viszont HR-típusú nekrotikus léziók az inokulált leveleken csak elvétve 62

72 fordultak elő. A kísérletekben kontrollként az SR1 dohányt is kereszteztük az Rx1 növényekkel. Az így kapott F 1 egyedekben az ER alig csökkent, a ferritin-túltermelő F 1 növényekhez képest. Ezek szerint a ROS-képződés ferritint túltermelésből adódó csökkenése specifikusan képes az extrém rezisztenciát mérsékelni. Erre utal az is, hogy a ferritint túltermelő dohányvonalak (cv. SR1; C8 és F9) sokkal fogékonyabbak PVX-re, mint a két vadtípus (cv. SR1 és cv. Samsun NN) (11. ábra). 63

73 (A) (B) 9. ábra: A burgonya X vírussal (Potato virus X, PVX) szembeni extrém rezisztencia (ER) részleges megtörése ER-t mutató dohány (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN Rx1) és két fogékony, ferritint túltermelő dohányvonal (N. tabacum cv. SR1; C8 és F9) keresztezéséből kapott F 1 utódnövényekben, a PVX fertőzés utáni első 5 napon. A keresztezésekben az Rx1 dohány volt az anya ( ). Az inokulált levelekben a PVX felhalmozódását (PVX CP relatív génexpresszió) kvantitatív RT-PCR-rel követtük (a normalizálásához egy dohány-aktingén (NtAct) expresszióját használtuk) (A): Rx1 dohány keresztezése a C8 vonallal; (B): Rx1 dohány keresztezése az F9 vonallal. 64

74 10. ábra: A burgonya X vírussal (Potato virus X, PVX) szembeni extrém rezisztencia (ER) részleges megtörése ER-t mutató dohány (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN Rx1) és két fogékony, ferritint túltermelő dohányvonal (N. tabacum cv. SR1; C8 és F9) keresztezéséből kapott F 1 utódnövényekben. A keresztezésekben az Rx1 dohány volt az anya ( ). Az F 1 növények nagy részében a PVX fertőzés után 5 nappal az inokulált levelekben szabad szemmel látható, hiperszenzitív lokális nekrózis (HR) alakult ki (nyíllal jelölve). (A): Rx1 dohány keresztezése a C8 vonallal; (B): Rx1 dohány keresztezése az F9 vonallal. 65

75 11. ábra: A burgonya X vírussal (Potato virus X, PVX) szembeni extrém rezisztencia (ER) részleges megtörése ER-t mutató dohány (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN Rx1) és két fogékony, ferritin túltermelő dohány vonal (N. tabacum cv. SR1; C8 és F9) keresztezéséből kapott F 1 utódnövényekben, a PVX - fertőzés utáni első 3 napon. Kontrollként az SR1 dohányt is kereszteztük az Rx1 növényekkel. A keresztezésekben az Rx1 dohány volt az apa ( ). SNN: fogékony kontrolldohányvonal. Az inokulált levelekben a PVX felhalmozódását (PVX CP relatív génexpresszió) kvantitatív RT-PCR-rel követtük (a normalizálásához egy dohány aktin gén (NtAct) expresszióját használtuk) PVX - rezisztencia kialakítása fogékony dohányban (cv. Samsun NN) szuperoxidot (ROS) képző ágens infiltrálásával Ha az Rx1 gént kifejező PVX - rezisztens dohányban (cv. Samsun NN Rx1) a szuperoxid korai (ROS) felhalmozódása ténylegesen hozzájárul az extrém rezisztenciához, akkor fogékony dohányban (cv. Samsun NN) az in planta szuperoxidszint növelése mérsékelheti a fogékonyságot (azaz a fogékony NN dohányban legalább részleges rezisztencia alakul ki a PVX fertőzésével szemben). A hipotézis bizonyításához PVX - fertőzésre fogékony dohány (cv. Samsun NN) vírusfertőzött leveleinek egyik felét a vírusfertőzés után 2 órával szuperoxidot (O.- 2 ) képző ágenssel (66 µm riboflavin, 10 mm L-metionin) infiltráltuk (a másik levélfelet pufferrel infiltráltuk). Az így kezelt cv. Samsun NN dohány fogékony volt a PVXre, de az inokulált levelek riboflavin-metionin eleggyel infiltrált felében 66

76 (a vírusfertőzés után 3 és 7 nappal) a vírusszint jelentősen kisebb volt a pufferrel infiltrált levélfélhez képest (12. ábra). A vírusfertőzés utáni 5. napra a riboflavin-metionin eleggyel infiltrált levélfelek nagy részében szabad szemmel látható, erősebb vagy gyengébb, hiperszenzitív lokális nekrózisra (HR) emlékeztető tünetek alakultak ki (13. ábra). A PVX-re fogékony dohányban az in planta szuperoxid (ROS) - szint mesterséges növelése feltételezhetően nem képes extrém rezisztenciát előidézni, de a lassabb, HR típusú rezisztenciát igen, amely részben képes visszaszorítani a PVX replikációját (ld. Bendahmane et al., 1999). 12. ábra: A burgonya X vírussal (Potato virus X, PVX) szembeni rezisztencia kialakítása fogékony dohányban (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN), szuperoxidot (O 2.- ) képző ágens (66 µm riboflavin, 10 mm L-metionin) infiltrálásával az inokulált levelek egyik felébe (riboflavin), a PVX fertőzés utáni első 7 napon. A PVX felhalmozódását (PVX CP relatív génexpresszió) az inokulált levelekben kvantitatív RT-PCR-rel követtük (a normalizálásához egy dohány-aktingén (NtAct) expresszióját használtuk). 67

77 13. ábra: A burgonya X vírussal (Potato virus X, PVX) szembeni rezisztencia kialakítása fogékony dohányban (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN), szuperoxidot (O 2.- ) képző ágens (66 µm riboflavin, 10 mm L-metionin) infiltrálásával az inokulált levelek egyik felébe (RF). A növények nagy részében a riboflavinnal infiltrált levélfélben a PVX fertőzés után 5 nappal szabad szemmel látható, erősebb vagy gyengébb, hiperszenzitív lokális nekrózisra (HR) emlékeztető tünetek alakultak ki. mock = kontroll inokulált levelek A PVX-szel szembeni tünetmentes, extrém rezisztencia és a TMV által kiváltott, lokális nekrózissal (HR) járó ellenálló képesség összehasonlítása dohányban - védekezéssel kapcsolatos gének és antioxidánsok aktivitása A Nicotiana tabacum cv. Samsun NN Rx1 dohányban a Burgonya X vírus (Potato virus X, PVX) fertőzésekor az Rx1 rezisztenciagén által meghatározott ún. extrém rezisztencia (ER) tünetmentes, míg az N rezisztenciagén által meghatározott, dohány mozaik vírussal (Tobacco mosaic virus, TMV) szembeni ellenálló képességet lokális sejt- és szövetelhalás (hiperszenzitív reakció, HR) kíséri (ld. Bendahmane et al., 1999) (14. ábra). 68

78 14. ábra: Tünetmentes (extrém) és hiperszenzitív (HR) vírusrezisztencia dohányban (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN Rx1). Baloldali kép: Az Rx1 rezisztenciagén által meghatározott extrém rezisztencia (ER) burgonya X vírus (Potato virus X, PVX) fertőzésekor. Jobboldali kép: Az N rezisztenciagén által irányított HR dohány mozaik vírus (Tobacco mosaic virus, TMV) fertőzés esetén. A felvételek 2 nappal a vírusfertőzés után készültek. A tünetmentes ER során a vírusgátlás tényleges folyamata nagyrészt tisztázatlan, bár a fent ismertetett eredményeink szerint a reaktív oxigénfajták (ROS), elsősorban a szuperoxid (O.- 2 ), hozzájárulhatnak ehhez a folyamathoz. Kíváncsiak voltunk azonban arra is, hogyan változik egyes védekezési (részben ún. patogenezissel kapcsolatos, PR) gének expressziója, valamint egyes nem enzimatikus és enzimatikus antioxidánsok mennyisége, ill. aktivitása e két vírusrezisztencia mechanizmus (tünetmentes ER és lokális nekrózissal járó HR) során? A további kísérletek előtt a PVX-szel szembeni tünetmentes (ER) és a TMV-vel szembeni HR típusú virus rezisztenciát a PVX, ill. TMV felhalmozódását ugyanabban a dohánygenotípusban összehasonlítva látszik, hogy az ER már a vírusfertőzés utáni 6. órától kialakul (a PVX gátolva van), míg a HR során a vírusszint a nekrotikus léziók megjelenésével (2 nap) még emelkedik (15. ábra). Ezek szerint már a 69

79 fertőzés utáni első 2 napban a HR során kb. egy nagyságrenddel több vírus (TMV) van jelen a gazdanövényben, mint a tünetmentes ER-nél, ahol a vírus (PVX) szinte teljesen visszaszorul. 15. ábra: Burgonya X vírus (Potato virus X, PVX) és dohány mozaik vírus (Tobacco mosaic virus, TMV) felhalmozódása az Rx1 extrém rezisztenciagént kifejező, PVX-re és TMV-re rezisztens dohányban (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN Rx1), a vírusfertőzés után különböző időpontokban (1, 3 és 6 óra, 1 és 2 nap), kvantitatív RT-PCR-rel mérve (PVX CP és TMV CP relatív génexpresszió). A génkifejeződés normalizálásához egy dohány-aktingén (NtAct) expresszióját használtuk Védekezéssel kapcsolatos gének expressziója a tünetmentes ER és a HR során A PVX-szel szembeni tünetmentes (ER) és a TMV-vel szembeni HR típusú rezisztenciánál először két, ún. patogenezissel kapcsolatos (PR) gén (NtPR-1a és NtPRB-1b), valamint egy szintén PR génnek tekinthető, stresszre jól indukálódó gén (glutation-s-transzferáz, NtGSTphi1) expresszióját vizsgáltuk. ER esetén a PVX - fertőzés után 1 és 3 órával az NtPR-1a expressziója kissé nőtt, majd a 6. órától fokozatosan csökkent. A TMV fertőzése által kiváltott HR-nél viszont az NtPR-1a expresszió a 70

80 fertőzés után 1 órától az 1. napig fokozatosan emelkedett, majd a 2. és 5. napra (amikor a HR-léziók kifejlődnek) már kb. tízszeresére nőtt. (16. ábra). Az NtPRB-1b gén expressziója mindkét rezisztenciatípusnál kezdetben nőtt, és a fertőzést követő 2. napon tetőzött. Az 5. napra viszont az ER-t mutató (PVX - fertőzött) növényekben az eleve alacsony NtPRB-1b mrns szint teljesen visszaszorult. Ebben az időpontban a TMV - fertőzött növényekben (HR) is megfigyeltünk jelentősebb visszaesést, de a NtPRB-1b expresszió még így is igen magas szinten maradt (16. ábra). PVX - fertőzött, ER-t mutató növényekben az NtGSTphi1 expressziója rendkívül alacsony szintű volt és a fertőzés során 5 napig alig növekedett. TMV fertőzött, HR-t mutató növényekben ugyanakkor a fertőzés után 2 és 5 nappal az NtGSTphi1 kifejeződése többszörösére nőtt, a NtPRB-1b-hez hasonló expressziós trendet követve (16. ábra). 71

81 16. ábra: Három védekezési (stressz) gén (NtPR-1a, NtPRB-1b és NtGSTphi1) kifejeződése burgonya X vírussal (Potato virus X, PVX) és dohány mozaik vírussal (Tobacco mosaic virus, TMV) fertőzött, PVX-re és TMV-re rezisztens dohányban (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN Rx1) a vírusfertőzés után különböző időpontokban (1, 3 és 6 óra, 1, 2 és 5 nap), kvantitatív RT-PCR-rel mérve (relatív génexpresszió). A génkifejeződés normalizálásához egy dohány-aktingén (NtAct) expresszióját használtuk, a kapott eredményeket a kontroll inokulált ( mock ) minták értékeihez is normalizáltuk. 72

82 A PVX-szel szembeni tünetmentes (ER) és a TMV-vel szembeni HR típusú rezisztenciánál figyelemmel kísértük három további olyan dohánygén aktivitását is, amelyek a sejthalál gátlásban (BAX inhibitor-1, NtBI-1), ill. a ROS - felhalmozódás szabályozásában (alternatív-oxidáz, NtAOX1-2 és kataláz, NtCat1) játszanak szerepet. Az NtBI-1 gén expressziója a HR-nél (TMV - fertőzés) eleve jóval nagyobb mértékű volt, és folyamatosan emelkedett, a fertőzés utáni 2. naptól az NtBI-1 mrns szintje a kezdeti érték többszörösére nőtt, összhangban a HRtípusú nekrotikus léziók kialakulásával. Tünetmentes ER-nél (PVX - fertőzés) viszont a fertőzés utáni 6. órától az eleve kismértékű NtBI-1 expresszió stagnált, majd erősen visszaszorult (17. ábra). Az NtAOX1-2 expressziója mindkét rezisztenciatípusnál (ER és HR) a fertőzést követő 3. órában visszaesett. A 6. órától a tünetmentes ER-nél (PVX fertőzés) az NtAOX1-2 génexpresszió lényegében stagnált, majd csökkent, míg HRnél (TMV fertőzés) az NtAOX1-2 mrns szintje kb. a kétszeresére emelkedett, még jóval a HR-léziók megjelenése előtt (6 HPI) (17. ábra). A hidrogén-peroxidot lebontó, katalázt kódoló NtCat1 expressziója ERnél a PVX fertőzés után 3 órával kb. a kétszeresére nőtt, de innentől kezdve a génexpresszió stagnált, majd csökkent. HR során, a BAX inhibitorhoz és az alternatív-oxidázhoz hasonlóan, az NtCat1-nál is megfigyelhető volt a fertőzés után 3 órával a génexpresszió átmeneti visszaesése, de ezután az NtCat1 expressziója kb. a kétszeresére nőtt, még a HR-léziók megjelenése előtt (1 DPI) (17. ábra). 73

83 17. ábra: Sejthalál gátló (NtBI-1=BAX inhibitor-1), ill. ROS felhalmozódást szabályozó gének (NtAOX1-2 =alternatív-oxidáz és a NtCat1=kataláz) kifejeződése burgonya X vírussal (Potato virus X, PVX) és dohány mozaik vírussal (Tobacco mosaic virus, TMV) fertőzött, PVX-re és TMV-re rezisztens dohányban (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN Rx1) a vírusfertőzés után különböző időpontokban (1, 3 és 6 óra, 1, 2 és 5 nap), kvantitatív RT-PCR-rel mérve (relatív génexpresszió). A génkifejeződés normalizálásához egy dohányaktingén (NtAct) expresszióját használtuk, a kapott eredményeket a kontroll inokulált ( mock ) minták értékeihez is normalizáltuk. 74

84 Összességében a vizsgált védekezési (PR) gének expressziója a tünetmentes ER (PVX fertőzés) esetén csak feleakkora mértékben vagy a PR gének, az NtBI-1 és NtGSTphi1 esetén kb. egy nagyságrenddel kisebb mértékben indukálódott, mint a lokális nekrotikus léziókkal járó HR-nél (TMV fertőzés). Ennek oka feltehetően az, hogy az ER rendkívül gyors lefolyású, már a vírusfertőzés után 6 órával kialakul (ld. 2., 3. és 15. ábra), ezért hosszabb távon nincs szükség a védekezési gének fokozott expressziójára Glutation felhalmozódásának meghatározása a tünetmentes ER és a HR során A glutation egy olyan nem enzimatikus antioxidáns, amely nemcsak a ROS semlegesítésében, de a betegségrezisztencia jelátvitelében is fontos szerepet játszik. A vírusfertőzés után 4 nappal az össz-glutation szintje (redukált és oxidált glutation) a HR (TMV - fertőzés) esetében megemelkedett, míg a tünetmentes ER (PVX fertőzés) során nem változott szignifikánsan az egészséges, fertőzetlen növényekben mért szinthez képest. A redukált és oxidált glutation aránya HR esetében volt a legnagyobb, tehát a glutation redukált formájának mennyisége is jelentősen megemelkedett a TMV-vel fertőzött, HR-típusú rezisztenciát mutató dohányban, ami feltehetően a nekrotikus (HR) léziók megjelenésével van összefüggésben (18. ábra). 75

85 18. ábra: Glutation felhalmozódása és az oxidált és redukált glutation aránya burgonya X vírussal (Potato virus X, PVX) és dohány mozaik vírussal (Tobacco mosaic virus, TMV) fertőzött, PVX-re és TMV-re rezisztens dohányban (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN Rx1) a vírusfertőzés után 4 nappal. mock = kontroll inokulált növények Glutation-reduktáz és glutation-s-transzferáz enzimek aktivitása a tünetmentes ER és a HR során A PVX-szel (ER) és TMV-vel (HR) fertőzött dohányokban két, a glutation működésében szerepet játszó antioxidáns hatású enzim, a glutation reduktáz (GR) és a glutation-s-transzferáz (GST) aktivitását mértük. A GR az aszkorbát-glutation-ciklusban az oxidált glutationt regenerálja (redukálja), míg a GST egy méregtelenítő funkciójú enzim: a redukált glutationt konjugálja a növény számára toxikus vegyületekkel, de néhány GST izoenzim glutation-peroxidázként is működik (antioxidáns funkció). A vírusfertőzés után 4 nappal a GR és GST aktivitása a fertőzetlen növényekhez képest HR (TMV - fertőzés) esetében többszörösére nőtt (feltételezhetően a HR léziók megjelenésével 76

86 összefüggésben), míg a tünetmentes ER (PVX fertőzés) során nem változott szignifikánsan (19. ábra). Összességében az általunk vizsgált, növényi védekezésben (betegségrezisztenciában) szerepet játszó antioxidánsok (glutation, GR, GST) fokozott aktivitása a TMV rezisztenciára jellemző nekrotikus (HR) léziók kialakulásához köthető. A PVX - fertőzés után 4 nappal a tünetmentes ER során a glutation szintje, ill. a GR és GST aktivitása nem változott, feltehetően azért, mert az ER rendkívül gyors lefolyású, már a vírusfertőzés után 6 órával kialakul (ld. 2., 3. és 15. ábra). 77

87 19. ábra: Glutation-reduktáz (GR) és glutation-s-transzferáz (GST) enzimaktivitás burgonya X vírussal (Potato virus X, PVX) és dohány mozaik vírussal (Tobacco mosaic virus, TMV) fertőzött, PVX-re és TMV-re rezisztens dohányban (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN Rx1) a vírusfertőzés után 4 nappal. mock = kontroll inokulált növények. 78

88 4.3. A paprika lisztharmattal szembeni, oltással átvihető tünetmentes rezisztenciája cseresznyepaprikában élettani háttér, a szuperoxid felhalmozódás szerepe Különös figyelmet fordítottunk a Szentesi cseresznyepaprikára (Capsicum annuum var. cerasiforme cv. Szentesi), mert előzetes megfigyeléseink alapján üvegházi illetve fóliasátoros termesztés során ellenállónak mutatkozott a paprikalisztharmat (Leveillula taurica) fertőzésével szemben. Az étkezési paprikák hajtató felület alatt (üvegházban, illetve fóliasátorban) történő termesztés során viszont igen fogékonyak erre a kórokozóra (Glits és Folk, 2000). A Totál étkezési paprikafajta hajtató felület alatt minden esetben fogékonynak bizonyult mutatott a paprikalisztharmattal szemben. Paprikatermesztés során a kertészeti oltás alkalmazásának egyik eredeti célja, hogy az alanyhatás segítségével javuljon a növények kalciumfelvétele (lásd: Lantos, 2011). Előzetes provokációs kísérleteinkben hajtató felület alatt történő termesztési körülmények között azt tapasztaltuk, hogy a lisztharmatra fogékony Totál étkezési paprika rezisztenssé válik, ha az ellenálló cv. Szentesi cseresznyepaprika alanyra oltjuk (20. és 21. ábra). 79

89 20. ábra: Capsicum annuum var. cerasiforme cv. Szentesi cseresznyepaprika-alanyra oltott Capsicum annuum cv. Totál, étkezési paprika (nemes). A piros vonal az oltási pontot mutatja. 21. ábra: Lisztharmatos (Leveillula taurica) fertőzésnek kitett, Szentesi cseresznyepaprikára oltott Totál étkezési paprika (Szentesi+Totál) gyakorlatban való használata Szentesen a Duna-R Kft telepén. Baloldali és középső kép: Szentesi+Totál oltott növények; jobboldali kép: saját gyökerű Totál növények. Doktori munkám egyik fő célkitűzése volt annak tisztázása, hogy a cseresznyepaprika oltással átvihető lisztharmat - rezisztenciájában milyen 80

90 szerepe van a szuperoxid felhalmozódásának, ill. az ehhez kapcsolódó védekezési folyamatoknak? A cseresznyepaprika oltással átvihető lisztharmat - rezisztenciája együtt jár-e a kórokozó gátlásával? Kíváncsiak voltunk arra, hogy a cseresznyepaprika oltással átvihető lisztharmat - rezisztenciája kontrollált, laboratóriumi körülmények között is hatásos-e, ill. a rezisztencia együtt jár-e a kórokozó tényleges gátlásával? A fent említett paprikanövényeket (saját gyökerű cv. Totál és cv. Szentesi, Szentesi alanyra oltott Totál ) egy fóliasátorból izolált paprikalisztharmattal (L. taurica) inokuláltuk. A fertőzött növényeket növénynevelő kamrában tartottuk. A lisztharmatos inokuláció után 45 nappal a saját gyökerű Totál növények egységesen a tipikus betegségtüneteket mutatták: a levél színén klorotikus foltok (kb. 1-2 cm átmérő), a fonákon a klorotikus foltokkal átellenben lisztharmat telepek alakultak ki. A Szentesi paprikanövények nem mutattak szabad szemmel látható tüneteket, míg a Szentesi alanyra oltott Totál növényeknél (Szentesi+Totál) az alsó, idősebb levelek felületének legfeljebb 30 %-án jelent meg enyhe lisztharmat, ill. klorózis (22A. ábra). Ezekben az oltott növényekben (Szentesi+Totál) a bogyótermés mennyisége (darabszám és méret) valamint külleme ugyanolyan volt, mint a saját gyökerű Totál egyedekben. A növényi betegség - ellenállóság akkor tekinthető valódi rezisztenciának, ha nemcsak a betegségtünetek (pl. lisztharmatbevonat, klorózis) szorulnak vissza, hanem a kórokozó felhalmozódása is ténylegesen gátlódik. A paprikalisztharmat (L. taurica) felhalmozódását a 81

91 fent említett növényekben kvantitatív PCR-rel követtük nyomon. A fertőzés előrehaladott fázisában (45 nappal az inokuláció után) a L. taurica genomi DNS - szintje szignifikánsan alacsonyabb volt a lisztharmatos tüneteknek ellenálló paprikákban (saját gyökerű Szentesi és oltott Szentesi+Totál), mint a fogékony, saját gyökerű Totál egyedekben (22B. ábra). 22. ábra: A Szentesi cseresznyepaprika (Capsicum. annuum var. cerasiforme cv. Szentesi) lisztharmattal (Leveillula taurica) szembeni rezisztenciája oltással átvihető: a Szentesi cseresznyepaprikára oltott, eredetileg fogékony Totál étkezési paprikában (Szentesi+Totál) lisztharmat -rezisztencia indukálódik. (A) Lisztharmatos fertőzés tipikus tünetei paprikaleveleken 45 nappal az inokuláció után. Felső képek: klorotikus foltok a levél színén; alsó képek: a klorotikus foltokkal átellenben lisztharmattelepek a levél fonákján. Baloldali, középső és jobboldali képek: lisztharmatra fogékony (saját gyökerű cv. Totál) és rezisztens (saját gyökerű cv. Szentesi és oltott Szentesi+Totál) paprika levelei. (B) A paprikalisztharmat (L. taurica) felhalmozódását kvantitatív PCR-rel követtük nyomon 45 nappal az inokuláció után (relatív genomi DNS - szint). A normalizáláshoz egy paprika - aktingént (CaAct) használtunk. 82

92 A szuperoxid - felhalmozódás és a NADPH-oxidáz aktivitásának szerepe a Szentesi cseresznyepaprika oltással átvihető lisztharmat - rezisztenciájában Mivel a reaktív oxigénfajták (ROS) felhalmozódása sok esetben együtt jár a betegségrezisztenciával, kíváncsiak voltunk arra, van-e összefüggés a paprika tünetmentes lisztharmat - rezisztenciája és egy ROS, a szuperoxid (O.- 2 ) jelenléte között? Eredményeink szerint a Szentesi cseresznyepaprika és Totál étkezési paprikafajta lisztharmattal szembeni rezisztenciája, ill. fogékonysága jól korrelált a nitroblue - tetrazolium - kloridos (NBT) festéssel kimutatható szuperoxid felhalmozódással, ill. annak hiányával. Kísérleteink igazolták, hogy a kertészeti oltással átvitt ismeretlen jel hatására is szuperoxid halmozódik fel a lisztharmatrezisztens Szentesi alanyra oltott fogékony Totál oltórészben, amely ellenállóvá válik (22. és 23. ábra). A fertőzetlen Szentesi cseresznyepaprika leveleiben NBT - festéssel kimutatható intenzív szuperoxid - akkumuláció a lisztharmatos fertőzés következtében tovább fokozódott. Ezzel szemben a fogékony növény (étkezési paprika, cv. Totál) leveleiben igen enyhe szuperoxid - felhalmozódást mértünk, de a rezisztens Szentesi alanyra való oltás után fertőzés hiányában is a fertőzés után meg különösen intenzív volt ennek a reaktív oxigénfajtának a jelenléte, ezzel párhuzamosan pedig a rezisztencia is megnyilvánult (22. és 23. ábra). A patogenezissel összefüggő szuperoxid termelés növényekben elsősorban a NADPH-oxidáz enzim működéséhez köthető (Pogány et al., 2009; Marino et al., 2012). Kíváncsiak voltunk arra, hogy paprikában a NADPH-oxidáz aktivitás korrelációban van-e az NBT - festéssel 83

93 kimutatható szuperoxid mennyiségével és a lisztharmat rezisztenciával? Eredményeink szerint a lisztharmatra rezisztens Szentesi cseresznyepaprikára oltott Totál étkezési paprikában a lisztharmatellenállóság megjelenése együtt jár nemcsak a szuperoxid felhalmozódásával, de a NADPH oxidáz aktivitásának jelentős mértékű fokozódásával is. Fertőzetlen növényekben a Szentesi cseresznyepaprika NADPH-oxidázának aktivitása szignifikánsan nagyobb volt, mint a Totál étkezési paprika enzimaktivitása. A Szentesi cseresznyepaprikára oltott Totál étkezési paprikák NADPHoxidáz aktivitása megegyezett a saját gyökerű Szentesi cseresznyepaprikáéval, ami jól korrelál a NBT - szövetfestés eredményeivel. A lisztharmatos inokuláció után 45 nappal a NADPHoxidáz aktivitásértékei összességében emelkedtek, de a rezisztens növényekre jellemző lényegesen magasabb aktivitás megmaradt (22. és 23. ábra). 84

94 NADPH oxidáz aktivitása (fertőzetlen) NADPH oxidáz aktivitása (lisztharmattal fertőzött) 23. ábra: A Szentesi cseresznyepaprika (Capsicum. annuum var. cerasiforme cv. Szentesi) lisztharmattal (Leveillula taurica) szembeni, oltással átvihető rezisztenciájának markere a szuperoxid (O 2.- )-felhalmozódás és a fokozott NADPH-oxidáz enzimaktivitás, a fertőzetlen (A) és lisztharmattal fertőzött (B) növényekben egyaránt (45 nappal az inokuláció után). Felső képek: szuperoxid-felhalmozódás kimutatása fertőzetlen és lisztharmattal fertőzött paprika levelekben, nitroblue-tetrazolium-klorid (NBT) festéssel detektálva. Az NBT- 85

95 szövetfestés kvantifikálása Image J számítógépes program segítségével történt (NBT festés a levélfelület %- ában). Baloldali, középső és jobboldali képek: lisztharmatra fogékony (saját gyökerű cv. Totál) és rezisztens (saját gyökerű cv. Szentesi és oltott Szentesi+Totál) paprika levelei. Alsó grafikonok: NADPH-oxidáz aktivitása fertőzetlen és lisztharmattal fertőzött paprikalevelekben A szuperoxid - felhalmozódás és a NADPH-oxidáz aktivitásának összefüggése cseresznyepaprika-alanyok oltással átvihető lisztharmat - rezisztenciájával Hajtató felület alatt történő termesztési körülmények között további provokációs kísérleteket végezve kimutattuk, hogy a lisztharmatra fogékony Totál étkezési paprika akkor is rezisztenssé válik, ha a Szentesi mellett más ellenálló cseresznyepaprika alanyokra ( Kalocsai A, Kalocsai M, Garai fehér ) oltjuk. A fogékony cseresznyepaprika - alanyokra ( Globál, Koral, Óriás cseresznye ) oltott Totál viszont lisztharmatra fogékony maradt. Igazoltuk továbbá, hogy a kertészeti oltás hatására ebben az esetben is szuperoxid halmozódik fel a lisztharmatrezisztens alanyra oltott, eredetileg fogékony Totál oltórészben, azaz a lisztharmat - rezisztencia jól korrelál a szuperoxid felhalmozódással (1. táblázat). 86

96 Kíváncsiak voltunk arra is, hogy a Szentesi mellett más, lisztharmatrezisztens cseresznyepaprika - alanyok esetében is igaz-e, hogy a NADPH-oxidáz fokozott aktivitása összhangban van a szuperoxid felhalmozódásával és a lisztharmat - rezisztenciával? Lisztharmatrezisztens ( Szentesi, Kalocsai A, Kalocsai M, Garai fehér ) és fogékony ( Globál, Koral ) cseresznyepaprika alanyokra oltott Totál étkezési paprikát lisztharmattal (L. taurica) inokuláltunk. A fertőzetlen paprikáknál a NADPH-oxidáz aktivitása az oltott növények nagy részében csak kb. feleakkora volt, mint a Szentesi+Totál (oltott) esetében. 45 nappal a lisztharmatos inokuláció után viszont az említett oltott növényekben a NADPH-oxidáz aktivitása közel 2,5-3-szorosára nőtt, megközelítve a Szentesi+Totál (oltott) mintákban mért értékeket. Ez a jelenség elsősorban a rezisztens oltványok (Kalocsai A+Totál, Kalocsai M+Totál, Garai fehér+totál) esetében volt szembetűnő (24. 87

97 ábra). Feltételezhető, hogy a Kalocsai A, Kalocsai M és Garai fehér által biztosított lisztharmat - ellenállóság azért kevésbé hatékony, mint a Szentesi rezisztenciája (ld. 1. táblázat), mert az egészséges növényekben is eleve jóval kisebb a NADPH-oxidáz aktivitása. NADPH oxidáz aktivitása 24. ábra: Fertőzetlen és paprikalisztharmattal (Leveilulla taurica) fertőzött, különböző cseresznyepaprika - alanyokra oltott étkezési paprika (cv. Totál) NADPH-oxidáz enzimaktivítása. Szentesi, Totál : saját gyökerű növények; Szentesi+Totál,Kalocsai A+Totál, stb.: oltott növények. A fertőzött növényekben a NADPH-oxidáz aktivitását a lisztharmatos inokuláció után 45 nappal mértük Védekezési folyamatok a Szentesi cseresznyepaprika oltással átvihető lisztharmat - rezisztenciájában: szalicilsav - felhalmozódás és spontán sejtelhalások Növényekben a ROS - termelés szorosan összefügg egy védekezésben (betegségrezisztenciában) szerepet játszó hormon, a szalicilsav (SA) termelésével (Chen et al., 1993; Neuenschwander et al., 1995). Mivel eredményeink szerint a lisztharmat-ellenálló Szentesi cseresznyepaprikában már fertőzés nélkül is nagy a szuperoxid szintje, 88

98 kíváncsiak voltunk, van-e összefüggés egy ROS, a szuperoxid, és a SA termelése között? Fertőzetlen paprikanövények leveleiben mértük a SA szabad és kötött (glikozilált) formájának mennyiségét nagyteljesítményű folyadékkromatográfiával (HPLC). A lisztharmatrezisztens növények leveleiben (saját gyökerű Szentesi és oltott Szentesi+Totál) a szabad SA szintje kb. kétszer akkora volt, mint a fogékony saját gyökerű Totál egyedekben. Ugyanakkor nem tapasztaltunk különbséget a kötött SA mennyiségében; ez lényegében ugyanakkora volt mind a lisztharmatrezisztens, mind a fogékony paprikákban (25. ábra). 89

99 Szabad szalicilsav tartalom Kötött szalicilsav tartalom 25. ábra: A Szentesi cseresznyepaprika (Capsicum. annuum var. cerasiforme cv. Szentesi) lisztharmattal (Leveillula taurica) szembeni, oltással átvihető rezisztenciájának markere a szalicilsav felhalmozódása fertőzetlen növényekben. Szabad és kötött szalicilsav (SA) lisztharmatrezisztens (saját gyökerű cv. Szentesi és oltott Szentesi+Totál) és fogékony (saját gyökerű cv. Totál) paprika leveleiben. Ismert, hogy kétszikű növényekben a nagy szalicilsav -, és ROS - tartalom oly módon járul hozzá a szerzett betegségrezisztenciához, hogy az érzékenyített szövetekben ún. mikroléziókat ( mikro-hr ), azaz egy-egy növényi sejt spontán elhalását idézi elő (Alvarez et al., 1998; Alvarez, 2000). Mivel a lisztharmat-ellenálló Szentesi 90

100 cseresznyepaprikában már fertőzés nélkül is nagy a szuperoxid és a szabad szalicilsav szintje, kíváncsiak voltunk, hogy ez együtt jár-e a fokozott mértékű spontán sejtelhalással? Fertőzetlen paprikanövények leveleit festettük Tripán - kék festékkel, amely növényekben specifikusan az elhalt sejteket festi meg. A lisztharmatrezisztens paprikák (saját gyökerű Szentesi ) leveleiben a spontán sejtelhalás mértéke (sűrűsége) jóval intenzívebb volt, mint a fogékony saját gyökerű Totál egyedekben, és a sejtelhalás elsősorban az erek környékén volt nyilvánvaló (26. ábra). A Szentesi levelekben a fokozott spontán sejtelhalással párhuzamosan sűrűn előforduló, szintén az erek mentén koncentrálódó barna foltok feltételezhetően a nagy kalciumtartalom miatt (Lantos, 2011) az egyes sejtek vakuólumaiban felhalmozódó kalcium-oxalát kristályok jelenlétére utalnak (lásd Weryszko-Chmielewska és Michałojć, 2009) (26. ábra). 91

101 26. ábra: A Szentesi cseresznyepaprika (Capsicum. annuum var. cerasiforme cv. Szentesi) lisztharmattal (Leveillula taurica) szembeni, oltással átvihető rezisztenciájának potenciális markere a fokozott mértékű spontán sejtelhalás a fertőzetlen növények leveleiben. Spontán sejtelhalás lisztharmatrezisztens (saját gyökerű cv. Szentesi) és fogékony (saját gyökerű cv. Totál) paprika leveleiben. Az elhalt sejteket Tripán kék-festéssel hívtuk elő. A sötétbarna foltok feltételezhetően az egyes sejtek vakuólumaiban felhalmozódó kalcium-oxalát kristályok jelenlétére utalnak (lásd Weryszko-Chmielewska és Michałojć,2009) Védekezési folyamatok a Szentesi cseresznyepaprika oltással átvihető lisztharmat - rezisztenciájában: patogenezissel kapcsolatos és sejthalált szabályozó gének kifejeződése A növényben fertőzések nyomán termelt szuperoxid hidrogén-peroxiddá alakulva, a szalicilsavval együtt többek között az ún. patogenezissel kapcsolatos (PR) védekezési géneket/fehérjéket is aktiválja, amely végső soron további védekezési folyamatokat és betegségrezisztenciát indukálhat (Van Loon et al., 2006; Torres, 2010; Lehmann et al., 2015). A paprika PR-1 és PR-2 génje/fehérjéje (CaPR-1, CaPR-2) szerepet 92

102 játszik egyes baktérium- és oomicéta kórokozókkal szembeni ellenálló képességben (Sarowar et al., 2005; Silvar et al., 2008). Fertőzetlen és lisztharmat fertőzött (45 nappal az inokuláció után, 45 DPI) paprikákban követtük nyomon két PR gén, a CaPR-1 és CaPR-2 expresszióját. Fertőzetlen növényekben a CaPR-1 expressziója a lisztharmat - ellenálló paprikákban többszörösen nagyobb volt, mint a fogékony Totál étkezési paprikában. Ugyanakkor a CaPR-1 kifejeződése a saját gyökerű Szentesi cseresznyepaprikában volt messze a legnagyobb, és ennél jóval kisebb expressziót mértünk a szintén lisztharmatrezisztens Szentesi cseresznyepaprikára oltott Totál étkezési paprikákban (oltott Szentesi+Totál). A CaPR-2 fokozott expressziója viszont csak részben korrelált a rezisztenciával, mivel csak a saját gyökerű Szentesi cseresznyepaprikában volt detektálható, de az oltott Szentesi+Totál és saját gyökerű Totál étkezési paprikában nem (27A. ábra). Érdekes, hogy a lisztharmattal fertőzött (45 DPI) paprikákban a PR génexpressziós mintázat pont fordított volt, mint a fertőzetlen növényekben, mivel a saját gyökerű Totál paprikában a rendkívül nagy CaPR-1 és CaPR-2 expresszió a lisztharmat - fogékonysággal korrelált, míg a rezisztens növényekben (saját gyökerű Szentesi és oltott Szentesi+Totál) alig volt kimutatható PR gén expressziója (27B. ábra). 93

103 27. ábra: A Szentesi cseresznyepaprika (Capsicum. annuum var. cerasiforme cv. Szentesi) lisztharmattal (Leveillula taurica) szembeni, oltással átvihető rezisztenciájának markere a CaPR-1 és CaPR-2 gén fokozott expressziója a fertőzetlen növényekben (A), de nem a lisztharmattal fertőzött paprikában (45 nappal az inokuláció után) (B). Saját gyökerű cv. Szentesi és Szentesi+Totál oltott: lisztharmatrezisztens paprika; saját gyökerű cv. Totál: lisztharmatfogékony paprika. A génexpressziót kvantitatív RT-PCR-rel követtük nyomon (relatív génexpresszió). A génkifejeződés normalizálásához egy paprika-aktingén (CaAct) expresszióját használtuk. Mivel a lisztharmat-ellenálló Szentesi cseresznyepaprika leveleiben már fertőzés nélkül is a szokásosnál jóval intenzívebb (sűrűbb) a spontán sejtelhalások mértéke, elképzelhető, hogy ebben a makroszkopikusan tünetmentes lisztharmat - ellenállóságban szerepet játszik a sejtelhalást szabályozó Mlo gén(ek) csökkent működése is, hasonlóan pl. a lisztharmatrezisztens mlo mutáns árpavonalakhoz, amelyeket szintén nagymértékű spontán sejtelhalás jellemez (Wolter et al., 1993; Büschges et al., 1997). Fertőzetlen és lisztharmat fertőzött (45 nappal az inokuláció után, 45 DPI) paprikákban követtük nyomon a két ismert Mlo gén, a CaMlo1 és CaMlo2 (Zheng et al., 2013a) expresszióját. Fertőzetlen növényekben a két gén expressziója a lisztharmat ellenálló paprikákban jóval kisebb 94

104 volt, mint a fogékony Totál étkezési paprikában, azonban a saját gyökerű Szentesi cseresznyepaprikában volt messze a legkisebb, ennél nagyobb (de a Totál -ban mértnél kisebb) expressziót mértünk a szintén lisztharmatrezisztens Szentesi cseresznyepaprikára oltott Totál étkezési paprikákban (oltott Szentesi+Totál) (28A. ábra). A lisztharmattal fertőzött (45 DPI) növényekben a két Mlo gén expressziós mintázata lényegében nem változott, kivéve az CaMlo2 gént, ahol az expresszió mindkét rezisztens paprikában (saját gyökerű Szentesi és oltott Szentesi+Totál) a fogékony Totál -hoz képest igen alacsony szintre esett vissza (28B. ábra). Ezek szerint paprikában az Mlo gének expressziója fordított arányban áll a lisztharmat rezisztenciával és ez elsősorban a CaMlo2 génnél szembetűnő. 28. ábra: A Szentesi cseresznyepaprika (Capsicum. annuum var. cerasiforme cv. Szentesi) lisztharmattal (Leveillula taurica) szembeni, oltással átvihető rezisztenciájának markere a CaMlo1 és CaMlo2 gén csökkent mértékű expressziója a fertőzetlen növényekben (A) és a lisztharmattal fertőzött paprikában (45 nappal az inokuláció után) (B). Saját gyökerű cv. Szentesi és Szentesi+Totál oltott: lisztharmatrezisztens paprika; saját gyökerű cv. Totál: lisztharmatfogékony paprika. A génexpressziót kvantitatív RT-PCR-rel követtük nyomon (relatív génexpresszió). A génkifejeződés normalizálásához egy paprika-aktingén (CaAct) expresszióját használtuk. 95

105 Az oltással átvihető lisztharmat - rezisztencia biokémiai markereinek öröklődése paprikában, az oltott rezisztens növények utódaiban Eredményeink szerint egy paprikalisztharmatra (Leveillula taurica) fogékony étkezési paprikafajta (cv. Totál) betegség-ellenállóvá válik, ha egy rezisztens cseresznyepaprika alanyra (cv. Szentesi) oltjuk. Az oltással átvihető lisztharmat - rezisztencia biokémiai markerei paprikában pl. a NADPH-oxidáz-enzimaktivitása, ill. az általa termelt szuperoxid felhalmozódása, valamint egyes patogenezissel kapcsolatos (PR) és sejtelhalást szabályozó (Mlo) gének fokozott, ill. csökkent mértékű kifejeződése. Kérdés, hogy a szuperoxid - felhalmozódáshoz kapcsolódó génexpressziós, ill. enzimaktivitás - változások mint rezisztencia markerek öröklődnek-e a lisztharmatrezisztens, oltott paprikák utódaiban? A rezisztencia markerek öröklődésének vizsgálatához 1-1 oltott, rezisztens növény utódaiban (15, ill. 13 db, összesen 28 utódnövény) mértük a NADPH oxidáz enzimaktivitást, ill. az említett gének expresszióját. Az utóegyedek legalább felében megnyilvánultak az említett rezisztenciamarkerek. Az öt marker közül négy (fokozott NADPH-oxidáz-aktivitás, fokozott CaPR-1 és CaPR-2 génexpresszió, alacsony CaMlo2 expresszió) feltehetően kapcsoltan öröklődik, ugyanis nagyrészt ugyanazokban az utódegyedekben (10 db növény) fordult elő. A négy markert kifejező 10 utód közül 4 növényben viszont valamennyi marker, tehát az alacsony CaMlo1 expresszió is megnyilvánult (29. ábra). Ezek szerint paprikában az oltással átvihető lisztharmat - 96

106 rezisztenciával összefüggő biokémiai markerek nagy része az oltott, rezisztens növények utódaiban jól kimutathatóan öröklődik. 97

107 29. ábra: A Szentesi cseresznyepaprika (Capsicum. annuum var. cerasiforme cv. Szentesi) oltással átvihető lisztharmat (Leveillula taurica) rezisztenciája biokémiai markereinek (fokozott NADPH-oxidáz aktivitás, fokozott CaPR-1 és CaPR-2, ill. alacsony CaMlo1 és CaMlo2 génexpresszió) öröklődése az oltott rezisztens növények utódaiban ( A oltott növény: 15 utódegyed; B oltott növény: 13 utódegyed). A fekete vonallal jelölt utódnövényekben négy, ill. mind az öt marker megnyilvánul. Saját gyökerű Szentesi és Szentesi+Totál 98

108 oltott: lisztharmatrezisztens paprika; saját gyökerű Totál : lisztharmatfogékony paprika. A génkifejeződés normalizálásához egy paprika-aktingén (CaAct) expresszióját használtuk Az oltással átvihető lisztharmat - rezisztencia biokémiai markereinek öröklődése paprikában, a keresztezett saját gyökerű rezisztens és fogékony növények utódaiban Kíváncsiak voltunk arra is, hogy a fent említett öt biokémiai rezisztencia marker öröklődik-e egy lisztharmatrezisztens, ill. -fogékony saját gyökerű paprika keresztezéséből származó utódokban? A rezisztenciamarkerek öröklődésének vizsgálatához a lisztharmatrezisztens, saját gyökerű Szentesi cseresznyepaprikát kereszteztük a fogékony Totál étkezési paprikával [Totál ( ) x Szentesi ( )]. Az F 1 utódnemzedék 12 egyedében követtük a markerek megnyilvánulását. Az F 1 egyedek legalább felében megnyilvánultak a rezisztenciamarkerek, kivéve a fokozott NADPH-oxidáz aktivitást és az alacsony CaMlo1 expressziót, amely csak az utódok kisebb részében (2/12, ill. 3/12 db F 1 növény) jelent meg. Az öt marker közül három (fokozott CaPR-1 és CaPR-2 génexpresszió, alacsony CaMlo2 expresszió) feltehetően kapcsoltan öröklődik, ugyanis nagyrészt ugyanazokban az utódegyedekben (6 F 1 növény) fordult elő (30. ábra). Ezek szerint paprikában az oltással átvihető lisztharmat - rezisztenciával összefüggő biokémiai markerek nagy része a keresztezett saját gyökerű rezisztens és fogékony növények F 1 utódaiban jól kimutathatóan öröklődik. 99

109 30. ábra: A Szentesi cseresznyepaprika (Capsicum. annuum var. cerasiforme cv. Szentesi) oltással átvihető lisztharmat (Leveillula taurica) - rezisztenciája biokémiai markereinek (fokozott NADPH-oxidáz-aktivitás, fokozott CaPR-1 és CaPR-2, ill. alacsony CaMlo1 és CaMlo2 génexpresszió) öröklődése a keresztezett saját gyökerű fogékony és rezisztens növények F 1 utódaiban [Totál ( ) x Szentesi ( )]. A fekete vonallal jelölt utódnövényekben két, három, ill. négy marker is megnyilvánul. Saját gyökerű Szentesi : lisztharmatrezisztens paprika; saját gyökerű Totál : lisztharmat fogékony paprika. A génkifejeződés normalizálásához egy paprika -aktingén (CaAct) expresszióját használtuk. 100