Az anthrax fágoktól a MALDI-TOF-ig;

Átírás

1 Az anthrax fágoktól a MALDI-TOF-ig; egy klinikai mikrobiológus pályájának alakulása Gerlóczy-emlékelőadás Prof. Dr. Nagy Erzsébet A Magyar Infektológiai és Klinikai Mikrobiológiai Társaság 40. Kongresszusa, 2012, Budapest

2 Dr. Gerlóczy Zsigmond, egyetemi tanár ( ) (

3 SZOTE Orvosi Mikrobiológiai Intézet Ivánovics György akadémikus

4 B. cereus specifikus fágok Anthrax-specifikus AP50 Elektronmikroszkópos képek negatív festéssel Mi volt ennek a kutatásnak a jelentősége a későbbi klinikai mikrobiológusi pálya szempontjából???

5 SZOTE Központi Klinikai Mikrobiológiai Laboratórium A laboratórium rutin bakteriológiai tevékenységének tervezése ( ) és beindítása Prof. Dr. Földes József A modern anaerob diagnosztika beindítása Korai alkalmazott és alapkutatás a klinikai mikrobiológia területén

6 MIDI (Thiry Lajos) home-made, gyors módszer fejlesztése aerob és anaerob baktériumok identifikálására

7 Orvosi Hetilap 1985 A toxin detektálásra kipróbált szövetek : HeLa Hep-2 GMK McCoy MDCK RK Szelektív CCFA Anaerob véres Sikertelen fágtipizálás oka: a törzsek nagyfokú lizogenitása!!! (+ 15 további közlemény)

8 28 C. difficile izolátum 15 toxintermelő 13 toxin negatív 18 törzs bizonyult lizogénnek, ép és defektív fágokat mutattunk ki A Bacteroides klinikai izolátumok is igen sok változatos fágot hordoznak

9 Nagy, Kreutz, Werner: Influence of B. vulgatus on growth and toxin production of C. difficile. In: Medical and dental aspects of anaerobes (1993) Vizsgálataink alátámasztják az egyre gyakrabban használt széklet transzplantáció hasznosságát súlyos C. difficile okozta hasmenésben

10 Elektronmikroszkópia a rutin diagnosztikában Virális gastroenteritisek rutin diagnosztikája Rota vírus Adeno vírus Kovács, Deák, Nagy, Földes: Rotavirus okozta gastroenteritis járvány Hódmezővásárhelyen 1983 tavaszán. (Gyermekgyógyászat 1984)

11 Laboratórium majd intézet vezetése Az önálló parazitológiai részleg kialakítása, diagnosztika és kutatás fejlesztés Gombadiagnosztika, majd később jelentős kutatás fejlesztés A vírusdiagnosztika területén a szerológiai módszerek automatizálása, molekuláris módszerek bevezetése Új bakteriológiai módszerek bevezetése, automatizált hemokultura vizsgálat, identifikáló automaták, molekuláris módszerek alkalmazása Széklet tenyésztés és egyéb ritka kórokozók kimutatásának megteremtése A konzultatív mikrobiológiai tevékenység intenzív támogatása Alkalmazott- és alapkutatás

12 Antibiotikumokkal, antibiotikum rezisztenciával kapcsolatos kutatások Antibiotikum kombinációk hatása vegyes baktérium tenyészetekre Induló B. frag. csíraszám 108 CFU/ml Metronidazol 4 μg/ml Inkubálás 24 h, anaerob chamber

13 Antibiotikumokkal, antibiotikum rezisztenciával kapcsolatos kutatások Szinergizmus vizsgálatok

14 Fodor et al.: Use of Etest to assess synergy of antibiotic combinations againts clinical isolates of P. aeruginosa. IJAA 2005 MIC A MIC B P. aeruginosa CTZ MIC:8 CIP MIC:>32 MIC A(B) 8 ug/ml MIC B(A) 1 ug/ml >32 ug/ml 1 ug/ml

15 Antibiotikumokkal, antibiotikum rezisztenciával kapcsolatos kutatások meca gén kimutatása home-made PCR módszerrel Veréb, Sóki, Deák, Nagy: Infektológia és klinikai mikrobiológia (1998) 475 bp K Kp SHV2 enzimet termelő K. pneumoniae

16 Antibiotikumokkal, antibiotikum rezisztenciával kapcsolatos kutatások Anaerob baktériumok rezisztencia vizsgálata Első hazai rezisztencia felmérés, csoport (Anaerobe 1995) Penicillinkötő fehérjék szerepe a béta-lactam rezisztenciában (CID 1997) Az első hazai carbapenemase termelésen alapuló imipenem rezisztens B. fragilis törzsek genetikai vizsgálata. (Inf. Klin Mikro. 2000) CfiA és nim gének előfordulása hazai klinikai és normál flóra izolátumok, valamint európai nagy törzsgyűjteményben (JMM 2000, IJAA 2006) Gram-pozitív anaerob coccusok európai antibiotikum rezisztencia felmérés (IJAA 2008) Anaerob baktériumok tigecyclin érzékenysége, Európai felmérés ( SJID 2010) 1-3. Európai group antibiotikum rezisztencia felmérés (CMI 2011)

17 Kutatások az anaerob baktériumok körében Anaerobok szerepe különböző kórképekben Bakteriális vaginosis Krónikus prostatitis Lactobacillus-dominálta hüvely flóra. Inkubálás 5% CO2 körülmények között 48 h Gyakori izolátumok BV esetén: Gardnerella vaginalis Mobiluncus mulieris (long curved rod) Mobiluncus curtisii (short curved rod) Bacteroides urealyticus és más speciesek Prevotella bivia és más speciesek Prophyromonas spp Fusobacterium nucleatum Peptostreptococcus spp BV flóra 96 hmorbillorum anaerob Streptococcus körülmények között történt Atopobium vaginae inkubálást Mycoplasma követően hominis stb.

18 Bakteriális vaginosis Korrekt diagnózis bevezetése (anaerob tenyésztés) Felmérés az előfordulással kapcsolatban BV és IUD használat összefüggése nőgyógyászokkal BV és PID összefüggése Flóraváltozásért mi felelős? krónikus prostatitis jó és rossz lactobacillusok fibronektin kötés antibiózis lactobacillusok és BV izolátumok között Anaerobok szerepe a krónikus prostatitisekben Terápiás lehetőségek BV és prostatitis összefüggése svéd együttműködés urulógusokkal

19 Kirándulás a gombák világába Transzgénikus gombatörzsek előállítása és molekuláris genetikai jellemzése (mint a MTA-SZTE Mikrobiológiai kutatócsoport vezetője) A csoport tagjai: Ferenczy Lajos, Kredics László, Antal Zsuzsa, Szekeres Ferenc, Papp Tamás, valamint Dóci Ilona, Somogyvári Ferenc 24 in extenso, angol nyelvű közlemény sarjadzó és fonalas gombák területén végzett molekuláris genetikai alapkutatási eredményekből, valamint klinikai mikrobiológiai jellegű témákból Direkt Candida kimutatás vérből RT-PCR technikával C. albicans kontrol Trichoderma longibrachium Kredics László (Somogyvári F. et al.: Diag. Microbiol. Infect. Dis. 2007)

20 Kirándulás a gombák világába Doczi et al: Acta Microbiologica 2012

21 ESCMID vezetőségi tagság Professional Affaires Officer for Clinical Microbiology ( , ) Treasurer ( ) Kapcsolat a UEMS-sel ( ), ECDC vel ( ) Kezdeményezések: Summerschool (2005 Szeged) Postgraduális kurzusok Observership/Collaborative Centre program Trainees association ESCMID / Germany ESCMID / Switzerland Kapcsolat építés az ESCMID és a MIFKM között Számos hazai fiatal pályázatának támogatása

22 ESCMID vezetőségi tagság Professional Affaires Officer for Clinical Microbiology ( , ) Treasurer ( ) Kapcsolat a UEMS-sel ( ), ECDC vel ( ) Kezdeményezések: Summerschool (2005 Szeged) Postgraduális kurzusok Observership/Collaborative Centre program Trainees association ESCMID / Germany ESCMID / Switzerland Kapcsolat építés az ESCMID és a MIFKM között Számos hazai fiatal pályázatának támogatása

23 2009 MALDI-TOF MS a klinikai mikrobiológiai diagnosztika szolgálatában Matrix-assisted laser desorption ionisation time-of-flight mass spectrometry Baktériumok gombák species identifikálása, tipizálása <10 perc alatt Microflex LTTM Bruker Daltonik

24 MALDI Biotyper 3.0 Ismeretlen izolátum Referencia MSP Összehasonlítás az adatbázisban lévő spektrumokkal Minta MSP Species meghatározás

25 Intens. [a.u.] Különböző Bacteroides speciesek tipikus tömegspektrogramja x10 4 Bacteroides fragilis ATCC 25285\0_M11\1\1SLin Intens. [a.u.] 0 Bacteroides m assiliensis DSM 17679_DSM\0_A12\1\1SLin Raw Intens. [a.u.] 0 Bacteroides eggerthii DSM 20697_DSM\0_K11\1\1SLin Raw Intens. [a.u.] 0 x Bacteroides nordii DSM 18764_DSM\0_I3\1\1SLin Raw Intens. [a.u.] x10 4 Bacteroides intestinalis DSM 17393_DSM\0_A22\1\1SLin Raw m/z (Nagy E. et al. : CMI 2009)

26 277 Bacteroides izolátum identifikálása MALDITOF MS és hagyományos biokémiai módszerekkel Species Number of isolates with an identification score >2.0 by MALDI-TOF MS Bacteroides fragilis Bacteroides thetaiotaomicron Bacteroides ovatus Bacteroides vulgatus Bacteroides uniformis Bacteroides eggerthii Bacteroides nordii Bacteroides salyersiae Bacteroides massiliensis Inconclusive identification by MALDI-TOF MS with discrepant species identification by biochemical tests 270 (97%) selected for 16S rdna sequencing* *Only strains with a log(score) were selected for sequencing Nagy E. et al: CMI 15: (2009)

27 Bacteroides törzsek összehasonlító species meghatározása Sample number Species determined by biochemical tests MALDI-TOF MS 16S rdna sequencing 1 B. ovatus 2 B. uniformis 3 B. ovatus B. thetaiotaomicron B. thetaiotaomicron 4 B. uniformis B. thetaiotaomicron B. thetaiotaomicron 5 B. uniformis B. thetaiotaomicron B. thetaiotaomicron 6 B. ovatus B. thetaiotaomicron B. thetaiotaomicron 7 B. uniformis B. ovatus B. ovatus 8 B. thetaiotaomicron B. vulgatus Bacteroides sp (new?) 9 B. ovatus B. uniformis B. uniformis 10 B. ovatus B. uniformis B. uniformis 11 B. ovatus B. nordii B. nordii B. thetaiotaomicron P. (B.) distasonis P. (B.) distasonis P. (B.) distasonis B. thetaiotaomicron B. merdae Bacteroides sp II*(log(score)>2.5)** II II(log(score)>2.5) II(log(score)>2.5) II II II P. (B.) distasonis P. (B.) distasonis P. (B.) distasonis P. (B.) distasonis B. eggerthii B. goldsteinii B. intestinalis

28 Dendogram of Bacteroides strains according to MALDI-TOF MALDI-TOF 16S rdna Phenotypic identification M S P D e n d ro g ra m x _B. B aovatus c _ H U P N 99.5% U x _B. B aovatus c _ H U _ % PNU B. thetaiotaomicron B. eggerthii x _B. B avulgatus c_hu 40347_2 P N U B. vulgatus x _B. B athetaiotaomicron c _ H U _ 2 _ 1 8 P N U B thetaiotaomicron x _B. B athetaiotaomicron c_hu 26686_6 P N U B. thetaiotaomicron x _P. B adistasonis c_hu P NU P. distasonis x _B. B auniformis c _ H U _ 3 _ 1 3 P N U B. unifomis x_b ac_hu 32405_3 P N U x_b ac_hu 26868_1 P N U x_b ac_hu 35328_4 P N U x_b ac_hu P NU x_b ac_hu 35300_2 P N U x_b ac_hu 37251_1 P N U x_b ac_hu 33120_3_12 P N U x_b ac_hu P NU x_b ac_hu P NU x_b ac_hu 36562_1 P N U x_b ac_hu 33866_2_19 P N U x_b ac_hu 34886_3 P N U 99.5% x_b ac_hu 26938_2 P N U x _ B a c _ H U P 99.5% NU Bacteroides sp. B. capillosus B. thetaiotaomicron x_b ac_hu P NU x_b ac_hu 36111_2 P N U x_b ac_hu 26938_1 P N U D is t a n c e L e ve l S rrna gene sequencing confirmed the identification based on MS

29 Division I és II törzsek elkülönítése 02 - CZE R TAL O21 04 BF8 cfia cfia _ R Nagy E, et al.: JMM (2011)

30 02 - CZE60 Intens. [a.u.] Kifejezet különbségek a csúcsok között a 4650 és 4850 Da között x Da 4711 Da 1.0 Division II R TAL Da 06 O21 04 BF8 cfia + cfia Da Division I _ R Nagy E, et al.: JMM

31 145 izolátum retrospektív MS analízise 145 törzs közül 9 mutatta a division II (cfia pozitív) törzsekre jellemző csúcsokat Strains A20 Characteristic peaks 4826, 9375, 9649 CfiA (PCR) Imipenem MIC (mg/l) + <0.125 Ba , 9375, <0.125 Bb , 7321, 9375, Bb , 7321, 9375, Be3 4826, 7321, 9375, Bm2 4826, 7321, 9375, , 5002, Fr , 7321, NL3 4688, 4826,5002, 5189, 7321, 9375, NL1 4688, 4826, 5002, 5189, 7321, 9375, Strains with silent cfia gene (IS614) >32 2

32 Propionibacterium acnes törzsek tipizálása Nagy et al.: Anaerobe, sent for publ. 12S Type III Asn12 ATCC11828 Type II 6609 Type IB PRP-38 Type IB/IC P.acn33 Type IA PRP-60 A vakon végzett vizsgálatok eredménye 100 %-ban megegyezik az emlst molekuláris tipizáló módszer eredményével

33