Gerániol meghatározása rovarriasztó készítményekben

Átírás

1 BUDAPESTI MŰSZAKI ÉS GAZDASÁGTUDOMÁNYI EGYETEM SZERVETLEN ÉS ANALITIKAI KÉMIA TANSZÉK SZAKDOLGOZAT Gerániol meghatározása rovarriasztó készítményekben Készítette: Nyerges Gyula Témavető: Dr. Balla József Konzulens: Mátyási Judit Szervetlen és Analitikai Kémiai Tanszék

2 Tartalomjegyzék 1. Bevezetés Irodalom A gerániol Mintaelőkészítési eljárások Mérési módszerek Gázkromatográfia Validálási paraméterek Módszerfejlesztés A mérés célja A módszer kidolgozása Mintaelőkészítés Az alkalmazott készülék beállítása A teljesítményjellemzőkkel szemben támasztott követelmények A mérés menete Eredmények és kiértékelés Összefoglalás Irodalomjegyzék Köszönetnyilvánítás Függelék

3 1. Bevezetés Az illatanyagokat tartalmazó termékek a mindennapi életünk részét képezik. Jelen vannak az egyéni tisztálkodó szerekben, a háztartási és mosodai termékekben. Fő szerepük, hogy a felhasználóban jó érzést váltsanak ki és elfedjék az egyéb kémiai összetevők illatát. Manapság körülbelül 3000 kémiai formulát és illóolajat használnak erre a célra [1]. Az illóolajokat az íz- és illataromájuk miatt széles körben alkalmazzák ételekben, italokban, gyógyszerekben és kozmetikumokban is. Jellemző komponenseik közé az illékony mono- és szeszkviterpének tartoznak [2]. Az illóolajok a különböző növényi részekből kivont eszenciák, melyek sok kémiai anyagot tartalmaznak. Ezen anyagok kis része adja a jellegzetes illatot [3]. Egyik legértékesebb képviselőjük a rózsaolaj és rózsavíz, melyeket a Rosa damascena Mill. növényből nyernek ki. Az olaj gyulladáscsökkentő és gyógyászati célú felhasználását is lejegyezték [4]. Olcsóbb gerániumolajjal szokták helyettesíteni a parfümökben, melyet a Pelargonium spp. növényből vonnak ki. A növényt lekvárok, sütemények, szirupok ízesítésére, fürdővíz illatosítására, a gerániumolajat pedig krémekben, szappanokban és különféle piperecikkekben használják előszeretettel *5]. Iránban farmakológiai aktivitásának és kis toxicitásának köszönhetően széles körben használják. A nők menstruáció és menopauza esetén alkalmazzák, ezért is nevezik a nők olajának. Hasznos továbbá ekcémára, a légúti egészség megőrzésében és a sportolók lábára *6]. A gerániolt széles körben alkalmazzák illatanyagként. Egy felmérés alapján az európai piacon a dezodorok 76%-ában, a háztartási termékek 41%-ában és a kozmetikumok 33%-ában használnak fel természetes összetevőket, melyekből évente 1000 tonnát állítanak elő *7]. Az alkoholos italok közül a borok rendelkeznek a legváltozatosabb ízvilággal. Több száz illékony komponenst azonosítottak a szőlőkben és borokban, de az aromáért a monoterpén-alkoholok a felelősek, mint a gerániol, nerol, linalool és α- terpineol [8]. A szőlőket is monoterpén-tartalmuk alapján sorolják muskotály, nem- 3

4 muskotály és semleges osztályokba. A muskotály szőlők tartalmazzák a legtöbb monoterpént, melyek adják a szőlő és a bor jellegzetes aromáját [9]. Az illataromaként alkalmazott növényi olajokat szúnyogriasztó szereknek is használják. Több, mint 2 milliárd ember van kitéve a szúnyogok által terjesztett betegségeknek, mint a malária és a vérzéses dengue-láz. A malária a legtöbb embert érintő betegségek közé sorolható. A csecsemőknél és fiatal gyerekeknél tapasztalt 90% körüli halálozás miatt elengedhetetlen a betegség és a szúnyogok kontrollálása. Erre a célra sok szintetikus szúnyogriasztót alkalmaznak, mint a N,N-dietil-3- metilbenzamid (DEET) és a pikaridin. Közülük is a DEET a leghatásosabb és változatos formákban kapható. A DEET káros hatásainak felfedezése után szükségessé vált az újabb riasztószerek keresése. A szintetikus vegyszerek környezetre káros hatását is kiküszöbölték az illóolajok bőrön való használatával *10]. Szúnyogriasztóként használják többek között a Cymbopogon spp. és a Pelargonium citrosum illóolaját. Ezen illóolajok főként gerániolt és citronellolt tartalmaznak az egyéb komponensek mellett [3, 10]. Kis állatok védelme érdekében különböző rovarriasztó eszközöket és készítményeket alkalmaznak. Munkám célja az volt, hogy ezekben a készítményekben lévő gerániol hatóanyag mennyiségi meghatározására alkalmas, megbízható mintaelőkészítési és gázkromatográfiás módszert alakítsak ki. 4

5 2. Irodalom 2.1 A gerániol A gerániol (3,7-dimetilokta-transz-2,6-dién-1-ol; C 10 H 18 O) egy monoterpén alkohol, melynek cisz izomerje a nerol. A gerániolt a pálmarózsa olajból, míg a nerolt a narancsvirág olajából izolálták. Illóolajok jellemző alkotója, megtalálható a Méhbalzsamban (Monarda fistulosa), a rózsaolajban, a pálmarózsa és a citronella olajban is. A gyógynövényekből gyakran kinyerhető anyag, mely gyakran az oxidált geránial és neral (együtt citrál) formáival együtt van jelen. Egy halványsárga folyadék olaj, mely vízben nem oldódik (<0,1g/l), de a szerves oldószerek többségében jól oldódik *7+. Kis molekulatömegű illékony vegyület, 20 C-on a tenziója 0,02 Hgmm, forráspontja 230 C [11]. Jellemzően rózsaillatú és az íze édes virágos, rózsaszerű, citrus gyümölccsel, viaszos árnyalatokkal. Ezen tulajdonságai miatt gyakran alkalmazzák illataromaként. A gerániol számos másik terpénné átalakítható biológiai úton. (R)-(+)- citronellolt enantiomerszelektíven képes a Saccharomyces cerevisiae baktérium előállítani. Emellett (S)-citronellol szelektív előállítására, izomerizálásával nerol, oxidálásával pedig geránial és neral előállítására is alkalmas. A Pennicillium digitatum képes NAD+ jelenlétében a citrol-dehidrogenáz enzimmel citrált előállítani. Az illóolajok fő komponensei rovarölő és -riasztó hatással rendelkeznek. Emlősökre kis mértékben toxikusak és biológiailag lebomlanak, mely kedvezővé teszi alkalmazásukat. Jeon és társai a Pelargonium graveolensből kivont gerániol atkaölő hatását vizsgálta a tárolt élelmiszerekben előforduló atkák és a Tyrophagus putrescentie ellen. Benzil-benzoáttal összehasonlítva sokkal hatásosabbnak bizonyult az 1,27 µg/cm 3 értékkel az 1,95 µg/cm 3 LD 50 értékhez képest. Traina és társai a vizsgálatuk során az 5%-os gerániol oldat az α-pinén, limonén és p-cimén oldatával szemben sokkal erősebb hatást fejtett ki az Otodectes cynotis ellen közvetlen alkalmazva. 1%-os gerániolt alkalmazva a csípések száma 98,4%-kal, 97,3%-kal és 91,3%-kal lecsökkent 7, 14 és 21 nap után. 5

6 Az illóolajok polaritásuknak köszönhetően képesek oldódni a sejtmembrán foszfolipid kettősrétegében, ezáltal antibakteriális és gombaölő szerepe van. Suppakul és társai a monoterpén alkoholok antibakteriális aktivitását hatásosabbnak találták, mint gombaölő tulajdonságát. Friedman és társai 96 illóolajat és 23 komponensét vizsgálták baktériumokon mikrotiter tálcás módszerrel. A gerániolt találták a leghatékonyabbnak az E. coli, Listeria monocytogenes, és Salmonella enterica ellen. 66 vizsgált vegyület és olaj közül a gerániol lassította az emberi és állati kórokozók, a Salmonella typhimurium és az E. coli növekedését a legjobban. Emellett gőzei a légúti kórokozók ellen is jelentős hatást fejtettek ki [7]. Caccioni és társai különböző citrusfélék illóolajait vizsgálták a Penilillium digitatum és Penicillium italicum ellen. Citrom, narancs, mandarin, citrancs, grapefruit és keserűnarancs volt a vizsgált növények között, melyek mindegyikében gerániolt is mutattak ki. A citrancs és a citrom bizonyultak a leghatásosabbnak és az oxigéntartalmú monoterpének pozitív korrelációját bizonyították a gombák ellen *12]. A szabad gyökök a biomolekulák átalakulásán keresztül öregedéshez, érelmeszesedéshez, rákhoz, Alzheimer-kórhoz, diabéteszhez és asztmához vezethetnek. Az illóolajok antioxidáns és szabad gyök megkötő tulajdonsága is bizonyított. A gerániolból kisebb mennyiség is elegendő volt az 1,1-difenil-2- pikrilhidrazil ellen, mint a Troloxból. Az emberi rákos sejtek növekedését jelentősen lassítja, valamint gyulladásgátló és herpesz ellenes hatása is ismert. Toxicitását számos élőlényen tesztelték. Patkányoknál ppm 16 hét, 1000 ppm 28 hét diétás etetés után sem tapasztaltak semmit. Klinikailag vizsgált teszt során 25 önkéntesen a 6%-os gerániol nem váltott ki semmilyen hatást. Nem elektrofil anyag révén érzékenységet nem kellene okoznia, mégis előfordul, hogy allergiás kontakt dermatitist vált ki. Ennek következtében az Európai Unió határértéket szabott meg, mely felett az összetevők listáján kötelező feltüntetni a jelenlétét. Hagvall és társai jelentették, hogy a gerániol levegőben autooxidációt szenvedve vagy a CYP-közvetített metabolikus aktiválás során a bőrben allergén anyagokká alakul át *7]. Tanulmányok során különböző módon vizsgálták toxikus hatását. Szájon át 3,6 és 5,0 g/kg közötti LD 50 értékeket határoztak meg a kísérletek során patkányokon. Bőrirritációs teszteket önkénteseken végezve eltérő oldószereket 6

7 használva eltérő eredményeket értek el. Tiszta és 32%-os acetonban oldott gerániol esetén bőrirritációt észleltek. A Research Institute for Fragrance Materials tesztje során a legmagasabb nem-irritáló mennyiséget 10%-ban, míg a legalacsonyabb irritatív mennyiséget 30%-ban határozták meg. Nyulak esetében vizsgálva a gerániol szemirritációját tapasztalták. Az UV spektruma alapján fototoxicitáct és fotoallergiát nem vált ki az illataromaként történő felhasználása *11]. 1. Ábra: A 26 vizsgálandó allergén illatanyag (A 2 természetes kivonat nem szerepel a képen.) [1] 2.2 Mintaelőkészítési eljárások Növényekből, iilóolajokból: Vízgőzdesztillációval kétféle módon lehetséges az illóolajok kinyerése. Egyik lehetőség a növény vízbe merítése majd forrásig hevítése. Az illóolajat magával viszi a vízgőz és újra lekondenzál. Könnyen elválaszthatóak egymástól, mivel az olaj úszik a víz felszínén. A vízbe beoldódó komponenseket további desztillációs lépéssel vagy 7

8 extrakcióval ki lehet nyerni. Előnye, hogy az illóolajok hőmérséklete nem megy 100 C fölé, ezáltal a bomlás esélye lecsökkenthető és kisebb hőmérsékleten vákuumban is alkalmazható *13]. A citronella olajat 350 g a friss levélből 1 ml desztillált vízben Clevenger sfeltéttel 8-10 órán át desztillálják, majd vízmentes nátrium-szulfáttal szárítják *3]. A Lamiaceae családjába tartozó növények esetén, mint a Közönséges Levendula, Rozmaring és Citromfű esetében is hasonló módon jártak el 3 órás desztillálással *14]. A gerániumolaj esetén a 4 órán át tartó desztilláció végén kapott zöldessárga oldatot lehűtötték, dekantálva leöntötték az olajat és n-pentánban nátrium-szulfát szárítószer jelenlétében szárították *6+. A Kakukkfű egyik előkészítési módja a 30 grammos növényrészletek állandó növény-víz tömegarány mellett 3 órán át történő desztillációja [15]. A vízgőzdesztilláció másik lehetséges alkalmazása során az illóolaj kinyerése céljából nyomás alatt lévő gőzáram hatol be a növényi részekbe, mely kioldja az illékony vegyületeket. A lekondenzáló olajat azonos módon különíthetjük el a víztől, mint az előző módszerrel. A módszer hőstabil illóolajok esetén kiválóan alkalmazható magas extrakciós hatásfokkal és kis hőbomlással *13]. A Java citronella esetén a korábban 2-3 napig szárított leveleket desztillálták ezzel a módszerrel *3+. A citrusfélék héjából grammot desztilláltak, majd nátrium-szulfáttal szárítás után nitrogén atmoszféra alatt tárolták *12]. Szőlőből a mag eltávolítása után 50 g homogén mintát készítettek, melyhez 1 g kalcium-kloridot, 10 g nátrium-kloridot és 0,1 ml 41mg/ml koncentrációjú 3-oktanol belső standardot adtak. 8 g gyümölcspépet szilárd fázisú mikroextrakciós (SPME) fiolába helyeztek, majd 40 C-on 20 percig kevergették. Dimetil-polisziloxánnal bevont előkondícionált filmet helyeztek a gőztérbe, melyen megkötődtek az illékony vegyületek. 3 percen át a gázkromatográf injektorában 220 C-on splitless módban deszorbeálták a megkötött komponenseket *9]. A Kakukkfű esetében a vízgőzdesztilláció mellett egyéb mintaelőkészítést is alkalmaztak. A szuperkritikus fluid extrakció során a növényi részekre 14 MPa nyomáson 40 C-os szén-dioxidot vezettek 3 órán át. A kioldott illó komponenseket és a nehéz molekulatömegű részeket elszeparálták egymástól. A szeparátorokat -15 C-ra 8

9 hűtötték, majd az extraktumot 50%-os vizes etilén-glikolba vezették. Kis mennyiségek esetén az oldószert csapdázással távolították el, a készüléket a csővezetékekkel együtt hexánnal átmosták az esetleges maradék anyagok eltávolítására. A másik esetben dinamikus headspace módszert alkalmaztak a növényen. 0,31 g növényt 60 C-on inkubáltak 15 percen keresztül, majd 90 percen át nitrogént fúvattak át a rendszeren és az illó komponenseket a hűtött csapdában gyűjtötték össze. 1 percen keresztül szárították 0 C-on, majd hélium öblítőgáz alkalmazása közben 250 C-ra fűtötték az elegyet. Ezután 15 percig deszorbeálták a csapdát és 15 percen át tartó nitrogénátfúvatás közben 260 C-on eltávolították a vizet *15]. Italok vizsgálata: Dinamikus headspace módszert alkalmaztak a perui pisco és a kínai tea előkészítése során. 80 ml homogén pisco mintát 400 mg LiChrolit EN gyantával töltött SPE fiolába helyezték, melyet előbb 20 ml diklór-metánnal átmostak és 10 perces száraz levegő átfúvatásával szárítottak. A rendszert 20 percig szobahőmérsékleten tartották miközben 500 ml/perc sebességgel nitrogént áramoltattak át rajta. Az illó komponenseket csapdázták, majd az eltávolítás után nitrogénnel szárították. A mintát ezután 3,2 ml 5% etanolt tartalmazó diklór-metánnal oldották le [16]. A kínai teákat vizsgálat előtt 1 órával kivették a hűtőből. 60 ml főzetet 30 percig 60 C-on egy headspaces üvegbe helyeztek, majd 120 percen át nitrogénnel öblítve csapdázták az illó anyagokat. 2 percen keresztül nagy tisztaságú nitrogénnel szárították, majd a termikus deszorpciós rendszerben deszorbeálták az anyagokat [17]. Barack- és körteleveket SPME módszerrel készítettek elő. 5 ml dzsúszhoz 5 µl belső standardot adtak, majd headspace módban egy dimetil-polisziloxán filmre adszorbeálták a minta gőzterét 40 C-on 30 perces kevertetés közben. A filmet a 250 C-os injektorban 5 perces splitless módban deszorbeálták *18]. Kozmetikumok: A gázkromatográfiához általában nem szükséges az illékony anyagok méréséhez különösebb mintaelőkészítés, ám a bonyolult mátrix gondot okozhat a kevésbé illékony anyagok révén. Ezek könnyen eltömíthetik az injektort, ezáltal hamis 9

10 eredményekhez vezetve. A legtöbb esetben ezért többek között szilárd fázisú extrakciót, statikus vagy statikus és csapdázó headspace módszert alkalmaznak [13]. Rovarriasztót és masszázsolajat egyszerű acetonitriles oldás és a belső standard hozzáadása után mértek Milla és társai. A hidratáló krém és a hajbalzsam esetén 1 g mintához 6 ml acetonitrilt adva 15 percig ultrahangozták, majd 0,2 µm pórusátmérőjű nejlon szűrővel leszűrték. A belső standard hozzáadása után 10 ml-re egészítették ki a térfogatot és folyadékkromatográfiás módszerrel mérték a mintákat [1]. Különböző hidratáló krémek, testápolók, samponok, gélek és szappanok mérését mátrix szilárd fázisú diszperziós módszerrel készítették elő. 0,5 g mintát egy 10 ml-es mérőlombikba mértek be. A mintát 1 g vízmentes nátrium-szulfáttal és 2 g diszperz oldószerrel egy dörzsmozsárban összekeverték, majd felvitték az alján 0,5 g Florisilt tartalmazó polipropilén szilikon kolonnára. Az elúciót gravitációs áramlásban etil-acetáttal vagy hexán:aceton (1:1 v/v) végezték. 5 ml oldathoz 50 µl PCB 30 oldatot adtak, szükség esetén hígították az oldatot, majd a gázkromatográfra injektálták *19]. 2.3 Mérési módszerek Az illatanyagoknál az UV-VIS-, IR- és NMR-spektroszkópia nem nyújt megfelelő információt. Helyette inkább gázkromatográfiát alkalmaznak injektálásos vagy headspace módban. A detektálást lángionizációs vagy hővezetéses detektorral, a Kováts-féle retenciós indexek segítségével végzik. Sok esetben még ez sem ad elegendő információt, ezért tömegspektrométert alkalmazva vizsgálják általában az illóolajokat. Ha a mérendő anyag nehezen elpárologtatható vagy hőérzékeny, célszerűbb folyadékkromatográfiás vagy vékonyréteg-kromatográfiát alkalmazni *13]. Illékony terpének esetén általában DB-1, Carbowax, OV-1, OV-101, PEG 20M, BP5 és DB-5 kolonnákat szoktak alkalmazni m hosszúsággal 0,2-0,7 µm filmvastagsággal. A hőprogramot általában C között körülbelül 5 C/perc fűtési sebességre szokták beállítani *18]. Általában a gerániumolajat gázkromatográffal vagy gázkromatográftömegspektrométer kapcsolással elemzik. Gázkromatográfia esetén a retenciós 10

11 időket hasonlítják össze referencia komponensek retenciós idejével. Ezzel a módszerrel viszont a mátrix komplexitása miatt nem lehet minden komponenst meghatározni és egyes esetekben a szükséges standardok is nehezen beszerezhetők. Tömegspektrometria esetén viszont a minőségi és a mennyiségi információ is megszerezhető a spektrumkönyvtárak segítségével. Problémát okozhat az elemzésnél a háttérkorrekció pontatlansága és az átlapoló csúcsok esetén a spektrumkönyvtár félrevezető lehet *6]. GC-FID mérések: Perkin-Elmer 8700 gázkromatográffal HP-5MS (30 m*0,25 mm*0,25 µm) kolonnát alkalmaztak 220 C-os injektor és 290 C-os lángionizációs detektorral az árvacsalán-félék illóolajának elemzése során. A kolonna hőmérsékletét 3 perc izoterm szakasz után 80 C-ról 4 C/perc sebességgel 120 C-ra emelték, melyen a kolonnát 10 percig termosztálták. Vivőgázként héliumot használtak 1,5 ml/perc térfogatárammal. 1,0 µl mintát injektáltak 1:100 splittarány mellett az injektorba [14]. Hewlett-Packard 5980 készülékkel HP-1 (25 m*0,2 mm) dimetil-polisziloxán állófázisú kolonnát használtak a citrusfélék illóolaj-komponenseinek elválasztására. A kolonna hőmérsékletét 6 percig 60 C-on tartották, majd 3 C/perc sebességgel 250 Cra emelték a hőmérsékletét. Az injektor hőmérséklete 250 C a detektoré 270 C volt [12]. A rózsavíz összetételét egy Shimadzu-17A gázkromatográffal vizsgálták CBP-5 (25 m*0,25 mm*0,22 µm) 5% difenil-polisziloxán állófázison. A kolonnát 60 C-on 1 percig termosztálták, majd 3 C/perc sebességgel 250 C-ra fűtötték és a véghőmérsékletet 10 percig izotermen hagyták. 20 cm/s lineáris áramlási sebességgel hélium vivőgázt használtak. A mintát a 200 C-os injektorba 1:30 splittarány mellett injektálták és 250 C-os lángionizációs detektorral detektálták *4]. A perui piscot López-Vázquez (2010) mérési metódja alapján vizsgálták. A mintákat egy STAR 3400 CX (Varian) készülékkel DB-WAX (50 m*0,32 mm*0,2 µm) kolonnán mérték. A hidrogén vivőgáz 4 ml/perc áramlási sebességgel haladt végig a rendszeren. A kolonnát 3 percig 40 C-on tartották, majd 6 C/perc sebességgel 75 Cig, onnan 9 C/perc sebességgel 220 C-ig fűtötték és a véghőmérsékleten 10 percig 11

12 termosztálták a kolonnát. Az 1,0 µl pisco mintát 220 C-os injektorba 1:10 splittarány mellett injektálták. A jelet a 220 C-os detektor szolgáltatta [16]. GM-MS: A Cymbopogon nardus leveleiből kinyert citronella olaj kromatogramját egy szilikon kolonnával (30 m* 0,25 mm* 0,25 µm) FFAP állófázissal vizsgálták. A kolonnát 1 percig 60 C-on tartották, majd 100 C/perc sebességgel 200 C-ra fűtötték. 1 ml/perc sebességgel hélium vivőgázt alkalmaztak. Az injektor, a detektor, az ioncsapda és a transfer line hőmérséklete 240 C volt, a manifold 220 C-on működött *10]. Borokat Hewlett-Packard 6890 gázkromatográffal, Gerstel MPS2 mintaadagolóval és Hewlett-Packard 5973 tömegspektrométerrel vizsgáltak. A kolonna egy ZB-Wax Phenomenox (30 m*0,25 mm*0,25 µm) szilikon kapilláris volt. 1,2 ml/perc sebességgel hélium vivőgázt alkalmaztak. A kolonnát 50 C-on 1 percig termosztálták, majd 10 C/perc sebességgel 220 C-ig fűtötték. A véghőmérsékletet 10 percig tartották. A 200 C-os injektorba egy 10 µl-es fecskendővel 2,0 µl folyadékot injektáltak. A gyors injektálás 36 másodpercig purge splitless módban történt 25,0 psig nyomással az 1:30 arányú splittig. A tömegspektrométer m/z tartományon pásztázta az ionokat, melyek 70 ev-on képződtek. A konkrét terpének mérése során SIM módban 10 milliszekundumig követték az ionokat. Gerániol esetén a 121, 136 és 154 m/z ionokat vizsgálták [8]. A barack- és körtelevek esetén egy Hewlett-Packard 5890A gázkromatográfot és Hewlett-Packard 5971A kvadrupol tömegspektrométert alkalmaztak Supelcowax 10 PEG 20M állófázisú kolonnával (30 m*0,25 mm*0,25 µl). A kolonna 5 percig 60 Con állt, majd 3 C/perc sebességgel 240 C-ra fűtötték és 10 percig izotermen termosztálták. Az SPME filmet 5 percre a 250 C-os injektorba helyezve splitless módban deszorbeálták a megkötött komponenseket. Az ionizációt 180 C-on 70 ev-tal végezték. Az azonosítást spektrumkönyvtárak segítségével és C 8 -C 32 alifás szénhidrogének PEG és SPB-1 (30 m*0,25 mm*0,25 µm) méréséből számított Kovátsindexek felhasználásával végezték [20]. 12

13 A kínai teák aromájának mérése során Agilent 7890-A5975 GC-MS készüléket alkalmaztak. A dinamikus headspace módszerrel előkészített mintát a Termál Deszorpciós Egységben deszorbeálták splitless módban 35 C-os kezdeti hőmérséklettel. 0,5 perc után 6 C/perccel 230 C-ra fűtötték az egységet és 1 percig izoterm tartották 280 C-os transfer line-nal. Az Előhűtött Injektor Rendszer a csúcs alakjának javítására szolgát, mely 0,2 percig 100 C-on állt, majd 10 C/perc sebességgel 230 C-ra fűtötték és 0,5 percig ezen a hőmérsékleten termosztálták. Az elválasztás egy AB-INNOWax kolonnán történt (30 m* 0,25 mm*0,25 µm) 1,2 ml/perc hélium vivőgázáramot alkalmazva. A kolonnát 2 percig 40 C-on tartották, majd 3 C/perc sebességgel 200 C-ra fűtötték. Onnan 10 C/perc sebességgel 230 C-ig fűtötték és 5 percet izotermen termosztálták. Pásztázó módban a m/z tartományt pásztázták 280 C-os interfésszel. A minőségi meghatározás a lineáris retenciós indexeken és a spektrumkönyvtárak használatán alapult *17]. Az előkészített krémeket és testápolókat egy Agilent 7890A Agilent 5975C GC-kvadrupol tömegpektrométerrel készülékkel vizsgálták. A transfer line 290 C-on, az analizátor 150 C-on, az ionforrás pedig 230 C-on működött. Hélium vivőgáz 1,0 ml/perc sebességgel áramlott végig a HP5 (30 m*0,25 mm*0,25 µm) kolonnán. A kolonnát 80 C-on 2 percig izoterm tartották, majd hőmérsékletét 8 C/perccel 100 Cra, onnan 20 C/perccel 150 C-ra és 25 C/perc sebességgel 200 C-ra emelték. A hőmérsékletet 5 percig ezen a hőmérsékleten tartották, majd 8 C/perccel 220 C-ig, végül 30 C/perc sebességgel 290 C-ra fűtötték és 6 percig tartották a hőmérsékletet. 1 perc splitless mód után 75ml/perc splitt árammal injektáltak 2,0 µl mintát a 220 Con injektorba. Az azonosításhoz a 4. perctől a 25. percig m/z tartományon pásztázták az ionokat. A komponenseket tömegspektrumok és retenciós idők alapján standardok segítségével azonosították *19]. GC-O A pisco minták olfaktometriás méréséhez a GC-FID rendszer splitt ágára egy ODO-1 szagló portot csatlakoztattak. Egy DB-WAX (30 m*0,32 mm*0,5 µm) és egy VF 5MS (30 m*0,25 mm*0,25 µm) típusú kolonnát alkalmaztak 3 ml/perces hidrogén vivőgázzal konstans 52 kpa nyomással. 1 perces splitless módban 1 µl mintát injektáltak a 250 C-os injektorba. A detektort 250 C-on tartották, míg a kolonnát 5 13

14 percet 40 C-on termosztálták és 4 C/perc sebességgel 100 C-ig, majd 6 C/perc sebességgel 220 C-ig fűtötték. A véghőmérsékletet 20 percig tartották. A lekondenzálódás elkerülésére érdekében egy reosztáttal fűtötték a szaglóportot. A mintákat 6 laboratóriumi szakember szagolta. A szaglás 40 percig tartott. A szakembernek 4 fokozatú skálán kellett értékelni az érzékelt komponenseket (0 nem detektált, 4 intenzív jel). A kapott eredményekből egy kalkulált módosított gyakorisággal jellemezték az adott mintát *16]. HS-GC-MS: Az extrahált kozmetikum mintákat egy Agilent 5973 készülékkel és G188A mintaadagolóval mérték Agilent 5973N kvadrupol tömegspektrométerrel. Az alkalmazott VF-5 (40 m*0,25 mm*0,25 µm, melyből 10 m inaktív) típusú kolonnát 1 percig 50 C-on tartották, majd 7 C/perc sebességgel 162 C-ig, végül 30 C/perc sebességgel 320 C-ig fűtötték. A véghőmérsékletet 1 percig izotermen tartották. 10 perc 135 C-os inkubálás után 1,0 ml gőz fázist injektáltak 1:6,8 splittarány mellett. A headspace hurok, a transfer line és az EPC volatiles interface 145 C, 155 C, és 160 C hőmérsékleten volt termosztálva. 14,65 psi konstans nyomással 1,3 ml/perc kezdeti áramlási sebességgel hélium vivőgáz áramlott át a rendszeren. Az injektor, az ionforrás, a kvadrupol és az interface hőmérséklete sorra 160 C, 230 C, 150 C és 280 C volt. A minőségi meghatározást pásztázással, míg a mennyiségi meghatározást szelektív ionkövetéssel végezték. A gerániol esetén a 93,10 és 123,10 m/z ionokat követték az azonosításhoz [21]. RPLC-DAD: Egy Hewlett-Packard HP1100 HPLC rendszerrel, mely kvaterner pumpával, folyamatos vákuum gáztisztítóval, egy Rheodyne 7125 kézi mintaadaolóval és egy HP UV-VIS diódasoros detektorral volt felszerelve, mérték a rovarriasztó, a masszázsolaj, hidratáló krém és hajbalzsam összetételét. Egy LiChro-CART Purespher Star RP18-e (250 mm*4,6 mm*5 µm) kolonnát kombináltak egy LiChroCART 4-4 LiChrospher 100 RP18 (5 µm) védőburkolattal. Az áramlási sebességet és az acetonitril:víz arányt a mérés során programozva változtatták szobahőmérsékleten. A diódasoros detektor 180 és 500 nm között pásztázott. A meghatározáshoz a 210, 254 és 280 nm-en mért értékeket használták fel. A minőségi meghatározás a retenciós idők 14

15 összehasonlításával és az UV-abszorbancia spektrum referencia standardokkal történő összehasonlításával történt [1]. 2.4 Gázkromatográfia Az analitikai feladatok esetén problémát jelent a szelektivitás egy adott komponensre nézve. Ezért szükséges lehet a mátrix egy részének elválasztásra a mérendő komponenstől. Erre a problémára a megoldást az anyagok különbözőségében kell keresni. Eltérő tulajdonságokkal rendelkező anyagok esetén többek között desztillációval, folyadék-folyadék extrakcióval vagy kicsapással is megoldható az elválasztás. Viszont hasonló anyagok esetén a kromatográfia vagy az elektroforézis alkalmazható [22]. Kromatográfiában valamilyen fluidum mozog egy helyhez kötött fázishoz képest. A mozgófázis halmazállapota alapján megkülönböztetünk gázkromatográfiát, folyadékkromatográfiát és szuperkritikus fluidum kromatográfiát. Az állófázis lehet szilárd vagy folyadék halmazállapotú *18, 22]. A két fázis között dinamikus anyagátmenet a jellemző, melynek hajtóereje a fázisok között kialakuló potenciálkülönbség. Egy minta akkor mérhető gázkromatográfiás úton, ha a komponenseit az injektorban bomlás nélkül el tudjuk párologtatni. A minta különböző molekulái az állófázissal eltérő mértékű és típusú kölcsönhatásokat alakítanak ki, ezáltal eltérő időket töltenek az állófázisban. A komponensek ezáltal eltérő átlagos sebességgel haladnak előre és időben elkülönülve hagyják el a kolonnát. Az elválasztott komponensek a lángionizációs detektorba kerülnek. A diffúziós lángot a gázáramhoz kevert hidrogén meggyújtása és levegővel történő körülöblítése tartja fent az elektródként is funkcionáló mikroégőn. A lángban gyökös reakcióban elégnek a minta komponensei és a szerves vegyületek szénatomszámával arányos mennyiségű elektron keletkezik, mely a mikroégő és a kollektor elektród között mérhető jelet ad. Az elpárologtatható szerves vegyületek a formaldehid és a hangyasav kivételével mind mérhetők ezzel a detektálási módszerrel [18]. 15

16 2. Ábra: Gázkromatográf készülék általános felépítése T,Sz.: Tisztító és szárító egység, Ny: nyomásszabályozó, Á: áramlásszabályozó, B: injektor, K: kolonna, D: detektor, E: erősítő, A/D: konverter, C: számítógép. Az 1,2,3 és 4 az interaktív kapcsolatokat jelöli *18]. 2.5 Validálási paraméterek A validálás egy eljárás, mely igazolja és dokumentálja, hogy a mérési módszer teljesítményjellemzői megfelelnek a feladat megoldásához. Szelektivitás: A mérési módszer képes különbséget tenni az analit és a mátrix komponensei között. Érzékenység: Az analitikai módszer kalibrációs görbéjének meredeksége, mely azt fejezi ki, hogy egységnyi koncentrációváltozásra a jel mennyivel változik meg. Kimutatási határ (LOD): A mérendő komponens legkisebb koncentrációja, amely megfelelő biztonsággal megkülönböztethető a vak minta jelétől. Általában a válaszjel várható értéke a vak válaszjelének várható értéke plusz a vak válaszjel szórásának a háromszorosa. 16

17 Meghatározási határ (LOQ): A mérendő komponens legkisebb koncentrációja, amely megfelelő biztonsággal meghatározható. A megadási az analitikai problémánál megengedhető hibától is függ, de általában a vak válaszjelének várható értéke plusz a vak válaszjel szórásának tízszerese [22]. Lineáris tartomány: A linearitási tartomány az analitikai jelleggörbe a kimutatás alsó és felső határa közötti szakasza. A kimutatás felső határa az a mennyiség, mely mérése során a jel ±5%-kal eltér az egyenestől *18]. Helyesség (pontosság): A rendszeres hiba mértékét jellemzi, melyet a mérés várható értéke és a valódi érték különbségével határozunk meg. Precizitás: A precizitást a mérés tapasztalati szórásával, esetleg a relatív szórásával (RSD) jellemezhetjük. Ismételhetőség esetén a minden körülmény azonos, míg a reprodukálhatóságnál azonos módszer esetén másik laborban másik műszerrel és kezelővel végzik el a mérést. Visszanyerés: A rendszeres hibát jellemzi bonyolult minták esetén alkalmazva. A mért koncentráció és a valós koncentráció, vagy koncentrációnövekedés aránya százalékos formában kifejezve. A meghatározása mátrix referencia anyagok mérésével, mintaerősítéssel vagy kísérő standard alkalmazásával lehetséges. Robosztusság: A módszer robosztus akkor, ha a mérési körülmények (pl. áramlási sebesség, detektor hőmérséklete) kis mértékű megváltozása a mérési eredményre csak kis mértékben van hatással [22]. 17

18 3. Módszerfejlesztés 3.1 A mérés célja A méréseim során egy olyan módszer kidolgozását tűztem ki célul, mely alkalmas gerániol megfelelő pontossággal történő mennyiségi meghatározására gázkromatográfiával. A módszer elkészítését az irodalomra, a laborban használt korábbi mérésekre és próbamérésekre alapoztam. Az analitikai teljesítményjellemzőket részleges validálással vizsgálva bizonyosodtam meg a módszer alkalmazhatóságáról. A vizsgálatokat bolhariasztó szerként forgalomba hozható spray, sampon és nyakörv mintákon végeztem. Ezen minták mérésére a módszer kidolgozása elengedhetetlen, hiszen a gerániol hatásos mennyiségben kell jelen legyen a termékekben, viszont az allergén hatása miatt nagy mennyiségű használata nem javasolt. Az eltérő összetételű minták miatt különböző előkészítési módszerek kidolgozása szükséges. 3.2 A módszer kidolgozása Mintaelőkészítés A minták megjelenése is már sejtette, hogy nem lesz elegendő egy mintaelőkészítési módszer a három mátrixra. Míg a sampon egy viszkózus folyadék formájában volt jelen, a spray egy kétfázisú rendszert alkotott, a nyakörv pedig műanyagból készült. A mérések előtt oldószerpróbát végeztem a mintákon. A spray oldása már több problémát vetett fel. Nem sikerült homogén oldatot készítenem az irodalomban használt hexánnal *23+, acetonnal *21+ és acetonitrillel *1+, de még metanollal sem. Megfelelő oldószernek az izopropanol bizonyult. Az izopropanol szerencsére alkalmas volt a sampon feloldására is. A nyakörv esetén a laborban használt korábbi mérés ultrahangos extrakcióját alkalmaztam. Az ultrahangos próba során az izopropanol nem vezetett eredményre. A laborban a nyakörv esetén hexán:diklór-metán 1:1 arányú elegyét alkalmazták. Ebből kiindulva izopropanol:diklór-metán 1:1 eleggyel és hexán:diklór-metán 1:1 eleggyel is elvégeztem az ultrahangos mérést. Az izopropanol:diklór-metán elegy már hatásos volt, lényegében a hexán:diklór-metán 18

19 eleggyel megegyező eredménnyel. A próba során bebizonyosodott, hogy a PVC nyakörvet a diklór-metán megduzzasztja, míg a gerániolt a hexán és az izopropanol is kioldja az anyagból. Az oldáspróba alapján a kísérő standardot is izopropanolban oldottam fel. Kísérő standard gyanánt n-oktanolt választottam, ami a gerániolhoz hasonlóan egy hosszú szénláncú alkohol és forráspontja is közel azonos. A mérésekhez használt névlegesen 1 mg/ml koncentrációjú oldatokat gerániol és n-oktanol standardok felhasználásával készítettem el. Egy-egy 20,00 ml-es mérőlombikba megközelítőleg mg gerániolt, illetve n-oktanolt mértem be. Izopropanollal jelre töltöttem a mérőlombikokat, majd összeráztam az oldatokat. A spray két fázisát összerázással tudtam homogenizálni, de a fázisok különválása már a bemérés során megtörtént. A minta homogenizálását a flakon teljes tartalmából történő törzsoldat készítésével oldottam meg izopropanol oldószerrel. A méréshez körülbelül 2,0-2,5 g törzsoldatot pipettáztam egy 10,00 ml-es mérőlombikba. Az oldathoz 1,00 ml névlegesen 1,00 mg/ml koncentrációjú kísérő standardot adtam, izopropanollal jelre állítottam a mérőlombikot és alaposan összeráztam. A samponból összerázással homogén mintát lehetett venni. Bemérése viszont nehézséget okozott. Nagy viszkozitása miatt a pipettába felszívott mennyiséget nehezen lehetett leereszteni, az anyag a pipetta falán maradt. A flakon tartalmának alapos felrázása után körülbelül 2,0 g mintát pipettáztam egy 10,00 ml-es mérőlombikba. A bemérést a sprayhez hasonlóan analitikai mérleggel végeztem. A samponhoz 1,00 ml névlegesen 1 mg/ml koncentrációjú kísérő standardot adtam, majd a mérőlombikot jelre töltöttem izopropanollal és homogenizáltam. A nyakörv méréséhez a mintát fel kellett aprítani az extrakcióhoz, mivel a nyakörv vágása során megfigyeltem, hogy a hatóanyag nem egyenletesen oszlik el a műanyagban. Az összevágott darabokat összekevertem és egy csavaros tetejű headspace üvegbe bemértem analitikai mérlegen 1 g-ot a mintából. Az üvegbe 1,00 ml n-oktanol oldatot pipettáztam, majd 2,00 ml izopropanol:diklór-metán 1:1 arányú elegyét adtam hozzá. A lezárt üveget a labor korábbi mérései alapján 25 percen át ultrahangoztam. Az ultrahangozás letelte után megvártam, míg lehűl a minta. Az 19

20 extraktot 5,00 ml-es mérőlombikba pipettáztam. A visszamaradt nyakörvdarabokhoz kevés izopropanolt adtam és vortexeltem. Az oldatot a mérőlombikba pipettáztam, majd ezt a műveletet még kétszer elvégeztem. A mérőlombikot izopropanollal jelre állítottam és összeráztam. Az előkészítés során megvizsgáltam, hogy az aprított nyakörv mérete mennyire befolyásolja a kioldott gerániol mennyiségét. A mérés eredményeképp minél kisebbre sikerült vágni a nyakörvet, annál nagyobb mennyiségben sikerült a gerániolt detektálni. A minta méretének hatását a 3. Ábra mutatja be uv(x10,000) min 3. Ábra: Nyakörv kromatogramja kis (kék) és nagy (piros) méretű darabok extrahálása után Az alkalmazott készülék beállítása A mérésekhez egy Shimadzu GC-2010 típusú gázkromatográfot használtam Shimadzu AOC-20i automata injektorral és lángionizációs detektorral felszerelve. Az injektor hőmérsékletét 290 C-ra állítottam be, mely az irodalmi C-hoz képest magas, de korábban a laborban a nyakörvet ezen a hőmérsékleten mérték. A felhasznált anyagok forráspontját ismertem, melyhez alacsonyabb hőmérséklet is elegendő lett volna. Viszont a mátrix összetétele ismeretlen volt számomra, mely könnyen tartalmazhatott ennél magasabb forráspontú komponenseket is. 20

21 oktanol gerániol Az injektálás során 1:100 splittarányt alkalmaztam, mely megfelel az irodalomnak [14, 15]. Vivőgázként az irodalomban gyakran alkalmazott hélium *4, 6, 12, 14, 15] helyett az olcsóbb hidrogént *16+ választottam, mely a detektor működtetéséhez egyébként is szükséges. 45 cm/perc állandó lineáris áramlási sebességgel dolgoztam, mely a kolonnára jutó térfogatáramban 1,69 ml/percnek felel meg, mely nagyjából megegyezik a Lamiaceae-család illóolajának mérésekor alkalmazott 1,5 ml/perc térfogatárammal *14]. A kolonna kiválasztásakor a gyakran alkalmazott 5% difenil- 95% dimetilpolisziloxán állófázisú *9, 14, 18, 19, 23] ZB-5 kolonnára esett a választásom, melynek hossza 30 m, átmérője 0,25 mm és filmvastagsága 0,25 µm. A kolonna nem bizonyult megfelelőnek az elválasztásra. A kapott csúcsok tailingesek voltak, mely az integrálásban jelentett hibát. Ez akkor látszódott meg, amikor a gerániolból és n- oktanolból készített oldatokat és tízszeres hígításukat megmértem. Az eredeti oldatnál kapott értékből a tízszeres hígításnál tizedannyi koncentrációt vártam, de a várt érték 50-70%-át sikerült csak mérni. Ezért egy polárisabb kolonnára tértem át, mely a poláris alkohol mérésére alkalmasnak tűnt. Az új kolonnához polietilén-glikol állófázist választottam [8, 15, 16, 17, 18, 20]. A választott ZB-WAX kolonna 30 m hosszú, 0,25 mm átmérőjű és 0,25 µm filmvastagsággal rendelkezett. A két kolonnán standardokkal végzett mérés kromatogramjai a 4. és az 5. Ábrán szerepelnek uv(x10,000) Chromatogram min 4. Ábra: A standardok kromatogramja a ZB-5 típusú kolonnán 21

22 Oktanol Gerániol uv(x10,000) Chromatogram min 5. Ábra: A standardok kromatogramja a ZB-WAX típusú kolonnán A kolonna hőmérsékletprogramja során az irodalmi kezdőhőmérsékletek [6, 9, 16, 17] alapján 40 C-ról indult a mérés, melyet 1 percig izotermen tartottam. A véghőmérséklet a kolonnacsere miatt megváltozott, mivel a ZB-WAX kolonna esetén a maximális alkalmazási hőmérséklet 250 C. A próbamérések során a lineáris hőmérsékletprofil alkalmazása nem hozott megfelelő eredményt, így lépcsős hőmérsékletprofilt kellett kialakítanom. A véghőmérsékletet azért kellett hosszan tartanom, hogy a kolonnán esetleg rajta maradó komponensek is végighaladjanak a kolonnán és ne zavarjanak a következő mérés során. A végleges hőmérsékletprogramot az 1. Táblázat tartalmazza. Hőmérséklet-emelkedés sebessége [ C/perc] Végső hőmérséklet [ C] Időtartam [perc] , , , ,00 1. Táblázat: Az alkalmazott hőmérsékletprogram A lángionizációs detektort az irodalomnak megfelelően 250 C-on [4, 6, 15] működtettem további hidrogén, levegő és nitrogén detektorgázok felhasználásával. A készülék tisztítása minden reggel lefuttatott kondicionálással történt. Ehhez a sampon és a nyakörv mátrix bonyolultsága miatt egy külön hőmérsékletprogramot 22

23 is alkalmaztam. Ennek hatására a kolonnán rajta maradt vegyületek is teljesen kromatografálódtak és nem okoztak problémát a következő mérésnél. Bizonyos számú mérés után kicseréltem a szeptumot és a linerben a kvarcgyapotot. 3.3 A teljesítményjellemzőkkel szemben támasztott követelmények A részleges validálás előtt meghatároztam az irodalmi adatok és a szakmai gyakorlat során szerzett tapasztalatok alapján a teljesítményjellemzőkkel szemben támasztott követelményeimet. Az elvárásaim a 2. Táblázat tartalmazza. Teljesítményjellemző Követelmény Kalibráció R 2 0,99 Mérőműszer precizitás RSD < 5% Módszer helyessége 75% REC 125% Módszer precizitása RSD 15 Robosztusság RSD 10% 2. Táblázat: A részleges validálás során elvárt követelmények 3.4 A mérés menete Specificitás A mérés során a gerániolt és az n-oktanolt standard oldatok mérése alapján a retenciós időket összehasonlítva azonosítottam a mintákban. A gerániol és az n- oktanol esetében a csúcstisztaságot az oldószer kromatogramja és a mintákban a szomszédos csúcsokra vonatkozó felbontóképesség alapján állapítottam meg. Linearitás és kalibráció A próbamérések során meghatározott koncentrációk alapján kijelöltem a mérési tartományt, melyen a linearitást vizsgáltam. Az n-oktanol és a gerániol standardból meghatározott koncentrációjú hígítási sort készítettem. A törzsoldat bemérését a 3. Táblázat, míg az 5 munkaoldat elkészítését a 4. Táblázat tartalmazza. Törzsoldat (TO) Bemérés [g] Mérőlombik térfogata [ml] 23 Névleges koncentráció Valós koncentráció 10,085 n-oktanol 0, Gerániol 0, , Táblázat: A törzsoldat elkészítése a hígítási sorhoz

24 Munkaoldat 1 (M1) Munkaoldat 2 (M2) Munkaoldat 3 (M3) Munkaoldat 4 (M4) Munkaoldat 5 (M5) Komponensek Elkészítés Mérőlombik [ml] Névleges koncentráció Valós koncentráció 5,0425 n-oktanol 2 5,00 ml 20 5 Gerániol TO 4,9750 n-oktanol 1,0085 2,00 ml TO 20 1 Gerániol 0,9950 n-oktanol 0,5043 2,00 ml M1 20 0,5 Gerániol 0,4970 n-oktanol 0,1009 4,00 ml M3 20 0,1 Gerániol 0,0995 n-oktanol 0,0504 2,00 ml M3 20 0,05 Gerániol 0, Táblázat: A hígítási sor elkészítése A kalibrációhoz ugyanezen oldatokat alkalmaztam, mivel elkészítésük hasonlóan történt volna. Az oldatokat háromszor lemértem, majd a kiértékelő szoftver segítségével felvettem a kalibrációs egyenest és meghatároztam a kimutatási és meghatározási határokat. Precizitás A rendszer precizitását a véletlen hiba jellemzi, melyet a koncentráció és a retenciós idő relatív szórásával lehet számszerűen megadni. Ehhez a kalibrálás során felhasznált névlegesen 0,5 mg/ml koncentrációjú munkaoldatát mértem le ötször. Visszanyerés-vizsgálat A visszanyerés-vizsgalát során 3 mintának meghatároztam a geránioltartalmát. Majd ugyanabból a 3 mintából előkészítettem még 3 mintát, de az n-oktanol mellett gerániolt is adtam a mintákhoz. A sprayhez 1,00 ml névlegesen 1 mg/ml koncentrációjú gerániol oldatot, míg a nyakörvhöz 0,50 ml névlegesen 10 mg/ml gerániolt adtam. A sampon esetében 2,00 ml névlegesen 10 mg/ml koncentrációjú gerániolt adtam. A mérések eredményei alapján meghatároztam a gerániol visszanyerését. A módszer precizitását mintánként 3 mérés alapján határoztam meg. Robosztusság A módszer robosztusságát 3 mérési paraméter megváltoztatásával végeztem. Először az injektor hőmérsékletét 280 C-ra csökkentettem 290 C-ról. Ezután a lineáris áramlási sebességet 45 cm/s helyett 60 cm/s-ra növeltem. A harmadik esetben a 24

25 hőmérsékletprogram első felfűtési szakaszát 20 C/perc sebességre növeltem és kivettem a 3 C/perc-es felfűtési részt. A mérés során a névlegesen 0,1 mg/ml koncentrációjú kalibráló oldatot mértem meg az új paraméterekkel 3-3 alkalommal és vetettem össze a mért koncentrációkat a kalibráció során mért értékekkel. 3.5 Eredmények és kiértékelés Specificitás A tiszta oldószer kromatogramja alapján az oldószer alkalmasnak bizonyult a gerániol meghatározására n-oktanol kísérő standarddal. A mérés eredményét a 6. Ábra szemlélteti. 2.5 uv(x10,000) Chromatogram min 6. Ábra: Izopropanol kromatogramja Egy nerolt kisebb mennyiségben tartalmazó gerániol standard segítségével sikerült ellenőrizni a sztereoizomerek elválasztását. A kromatogram a 7. Ábrán látható. 25

26 Nerol Gerániol 3.5 uv(x10,000) Chromatogram min 7. Ábra: Gerániolt és nerolt tartalmazó oldat kromatogramja Az alkalmazott körülmények a sampon és a spray esetében teljes mértékben lehetővé tették a meghatározást, míg a nyakörvben a kísérő standard teljes elválasztását nem sikerült megoldani. A mátrix valamely komponense részben átfed az n-oktanol csúcsával, de még így is megfelelően megadhatók az integrálási határok. Linearitás és kalibráció A mérési eredményekből készített kalibrációs egyenest az n-oktanolra a 8. Ábra, gerániolra a 9. ábra tartalmazza Area(x1,000,000) Conc. 8. Ábra: Az n-oktanol kísérő standard kalibrációs görbéje 26

27 1.50 Area(x1,000,000) Ábra: A gerániol kalibrációs görbéje A kalibrációs egyenesek egyenletét az n-oktanolra az 1. Egyenlet, gerániolra a 2. Egyenlet szemlélteti. Y oktanol = ,5 c oktanol Y gerániol = ,0 c(gerániol) 27 (1. Egyenlet) (2. Egyenlet) A mérés érzékenysége a kalibrációs egyenes meredeksége. A kalibrációs egyenes jóságát a korrelációs együttható jellemzi, mely értéke mindkét komponensre (R 2 =0,99) megfelel a követelményeknek. A kimutatási és meghatározási határ meghatározásához a kalibráló oldatok legkisebb koncentrációjú tagja alapján végeztem el. A névlegesen 0,05 mg/ml koncentrációjú oldat mérésénél a jel és a zaj átlagos magasságát leolvastam a kromatogramról, melyből meghatároztam a jel/zaj viszonyt. A megállapított kimutatási határt (LOD) és meghatározási határt (LOQ) az 5. Táblázat tartalmazza. Koncentráció Csúcsmagasság [mv] LOD LOQ n-oktanol 0, ,0022 0,0073 Gerániol 0, ,0040 0,0132 Zaj Táblázat: A módszer kimutatási és meghatározási határa tartalmazza Conc. Precizitás A precizitás vizsgálata során kapott eredményeket a 6. és a 7. Táblázat

28 n-oktanol Gerániol t R1 [min] 8,693 14,708 t R2 [min] 8,693 14,709 t R3 [min] 8,694 14,707 t R4 [min] 8,694 14,707 t R5 [min] 8,694 14,708 Átlag [min] 8,694 14,708 s [min] 0,001 0,001 RSD [%] 0,006 0, Táblázat: A retenciós idők ismételhetősége n-oktanol Gerániol c 1 0,4510 0,4465 c 2 0,4496 0,4472 c 3 0,4490 0,4464 c 4 0,4544 0,4512 c 5 0,4521 0,4492 Átlag 0,4512 0,4481 s 0,0022 0,0021 RSD [%] 0,5 0,5 7. Táblázat: A koncentrációk mérésének ismételhetősége A precizitást a koncentrációk és retenciós idők esetén számított relatív szórással (RSD) jellemeztem. Először a mérési eredményekből átlagot számítottam a 3. Egyenlet alapján. Egyenlettel. c átlag = n i=1 c i n (3. Egyenlet) A kapott eredményekből kiszámítottam a korrigált tapasztalati szórást a 4. s = n i=1 c i c átlag 2 n 1 A relatív szórást ezen adatokból számítottam ki az 5. Egyenlettel. RSD = (4. Egyenlet) s c átlag 100 (5. Egyenlet) A mérési eredményekből számított relatív szórások (RSD) megfelelnek a velük szemben támasztott követelményekkel a retenciós idők és a koncentrációk esetében is mindkét vegyületre. Ezek alapján a rendszer precizitása megfelelő. 28

29 Gerániol Oktanol Visszanyerés-vizsgálat A névlegesen 1 mg/ml koncentrációjú n-oktanol kísérő standardból 1,00 ml-t pipettáztam a mintákhoz. A módszer jóságát jellemző kísérő standard visszanyerések % közötti értéket vettek fel, melyek megfelelnek az elvárásoknak. Mivel a kiválasztott 3-3 mintában jelentősen eltért a gerániol mennyisége, ezért a módszer precizitásának meghatározásához a visszanyerés-vizsgálat során hozzáadott gerániol mennyiségét használtam fel. A spray minta kromatogramját a 10. Ábra szemlélteti. uv(x10,000) Chromatogram min 10. Ábra: Spray minta kromatogramja A minták koncentrációit a mintaerősítés nélküli mérésekből határoztam meg, melyet a 8. Táblázat tartalmaz. Mért koncentráció Oldat geránioltartalma [mg] Bemért minta tömege [g] Spray geránioltartalma [mg/g] Spray 1 0,0087* 0,087 2, ,041* Spray 2 0,0549 0,549 2, ,221 Spray 3 0,0297 0,297 2, , Táblázat: A spray minták koncentrációja * A mért koncentráció a meghatározási határ alatt van. Az oldat geránioltartalmát az 6. Egyenlet alapján végeztem el. m ger ániol,oldat = c mért V oldat (6. Egyenlet) 29

30 számítottam. A minta geránioltartalmát a bemért spray mennyiségéből a 7. Egyenlettel c minta = m ger ániol,oldat m minta A párhuzamos mérések eredményeit a 8. Táblázat mutatja be. Mért koncentráció Oldat geránioltartalma [mg] Bemért minta tömege [g] Hozzáadott gerániol [mg] Átlag [mg] (7. Egyenlet) s [mg] Spray 1 REC 0,1486 1,486 2, ,382 Spray 2 REC 0,1865 1,865 2, ,362 1,363 0,018 1,3 Spray 3 REC 0,1654 1,654 2, , Táblázat: Spray minták geránioltartalma A hozzáadott gerániol mennyiségét a 8. Egyenlettel határoztam meg. RSD [%] m hozz áadott = m oldat c minta m minta (8. Egyenlet) Az átlagot, szórást és relatív szórást a 3., 4. és 5. Egyenletekkel számítottam ki. A kapott relatív szórások (RSD) megfelelnek a támasztott követelményeknek. A módszer precizitása megfelel a spray minták mérése során. A visszanyerés-vizsgálat során elvégzett mérés a spray mintával eredményeit a 9. Táblázat tartalmazza. Mért koncentráció Oldat geránioltartalma [mg] Bemért minta tömege [g] Névleges geránioltartalom [mg] REC [%] Spray 1 REC 0,1486 1,4857 2, , ,1 Spray 2 REC 0,1865 1,8645 2, , ,2 Spray 3 REC 0,1654 1,6539 2, , ,1 9. Táblázat: A spray visszanyerés-vizsgálatának eredménye Az oldat geránioltartalmát az 6. Egyenlet alapján számítottam. A névleges geránioltartalom a 9. Egyenlet alapján számítható. m ger ániol,számított = m minta c minta + V ger ániol c ger ániol (9. Egyenlet) A visszanyerést (REC) a 10. Egyenlet alapján határoztam meg. REC = m ger ániol,m ért m ger ániol,szám ított 100 (10. Egyenlet) Az eredmények alapján a visszanyerés az elfogadható tartományon belül van. A sampon minta kromatogramja a 11. Ábrán látható. 30

31 Oktanol Gerániol uv(x10,000) Chromatogram min 11. Ábra: Sampon minta kromatogramja A sampon minták koncentrációit a 10. Táblázat tartalmazza. Mért koncentráció Oldat geránioltartalma [mg] Bemért minta tömege [g] Sampon geránioltartalma [mg/g] Sampon 1 1, ,176 2, ,365 Sampon 2 1, ,164 2, ,206 Sampon 3 1, ,321 2, , Táblázat: A Sampon minták koncentrációi be. A sampon minta párhuzamos méréseinek eredményét a 11. Táblázat mutatja Mért koncentráció Oldat geránioltartalma [mg] Bemért minta tömege [g] Hozzáadott gerániol [mg] Sampon 1 REC 3, ,988 2, ,025 Átlag [mg] s [mg] Sampon 2 REC 4, ,570 2, ,155 21,088 0,065 0,3 Sampon 3 REC 3, ,227 2, , Táblázat: A sampon minta párhuzamos méréseinek eredménye RSD [%] A kapott relatív szórások (RSD) megfelelnek a támasztott követelményeknek. A módszer precizitása megfelelő a sampon minta mérése során. 31

32 Oktanol Gerániol találhatók. A visszanyerés-vizsgálat eredményei a sampon mintára a 11. Táblázatban Mért koncentráció Oldat geránioltartalma [mg] Bemért minta tömege [g] Névleges geránioltartalom [mg] REC [%] Sampon 1 3, ,9875 2, , Sampon 2 4, ,5698 2, , Sampon 3 3, ,2272 2, , Táblázat: A sampon minta visszanyerésének meghatározása A számított visszanyerés értékek (REC) alapján a módszer megfelel a követelményeknek. A nyakörv minta kromatogramját a 12. Ábra mutatja be. uv(x10,000) Chromatogram min 12.Ábra: Nyakörv minta kromatogramja A nyakörv minták koncentrációit a 13. Táblázat tartalmazza. Mért koncentráció Oldat geránioltartalma [mg] Bemért minta tömege [g] Nyakörv geránioltartalma [mg/g] Nyakörv 1 0,7660 3,830 1, ,635 Nyakörv 2 0,9031 4,515 0, ,588 Nyakörv 3 0,9193 4,597 0, , Táblázat: A Nyakörv minták koncentrációi 32

33 A nyakörv minták mérési eredményei a 14. Táblázatban találhatók. Mért koncentráció Oldat geránioltartalma [mg] Bemért minta tömege [g] Hozzáadott gerániol [mg] Nyakörv 1 REC 1,6478 8,239 1, ,544 Átlag [mg] s [mg] Nyakörv 2 REC 1,7871 8,936 0, ,462 4,616 0,200 4,3 Nyakörv 3 REC 1,8802 9,401 0, , Táblázat: A nyakörv minta mérésének eredményei RSD [%] A kapott relatív szórások (RSD) teljesítik a korábban megfogalmazott elvárásokat. A nyakörv minták mérése megfelelően precíz. tartalmazza. A visszanyerés-vizsgálat eredményeit a nyakörv mintára a 15. Táblázat Mért koncentráció Oldat geránioltartalma [mg] Bemért minta tömege [g] Névleges geránioltartalom [mg] REC [%] Nyakörv 1 1,6478 8,2388 1, , ,7 Nyakörv 2 1,7871 8,9357 0, , ,2 Nyakörv 3 1,8802 9,4011 0, , ,3 15. Táblázat: A nyakörv visszanyerés-vizsgálatának eredményei Az visszanyerés-vizsgálat eredményei (REC) megfelelnek az elvárásoknak. Robosztusság Mivel a robosztusság meghatározásánál nagyobb változtatásokat is végeztem az áramlási sebesség és a hőmérsékletprogram esetén, így nem várom el a retenciós idők robosztusságát és csak a koncentrációkat vizsgálom. Az injektor hőmérsékletének 10 C-kal történő csökkentés esetén kapott kromatogramot a 13. Ábra mutatja be. 33

34 10.0 uv(x1,000) min Komponens n-oktanol Gerániol 13. Ábra: Az injektor hőmérsékletének hatása a mérésre (Piros színnel az eredeti 290 C-os, kék színnel a 280 C-os injektorral.) Az eredményeket a 16. Táblázat tartalmazza. c mért,eredeti c mért,módosított 0,0887 0,0897 0,0884 0,0892 0,0883 0,0887 0,0887 0,0890 0,0878 0,0889 Átlag s RSD [%] 0,0888 0,0005 0,6 0,0885 0,0008 0,9 0,0874 0, Táblázat: Az injektor hőmérsékletének hatása a koncentrációkra Az átlagot és a szórást (s) a 6 koncentrációra és relatív szórás (RSD) értékeket a 3., 4. és 5. Egyenlet alapján határoztam meg. Mivel a koncentrációk esetén számított relatív szórás a megengedett tartományon belül van, így mondhatjuk, hogy a módszer az injektor hőmérsékletének megváltoztatására robosztus. Az áramlási sebesség megnövelése esetén jól látható a 14. Ábrán, hogy a 60 cm/s áramlási sebességgel a retenciós idők csökkenését eredményezte. 34

35 uv(x1,000) 10.0Chromatogram min 14. Ábra: Az áramlási sebesség hatása a mérésre (A piros az eredeti 45 cm/s, míg a kék a 60 cm/s áramlási sebességgel) A mérési eredményeket a 17. Táblázat tartalmazza. Komponens n-oktanol Gerániol c mért,eredeti c mért,módosított 0,0887 0,0878 0,0884 0,0871 0,0883 0,0864 0,0887 0,0866 0,0878 0,0865 Átlag s RSD [%] 0,0878 0,0009 1,0 0,0872 0,0010 1,1 0,0874 0, Táblázat: Az áramlási sebesség megváltoztatásának hatása A koncentrációkra számított relatív szórás az áramlási sebesség megváltoztatására is 10%-nál kisebb érték, így a módszerem az áramlási sebességet tekintve robosztusnak mondható. A hőmérséklet program esetén a lassú fűtési szakasz kihagyása és a kezdeti fűtési sebesség megnövelése a retenciós idők nagymértékű lerövidülését eredményezte, melyet a 15. Ábra szemléltet. 35

36 uv(x10,000) min Komponens n-oktanol Gerániol 17. Ábra: A hőmérsékletprogram hatása a mérésre (A piros az eredeti, míg a kék a módosított hőmérsékletprogram) A számítás eredményeit a 18. Táblázat tartalmazza. c mért,eredeti c mért,módosított 0,0887 0,0894 0,0884 0,0893 0,0883 0,0902 0,0887 0,0894 0,0878 0,0895 Átlag s RSD [%] 0,0890 0,0007 0,8 0,0888 0,0010 1,2 0,0874 0, Táblázat: A hőmérsékletprogram megváltoztatásának hatása A koncentrációkra a hőmérsékletprogram változása esetén kapott relatív szórások megfelelnek az elvárásoknak, így a módszer robosztusnak tekinthető. 36

37 4. Összefoglalás Célom egy olyan gázkromatográfiás mérés kidolgozása volt, mellyel megfelelő pontossággal mérhető rovarriasztó szerek geránioltartalma. A mérés során sikerült elválasztanom a gerániolt cisz izomerjétől, a neroltól. A választott oldószer és a minta egyéb komponensei sem zavarták a gerániol meghatározását. Az n-oktanol kísérő standard esetében a nyakörvben lévő vegyületek zavarták a meghatározást, de az integrálási határok még így is meghatározhatóak. A gerániolra és n-oktanolra készített hígítási sorral vizsgáltam a linearitási tartományt. A linearitási méréseket felhasználva elkészítettem a kalibrációs egyenest mindkét komponensre. A kalibráció jóságát jellemző R 2 értéke nagyobb, mint 0,99, így a kalibráció alkalmas a minták mennyiségi meghatározására. A legalsó kalibrációs pont alapján a jel/zaj arány háromszorosaként a kimutatási határt (LOD), tízszereseként a meghatározási határt (LOQ) is kiszámítottam a módszerhez. A rendszer precizitását a hígítási sor egyik tagjának ötszöri lemérésével határoztam meg. A retenciós idők és a koncentrációk esetében is a relatív szórás (RSD) 1% alatt van, mely bőven teljesíti az elvárásokat. A mintaelőkészítés jóságát egyrészt a kísérő standard visszanyerésének az ellenőrzésével, másrészt a mintához hozzáadott gerániol mennyiségének a mérésével vizsgáltam. A visszanyerés 90 és 110% között változott. Ezeknek a méréseknek a relatív szórása (RSD) 5% alatt volt, mely megfelel a helyességgel szemben támasztott követelményeknek. A rendszer robosztusságát 3 műveleti paraméter megváltoztatásával vizsgáltam. A vizsgálat során a retenciós idők robosztusságát nem várom el, mivel az áramlási sebesség és a hőmérsékletprogram megváltoztatása is jelentősen befolyásolja a retenciót, ezért csak a koncentrációkat vizsgáltam. Az eredeti és a megváltoztatott körülmények között mért koncentrációkból számított relatív szórás 37

38 (RSD) 5% alatt van, mely eleget tesz a feltételeknek. Ezek alapján a módszer a koncentrációk meghatározására robosztusnak tekinthető. A mérési eredmények alapján a módszert alkalmasnak találom gerániol meghatározására a vizsgált rovarriasztó készítményekben. 38

39 5. Irodalomjegyzék [1] C. Villa, R. Gambaro, E. Mariani, S. Dorato; High-performance liquid chromatographic method for the simultaneous determination of 24 fragrance allergens to study scented products; Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis; (2007); 44: [2] G.B. Lockwood; Techniques for gas chromatography of volatile terpenoids from a range of matrices; Journal of Chromatography A; (2001); 936:23 31 [3] Aakanksha Wany Ashutosh Kumar Sivaramaiah Nallapeta Shivesh Jha Vinod K. Nigam Dev Mani Pandey; Extraction and characterization of essential oil components based on geraniol and citronellol from Java citronella (Cymbopogon winterianus Jowitt); Plant Growth Regul; (2014); 73: [4] Hassan Sereshti, Maryam Karimi, Soheila Samadi; Application of response surface method for optimization of dispersive liquid liquid microextraction of water-soluble components of Rosa damascena Mill. essential oil; Journal of Chromatography A,; (2009); 1216: [5] N.S. Ravindra, R.N. Kulkarni; Essential oil yield and quality in rose-scented geranium: Variation among clones and plant parts; Scientia Horticulturae; (2015); 184:31 35 [6] Mehdi Jalali-Heravi, Behrooz Zekavat, Hassan Sereshti; Characterization of essential oil components of Iranian geranium oil using gas chromatography mass spectrometry combined with chemometric resolution techniques; Journal of Chromatography A; (2006); 1114: [7] W. Chen, A.M. Viljoen; Geraniol A review of a commercially important fragrance material; South African Journal of Botany; (2010); 76:

40 [8] D. Sejer Pedersen, Dimitra L. Capone, George K. Skouroumounis, Alan P. Pollnitz Mark A. Sefton; Quantitative analysis of geraniol, nerol, linalool, and α-terpineol in wine; Anal Bioanal Chem; (2003); 375: [9] B. H. Wu, C. X. Yang, Z. C. Liang, W. Liu, Y. J. Wang, C. Y. Liu, S. H. Li; Inheritance of berry volatile compounds in two half-sib grape (Vitis vinifera) populations; Euphytica; (2013); 189: [10] B. Solomon, F.F. Sahle, T. Gebre-Mariam, K. Asres, R.H.H. Neubert; Microencapsulation of citronella oil for mosquito-repellent application: Formulation and in vitro permeation studies; European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics (2012); 80:61 66 [11] A. Lapczynski, S.P. Bhatia, R.J. Foxenberg, C.S. Letizia, A.M. Api; Fragrance material review on geraniol; Food and Chemical Toxicology; (2008); 46: [12] Duccio R.L. Caccioni, Monica Guizzardi, Daniela M. Biondi, Agatino Renda, Giuseppe Ruberto; Relationship between volatile components of citrus fruit essential oils and antimicrobial action on Penicillium digitatum and Penicillium italicum; International Journal of Food Microbiology; (1998); 43:73 79 [13] A. Chisvert, A. Salvador; 6 Perfumes in Cosmetics. Analytical Methods 6.1. Perfumes in Cosmetics. Regulatory Aspects and Analytical Methods for Fragrance Ingredients and other Related Chemicals in Cosmetics; Elsevier B.V.; (2007); 6.1. fejezet [14] Abdullah I. Hussain, Farooq Anwar, Poonam S. Nigam, Satyajit D. Sarker, John E. Moore, Juluri R. Rao, Anisha Mazumdar; Antibacterial activity of some Lamiaceae essential oils using resazurin as an indicator of cell growth; LWT - Food Science and Technology; (2011); 44: [15] Miguel A. Teixeira and Alírio E. Rodrigues; Coupled Extraction and Dynamic Headspace Techniques for the Characterization of Essential Oil and Aroma Fingerprint of Thymus Species; Ind. Eng. Chem. Res.; (2014); 53:

41 [16] Juan Cacho, Liliana Moncayo, Juan Carlos Palma, Vicente Ferreira, Laura Culleré; Characterization of the aromatic profile of the Italia variety of Peruvian pisco by gas chromatography-olfactometry and gas chromatography coupled with flame ionization and mass spectrometry detection systems; Food Research International; (2012); 49: [17] Zihan Qin, Xueli Pang, Dong Chen, Huan Cheng, Xiaosong Hu, Jihong Wu; Evaluation of Chinese tea by the electronic nose and gas chromatography mass spectrometry: Correlation with sensory properties and classification according to grade level; Food Research International; (2013); 53: [18] Dr. Balla József; A gázkromatográfia analitikai alkalmazásai; Edison House Kft.; (2006) [19] Lucia Sanchez-Prado, J. Pablo Lamas, Gerardo Alvarez-Rivera, Marta Lores, Carmen Garcia-Jares, Maria Llompart; Determination of suspected fragrance allergens in cosmetics by matrix solid-phase dispersion gas chromatography mass spectrometry analysis; Journal of Chromatography A,; (2011); 1218: [20] M. Riu-Aumatell, M. Castellari, E. Lopez-Tamames, S. Galassi, S. Buxaderas; Characterisation of volatile compounds of fruit juices and nectars by HS/SPME and GC/MS; Food Chemistry; (2004); 87: [21] B. Desmedt, M.Canfyn, M.Pype, S.Baudewyns, V.Hanot, P.Courselle, J.O. DeBeer, V.Rogiers, K.DePaepe, E.Deconinck; HS GC MS method for the analysis of fragrance allergens in complex cosmetic matrices; Talanta; (2015); 131: [22] Pokol György, Gyurcsányi E. Róbert, Simon András, Bezúr László, Horvai György, Horváth Viola, Dudás Katalin Mária; Analitikai kémia; Typotex Kiadó; (2011) [23] J. Pablo Lamas, Lucia Sanchez-Prado, Carmen Garcia-Jares, Marta Lores, Maria Llompart; Development of a solid phase dispersion-pressurized liquid extraction method for the analysis of suspected fragrance allergens in leave-on cosmetics; Journal of Chromatography A,; (2010) 1217 :

42 6. Köszönetnyilvánítás Ezúton szeretném megköszönni témavezetőmnek Dr. Balla József Tanár Úrnak a szakdolgozat készítése közben nyújtott segítséget és a szakmai tudást, melyet a munkám során elsajátíthattam. Köszönöm Göröcs Noéminek az első mérések során nyújtott útmutatást és külön köszönöm Mátyási Juditnak, hogy a szakdolgozat teljes elkészítése során bármikor fordulhattam hozzá segítségért. Meg kell köszönnöm Kódor Nikolettnek az együttműködést, melynek köszönhetően a laborban folytatott tevékenység jó hangulatban telt. 42

43 7. Függelék I. Függelék: A gerániol biztonsági adatlapja 43

44 44

45 45

46 46