SEMMELWEIS EGYETEM. Doktori (Ph.D.) tézisek BIOANALITIKAI MÓDSZEREK KIDOLGOZÁSA FARMAKOKINETIKAI ÉS METABOLIZMUS VIZSGÁLATOK SZÁMÁRA

Átírás

1 SEMMELWEIS EGYETEM GYÓGYSZERTUDOMÁNYOK DOKTORI ISKOLA Doktori (Ph.D.) tézisek BIOANALITIKAI MÓDSZEREK KIDOLGOZÁSA FARMAKOKINETIKAI ÉS METABOLIZMUS VIZSGÁLATOK SZÁMÁRA DALMADINÉ KISS BORBÁLA Témavezetõ: Klebovich Imre Ds.C. EGIS Gyógyszergyár Rt. Farmakokinetikai Kutató Laboratórium Budapest, 2003

2 DALMADINÉ KISS BORBÁLA Az értekezéshez kapcsolódó elõadások: I. Klebovich, E. Mincsovics, J. Szúnyog, K. Ludányi, T. Karancsi, K. Újszászy, B. Dalmadi Kiss, K. Vékey, Isolation and identification of deramciclane metabolites by OPLC-(DAR) online sample collection combined with MS techniques, 10 th International Symposium on Instrumental Planar Chromatography, Visegrád, May 16-19, Proceedings of Instrumental Planar Chromatography, II. Baloghné Nemes Katalin, Dalmadiné Kiss Borbála, Klebovich Imre, Acyclovir meghatározása humán plazmában HPLC módszerrel, Elválasztástudományi Vándorgyûlés 98, Lillafüred, szeptember 30- október 2., Abstr. p. 39. III. Klebovich Imre, Baloghné Nemes Katalin, Dalmadiné Kiss Borbála, Újszászy Kálmán, Karancsi Tamás, Ludányi Krisztina, Kövesdi István, Vékey Károly, Deramciclane metabolitok izolálása HPLC-Radiokémiai detektorral és azonosítása különbözõ spektroszkópiai módszerekkel kutya vizeletbõl, Elválasztástudományi Vándorgyûlés 98, Lillafüred, szeptember 30- október 2., Abstr. p. 15. IV. Katalin B. Nemes, Gyula Grézal,, Judit Tömlõ, Valentina Patai, Lajos Nagy, Gyula Mózsik, Margit Csörgõ, Imre Szentpéteri, Imre Klebovich, Bioequivalence study of 800 mg acycovir-containing Telviran and Zovirax containing tablets in healthy volunteers, 7 th European ISSX Meeting, Budapest, Hungary, August 22-26, 1999., ISSX Proceeding, 14, 90 (1999). V. Borbála K. Dalmadi, Imre Klebovich, József Szúnyog, Emil Mincsovics, Krisztina Ludányi, Kálmán Újszászy, Tamás Karancsi, Károly Vékey, István Hazai, Isolation and identification of deramciclane metabolites by OPLC- DAR-MS-(MS) technique from dog urine and plasma 7 th European ISSX Meeting, Budapest, Hungary, August 22-26, 1999, ISSX Proceeding, 14, 93 (1999). VI. K. Balogh Nemes, B. Dalmadi Kiss, I. Klebovich, Determination of ambroxol in dog plasma using column switching technique, Balaton Symposium 99 on High Performance Separation Methods, Siófok,Hungary, September 1-3, 1999, Abstr. p BIOANALITIKAI MÓDSZEREK KIDOLGOZÁSA FARMAKOKINETIKAI ÉS METABOLIZMUS VIZSGÁLATOK Ph.D. értekezés Összefoglaló A farmakokinetikai vizsgálatok mind a generikus, mind az originális gyógyszerfejlesztés folyamatához kapcsolódnak. A gyógyszer metabolizmus során a szervezetbe került farmakon, mint testidegen anyag, a szervezet metabolizáló enzimeinek szubsztrátjaként olyan kémiai átalakulásokon megy keresztül, amelyek a farmakon szervezetbõl való kiürülését segítik. Ezen folyamatok minél pontosabb feltárására törekednek az in vitro és in vivo metabolizmus, valamint a farmakokinetikai vizsgálatok, amelyek az originális gyógyszerfejlesztés preklinikai és klinikai fázisában egyaránt szerepet kapnak. A generikus gyógyszerfejlesztés során úgynevezett bioekvivalencia vizsgálat kivitelezésével igazoljuk, hogy a generikus készítmény biológiailag és terápiásan egyenértékû az originális készítménnyel. A különbözõ farmakokinetikai és bioekvivalencia vizsgálatok számára olyan validált bioanalitikai módszer kidolgozására van szükség, amely megfelel a GLP, GALP elõírásainak, alkalmas nagy számú minta gyors elemzésére, és az anyavegyület, az esetleges farmakológiailag aktív metabolit(ok) és a belsõ standard specifikus, szelektív egymás melletti analízisére. Jelen munkám a gyógyszerfejlesztés folyamatához több ponton kapcsolódik. Az általam kidolgozott, a cisapride és az ambroxol meghatározására szolgáló bioanalitikai módszerek a generikus gyógyszerfejlesztés folyamatába illeszkednek. A cisapride humán plazmából való meghatározására szolgáló bioanalitikai módszert bioekvivalencia vizsgálat számára dolgoztam ki. A generikus gyógyszerfejlesztés egy korábbi fázisát szolgálja az ambroxol kutya plazmából történõ meghatározására alkalmas bioanalitikai módszer, amely a tervezett retard készítmény minõségének állatkísérletes vizsgálatára alkalmas. A két bioanalitikai módszert a nemzetközi elõírásoknak megfelelõen validáltam, amely önmagában is kiterjedt vizsgálat sorozatot jelent. Munkám másik része az originális gyógyszerfejlesztéshez kapcsolódik. A deramciclane, mint nembenzodiazepin típusú új anxiolitikus hatású gyógyszerjelölt metabolizmusát vizsgáltam kutya kísérletekben, és humán vizsgálatokban egyaránt. A metabolizmus vizsgálatok során az általunk kidolgozott folyadékkromatográfiaradioaktív detektálás kapcsolt technikákat alkalmaztam a metabolitok izolálására, tisztítására, és mennyiségi meghatározására. Munkám hozzájárult a deramciclane igen bonyolult és fajfüggõ metabolizmusának felderítéséhez.

3 Külön köszönöm Haász Rozália Máriának a kísérletek elvégzésében nyújtott segítségét, a sok biztatást és kedvességet. Köszönöm Filó Gabriellának és Deli Edinának a kísérletek elvégzésében nyújtott Végül, de nem utolsó sorban köszönöm családomnak a támogatást és Saját közlemények I. Imre Klebovich, Emil Mincsovics, József Szunyog, Krisztina Ludányi, Tamás Isolation and identification of metabolites of 3 H- and 14 C-deramciclane by OPLC-digital autoradiography on-line sample collection and mass spectrometry JPC J. Planar Chromatogr. 11: II. Borbála Dalmadi Kiss, Katalin Balogh Nemes, Iván Ürmös, József Szúnyog, Imre Klebovich Determination of ambroxol in dog plasma by high performance liquid chromatography and UV detection. Chromatographia 51: S III. Borbála Dalmadi Kiss, Emil Mincsovics, Katalin Balogh Nemes, Imre Klebovich Applications of OPLC-DAR and HPLC-RD tecniques in metabolite research JPC, J. Planar Chromatogr. 13: IV. E. Mincsovics, B. Dalmadi Kiss, Gy. Morovján, K. Balogh-Nemes, I. Klebovich A New Tool in Metabolism Research: Combination of OPLC On-line Radioactivity Detection with HPLC-RD Technique. JPC, J. Planar Chromatogr. 14: V. Gy. Morovján, B. Dalmadi Kiss, I. Klebovich, E. Mincsovics Metabolite Analysis, Isolation and Purity Assessment Using Various Liquid Chromatographic Techniques Combined with Radioactivity Detection. Journal of Chromatogr. Sci, 40: VI. B. Dalmadi Kiss, K. Balogh Nemes, I. Klebovich Determination of Cisapride in Human Plasma by High-Performance Liquid Chromatography and Fluorescence Detection. Chromatographia 57: Bevezetés és célkitûzések A farmakokinetikai és metabolizmus vizsgálatok a gyógyszerkutatás folyamatába több ponton kapcsolódnak. Fontos szerepet töltenek be az originális gyógyszerkutatásban, tehát az új gyógyszerek bevezetését megelõzõ, az egészségügyi hatóságok által elõírt biztonsági (toxicitási, teratológiai, karcinogenitási stb.) vizsgálatokban, a gyógyszerfejlesztés úgynevezett preklinikai és klinikai I. II. és III. fázisában egyaránt. A farmakokinetika tárgya a gyógyszerek felszívódásának, megoszlásának, lebomlásának és kiürülésének kvalitatív, illetve kvantitatív leírása. Az így nyert matematikai modellek felhasználhatók a gyógyszeres terápia optimalizálására, lehetõvé téve az egyén rasszbéli hovatartozását, korát, fizikai és egészségi állapotát például az esetleges csökkent máj- vagy vesemûködését - figyelembe vevõ racionális gyógyszeradagolást. A gyógyszerek a szervezet számára testidegen anyagok (xenobiotikumok), mivel általában nem építi be õket szerkezeti elemeibe és nem használja fel energiaforrásként. A testidegen vegyületek, kémiai szerkezetüknél fogva a szervezet metabolizáló enzimeinek szubsztrátjai lehetnek, és így biokémiai átalakulást szenvednek. Ez a folyamat a gyógyszermetabolizmus, vagy biotranszformáció. Az in vitro és in vivo metabolizmus vizsgálatok célja ennek a folyamatnak a minél pontosabb feltárása. A gyógyszerfejlesztés preklinikai fázisában több állatfajon (egér, patkány, kutya, nyúl) fel kell térképezni a vegyület kvalitatív és kvantitatív metabolikus profilját. A metabolizmus fajspecifikussága miatt azonban még így is szükséges az ember bevonása a metabolizmus vizsgálatokba. Humán metabolizmus vizsgálatokra a gyógyszerfejlesztés klinikai I. fázisában kerül sor. Ezen vizsgálatok során fel kell térképezni a fõ metabolitokat, állatkísérletben toxicitás vizsgálatokat kell végezni velük, és fel kell deríteni esetleges farmakológiai hatásukat. Meg kell ismerni a kiürülési utakat (vizelet, epe, stb.) amibõl a vese és máj betegsége esetén a dózisra vonatkozó megszorításokra lehet következtetni. Fel kell térképezni továbbá az 1

4 toxicitás és a helyes terápia szempontjából. Fontos szerepe van a farmakokinetikai vizsgálatoknak az úgynevezett generikus gyógyszerfejlesztésben is, ahol nem szükséges a fent említett biztonsági vizsgálatok elvégzése, hanem úgynevezett bioekvivalencia vizsgálat kivitelezésével igazoljuk, hogy a generikus készítmény biológiailag és terápiásan egyenértékû az originális készítménnyel, tehát helyettesíthetõk a terápiában. A biológiai egyenértékûséget a teszt és referens készítmény humán plazmában mért koncentráció-idõ adataiból származtatott farmakokinetikai paraméterek egyezésének statisztikus vizsgálatával igazoljuk. A bioekvivalencia vizsgálat klinikai és bioanalitikai fázisból áll. A klinikai fázis tervezésekor meg kell határozni a vizsgálatba bevont önkéntesek számát, a beadandó gyógyszer dózist, a vérvételek számát és idõpontját, és a kezelési periódusok között eltelt úgynevezett kiürülési idõt. A klinikai fázisnak meg kell felelnie a GCP A különbözõ farmakokinetikai és bioekvivalencia vizsgálatok számára olyan validált bioanalitikai módszer kidolgozására van szükség, mely megfelel a GLP, GALP elõírásainak, alkalmas nagy számú minta gyors elemzésére, és az anyavegyület, az esetleges farmakológiailag aktív metabolit(ok) és a belsõ standard specifikus, szelektív egymás melletti analízisére. A fejlõdés az egyre hatékonyabb gyógyszermolekulák fejlesztése irányába mutat, melyek egyre kisebb koncentrációt érnek el az emberi vérben, így egyre alacsonyabb kimutatási határral rendelkezõ bioanalitikai módszerekre van szükség. HPLC módszer kidolgozása fluoreszcens detektálással a cisapride humán plazmából történõ meghatározására ng/ml tartományban a Cisaprid és Coordinax 5 és 10 mg-os tabletták bioekvivalencia vizsgálata számára. 2 alkalmazása a metabolizmus kutatásban lehetõvé teszi az egyes tisztítási, izolálási és mennyiségi meghatározási feladatok idõben és költségben optimális megoldását, és így fontos szerepet kapnak az originális gyógyszerfejlesztés során végzett kutatásban. Köszönetnyilvánítás Köszönöm Prof. Dr. Orbán Istvánnak, az EGIS Rt. vezérigazgatójának, hogy Ph.D. tanulmányaimhoz hozzájárult. Köszönetemet fejezem ki Prof. Dr. Blaskó Gábornak az EGIS Rt. Kutatási igazgatójának és dr. Szentpéteri Imre fõosztályvezetõnek, hogy doktori tanulmányaimat és kísérletes munkámat támogatta és lehetõvé tette. Köszönöm Prof. Dr. Magyar Kálmánnak a Semmelweis Egyetem Gyógyszertudományok Doktori Iskola Experimentális és klinikai farmakológia doktori program vezetõjének, hogy a programban való részvételemet támogatta. Hálás vagyok Dr. Klebovich Imrének, témavezetõmnek, az EGIS Gyógyszergyár Rt. Farmakokinetikai Kutató Laboratóriuma vezetõjének, hogy Ph.D tanulmányaim megkezdésére buzdított, kísérletes munkámat támogatta és segítette, köszönöm a sok bátorítást, publikációim és az értekezés elkészítésében nyújtott segítségét. Köszönöm kollégáimnak, Baloghné Dr. Nemes Katalinnak, Dr. Szúnyog Józsefnek és Grézal Gyulának a szakmai tanácsokat és a sok bátorítást. Külön köszönet illeti Dr. Morovján Györgyöt az értekezés elkészítéséhez nyújtott hasznos tanácsaiért. Hálás vagyok Dr. Mincsovics Emilnek az OPLCs vizsgálatok kivitelezésében nyújtott segítségéért. Köszönöm Dr. Vékey Károlynak és munkacsoportjának, különösképpen Dr. Drahos Lászlónak és Dr. Ludányi Krisztinának a HPLC-MS-MS és GC-MS vizsgálatokban végzett munkáját. Köszönöm Dr. Újszászy Kálmánnak, az EGIS Gyógyszergyár Rt. Szerkezetkutatási Osztálya nyugalmazott vezetõjének a szerkezetkutatási vizsgálatok összehangolását és irányítását, illetve Dr. Kövesdi Istvánnak az NMR vizsgálatokban végzett munkáját. Köszönet illeti szerzõtársaimat a publikációk elkészítésekor végzett közös munkáért. 11

5 komplex kívül a minor metabolitok izolálására és tisztítására is. A folyadékkromatográfia-radioaktív detektálás technikák kombinált alkalmazása nagy mértékben hozzájárult a deramciclane igen bonyolult, faj- és biológiai mátrix függõ metabolizmusának felderítéséhez és ezáltal a gyógyszerbevezetés folyamatához. A laboratóriumban kifejlesztett új technikák (OPLC on-line frakciógyûjtés, OPLC-DAR, on-line OPLC-RD), és a HPLC-RD alkalmasak egyéb gyógyszervegyületek metabolizmusának A vizsgálat során mód nyílt az egyes technikák alkalmazhatóságának összehasonlító vizsgálatára is a metabolizmus kutatás során. Ennek alapján megállapítható, hogy az off-line OPLC-DAR technika alkalmazásával kis mennyiségû minta felhasználásával igen gyors eredmény kapható a metabolit konjugátumok meglétérõl, vagy hiányáról. Fontos szerepe van a technikának a módszerkidolgozás szakaszában is, mivel a startról el nem mozduló komponensek is detektálhatók a vékonyrétegen. Ezáltal elkerülhetõ az esetleges anyagveszteség. Az on-line OPLC frakciógyûjtéssel elkerülhetõ a radioaktív foltok szilikagélrõl való leoldásával járó esetleges anyagveszteség. A szerkezetkutatás vizsgálatok különösen az NMR vizsgálatok - számára nagy mennyiségû, tiszta metabolit izolálására van szükség. Ennek a feladatnak az elvégzésére alkalmas a HPLC-RD illetve az általunk kifejlesztett on-line OPLC-RD technika, ahol a nagy kapacitás szelektív detektálással párosul. A két kromatográfiás módszer kombinálása eredményes lehet a metabolit frakciók tisztításában, az állófázisok eltérõ szelektivitása révén. A HPLC-RD technika a metabolitok kvantitatív meghatározásában is szerepet játszik. Az OPLC-RD felkínálta további lehetõség, hogy DAR vizsgálattal ellenõrizhetõ, hogy nem maradt-e eluálatlan komponens a vékonyrétegen. Mindezek alapján megállapítható, hogy a folyadékkromatográfia-radioaktív detektálás kapcsolt technikák 10 A kidolgozott HPLC-FLD módszer validálása a nemzetközi elõírásoknak megfelelõen. ÚJ HPLC-UV módszer kidolgozása az ambroxol kutya plazmából történõ meghatározására, 75 mg ambroxol tartalmú késleltetett kioldódású gyógyszerkészítmények kutyakísérletben történõ öszehasolító vizsgálata számára. Az új HPLC-UV bioanalitikai módszer validálása a nemzetközi elõírások figyelembe vételével. A folyadékkromatográfia-radioaktív detektálás kapcsolt technikák (OPLC-DAR, OPLC- on-line mintagyûjtés, OPLC- RD, HPLC-RD) alkalmazása a deramciclane, mint új anxiolitikus hatású gyógyszervegyület, metabolit profiljának humán és kutya vizeletben illetve plazmában való feltérképezésére. Az egyes folyadékkromatográfia-radioaktív detektálás kapcsolt technikák módszertani összehasonlítása, és alkalmazhatóságuk vizsgálata a metabolizmus kutatás Kutatási módszerek A cisapride meghatározása humán plazmában HPLC-FLD A mintaelõkészítés szilárd fázisú extrakcióval (SPE) történt 100 mg töltetet tartalmazó Chromabond C8 típusú SPE oszlopon. A kromtográfiás elválasztás és a detektálás Hewlett-Packard 1090 Series II/M folyadékkromatográf, illetve Hewlett-Packard 1046A típusú fluoreszcens detektor alkalmazásával történt. Az elválasztás LiChroCART Purospher RP-18 (5 µm) típusú analitikai 3

6 távolítottam el az analitikai oszlopról. A fluoreszcens detektálás során a λ ex 295 nm, a λ em pedig 350 nm volt. Az ambroxol meghatározása kutya plazmában HPLC-UV A mintaelõkészítés szilárd fázisú extarkcióval történt 100 mg töltetet tartalmazó Bond Elut C18 SPE oszlopon. A kromtográfiás elválasztás és a detektálás Hewlett-Packard 1090 Series II/M folyadékkromatográf segítségével történt, mely magában foglalta az UV diódasoros detektort. Az elválasztás BDS Hypersil C18, 5 µm, 250 X 2,1 mm típusú komponenseket gradiens elúcióval távolítottam el az analitikai oszlopról. Az UV detektálás hullámhossza 210 nm volt. Deramciclane metabolitok izolálása humán és kutya vizeletbõl illetve plazmából A deramciclane extrakciója mind a kutya, mind pedig a humán plazma és vizelet mintákból szilárd fázisú extrakcióval történt 200, illetve 500 mg Lichrolut RP-18 típusú töltetet tartalmazó SPE oszlopon. A kutya vizelet és plazma elemzését OPLC (overpressure layer chromatography) on-line mintagyûjtéssel, illetve OPLC-DAR (digitális autiradiográfia) technikával végeztem. Az on-line gyûjtött metabolit frakciók radioaktív anyag tartalmát folydékszcintillációs számlálóval (LSC) határoztam meg. A humán vizelet esetében a metabolit konjugátumok vizsgálatakor alkalmaztam OPLC-DAR technikát. Az OPLC-s futtatások gradiens elúcióval történtek. A DAR mérések során metilállal (formaldehid-dimetil-acetal) telített argonmetán gázelegy 9:1 arányú keverékét használtam számlálógázként. A gáz hõmérséklete 3,4 C volt, áramlási sebessége 5 ml/perc. A mérések idõtartama 1,5-4 óra volt, a feladattól és a minta radioaktív koncentrációjától függõen. A humán vizelet és plazma 4 Az új, komplex metabolit kutatási módszer alkalmas a major metabolitokon kívül, a minor metabolitok izolálására, tisztítására is. A kapott eredmények a deramciclane humán vizelet metabolit profilját illetõen összhangban vannak a plazmában megjelenõ metabolitok feltérképezése érdekében végzett humán plazma metabolizmus vizsgálat eredményeivel. A humán plazma metabolizmus vizsgálat során tizenhat metabolit szerkezetét sikerült azonosítani. Ezek közül kilenc tekinthetõ fõ metabolitnak, amelyek farmakokinetikai paramétereit sikerült meghatározni. A kámfor-hidroxi-fenilkámfénszulfát metabolit esetében például a t max 3 óra, a C max 30,57 ngeqv/ml, az AUC 0-t 655 ngeqv*h/ml, a t β 1/2 13,23 óra, az MRT 48,46 óra volt. A cisapride humán plazmában történõ meghatározására kidolgozott új bioanalitikai módszer a validálás eredményei alapján alkalmas 20 mg cisapride tartalmú orális gyógyszerkészítmények bioekvivalencia vizsgálata, és egyéb farmakokinetikai vizsgálatok végzése céljára, valamint a cisapride humán plazmában történõ meghatározására ng/ml tartományban. Megállapítható, hogy a kidolgozott HPLC-FLD bioanalitikai módszer a kidolgozáskor az irodalomban fellelhetõ bioanalitikai módszereknél szelektívebb, etikai szempontokból megfelelõbb, mivel a minta elõkészítés csak 1 ml plazmából indul ki, továbbá a mennyiségi meghatározás határa alacsonyabb. A minta elõkészítés gyors, munkaegészségügyi szempontból is kedvezõbb, szilárd fázisú extrakcióval történt. Az ambroxol kutya plazmában történõ meghatározására kidolgozott új HPLC-UV bioanalitikai módszert a nemzetközi elõírások figyelembe vételével validáltam. A validálás eredményei alapján a bioanalitikai módszer alkalmas az ambroxol kutya plazmában történõ meghatározására ng/ml koncentráció tartományban, és ezzel együtt a 75 mg ambroxol tartalmú késleltetett hatóanyag kioldódású (retard) orális gyógyszerkészítmények kutyakísérletben történõ összehasonlító vizsgálatára. 9

7 Deramciclane metabolitok izolálása és meghatározása kutya és humán vizeletben és plazmában Sikerrel alkalmaztam a folyadékkromatográfia-radioaktív detektálás kapcsolt technikákat a deramciclane metabolit profiljának feltérképezésére kutya és humán vizeletben illetve plazmában. A kutya vizelet és plazma esetében OPLC on-line frakciógyûjtést, folyadékszcintillációs számlálást és off-line OPLC-DAR módszert alkalmaztam a metabolitok izolálására. Az on-line mintagyûjtést követõ, második OPLC-s elválasztás során 14 metabolit frakció elválasztására volt lehetõség egyazon rétegen. A detektálást DAR technikával végeztem. A DAR kép alapján lekapart foltok, a szilikagélrõl való leoldást követõen alkalmasak voltak a szerkezet azonosításra. A vizsgálat fontos adatokat szolgáltatott a deramciclane metabolit profiljának megismeréséhez kutya plazmában és vizeletben. A humán vizelet metabolitok izolálását a folyadékkromatográfiaradioaktív detektálás kapcsolt technikák kombinált alkalmazásával sikerült megoldani kihasználva az egyes technikák eltérõ szelektivitását, kapacitását, mintaigényét, kimutatási határát és gyorsaságát. A glükuronid konjugátum metabolitok gyors fingerprint vizsgálatára off-line OPLC-DAR technikát alkalmaztam. A metabolitok szerkezetvizsgálatához (HPLC-MS-MS, NMR) és kvantitatív meghatározásához HPLC-RD elválasztást követõen gyûjtöttem anyagot. Különösen az NMR vizsgálatokhoz volt szükség relatíve nagy anyagmennyiségre, amelyet HPLC-RD elválasztást követõen gyûjtöttem. A problémásabb tisztítási feladatoknál kihasználtam az általunk elsõként kidolgozott on-line OPLC-RD által felkínált eltérõ állófázis szelektivitás és az azonnali mintagyûjtés lehetõségét. Az off-line DAR detektálás alkalmazása az on-line elválasztást követõen lehetõvé tette az esetlegesen a HPTLC rétegen maradt eluálatlan radioaktív komponensek meglétének vizsgálatát. Ez a tény fontos abból a szempontból, hogy ily módon a startponton f értékkel eluálódó komponensek is detektálhatók. A leírt módszerek alkalmazásával huszonhat major és minor metabolitot sikerült azonosítani humán vizeletbõl. 8 minták esetében HPLC-RD (nagy hatékonyságú folyadékkromatográfia-radiokémiai detektálás) elválasztást LichroCART Purosphere RP-18 (5µm) típusú analitikai oszlop segítségével oldottam meg. A metabolitok elválasztása gradiens elúcióval történt 40 fázisú szcintillátort tartalmazó, YG150U4D típusú radioaktív detektor Validálási paraméterek vizsgálata a cisapride humán plazmából történõ meghatározása esetében A cisapride validálásakor vizsgáltam a specificitást és szelektivitást; a kalibrációs függvény linearitását; meghatároztam a detektálhatóság és mennyiségi meghatározás határát; a napok közötti és napon belüli megbízhatóságot; a kinyerési hatásfokot; a rendszeralkalmasságot és a hosszútávú stabilitást. Vizsgáltam ezen kívül a rövidtávú és törzsoldat stabilitást, és bizonyítottam, hogy a kalibráció kiterjeszthetõ plazmával való hígítással. A specificitás/szelektivitás vizsgálat során hat különbözõ személytõl levett plazmát vizsgáltam meg és hasonlítottam össze az extrahált mintákkal. A vizsgálatok alapján a módszert szelektívnek találtam, mivel sem a cisapride, sem pedig a belsõ standard retenciós tartományában nem található interferáló komponens. A cisapride kalibrációs függvényének vizsgálatakor mért 42 kalibrációs pont esetében a torzítatlanság értékek egyszer sem haladták meg a 5

8 Az átlag kalibrációs egyenes maximális torzítatlanság értéke 3,78% volt 100 ng/ml koncentrációnál. A hat kalibrációból számított RSD értékek is a megengedett határokon belül maradtak, a maximális érték 10,13% volt 5 ng/ml koncentrációnál. Az átlag egyenes egyenlete Y= -0, ,012077*X volt. A regressziós együttható r=0,997-nek A validálás alapján a mennyiségi meghatározás alsó határa (LLOQ) a cisapride meghatározás esetében 5 ng/ml-nek, a kimutatási határ (LOD) pedig 1,5 ng/ml-nek adódott. A napok közötti ng/ml koncentrációnál 7,48%, 50 ng/ml koncentrációnál 3,62%, 150 ng/ml koncentrációnál pedig 4,02% volt. A torzítatlanság értéke 10 ng/ml koncentrációnál 0,31%, 50 ng/ml koncentrációnál 0,05%, 150 ng/ml koncentrációnál pedig 1,94%-nak adódott. A kapott értékek a megengedett határokon belül maradtak. A napon belüli megbízhatóság vizsgálatakor az RSD értékek a megengedett 15% alatt maradtak, a maximális érték 8,54% volt. A torzítatlanság maximális értéke 12,28% volt. A rendszer alkalmassági teszt alapján kapott RSD értékek 0,20 és 0,60 % között változtak, bizonyítva a kromatográfiás rendszer megfelelõ mûködését. Bizonyítottam továbbá, hogy a kalibráció kiterjeszthetõ plazmával való hígítással, a plazmaminták ötször felolvasztható fagyott állapotukból, a feldolgozott minták eltarthatók 24 óráig szobahõmérsékleten és 48 óráig hûtõben, illetve hogy stabilak 4 órán keresztül szobahõmérsékleten tárolva a minta feldolgozást megelõzõen. A cisaprideot stabilnak találtam humán plazmában három hónapig 20 C-on történõ tárolást követõen. Validálási paraméterek vizsgálata az ambroxol kutya plazmából történõ meghatározása esetében Az ambroxol esetében vizsgáltam a specificitást és szelektivitást; a kalibrációs függvény linearitását; meghatároztam a detektálhatóság és a mennyiségi meghatározás határát; a napok közötti és napon belüli megbízhatóságot; a kinyerési hatásfokot; a rendszeralkalmasságot és a hosszútávú stabilitást. A specificitás/szelektivitás vizsgálat során hat különbözõ egyedi kutyaplazmát vizsgáltam meg és hasonlítottam össze az extrahált mintákkal. Ennek alapján a módszer szelektívnek bizonyult, mivel nem jelent meg interferáló kromatográfiás csúcs a meghatározandó vegyületek retenciós tartományában. Az ambroxol kalibrációs függvényének vizsgálatakor mért 35 kalibrációs pont esetében a torzítatlanság értékek egyszer sem haladták meg a megengedett határokat. Az átlag kalibrációs egyenes maximális torzítatlanság értéke 4,73% volt 1000 ng/ml koncentrációnál. Az öt kalibrációból számított RSD értékek is a megengedett határokon belül maradtak, a maximális érték 9,73% volt 100 ng/ml koncentrációnál. Az átlag egyenes egyenlete Y= -0, ,00219*X volt. A regressziós együttható r=0,998-nak adódott. LLOQ az ambroxol meghatározás esetében 25 ng/ml-nek, az LOD pedig 5 ng/ml-nek adódott. A napok közötti megbízhatóság a pontosság értéke 75 ng/ml koncentrációnál átlagosan 7,99%, 150 ng/ml koncentrációnál 10,70%, 750 ng/ml koncentrációnál 3,08%, 1500 ng/ml koncentrációnál 7,16% volt. A torzítatlanság átlagos értéke 75 ng/ml koncentrációnál 3,43%, 150 ng/ml koncentrációnál 2,26%, 750 ng/ml koncentrációnál 3,38%, 1500 ng/ml koncentrációnál 8,03% volt. A kapott torzítatlanság és pontosság értékek minden esetben a megengedett határokon belül maradtak. A napon belüli megbízhatóság vizsgálatakor az RSD értékek a megengedett 15% alatt maradtak, a maximális érték 10,31% volt. A torzítatlanság maximális értéke 14,28% volt. A rendszeralkalmasság vizsgálatakor kapott RSD értékek 0,43 és 1,37 % között változtak, bizonyítva a kromatográfiás rendszer megfelelõ mûködését. A hosszútávú stablitás vizsgálatakor az ambroxolt egy hónapig stabilnak találtam kutya plazmában -20 C-on történõ tárolást követõen. 6 7

9 VII. I. Klebovich, E. Mincsovics, J. Szunyog, K. Ludányi, T. Karancsi, K. B. Dalmadi Kiss, K. Vékey Isolation and identification of deramciclane metabolites by OPLC-(DAR) online sample collection combined with MS techniques, in: Proceedings of Instrumental Planar Chromatography (Eds: Sz. Nyíredy, B. Szabady, R.E. Kaiser, A. Studer), Published by Research Institute for Medicinal Plants, Budakalász. Springer Hungaria, Budapest, VIII. Baloghné Nemes Katalin, Grézal Gyula, Dalmadiné Kiss Borbála, Tömlõ Judit, Patai Valentina, Nagy Lajos, Mózsik Gyula, Csörgõ Margit, Szentpéteri Imre, Klebovich Imre Telviran és Zovirax 800 mg acyclovir hatóanyagtartalmú tabletták összehasonlító farmakokinetikája egészséges önkénteseken. Acta Pharm. Hung. 69: IX. Katalin Balogh Nemes, Borbála Dalmadi Kiss, Imre Klebovich Determination of acyclovir in dog plasma by column switching technique. Chromatographia 51: S X. B. Dalmadi Kiss, I. Klebovich, E. Mincsovics, Katalin Balogh Nemes Application of OPLC-DAR and HPLC-RD techniques in metabolite research in: Proceedings of Planar Chromatography 2000 (Ed: Sz. Nyíredy), Published by Research Institute for Medicinal Plants Budakalász, Hungary, XI. E. Mincsovics, B. Dalmadi-Kiss, Gy. Morovjan, K. Balogh-Nemes, I. Klebovich A New Tool in Metabolism Research: Combination of OPLC On-line Radioactivity Detection with HPLC-RD Technique in: Proceedings of New Milestones in TLC - Planar Chromatography 2001 (Ed: Sz. Nyíredy), Published by Research Institute for Medicinal Plants, Budakalász,

10 VII. B. Dalmadi Kiss, K. Balogh Nemes, I. Ürmös, J. Szúnyog, I. Klebovich, Determination of ambroxol in dog plasma by high performance liquid chromatography and UV detection, Determination of ambroxol in dog plasma using column switching technique, Balaton Symposium 99 on High Performance Separation Methods, Siófok, Hungary, September 1-3, 1999, Abstr. p VIII. B. Dalmadi Kiss, I. Klebovich, E. Mincsovics, Katalin Balogh Nemes, E. Mincsovics, Katalin Balogh Nemes, Application of OPLC-DAR and HPLC-RD techniques in metabolite research, Proceedings of the International Symposium on Planar Separations, Planar Chromatography 2000, Lillafüred, Hungary, June 2000., Abstr. p. L-08. IX. K. Balogh Nemes, Gy. Grézal, B. Dalmadi Kiss, I. Klebovich, Pharmacokinetic dose linearity study of 200, 400 and 800 mg acyclovir containing Telviran tablets in dog, 6 th European Congress of Pharmaceutical Sciences, EUFEBS 2000, Budapest, Hungary, September 16-19, 2000, Abstr. No. PO-176: EUR. J: Pharm. Sci., (Suppl. 1), S (2000). X. Dalmadiné Kiss Borbála, Baloghné Nemes Katalin, Klebovich Imre, A cisapride meghatározása humán plazmában nagyérzékenységû RP-HPLC- FLD bioanalitikai módszerrel, Elválasztástudományi Vándorgyûlés 2000, Visegrád, 2000 november 8-10, Abstr. p. PO3. XI. E. Mincsovics, B. Dalmadi Kiss, Gy. Morovján, K. Balogh Nemes, I. Klebovich, A New Tool in Metabolite Research: Combination of OPLC On-Line Radioactivity Detection with HPLC-RD Technique, New Milestones in TLC-Planar Chromatography 2001, June 2001, Lillafüred, Hungary, pp Szabadalom Gacsályi István, Lévay György, Lukács Gyula, Mezei Tibor, Klebovich Imre, Simig Gyula, Schmidt Éva, Baloghné Nemes Katalin,, Morovján György, Kompagne Hajnalka, Leveleki Csilla, Egyed András, Hársing [2.2.1.] heptán-2-on-származékok, Magyar Szabadalmi bejelentés, 3410/

11