X-kromoszómához kötötten öröklődő juvenilis retinoschisis klinikai és genetikai vizsgálata

Átírás

1 X-kromoszómához kötötten öröklődő juvenilis retinoschisis klinikai és genetikai vizsgálata Doktori értekezés tézisei Dr. Lesch Balázs Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola Témavezető: Dr. Farkas Ágnes egyetemi docens, PhD Hivatalos bírálók: Dr. Kerényi Ágnes osztályvezető főorvos, PhD Dr. Füst Ágnes egyetemi adjunktus, PhD Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Rácz Károly egyetemi tanár, az MTA doktora Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Vogt Gábor osztályvezető főorvos, PhD Dr. Lukáts Ákos egyetemi tanársegéd, PhD Budapest 2009

2 Bevezetés Az először 1898-ban Haas által leírt X-kromoszómához kötött juvenilis retinoschisis (XLRS) az egyik leggyakoribb, gyógyíthatatlan, fiúgyermekeket érintő, recesszíven öröklődő, progresszív, bilaterális vitreoretinalis dystrophia. Az XLRS becsült prevalenciája (1: :30000) alapján, Magyarországon fő lehet érintett. A betegség világszerte, így hazánkban is alul- és gyakran félrediagnosztizált. A betegség penetranciája 100%-os az érintett fiúk körében, de fenotípusa, időbeni megjelenése és lefolyása meglehetősen változatos, mely megnehezíti helyes diagnosztizálását. Az első jellegzetes panasz a centrális látóélesség nem korrigálható csökkenéséből adódó olvasási nehézség, mely miatt a betegségben szenvedő fiúk általában 5-10 éves életkoruk között kerülnek észlelésre, sokszor téves diagnózissal. Látóélességük meglehetősen változó, gyakran jelentős az oldalkülönbség. Észleléskor rendszerint 0,2-0,4 közötti, ami a pubertás végéig tovább progrediál, majd többnyire stagnál. A 6-7. évtizedre a vízus csökkenés elérheti a legális vakság fokát, azaz a 0,1-et. A kétoldali macula érintettség a betegek csaknem 100%-ában jelen van. A betegség korai stádiumában az érintettek %-ában a fovealis fényreflex hiánya mellett fovealisan nagyobb, perifovealisan kisebb, sugár irányban elrendezett intraretinalis cystoid űrök figyelhetők meg, melyek keréküllő-szerű rajzolatot alkotnak. A továbbiakban az egyszerűség kedvéért a cystoid űrök jelenlétét cystás stádiumnak nevezzük. A betegség előrehaladtával a cystoid űrök fokozatosan összeolvadnak, a fovealis schisis ellapul, majd végül nonspecifikus macula atrophia alakul ki. Ebben a stádiumban a helyes diagnózis kizárólag a klinikai kép alapján igen nehezen állítható fel. Az esetek mintegy 50%-ában perifériás retinoschisis is jelen van, mely jellegzetesen az alsó-temporalis retina kvadránst érinti. Mérete gyermekkorban jelentősen progrediálhat, az egészen lapostól a kiterjedt bullózusig változhat, később azonban többnyire spontán regrediál. Az XLRS X-kromoszómához kötött recesszív módon öröklődik és jellegzetesen csak a fiúkat/férfiakat betegíti meg. 2

3 Az RS1 gént, melynek mutálódása felelős a betegség kialakulásáért Sauer és munkatársai azonosították pozícionális klónozás segítségével az X-kromoszóma rövid karján 1997-ben. A 6 exont tartalmazó RS1 gén egy 224 aminosavból álló, retinaspecifikus, extracelluláris, adhéziós, retinoschisin (RS1) nevű fehérjét kódol, melyet legnagyobb mértékben a fotoreceptorok és bipoláris sejtek expresszálnak, majd szecernálnak. Az intra és intermolekuláris diszulfidhidak segítségével homo-oktamer komplexet formáló RS1 protein, konzervatív discoidin doménje révén a sejtadhézióban és a szignalizációs folyamatokban tölt be kritikus feladatot. A retinoschisin mutáció következtében kialakult funkcióvesztése, majd intra- és extracelluláris felhalmozódása vezet a retinoschisisre jellemző, főleg a belső magvas rétegben (INL) megfigyelhető intraretinalis cystoid űrök kialakulásához. Mindez a retina szerkezeti integritásának felbomlásához, a fotoreceptor-bipoláris sejtek közötti szinaptikus kapcsolatok károsodásán keresztül a fotoreceptorok másodlagos degeneratiójához vezet. A betegség mutációs spektruma nagyon heterogén, az RS1 gén azonosítása óta már több mint 178 különböző, főleg de novo, XLRS-t okozó mutációt azonosítottak, melyek közül a legtöbb a discoidin domént kódoló 4-6. exont érinti. A szemészeti diagnosztika új módszerei (optikai koherencia tomográfia= OCT, elektroretinográfia= ERG) a kórkép pontosabb morfológiai és funkcionális megértését és követését teszik lehetővé. A korai diagnózis elősegítheti, hogy az érintettek megfelelő életvitellel csökkentsék a lehetséges szövődmények kialakulásának esélyét. Differenciáldiagnosztikus értékű az XLRS-ben Ganzfeld ERG-vel (GfERG) detektálható negatív jellegű szkotopikus maximális válasz (a b-hullám amplitúdó kifejezett csökkenése, az a-hullám amplitúdó relatív megtartottsága mellett). Oki terápia híján, a lehetséges tüneti terápiák között a retina korai elöregedését hátráltató multivitamin készítmények alkalmazása, illetve szövődmények esetén vitrectomia szerepel. Az XLRS-sel kapcsolatos molekuláris genetikai ismeretek kibővülésével párhuzamosan egyre több állatkísérlet kezdődött, amelyek már nem csak a betegség tüneti kezelését, hanem oki terápiáját tűzték ki célul. Ezekben a betegséget gén szinten próbálják kezelni, mellyel más öröklött retinalis betegséghez hasonlóan (Leber-féle congenitális amaurosis, retinitis pigmetosa, Stargardt macula-dystrophia) reménykeltő 3

4 anatómia és funkcionális rehabilitációt sikerült elérni az utóbbi években. Az első humán kísérletek napjainkban zajlanak. Célkitűzések Kutatásunk célja Magyarországon elsőként, a hazai szemészeti centrumok bevonásával az X-hez kötött juvenilis retinoschisis átfogó klinikai elemzése és progressziójának megítélése korszerű szemészeti diagnosztikus eszközökkel, valamint a betegség genetikai hátterének feltérképezése volt. Vizsgálataink során a következő célokat tűztük ki és az alábbi kérdésekre kerestünk választ: 1. Részletes családfaelemzést követően a lehető legszélesebb körben (országosan) felkutatni az XLRS-ben szenvedő betegeket és családtagjaikat. 2. A retina károsodását megítélni objektív morfológiai és funkcionális vizsgálatokkal a különböző megjelenési formákban és az életkor függvényében (időbeni lefolyás modellezése), majd a kapott eredményeket összehasonlítani egymással és a normál korcsoporti értékekkel. 3. Összefüggéseket keresni a legjobb korrigált látóélesség (BCVA), valamint a retina morfológiai és funkcionális vizsgálatinak eredményei között. 4. Új, a korábbinál részletesebb klasszifikációt készíteni a betegség különböző megjelenési formáinak könnyebb besorolásához. 5. Feltárni a molekuláris genetikai hátteret minél több XLRS-ben szenvedő betegen, meghatározni az előforduló mutációk prevalenciáját, majd a kapott eredményeket összevetni a nemzetközi adatokkal. 6. A mutáns RS1 proteinek harmadlagos szerkezetbeli változását feltárni és összefüggést keresni a szerkezetváltozások és a betegség súlyossága között. 7. Összehasonlítani az eltérő genetikai hátterű esetek klinikai jellegzetességeit (genotípus-fenotípus elemzés). Betegek és módszerek A Mária utcai Szemészeti Klinikán szeptember 1. és szeptember 1. között végzett prospektív vizsgálat során, a Budapest vonzáskörzetébe tartozó betegeken kívül a Pécsi és Szegedi Szemklinikákon észlelt 35 XLRS által érintett család közül 24 család 4

5 107 tagja vállalta a kutatásban való részvételt. A vizsgálat során 51 családtag (31 beteg férfi, 19 tünetmentes hordozó nő, 1 XLRS klinikai képét mutató nőbeteg) funkcionális (látóélesség, ERG), morfológiai (szemfenék, OCT) és 107 családtag molekuláris genetikai vizsgálati eredményeit dolgoztuk fel a betegség minél részletesebb megismerése céljából. Az OCT-vel tapasztalható és pontosan mérhető morfológiai változások (cystás atrophiás stádium) funkcióra gyakorolt hatásának pontosabb megítélésére két betegcsoportot alakítottunk ki a centrális foveolaris vastagsági (CFT) értékek alapján. Az I. betegcsoportba a cystás maculájú betegeket (23 fő, 45 szeme, átlagéletkor±sd: 16,2±9,8 év) soroltuk, akiknek CFT értékei nagyobbak voltak, mint az átlagos kontroll CFT+SD, azaz >173,2 µm. A II. betegcsoportba az atrophiás maculájú betegek (9 fő, 16 szeme, átlagéletkor±sd: 39,6±9 év) kerültek, akiknek CFT értékei alacsonyabbak voltak, mint az átlagos kontroll CFT-SD, azaz <140,2 µm. Kontroll céljából 50 egészséges, azonos korcsoportú (átlagéletkor±sd: 25,2±15,3 év) férfit vontunk be ugyanazon protokoll szerint végzett klinikai és genetikai vizsgálatokba. A vizsgálómódszereket abban a sorrendjében tárgyaljuk, ahogy a tanulmányba bevont személyek kivizsgálását végeztük: A retina funkciójának szubjektív vizsgálata - látóélesség vizsgálat Megvizsgáltuk minden résztvevő fénytörési állapotát automata refraktométerrel (Tomey RT-6000, Tomey Corporation, Nagoya, Japan), majd Kettesy-féle látásvizsgáló táblát alkalmazva meghatároztuk a legjobb korrigált látóélesség ( Best Corrected Visual Acuity, BCVA) decimális értékét. Az eredmények összehasonlíthatósága és statisztikai feldolgozhatósága érdekében az így kapott értékeket logmar (logarithm of the Minimum Angle of Resolution) egységbe konvertáltuk. A retina morfológiájának szubjektív vizsgálata - indirekt szemtükrözés Réslámpánál pupillatágítást (0,5% cyclopentolate) követően 90D-ás SuperField Volk lencsével történt részletes indirekt szemfenék vizsgálat. 5

6 A retina morfológiájának objektív vizsgálata - optikai koherencia tomográfia (OCT) A retina szerkezetének objektív vizsgálatára, a pupillák tágítását követően optikai koherencia tomográfiát (OCT) végeztünk 3. generációs OCT berendezéssel (StratusOCT, Zeiss-Humphrey Instruments, Dublin, CA, USA), melynek segítségével transversalisan 20 mikronos, axiálisan 10 mikronos felbontással vizsgálható a retina keresztmetszeti szerkezete. A készülék beépített szoftvere automatikusan kiszámította a 6 mm-es scan átmérőnek megfelelő teljes (TMV) és a 3,45 mm-es scan átmérőnek megfelelő (fovealis térfogatot pontosabban tükröző) centrális macula térfogatot (CMV). A pontosabb mérés érdekében manuális caliper mérési módszerrel mértük az ILM és az RPE közötti távolságot, azaz a retina vastagságát. Centrális fixációnál a caliper mindkét célkeresztjét a retina síkjára merőlegesen, a hat radiális scan metszéspontjában elhelyezve, mértük a centrális foveolaris vastagságot (CFT). Excentrikus fixációnál cystás stádiumban, vagy szabálytalan cystoid űr esetén a legnagyobb, atrophiás stádiumban pedig a legkisebb centrális foveolaris vastagságot mértük. A retina funkciójának objektív vizsgálata - elektroretinográfia Objektív vizsgálatként először GfERG vizsgálatot végeztünk binocularisan a Roland Consult cég (Brandenburg/Wiesbaden, Germany) RetiPort rendszerével, az ISCEV (International Society for Clinical Electrophysiology of Vision) által meghatározott standard beállítások szerint, ERG-Jet kontaktlencse elektródokkal. A vizsgálat első részében, 30 perces sötétadaptációt követően a pálcikák funkcióját vizsgáltuk szkotopikus körülmények között, majd a második részében 10 perces fényadaptáció után a csapok funkcióját értékeltük fotopikus körülmények között. A GfERG vizsgálat alkalmas az XLRS noninvazív diagnosztizálására, differenciáldiagnosztizálására. Ugyanakkor számos, genetikailag megerősített esetben nem tapasztalható negatív típusú ERG, sőt olyan esetek is ismertek az irodalomban, amikor szignifikáns b-hullám amplitúdó csökkenés sem volt kimutatható. Ezt követően mferg vizsgálatot végeztünk monocularisan a készülék RetiScan rendszerével az ISCEV standardoknak megfelelően 15 perces fényadaptációt követően. Ingerforrásként egy 21 katódsugárcsöves monitort alkalmaztunk, melyen ingermintaként 61 fekete-fehér hexagonból álló, speciális pszeudorandom szekvencia 6

7 szerint váltakozó mintát jelenítettünk meg. A betegek előkészítése, az alkalmazott elektródák és azok felszerelése a GfERG-vel azonos módon történt. A mferg vizsgálat segítségével noninvazív módon, topográfikusan vizsgálható a macula funkcionális állapota és jól nyomon követhető az esetleges további funkcióromlás. A kapott eredmény azonban nem specifikus az XLRS-re, így nem alkalmas differenciáldiagnózisra és csak a többi vizsgálati eredménnyel együtt értékelhető. Mindkét ERG vizsgálatnál a válaszok amplitúdóját és implicit (csúcs) idejét mértük. Molekuláris genetikai vizsgálatok 6 ml perifériás vénás vér leukocitáiból izolált genomiális DNS-ből polimeráz láncreakció (PCR) segítségével automata PCR készülékben (Thermo Hybaid PxE thermal cycler, Thermo Hybaid, Franklin, MA) amplifikáltuk az RS1 gén 6 exonját és a velük szomszédos intronszakaszokat. Az amplifikonok genotipizálása automata DNS szekvenáló készüléken (ABI Prism 310 Genetic Analyzer; Perkin Elmer ; Applied Biosystems) történt. A normál és mutáns RS1 protein harmadlagos térbeli szerkezetét a CPHmodels 2.0 Server, prediktív fehérje modellező szoftverével jelenítettük meg, míg az alternatív splice site meghatározásra a Berkeley Drosophila genome project NNSPLICE 0.9 predilekciós szoftverét használtuk. Statisztikai módszerek A statisztikai számításokat a Statistica 8.0 (StatSoft Inc., Tulsa, Oklahoma, USA), az SPSS 15 (SPSS Inc., Chicago, USA) és az Microsoft Office Excel 2003 (Microsoft Corp.) programokkal végeztük. Szignifikánsnak a p<0,05 értékeket tekintettük. A kontroll, a hordozó és a két betegcsoport életkor, BCVA, OCT és ERG paraméterei közti eltérések szignifikanciájának kiszámítására variancia analízist (one-way ANOVA) követően Newman-Keuls post hoc analízist alkalmaztunk. Az egyes paraméterek közti korreláció vizsgálatára lineáris regressziót végeztünk, több esetben a két változó közti összefüggés jobb szemléltetésére a legkisebb négyzetek (DWLS) módszerével illesztettünk görbét. A korreláció mértékét Pearson-féle korrelációs együtthatóval (r) írtuk le. ROC analízissel vizsgáltuk a centrális foveolaris vastagságot az életkor 7

8 függvényében és meghatároztuk a cystás és atrophiás stádium közötti legjobb szenzitivitással és specificitással rendelkező elválasztó (cut-off) pontot. Eredmények A 24 vizsgálatba bevont magyar család tagjainak tanulmányozása során, elsőként foglaltuk össze hazánkban az X-kromoszómához kötötten öröklődő juvenilis retinoschisis klinikai és molekuláris genetikai vonatkozásait. Klinikai vizsgálatok eredményei Részletes családfaelemzést követően a klinikai vizsgálatok során a betegség okozta morfológiai eltéréseket OCT-vel, a funkcionális eltéréseket Ganzfeld és multifokális ERG-vel tanulmányoztuk 31 XLRS-ben szenvedő férfi- és 1 nőbetegen, valamint 19 hordozó nőn. A retina funkciójának szubjektív vizsgálata - látóélesség Az XLRS-ben szenvedő betegek BCVA logmar értékei szignifikánsan magasabbak voltak (I<II. betegcsoport), mint a kontroll csoport értékei, a két betegcsoport értékei között szignifikáns különbség volt. A betegek életkora és látóélessége között közepes fokú negatív, szignifikáns korreláció mutatkozott. A látóélesség életkor szerinti részletes vizsgálata 13 éves korig tartó kismértékű javulást, majd 45 éves korig tartó lassú, ezt követően gyorsuló ütemű romlást mutatott. A gyermekkorban tapasztalt kismértékű látóélesség javulás valószínűleg a még funkcióképes parafovealis retinaterületek hatékonyabb használatával (excentrikus fixáció), a fejlődő vizuális rendszer plaszticitásának köszönhetően alakulhat ki. Ezt támasztja alá az a tény is, hogy a fiatalabb I. betegcsoportban csaknem kétszer gyakrabban találtunk excentrikus fixációt, mint az idősebb II. betegcsoportban. Az idősebb életkorban megfigyelhető fokozódó látóélesség romlás szinte kizárólag atrophiás maculák esetén fordult elő. 8

9 A retina morfológiájának szubjektív vizsgálata - indirekt szemtükrözés A maculák érintettsége a nagy inter- és intrafamiliaris variabilitás ellenére minden XLRS-ben szenvedő betegnél kimutatható volt. Az esetek csaknem ¾ részében (szinte kizárólag 28 éves kor alatt) bilaterális cystás retinoschisist, míg több mint ¼ részében (28 éves kor fölött) nem-specifikus atrophiát találtunk a foveolában. A jellegzetes infero-temporalis perifériás retinoschisis a betegek csaknem ¼-nél volt megfigyelhető, melyek ⅔-a bilaterális megjelenésű volt. A legmagasabb OCT paraméterekkel rendelkező betegünknél a hátsó póluson talált bilaterális fehér (fundus albipunctatus-szerű) pettyekről készített fénykép és OCT felvételek alapján mérésekkel bebizonyítottuk, hogy a fehér pettyek az intraretinalis cystoid űrök falát alkotó, Müller-sejtek testének tartott oszlopoknak felelnek meg. A retina morfológiájának objektív vizsgálata - OCT A betegek OCT képei és értékei nagyfokú interocularis és intrafamiliaris variabilitást mutattak. A fundus vizsgálattal talált macularis cystás schisisek számához képest OCT segítségével 16,1%-al több esetben sikerült macularis cystoid űrt kimutatni. Fovealis cystás schisis a szemek ¾ részében volt kimutatható, míg a csak OCT-vel detektálható lapos macularis lamellaris schisis több mint ¾ részében volt kimutatható. Nem-specifikus fovealis atrophiát 12,9%-ban találtunk. Fiatal korban a kóros működésű RS1 protein extra- és intracellularis felhalmozódásának következményeként kialakuló cystosus elváltozásnál a legnagyobb cystoid űrök minden esetben a foveola területében, az INL rétegben voltak jelen, amiket para- és perifovealisan egyre kisebb méretű cystoid űrök öveztek. Ezen kívül kisebb méretű cystoid űröket találtunk a ganglionsejtrétegben (GCL) és a fotoreceptor rétegben (PRL) is. Az általunk kibővített klasszifikáció szerint a leggyakoribb megjelenési forma (56,45%) a 3. számú foveo-lamellaris típus volt, mely esetén a retinoschisis a foveola és a macula területén az INL rétegben figyelhető meg, perifériás schisis nélkül. A cystoid űrök életkorral történő longitudinalis (hosszanti) változásait elemezve kisgyermekkorban csak fovealis retinoschisis volt jelen, majd a kor előrehaladtával 9

10 megjelent a macularis lamellaris schisis, míg később a fovealis és macularis lamellaris schisis eltűnésével nem-specifikus atrophia alakult ki a macula területén. A folyamatot a látóélesség fokozatos romlása kísérte. A cystoid űrök életkorral történő transversalis (mélységbeli) változásait elemezve fiatal életkorban mindhárom réteg érintettsége jelen volt. A legnagyobb cystoid űrök jellegzetesen az INL-ben helyezkedtek el, mely réteg minden cystás esetben érintett volt. Az életkor előrehaladtával, valószínűleg méretükkel összefüggésben fokozatosan eltűntek a cystoid űrök, előbb a GCL-ből a kis, a PRL-ből a közepesek, majd később az INL-ből a legnagyobbak és nem-specifikus fovealis és perifovealis atrophia alakult ki változatlan parafovealis retinavastagság mellett. Idősebb korban (28. életév fölött) az egész macula atrophiássá vált, melyhez a legrosszabb látóélesség társult. A betegség időbeni lefolyását vizsgálva, a CFT és az életkor között erős negatív, szignifikáns korrelációt találtunk. Fiatal korban - a kontroll csoport értékeihez képest - a cystoid űrök okozta szignifikáns CFT emelkedés a húszas évek közepéig változatlan maradt, majd ezt követően a fovealis cystoid űrök eltűnésével a CFT jelentősen csökkent és az atrophiás stádium kialakultával lényegében változatlanul alacsony maradt az életkor előrehaladtával. A centrális foveolaris vastagságot az életkor függvényében ROC analízissel vizsgálva, a cystás és atrophiás stádium közötti elválasztó (cut-off) pontot 28. életévnél kaptuk. A CFT vizsgálata során észlelt kor szerinti tendencia enyhébb mértékben a CMV és a TMV esetén is megfigyelhető volt. A cystás és atrophiás maculájú betegek klinikai értékeit vizsgálva, BCVA logmar értékeik szignifikánsan magasabbak voltak a kontroll csoport értékeihez és egymáshoz képest is (I.<II. csoport), azonban hirtelen nagyfokú látásromlást nem tapasztaltunk a macularis régió nagyfokú változásával (cystoid űr atrophia) összefüggésben. Az OCT CFT, CMV és TMV értékeit vizsgálva a cystás maculájú betegcsoport értékei szignifikáns emelkedést, míg az atrophiás maculájú betegcsoport értékei szignifikáns csökkenést mutattak a kontroll csoport értékeihez képest, ami összhangban van a cystoid űrök életkorral való ellapulásával. 10

11 A retina funkciójának objektív vizsgálata - elektroretinográfia Mindkét betegcsoport szkotopikus és fotopikus GfERG válasz amplitúdói szignifikánsan csökkentek (I.<II. betegcsoport) a kontroll csoport értékeihez képest és csak a pálcika és a maximális válaszok b-hullám amplitúdó értékei közt volt szignifikáns különbség a két betegcsoport értékei között (I.>II. betegcsoport). A szkotopikus maximális válaszok közül a b-hullám amplitúdó átlagosan 56%-os, míg a maximális a-hullám amplitúdó csupán 21,1%-os csökkenést mutatott, így a beteg szemek csupán 50%-nál (I.<II. betegcsoport) talált jellegzetes, differenciáldiagnosztikus értékű negatív típusú ERG (b/a arány±sd: 0,85±0,1) kialakulásért elsősorban a maximális b-hullám amplitúdó csökkenése volt a felelős. A GfERG pálcika válaszainak b-hullám implicit idői az I. betegcsoportban, míg a csap és 30 Hz flicker válaszok b-hullám implicit idői mindkét betegcsoportban szignifikánsan megnyúltak a kontroll csoport értékeihez képest. A betegek mferg P1- (b) hullám válaszsűrűség értékei mindkét betegcsoportban (I.<II.) szignifikánsan csökkentek a kontroll csoport értékeihez képest az egész vizsgált retinaterületen (főleg a károsodott foveolának megfelelő 2 centrális gyűrűben), míg implicit időik az I. betegcsoportban a 3-5. gyűrűben, a II. betegcsoportban a 4-5. gyűrűben szignifikánsan megnyúltak a kontrol csoport értékeihez képest. A két betegcsoport válaszsűrűség és implicit idő értékei között nem volt szignifikáns különbség. XLRS-ben szenvedő betegeinken ERG-vel elsősorban az INL és a PRL érintettségét tapasztaltuk, mely rétegekben OCT-vel a legnagyobb méretű schisis volt megfigyelhető és egészségeseken a legnagyobb koncentrációban mutatható ki a funkcionáló RS1 protein. A betegek Ganzfeld és multifokális ERG válasz amplitúdói gyenge és közepes fokú negatív, szignifikáns korrelációkat mutattak az életkorral és a látóélességgel, mely összhangban van a retinalis sejtek funkciójának és így a látóélességnek az életkor előrehaladtával tapasztalható csökkenésével. Az OCT-vel tapasztalt lapos lamellaris schisis és a mferg-vel mért funkciócsökkenés területe a retina nagyobb kiterjedésű morfológiai és funkcionális károsodását jelezte, mint ami a fundus vizsgálatok alapján várható volt. Mindez azt mutatja, hogy a retinalis 11

12 károsodás valós mértékének és kiterjedésének megítélésében elengedhetetlen az OCT és a mferg vizsgálat. Molekuláris genetikai vizsgálatok eredményei Jelen munkánk az első hazai tanulmány, mely magyar XLRS-ben szenvedő betegek genetikai hátterét is vizsgálta. Vizsgálataink során minden klinikailag XLRS-ben szenvedő férfibetegen sikerült kimutatni a betegségért felelős mutációt az RS1 génben. Összesen 1 új intronikus splice site (c.78+1g>c), 2 új missense, 1 ismert frame shiftet okozó inzerciós és 9 ismert missense mutációt találtunk 39 XLRS-ben szenvedő férfibeteg és 46 tünetmentes női hordozó RS1 génjében. A c.78+1g>c splice site mutációt és az általa okozott két lehetséges alternatív splicing mechanizmust elsőként írtuk le emberben, melyet humán retinalis minta hiányában egy korábban mások által közölt, egereken végzett mutagenezis eredményeivel támasztottunk alá. Betegeink mutációs prevalenciáját tekintve a nemzetközi retinoschisis adatbázis adataival ellentétben (exon 4: 42.7%; exon 5: 16.3%; exon 6: 26.9%), a hazai betegpopulációban a leggyakrabban az 5. exon volt érintett (4. exon: 28,2%, 5. exon: 35,9%, 6. exon: 30,8%), míg a legtöbb különböző típusú mutáció a 6. exonban volt. Szemléltettük a mutáns RS1 proteinek harmadlagos szerkezetváltozásait, melyek nem korreláltak a betegség súlyosságával. Mindez összhangban van azzal a megállapítással, hogy férfiaknál a funkcionáló RS1 protein hiánya felelős a retinoschisis kialakulásáért. A betegség okozta morfológiai és funkcionális eltérések mutációval való összefüggését vizsgálva egyértelmű genotípus-fenotípust összefüggést találtunk a c.305g>a mutációban, melyhez a legkifejezettebb morfológiai és funkcionális károsodások társultak (legmagasabb OCT paraméterek, a legalacsonyabb GfERG maximális b/ahullám amplitúdó arányok és a legalacsonyabb mferg válaszsűrűségek). A leggyakrabban azonosított c.214g>a mutációhoz kifejezetten megromlott látóélesség, magas OCT paraméterek és jelentősen csökkent GfERG maximális a- és b- hullám amplitúdók társultak. A c.527t>c mutációhoz társult a legkevésbé károsodott látóélesség és (a csapok funkcióját jellemző) 30 Hz flicker GfERG válasz. 12

13 Az új intronikus c.78+1g>c mutációt hordozó mindkét betegen megfigyelhető volt bilateralisan a Mizou-Nakamura fenomén. A típusos kerékküllő-szerű rajzolatú, funduskép alapján kezdetben XLRS-ben szenvedőnek tartott egyetlen nőbetegünk genetikai vizsgálata RS1 gént érintő mutációt nem mutatott ki. A macula területén OCT-vel megfigyelhető nagy cystoid űrök az XLRS-nél megfigyeltekkel ellentétben nem az INL-ben, hanem az OPL-ben helyezkedtek el. FLAG vizsgálata az XLRS-nél tapasztalt negatív leletekkel ellentétben poolingot mutatott. Normál Ganzfeld ERG válaszok mellett centrális túlsúlyú funkciócsökkenést tapasztaltunk a mferg-én. Mindezek alapján az esetet a meglehetősen ritka autoszomális recesszív módon öröklődő izolált fovealis retinoschisisként azonosítottuk. Következtetések - Új eredmények és gyakorlati alkalmazásuk 1. Elsőként indítottuk el az XLRS-ben szenvedő családok felkutatását az országban, majd részletes családfaelemzést követően korszerű klinikai és molekuláris genetikai vizsgálatokkal a lehető legszélesebb körben vizsgáltuk a betegeket és a hordozókat (24 család, klinikai vizsgálatok: 51 fő /31 férfi, 19 nő/, genetikai vizsgálatok: 107 fő /49 férfi, 58 nő/). 2. Kibővítettük az eddig használt nemzetközi klasszifikációs sémát és ennek alapján megállapítottuk betegeinken az egyes megjelenési típusok prevalenciáját és azok életkorral és a látóélességgel való összefüggését. Genetikai vonatkozások: 3. Elsőként vizsgáltuk a magyar XLRS-ben szenvedő betegek genetikai hátterét. Minden XLRS-ben szenvedő fiúban/férfiben kimutattuk az RS1 génben a betegséget okozó mutációt, 3 új mutációt (c.78+1g>c, c.575c>t, c.626g>t) írtunk le, valamint 10 ismert mutációt mutattunk ki (39 férfi, 46 hordozó nő). Meghatároztuk a mutációk prevalenciáját és megállapítottuk, hogy a magyar betegek mutációs spektruma különbözik a nyugat-európai mintától. 4. Elsőként írtuk le emberben a c.78+1g>c splice site mutációt és az általa okozott két lehetséges alternatív splicing mechanizmust. 13

14 5. Négy mutáció (1 új, 3 ismert) esetében egyértelmű genotípus-fenotípus összefüggéseket írtunk le. Ezek közül az új intronikus c.78+1g>c mutációt hordozó mindkét betegen megfigyelhető volt bilateralisan a Mizou-Nakamura fenomén. 6. Szemléltettük az RS1 protein harmadlagos szerkezetében az egyes mutációk következtében kialakult térbeli változásokat, melyek mértéke nem korrelált a betegség súlyosságával. 7. Elsőként írtuk le hazai viszonylatban a ritka, AR módon öröklődő izolált fovealis retinoschisis klinikumát egy nőbeteg kapcsán, majd az RS1 gén épségét molekuláris genetikai vizsgálatokkal bizonyítva különítettük el az XLRS-től. Klinikai vonatkozások: 8. Korszerű berendezésekkel végzett vizsgálatokkal igazoltuk a betegség ismert Ganzfeld (negatív típusú maximális válasz) és multifokális (centrális túlsúlyú amplitúdó csökkenés és perifériás túlsúlyú implicit idő megnyúlás) ERG-és jellemzőit. 9. Az OCT-vel és mferg-vel végzett mérésekkel igazoltuk, hogy a betegség okozta morfológiai és funkcionális retinakárosodás nagyobb kiterjedésű, mint ami a fundus vizsgálatok alapján várható. Betegeink több mint ¾ részében - csak OCT-vel azonosítható - lapos macularis lamellaris retinoschisist is detektáltunk. 10. Elemeztük OCT vizsgálatok alapján az intraretinalis cystoid űrök elhelyezkedését és elsőként írtuk le helyzetük életkorral összefüggő transversalis és longitudinalis változását és az egyes megjelenési formákhoz társuló látóélességet. 11. Elsőként írtuk le OCT vizsgálatok alapján végzett statisztikai vizsgálatokkal a betegség cystás stádiumból atrophiás stádiumba való átmenetének idejét (28. életév). A betegek OCT paraméterei és életkoruk között erős negatív, szignifikáns korrelációt találtunk. Az I. (cystás) és a II. (atrophiás) betegcsoportok klinikai eredményeit összevetve szignifikáns különbséget találtunk a látóélesség, az OCT, a GfERG pálcika és maximális válasz b-hullám amplitúdó értékei között (I>II.). 14

15 12. A betegek látóélessége és életkora között közepes fokú negatív, szignifikáns korrelációt találtunk. A látóélesség 13 éves korig tartó kismértékű javulása után a 45. életévig lassú, ezt követően gyorsuló ütemű romlását figyeltük meg a betegeken. 13. Betegeink OCT és ERG eltérései elsősorban az INL és PRL érintettségét mutatták, mely rétegekben, egészséges egyedeken a legnagyobb a funkcionáló RS1 protein koncentrációja. 14. OCT és fundusfoto alapján végzett mérésekkel bizonyítottuk, hogy a fundus albipunctatus-szerű fehér pettyek az intraretinalis cystoid űrök falát alkotó (Müller-sejteknek tartott) oszlopoknak felelnek meg. Publikációk Az értekezés témájában megjelent közlemények: 1. Lesch B, Szabó V, Kánya M, Somfai GM, Vámos R, Varsányi B, Pámer Zs, Knézy K, Salacz Gy, Janáky M, Ferencz M, Hargitai J, Papp A, Farkas Á. (2008) Clinical and genetic findings in Hungarian patients with X-linked juvenile retinoschisis. Mol Vis, 14: (IF: 2,464) 2. Lesch B, Szabó V, Kánya M, Varsányi B, Somfai GM, Hargitai J, Vámos R, Fiedler O, Farkas Á. (2008) Truncation of retinoschisin protein associated with a novel splice site mutation in the RS1 gene. Mol Vis, 14: (IF: 2.464) 3. Lesch B, Szabó V, Salacz Gy, Varsányi B, Somfai GM, Farkas Á. (2006) Az X- kromoszómához kötötten öröklődő juvenilis retinoschisis korszerű komplex vizsgálata. Szemészet, 143: Az értekezés témájában idézhető absztraktok: 1. Lesch B, Szabó V, Pámer Zs, Knézy K, Varsányi B, Vámos R, Somfai GM, Hargitai J, Farkas Á. (2006) X-linked juvenile retinoschisis - electrophysiological and molecular genetic features. Doc Ophthalmol, 112: Lesch B, Szabó V, Pámer Zs, Knézy K, Salacz G, Papp A, Somfai GM, Varsányi B, Vámos R, Hargitai J, Farkas Á. (2006) X-linked juvenile retinoschisis - age related macular changes by optical coherence tomography. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 84 Supplement 239:34. 15

16 Az értekezés témájában tartott előadások: 1. Lesch B. Klinikai és molekuláris genetikai vizsgálatok X-kromoszómához kötött juvenilis retinoschisisben. (2006) Ph.D. Tudományos Napok, Budapest Különdíj és dicséret. 2. Lesch B, Szabó V, Vámos R, Somfai GM, Hargitai J, Farkas Á. (2005) Optikai koherencia tomográfia és elektroretinográfia az X-kromoszómához kötött juvenilis retinoschisis diagnózisában. A Magyar Szemorvos társaság éves Kongresszusa, Szeged 3. Lesch B. (2005) Optikai koherencia tomográfia és elektroretinográfia az X- kromoszómához kötött juvenilis retinoschisis diagnózisában. Ph.D. Tudományos Napok, Budapest Az értekezés témájában készített poszterek: 1. Lesch B, Szabó V, Pámer Zs, Knézy K, Salacz Gy, Papp A, Somfai GM, Varsányi B, Vámos R, Hargitai J, Farkas Á. (2006) X-linked juvenile retinoschisis - age related macular changes by optical coherence tomography. EVER, Vilamoura, Portugal 2. Lesch B, Szabó V, Pámer Zs, Knézy K, Varsányi B, Vámos R, Somfai GM, Hargitai J, Farkas Á. (2006) X-linked juvenile retinoschisis - electrophysiological and molecular genetic features. 44th ISCEV Annual Symposium, Fontevraud Abbey, France 3. Lesch B, Szabó V, Vámos R, Hargitai J, Farkas Á. (2005) Optical coherence tomography and electroretinography in 4 hungarian families with X-linked juvenile retinoschisis. SOE & DOG, Berlin, Germany Az értekezés témájában tartott kurzus: 1. Lesch B. (2008) A centrális látás csökkenése a gyermekkorban (Stargardt macula dystrophia, X-kromoszómához kötött juvenilis retinoschisis, progresszív csapdystrophia, Best-vitelliform macula dystrophia). MSZT kongresszus, Pécs 16

17 Egyéb témában megjelent közlemények: 1. Balázs Varsányi, Rita Tuzson, Balázs Vince Nagy, Balázs Lesch, Rita Vámos, János Németh, Ágnes Farkas, Mária Ferencz. (2009) Role of multifocal electroretinography in the diagnosis of idiopathic macular hole. Invest Ophth Vis Sci-be elfogadva (IF: 3.582) 2. Varsányi B, Somfai GM, Lesch B, Vámos R and Farkas Á. (2007) Optical Coherence Tomography of the Macula in Congenital Achromatopsia. Invest Ophth Vis Sci, 48: (IF: 3.528) 3. Ferencz M, Somfai GM, Farkas Á, Kovács I, Lesch B, Récsán Zs, Nemes J, Fiedler O, Salacz Gy. (2006) Functional assessment of the possible toxicity of indocyanine green dye in macular hole surgery. Am J Ophthalmol, 142(5): (IF: 2.468) 4. Farkas Á, Vámos R, Lesch B, Salacz Gy. (2005) Multifokális elektroretinográfia: a retinafunkció objektív topográfiai vizsgálata. Szemészet, 142: Egyéb témában idézhető absztraktok: 1. Farkas A, Lesch B, Varsányi B and Vámos R. (2007) Phenotype characteristics of patients with Usher syndrome type 2. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 85 Suppl. 240: 2. Vámos R, Varsányi B, Lesch B and Farkas Á. (2007) Optical coherence tomography in patients with cone-rod dystrophy. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 85 Suppl. 240: 3. Farkas Á, Bolz H, Vámos R, Lesch B, Varsányi B. (2006) Az Usher szindróma - klinikai és molekuláris genetikiai vizsgálatok. Szemészet, 143: Varsányi B, Lesch B, Vámos R, Farkas Á. (2006) Colour full-field ERGs in the differential diagnosis of complete and incomplete forms of achromatopsia. Doc Ophthalmol, 112: Varsányi B, Lesch B, Somfai GM, Farkas Á. (2006) Age dependence of macular changes in congenital achromatopsia. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 84 Supplement 239: Vámos R, Lesch B, Somfai GM, Farkas Á. (2006) Follow-up of young patients with retinitis pigmentosa by multifocal ERG. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 84 Supplement 239:49. 17

18 7. Varsányi B, Somfai GM, Lesch B, Farkas Á. (2005) Comparison of measurements with OCT2 and OCT3 in patients with achromatopsia. Ophthalmic Research. Volume 37, Suppl Ferencz M, Kovács I, Lesch B, Farkas Á, Somfai GM, Barabási Z, Récsán Zs, Nemes J, Fiedler O, Salacz Gy. (2005) Assesment of possible toxic effect of indocianine dye applied in macular hole surgary. IOVS Suppl., 46: Lesch B, Farkas Á, Vámos R, Módos K, Salacz Gy. (2004) 30Hz flicker multifocal electroretinography in different macular diseases. Ophthalmic Research. Volume 36, Suppl Farkas Á, Vámos R, Lesch B. (2003) 30Hz flicker multifocal ERGs in retinitis pigmentosa. Ophthalmic Research, Volume 35, Suppl. 1. Egyéb témában tartott előadások: 1. Varsanyi B, Lesch B, Somfai GM, Farkas Á. (2006) Age dependence of macular changes in congenital achromatopsia. EVER, Villamoura, Portugal 2. Farkas Á, Bolz H, Vámos R, Lesch B, Varsányi B. (2006) Az Usher szindróma - klinikai és molekuláris genetikai vizsgálatok. MSZT kongresszus, Sopron 3. Vámos R, Farkas Á, Lesch B, Varsányi B. (2005) A Leber-féle congenitális amaurosisról - 2 eset kapcsán. MSZT kongresszus, Szeged 4. Farkas Á, Vámos R, Lesch B, Varsányi B, Salacz Gy. (2005) A szemészeti diagnózis jelentősége a retina dystrophiaval társult tünetegyüttesek korai felismerésében (esetismertetés) MSZT kongresszus, Szeged 5. Lesch B, Farkas Á, Vámos R, Salacz Gy. (2004) A retina elektromos tevékenységének vizsgálata. Euro-Tandem tour, Budapest, SE II. sz. Szemészeti Klinika 6. Lesch B, Farkas Á, Vámos R, Salacz Gy. (2004) A 30Hz flicker inger alkalmazása a multifokális elektrortinográfiában. Ph.D. Tudományos Napok, Budapest 7. Lesch B, Farkas Á, Vámos R, Salacz Gy. (2003) A multifokális elektroretinogram paramétereinek jellegzetességei retinitis pigmentosaban és Stargardt macula dystrophiaban. Novemberi Szemészeti Találkozó, I sz. Szemészeti Klinika, Budapest 18

19 8. Lesch B, Farkas Á, Vámos R, Salacz Gy.(2002) Multifokális elektroretinográfia érett szürkehályog esetén. Korányi Frigyes Szakkollégium VII. Tudományos Fóruma, Budapest, Különdíj Egyéb témában készített poszterek: 1. Vámos R, Lesch B, Varsányi B, Farkas Á. (2008) Leber congenital amaurosis: clinical characteristic of genotyped patients and full-filed ERG abnormalities in parents of AIPL1, CRB1 and CEP290-related subjects. PRO RETINA Researchcolloquium, Potzdam, Germany 2. Lesch B, Vámos R, Somfai GM, Varsányi B, Farkas Á. (2007) Unilateral, recurrent serous retinal detachment after trabeculectomy in a renal transplanted patient. SOE/AAO, Vienna, Austria 3. Farkas Á, Vámos R, Lesch B, Varsányi B. (2007) Clinical diagnostic approach to Bardet-Biedl syndrome. SOE/AAO, Vienna, Austria 4. Vámos R, Lesch B, Somfai GM, Farkas Á. (2006) Follow-up of young patients with retinitis pigmentosa by multifocal ERG. EVER, Villamoura, Portugal 5. Varsanyi B, Lesch B, Vamos R, Farkas Á. (2006) Colour full-field ERGs in the differential diagnosis of complete and incomplete forms of achromatopsia. 44th ISCEV Annual Symposium, Fontevraud Abbey, France 6. Vámos R, Hargitai J, Varsányi B, Lesch B, Szabó V, Farkas Á. (2006) Research on inherited retinal diseases at the University Eye Clinic, Budapest. Pro Retina Research-colloquium, Potzdam, Germany 7. Varsányi B, Somfai GM, Lesch B, Farkas Á. (2005) Comparison of measurements with OCT2 and OCT3 in patients with achromatopsia. EVER, Portugal, Vilamoura 8. Ferencz M, Kovács I, Lesch B, Farkas Á, Somfai GM, Barabási Z, Récsán Zs, Nemes J, Fiedler O, Salacz Gy. (2005) Assesment of possible toxic effect of indocianine dye applied in macular hole surgary. SOE & DOG, Berlin, Germany 9. Ferencz M, Kovács I, Lesch B, Farkas Á, Somfai GM, Barabási Z, Récsán Zs, Nemes J, Fiedler O, Salacz Gy. (2005) Assesment of possible toxic effect of indocianine dye applied in macular hole surgary. ARVO, Fort Lauderdale, Florida, USA 19

20 10. Lesch B, Farkas Á, Vámos R, Módos K, Salacz Gy. (2004) 30Hz flicker multifocal electroretinography in different macular diseases EVER, Vilamoura, Portugal 11. Farkas Á, Vámos R, Lesch B. (2003) 30Hz flicker multifocal ERGs in retinitis pigmentosa. EVER, Alicante, Spain 12. Ferencz M, Lesch B, Farkas Á, Salacz Gy. (2003) Assesment of possible toxic effect of indocianine dye applied in macular hole surgary. EURETINA, Hamburg, Germany 13. Vámos R, Hargitai J, Somfai G, Farkas Á, Lesch B, Salacz Gy. (2003) Multifocal electroretinography and optical coherence tomography in cases with Stargardt s macular dystrophy. ISCEV 41 th Symposium, Nagoya, Japan 14. Farkas Á, Vámos R, Lesch B, Weiszer I, Salacz Gy. (2003) Use of 30Hz flicker stimulation in multifocal ERG - early results ISCEV 41 th Symposium, Nagoya, Japan 15. Lesch B, Farkas Á, Vámos R, Salacz Gy. (2002) A multifokális elektroretinográfia lehetséges haszna érett szürkehályog műtéti prognózisában. MSZT kongresszus, Miskolc 16. Farkas Á, Ferencz M, Vámos R, Lesch B, Salacz Gy. (2002) Monitoring of macular function by multifocal electoretinography before and after macular hole surgery. ISCEV 40 th symposium, Leuven, Belgium 20