SEMMELWEIS EGYETEM GYÓGYSZERTUDOMÁNYOK DOKTORI ISKOLA A Taraxacum officinale és Morus nigra bioaktív anyagainak vizsgálata Doktori (Ph. D.) értekezés Kristó Tita Szidónia Témavezeto: Dr. Kéry Ágnes, Ph. D. Készült: Semmelweis Egyetem, Gyógyszerésztudományi Kar, Farmakognózia Intézet Budapest, 2002
Ph. D. doktori értekezés A Taraxacum officinale és Morus nigra bioaktív anyagainak vizsgálata Kristó Tita Szidónia Témavezeto: Dr. Kéry Ágnes c. egyetemi tanár Semmelweis Egyetem, Gyógyszerésztudományi Kar, Farmakognózia Intézet, 2002 Összefoglaló A növényi eredetu, biológiailag aktív anyagok egyre szélesebb köru és aprólékosabb farmakológiai vizsgálata az új, gyors, pontos és hatékony extrakciós és fitoanalitikai módszerek alkalmazását sürgeti. A jól összehangolt kémiai-farmakológiai kutatások egyúttal adatokat szolgáltathatnak a szerkezet-hatás összefüggésekkel kapcsolatban is. Számos kísérleti adat támasztja alá, hogy az eddig nem hatóanyagnak tekintett növényi összetevok jelentosen befolyásolhatják a gyógynövények és kivonataik aktivitását, illetve biztonságos felhasználásuk is módosulhat. A Taraxacum officinale és Morus nigra bioaktív anyagai közül a gyulladáscsökkento, immunmoduláns, daganatellenes tulajdonságokkal rendelkezo triterpének és fitoszterolok tanulmányozásához az ezidáig foleg illó komponensek eloállítására alkalmazott hatékony, környezetkímélo szuperkritikus extrakciót alkalmaztuk. Optimalizáltuk a kísérleti paramétereket (nyomás, homérséklet) és megvalósítottuk a hatóanyagok jelentos és szelektív dúsítását. Az elonyök és hátrányok mérlegelése céljából a kivonás hatékonyságát összehasonlítottuk a hagyományos módszerekkel. Az extraktumok kvantitatív értékeléséhez VRK-denzitometriás módszert dolgoztunk ki és megállapítottuk, hogy a szuperkritikus extraktumokban a hatóanyagok esetenként 10%-ig is feldúsultak. A Taraxacum officinale és a Morus nigra liofilizált kivonatai antioxidáns, szabadgyökfogó aktivitással rendelkeznek, amit in vitro vizsgálatokkal bizonyítottunk. A hatásért felelos vegyületek feltárásához kapillárelektroforézist alkalmaztunk, melynek hatékonyságát nagynyomású folyadék-kromatográfiás módszerrel is összehasonlítottuk. Azonosítottuk a drogok fenoloid komponenseit (Taraxacum officinale: apigenin-7-o-?-glükozid, luteolin-7-o-?-glükozid, klorogénsav; Morus nigra: kvercetin-3-o-ramnoglükozid; kvercetin-3-o-glükozid, klorogénsav) és eltéro hatásmechanizmusuk (kelátképzo, szuperoxid ion scavanger) alapján valószínusítettük különbözo betegségekben való alkalmazhatóságukat.
Ph. D. Thesis Investigation of bioactive compounds from Taraxacum officinale and Morus nigra Kristó Tita Szidónia Supervisor: Prof. Dr. Ágnes Kéry Department of Pharmachognosy, Faculty of Pharmacy, Semmelweis University, 2002 Summary The results of the continously expanding and detailated pharmacological researches on bioactive plant components call for new, accurate and efficient extraction and phytoanalitical methods to invent and identify the pharmacologically active components. The syncronized biologicalchemical studies can give new answers to questions of structure-activity relationships too. It can be concluded from lots of experimental and clinical data that some so far not bio-active considerated components may influence the efficacy and safety of medical plant extracts through pharmacodynamic or pharmacokinetic way. The antiinflammatory, immunomodulator triterpenes and phytosterols in Taraxacum officinale and Morus nigra were studied in order to find optimal extraction technology. The environmentaly acceptable supercritical fluid extraction have been choosen, which received reduced interest for the extraction of medicinal plant metabolites except volatile and fixed oils. The optimal extraction parameters (pressure, temperature) were determined, which resulted successfull enrichment of active components in supercritical CO 2 extracts. To consider the advantages and disadvantages of the supercritical fluid extraction, the results were compared with the traditional extraction methods. For the quantive evaluation of the extracts a thin layer chromatographic densitometric method was developed and it was demonstrated that some supercritical extracts contained up to 10% (g/ 100 g) of active components. It was proved that the liofilized aqueous and methanolic extracts of Taraxacum officinale and Morus nigra exhibit significant antioxidant activity in in vitro models. To search for possible active components responsible for scavanging activity, capillary electrophoresis was used providing good separation in a relatively short time. Results were compared with high pressure liquid chromatography. Identifing the fenoloid components (Taraxacum officinale: apigenin-7- O-?-glucosid, luteolin-7-o-?-glucosid, chlorogenic acid; Morus nigra: quercetin-3-o rhamnoglucosyl, quercetin-3-o-glucosid, chlorogenic acid) we postulated the possible traditional use, based on the antioxidant (chelating and superoxid scavanging) activity due to their influence on pathological free radical reactions.
1. BEVEZETÉS A növényi hatóanyagok egyre inkább a tudományos kutatás érdeklodési terébe kerülnek. Néhány közismert gyógynövény újraértékelése, részletesebb farmakológiai tanulmányozása során kiderült, hogy az eddig a hatásért felelosnek tartott vegyületek csak szinergista módon más vegyületek jelenlétében aktívak vagy esetleg más újonnan felfedezett hatóanyagcsoport felelos élettani hatásukért. Például a Calendula officinalis gyulladáscsökkento hatásáért korábban foleg a flavonglikozidokat, esetleg szaponinokat tették felelossé; újabban a körömvirág kivonatokat a triterpén alkohol faradiol származékokra standardizálják, mert egyértelmuen bebizonyosodott e hatóanyagok kiemelkedo szerepe a gyulladásos folyamatok gátlásában?78-83?. Számos további eredmény igazolja, hogy az eddig nem hatóanyagnak tekintett növényi összetevok jelentosen befolyásolhatják a gyógynövények vagy kivonataik hatékonyságát, illetve terápiás felhasználhatóságuk is módosulhat ezek jelenlétében. A gyulladáscsökkento szerek között a gyógyszerpiacon két fo hatástani csoport van forgalomban: az egyik csoport gátolja a ciklooxigenázt, aminek következtében csökken a prosztanoidok képzodése (nem szteroid gyulladásgátlók, pl. aszpirin származékok); a másik csoport a glukokortikoidok, amelyek, mind a ciklooxigenáz mind a lipoxigenáz utat gátolják, a foszfolipáz A 2 -reakcióval interferálva. A mellékhatások ismertek. A gyógyszerpiacnak eddig ismerteknél szelektívebb (COX-1, illetve COX-2 gátlók) gyulladásgátló szerek iránti igénye miatt újra és újra elotérbe kerülnek a természetes anyagok. Német kutatók hatásmechanizmusra is választ kereso hatás és szerkezet in vitro vizsgálatokban olyan pentaciklikus triterpéneket kerestek, amelyek in vivo modellekben, ésszeru koncentrációban fejtenek ki gyulladáscsökkento hatást. Így terápiás alkalmazhatóságuk esélye megno, tekintetbe, hogy ezek a természetes eredetu vegyületek kis akut toxicitással jellemezhetok?84?. Egyes triterpének (pl. ß-amirin) gyulladáscsökkento aktivitása valószínu a proteinkináz C enzim gátlásától függ, a neurogenetikus gyulladásos folyamatok teljes mellozésével?93?. Különbözo csoporthoz tartozó triterpének és számos szterol rendelkezik tumor- és HIV ellenes aktivitással?85, 86, 87, 90, 92, 109, 111, 112?. Egy átlag nyugati táplákozás 250-500 mg koleszterolt és 200-400 mg nem-koleszterol szterolt tartalmaz, amelynek fo alkotói a növényi szterolok. A vérben legnagyobb mennyiségben jelen lévo 4
?-szitoszterol és kampeszterol elsosorban?124?, de a fitoszterolok általában is jelentosek a rákmegelozésben. A? -szitoszterol/? -szitoszterol glikozid keverékek nemcsak gyulladáscsökkento, lázcsökkento, daganatellenes, hanem immunmoduláns hatást is kifejtenek, serkentve a T-limfociták és killer sejtek aktivitását, csökkentve a túlzott ellenanyag termelést és normalizálva a DHEAH/ kortizon arányt?138,139,140?. A másik nagy hatóanyagcsoport, amelyre fokozott figyelem irányul a flavonoidok. Számos farmakológiai hatást tulajdonítanak nekik; így antiishaemiás, thrombózisgátló, daganatellenes, gyulladáscsökkento, allergia ellenes, lipidperoxidáció gátló, gasztroprotektív funkciót. Ezen túlmenoen potenciális antioxidánsok, szabad gyökfogók, fémkelátképzok és gátolják a lipidperoxidációt is?141?. A jelenkori tudomány a hatás-szerkezet összefüggéseket biomolekuláris szinten tanulmányozza?142-165?. A köztudatba azonban az a téves felfogás is befészkelte magát, hogy az antioxidánsok boséges fogyasztása az egészségmegorzés kulcsa. Ugyanakkor az arányokban történo durva eltolódások károsodásokat okozhatnak az életminoséget rontó, hosszan tartó betegségekben, mint például az alkoholos májbetegség, diabetes mellitus, colitis ulcerosa, a Crohn-betegség?142?. A triterpének mint citotoxikus ágensek excesszív alkalmazása, egyes betegség kiújulásához is vezethet?94-95?. Szitoszterolémiában, amely egy ritka autoszomális rendellenesség, az érintett egyének szervezete hiperabszorbeálja és visszatartja nem csak a koleszterolt, hanem más szterolokat is. Így a betegnek igen magas a növényi szterol plazmaszintje. Íny és gumós xanthóma, gyorsított arteroszklerózis és korai szívér betegségek jelentkezhetnek?125?. A különbözo etimológiájú betegségek megelozésében és kezelésében indikált szerek helyes használatához a készítmények standardizálása szükséges kiválasztott aktív anyagokra. Mindezek figyelembevételével a növényi, természetes eredetu hatóanyagok kutatásával foglalkozó szakemberek egyre inkább hangsúlyozzák megfelelo módszerek kidolgozásának fontosságát, amelyek az aktív komponensek gyors azonosítását, másrészt kivonatokban való szelektív dúsításukat valósítják meg, ezáltal lehetové téve standardizált készítmények eloállítását és célzott alkalmazhatóságát különbözo betegségekben. 5
2. CÉLKITUZÉSEK Kísérletes munkánkkal két az Asteraceae és Moraceae családba tartozó gyógynövény vizsgálatával a bevezetésben vázolt kérdéskör megismeréséhez kívántunk kísérletes adatokat szolgáltatni. A gyermekláncfüvet már az ókorban kínai orvosok is alkalmazták megfázás, hörghurut, tüdogyulladás, májgyulladás, furunkulus, fekélyek, elhízás, viszketés és belso sérülések kezelésére. A mai kor herbalistái vizelethajtásra, epehajtásra, emésztés serkentésére, menstruációt megelozo kellemetlen tünetek enyhítésére, lábduzzadásra, magas vérnyomásra és pangásos szívelégtelenségre ajánlják?166,170,173,174,175?. Változatos tartalmi anyagai az alábbi fontosabb csoportokba sorolhatók: triterpének, szterolok, szeszkviterpén laktonok, fenoloidok, nyálka, inulin, ásványi anyagok és vitaminok?168-176?. A fekete eperfa kevésbé elterjedt, mint a fehér eperfa, kellemes ízu gyümölcse miatt inkább kertekbe, udvarokba ültetik. Az eperfa leveleket más drogokhoz elegyítve diétás teakeverékek készítésére használják, foleg cukorbetegeknek ajánlják. Vércukorszint csökkento hatása azonban gyenge, megbízhatatlan; a kínai gyógyászat több indikációval alkalmazza?198-199?. A levelei glukózt, karotint, C-vitamint, folsavat,? -amirint, fitoszterolokat és flavonoidokat tartalmaz?193?. Gyökérkérgében antinoniceptív, potenciális rákellenes prenilflavonidokat mutattak ki?193, 194, 195, 197?. Célul tuztük ki a minkét növény tartalmi anyagai között jelentos triterpének, fitoszterolok kivonására hatékony, környezetkímélo extrakciós módszer kidolgozását. Ennek megvalósítására a szuperkritikus kivonást választottuk. Ezt a módszert ezidáig foleg illó komponenseket tartalmazó kivonatok eloállítására alkalmazták. A gyermekláncfu és fekete eperfa nem illó komponenseinek extrahálásánál az optimális körülmények kidolgozását is célul tuztük ki. A folyamat szélesebb köru alkalmazásához az elméleti fizikai-kémiai folyamatokat is értelmeznünk szükséges. Fontos ugyanakkor a hagyományos kivonási módszerekkel történo összehasonlítás is és így az elonyök és hátrányok mérlegelése. Ezt a költséges, de elsosorban lipofil anyagok kivonására kiváló módszert egyre kiterjedtebben alkalmazza az élelmiszer és gyógyszeripar. Éppen költséges volta miatt azonban akkor lehetséges létjogosultsága növényi gyógyszeralapanyagok eloállításában, ha alkalmazásával a kívánt hatóanyag jelentos és lehetoleg szelektív dúsítása érheto el. Másrészt viszont égeto igény jelentkezik a módszer alkalmazásával kapcsolatos tapasztalatokra, ahogy ezt egy közelmúltban rendezett fitokémiai konferencia is megfogalmazta. Ez is indokolta egy gyors és megfeleloen szelektív módszer kidolgozását a szuperkritikus extrakcióval nyert nagyszámú minta étékeléséhez. Erre a célra vékonyréteg kromatográfiával kombinált denzitometriás eljárást dolgoztunk ki. Elemezni kívántuk a kifejleszto rendszer befolyását a szétválasztásra, az elohívó reagens, homérséklet és ido befolyását a mérés pontosságára 6
és megbízhatóságára. Célunk volt a megfelelo muszeres analízis kidolgozása után a kivonatok hatóanyagban való feldúsulásának pontos adatokkal történo jellemzése. Tekintettel a Taraxacum és Morus fajok gyulladásgátló hatásának terápiás felhasználására, valamint a flavonoidok, mint potenciális hatóanyagoknak jelenlétére szükségessé vált részletesebben tanulmányozni a Taraxaci folium és Mori nigri folium vizes kivonatai antioxidáns hatásának jellemzoit, in vitro modelekben. Jellemezni kívántuk: hidrogén-donor aktivitásukat, redukáló képességüket, össz-scavanger kapacitásukat stb. A hatás és szerkezet összefüggések feltárásához meg kívántuk határozni az antioxidáns, szabadgyökfogó aktivitással rendelkezo drog extraktumok flavonoid és összpolifenol tartalmát. A flavonoidkémiában legkiterjedtebben alkalmazott HPLC vizsgálatok mellett célul tuztük ki egy kevésbé ismert, de az összetett fitoterápiás készítmények minoségvizsgálatában, a jövoben, egyszerusége miatt, feltehetoen jelentosebb szerepet kapó kapillárelektroforézis technika alkalmazását. Adatokat kívántunk szolgáltatni alkalmazhatóságukhoz, illetve a HPLC-vel való összehasonlítását is célul tuztük ki. A kapillárelektroforetikus tapasztalatokkal hozzá szeretnénk járulni a fito-gyógyszerek eloállítási és standardizálási kérdéseinek eredményes eloviteléhez is, különös tekintettel az európai harmónizációs törekvésekre. 7
3. ANYAG ÉS MÓDSZER 3.1. VIZSGÁLATI ANYAGOK Az elovizsgálatokhoz a Taraxacum officinale Wiggers et Weber mintákat Budapest területérol gyujtöttük 1998 oszén és 1999 tavaszán. A szuperkritikus extrakcióhoz használt gyermekláncfu levél és gyökér drogok kereskedelmi forgalomban kapható, hivatalosan ellenorzött drogtételek voltak (Rózsahegyi Ltd., Erdokeresztes, Hungary). A szuperkritikus kivonáshoz a Morus nigra L. mintákat a Marosvásárhelyi Orvosi és Gyógyszerészeti Egyetem, Farmakognózia Tanszéke bocsátotta rendelkezésünkre. 3.2. VIZSGÁLATI MÓDSZEREK 3.2.1. MINTÁK KÉSZÍTÉSE 3.2.1.1. Liofilizátumok eloállítása az antioxidáns vizsgálatokhoz Antioxidáns vizsgálatokhoz 15 g mintákból infuzumot készítettünk, majd az infuzumokat liofilizáltuk. A liofilizátumokat -20 o C-on tároltuk. 3.2.1.2. Szerves oldószeres extrakciók Soxhlet készülékben triterpének és fitoszterolok meghatározásához A különbözo porított drogmintákat Soxhlet készülékben metanollal és n-hexánnal extraháltuk. A szárított kivonatokat metanolban visszaoldva vizsgáltuk. A mintákat vékonyréteg-kromatográfiás és VRK-denzitometriás mérésekhez használtuk fel. 4.2.1.3. Soxhlet extrakció ipari méretu kísérletekben A felhasznált minták tömege 1200 g volt. Oldószerként 2650 ml hexánt illetve 96 %-os etilalkoholt alkalmaztunk. A bepárolt mintákat visszamértük, petroléterben (40-45 o C) oldottuk és VRKdenzitometriás mérésekhez használtuk. 3.2.1.3. Szuperkritikus extrakció a triterpének és fitoszterolok eloállítására és meghatározásához Minták elokészítése és elozetes vizsgálata: A szárazanyag tartalom meghatározásához a drogot 105 o C homérsékletu szárítószekrénybe tettük és tömegállandóságig szárítottuk. A részecskeméret eloszlást szitaanalízissel határoztuk meg. Mori nigri folium szuperkritikus extrakciója A felhasznált drog mennyisége 1348 g volt. A homérséklet 39,8-43,9 o C között, míg a nyomás 448-451 bar intervallumban változott. 8
Taraxaci radix és Taraxaci folium szuperkritikus extrakciója A felhasznált drog mennyisége 1200 g (Taraxaci radix), illetve 980 g (Taraxaci folium) volt. Háromszintes kétfaktoros kísérleti terv alapján, a nyomást (150, 350, 450 bar) és homérsékletet (35, 50, 65 o C) fokozatonként változtattuk, két szeparátort alkalmazva. 3.2.1.5. Oszlopkromatográfiás vizsgálatok a triterpének és fitoszterolok azonosítására A szuperkritikus kivonatokból, a triterpén és fitoszterol komponensek azonosítására, oszlopkromatográfiás módszerrel tisztított, dúsított frakciókat állítottunk elo: szilikagéllel töltött oszlopot és n-hexán, n-hexán etil-acetát, metanol eluenseket használva. 3.2.2. Minoségi és mennyiségi vizsgálatok 3.2.2.1. A flavonoid tartalom meghatározása A flavonoid tartalom meghatározását a Német Gyógyszerkönyv (DAB 10)?202? módszere alapján végeztük. A flavonoid tartalmat hiperozidban számoltuk. 3.2.2.3. Kapillár elektroforézis vizsgálatok a fenoloidok minoségi jellemzésére A kapilláris elektroforézishez standard töltettel felszerelt, UV detektoros, diodasoros Hewlett Packard készüléket használtunk. Adott csúcs azonosítását a mobilitásuk, az egymást követo karakterisztikus csúcsok változatlan sorrendje, a csúcsok ujjlenyomatában elfoglalt helye és UV spektruma alapján végeztük. 4.2.2.4. HPLC vizsgálatok a fenoloid komponensek mennyiségi meghatározására A HPLC analízist ABL&EJASCO készülékkel végeztük, amely PU-980 gradiens pumpát és RHEODYNE (20? l) injectort tartalmazott. Két szolvens keverékét alkalmaztuk az elucióhoz: AcCN; H 2 O CH 3 COOH. A csúcsokat autentikus standardok segítségével UV spektrumuk és a retenciós idok alapján azonosítottuk. 4.2.2.5. Vékonyréteg-kromatográfiás és VRK-denzitometriás vizsgálatok Minta elokészítése: el nem szappanosítható rész meghatározása: A triterpén komponensek kvantitatív meghatározásához a kivonatok elszappanosított mintáit használtuk fel. A vizsgálatokat a Ph.Hg. VII.?204? módszere alapján végeztük. Vékonyréteg-kromatográfiás módszer kidolgozása: A módszer kiválasztásához elo-kísérleteket végeztünk, három-három kifejleszto rendszert és elohívó reagenst teszteltünk, valamint az elohívási idot optimalizáltuk. A denzitometriás kiértékelés CS-930 (Shimadzu-Corporation, Kyoto, Japán) típusú denzitométerrel történt. A kalibrációs egyeneseket,? -amirin illeteve? -szitoszterol oldatokkal készítettük 2,5-5,5 ng tartományban. 9
4.2.2.6. Az oszlopkromatográfiásan tisztított frakciók HPLC vizsgálata Az elemzéshez használt készülék Spectra Physics P 4000 kvaterner gradiens pumpa, IMB P S/2 számítógép kombinációja volt. A meghatározáshoz standard anyagokat használtunk. A komponenseket a retenciós idok alapján, valamint csúcsaddicióval és/ vagy UV spektrumok alapján azonosítottuk. 4.2.2.7. Az antioxidáns hatás igazolására végzett vizsgálatok Hidrogén donor aktivitás meghatározása A kivonatok H-donor aktivitását 1,1-difenil-2-pikril-hidrazil (DPPH) gyök jelenlétében vizsgáltuk a Hatano?206? által módosított Blois?207? módszer alapján. Az aktivitás jellemzésére az 50%-os DDPH-gátlás értékét adtuk meg. Redukáló képesség meghatározása A redukálóképesség mérésénél Oyaizu módszerével?208? a Fe 3+? Fe 2+ átalakulást vizsgáltuk kivonataink jelenlétében. A minták redukáló képességét ASE/ mg egységben fejeztük ki. Nem specifikus szabadgyökfogó kapacitás meghatározása A nem specifikus szabadgyökfogó kapacitást kemilumineszcenciás vizsgálatokkal igazoltuk. A vizsgálatokat Lumat LB 9051 luminométerrel végeztük, Blázovics és mtsai által módosított módszerrel. Az I 50 -et határoztuk meg és? g-ban fejeztük ki. Lipidperoxidációs vizsgálatok Enzimatikusan indukált lipidperoxidáció vizsgálata Enzimatikusan indukált lipid peroxidációt vizsgáltunk máj mikroszómákban a malon-dialdehid produkció mérésével. A patkány máj mikroszómák protein koncentrációját a Lowry és mtsai?211? módszerével kísértük nyomon. NADPH citokrom c reduktáz aktivitását Jansson és Schenkman szerint mértük?212?. 10
4. EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA Laboratóriumi, in vitro, in vivo vizsgálatok egész sora mutat rá a triterpének és fitoszterolok jelentoségére. A kísérletes munka egyik fo célja az volt, hogy a Taraxaci folium, Taraxaci radix és Mori nigri folium triterpén és fitoszterol tartalmának kivonására hatékony módszert dolgozzunk ki. A szuperkritikus extrakció az oldószeres Soxhlet extrakció alternatívájának tekintheto. A két módszer közötti lényeges különbség, hogy szuperkritikus fluidummal kapott anyag nyomokban sem tartalmaz oldószermaradékot, az extrakció kíméletes körülmények között folyik, és az extraktum összetétele a szuperkritikus muveleti paraméterek megválasztásával befolyásolható. Többkomponensu rendszerekben az egyensúlyi összetétel jelentosen eltérhet a binér elegyek adataiból becsült értékektol. A komponensek ugyanis kölcsönösen befolyásolhatják egymás oldhatóságát. Sokkomponensu rendszerek (ilyenek például a növényi kivonatok) szuperkritikus oldószer és egy másik fázis (folyadék, szilárd) közötti megoszlásnál csak nagyon kevés mérési adatot ismerünk.? Kísérleti munkánk során a szuperkritikus és Soxhlet extrakció összehasonlításával vizsgáltuk a triterpénekben és fitoszterolokban gazdag kivonatok eloállításának megvalósíthatóságát három növényi drogból: - A Mori nigri folium-ból szuperkritikus extrakcióval eloállított kivonat? -amirin tartalma több mint háromszorosa (2,082g/ 100g kivonat) a hagyományos kivonat hatóanyagtartalmának (0,063g/ 100g kivonat). A fitoszterol tartalom kétszeresére dúsul szuperkritikus kivonással (1,45g/ 100g kivonat) a Soxhlet extrakcióhoz viszonyítva (0,076g/ 100g kivonat). Mérési eredményeink alapján feltételezzük, hogy a fitoszterolok valószínuleg szabad formában találhatók a levéldrogban. A triterpének csoportjába tartozó még nem azonosított vegyület a Mori nigri folium-ból tízszeresére dúsult fel a szuperkritikus extraktumokban (6,11g/ 100g kivonat) az alkoholos kivonáshoz képest (0,642g/ 100g kivonat). - A szuperkritikus extrakció hozamát vizsgálva a Taraxaci radix nem illó komponenseire megállapítottuk, hogy a gyermekláncfu gyökérdrogból a? -amirin kivonása szuperkritikus extrakcióval (450 bar és 35 o C- 24,54g/ 100g kivonat) hatékonyabb ( kétszer), mint az alkoholos kivonás (13,01g/ 100g kivonat). A fitoszterolok (a szabadon és glikozidikus kötésben lévok) kivonása szuperkritikus kivonással nem tekintheto elonyösebbnek a hagyományos extrakciós módszereknél. - Hasonló a tendencia a Taraxaci folium-ból extrahált? -amirin feldúsulási dinamikáját illetoen a különbözo kivonatokban (alkoholos: 2,46g/ 100g kivonat). A szuperkritikus kivonás (11,17g/ 100g kivonat) ezúttal is hatékonyabb volt (450 bar 65 o C). Mivel a 11
levéldrogból az apolárisabb oldószerekkel való kivonás (SFE, n-hexán) hatékonyabb, feltételezheto, hogy a fitoszterolok döntoen szabad formában vannak jelen.? A szuperkritikus és Soxhlet extrakcióval nyert nagyszámú minta értékeléséhez, a kivonatok potenciális hatóanyagai minoségi-mennyiségi feldúsulásának jellemzésére vékonyréteg kromatográfiával kombinált denzitometriás módszert dolgoztunk ki. Az eljárás kifejlesztése során a következoket bizonyítottuk: - A triterpéneket és fitoszterolokat a kivonatok elszappanosítását követoen az el nem szappanosítható frakció tartalmazta. - Az alkalmazott kifejleszto rendszer (n-hexán etil-acetát= 6:2) alkalmas a vizsgált vegyületek elválasztására, a? -amirin és? -szitoszterol R f értéke ez esetben volt a legmagasabb, illetve a két komponens R f értéke jelentosen különbözött (R f?-szitoszterol =0,43; R f?-amirin =0,58). - A látható tartományban mért vegyületekkel kapcsolatban megállapítottuk, hogy a választott elohívó reagenssel (kénsavas cérium-szulfát) a foltok élesen körülhatároltak voltak, színintenzitásuk a háttérszínezodéstol jelentosen különbözött. - Színstabilitási vizsgálatokat végeztünk azon idointervallum és homérsékleti tartomány meghatározására, melynek során a foltok színintenzitása csak elhanyagolható mértékben változik (a reakció teljes, de nem keletkeznek égéstermékek). Az optimális paraméterek: 10 min, 100 o C. - Kalibrációs görbék felvételével megállapítottuk azokat a tartományokat, melyekben a mért értékek és az anyagmennyiség kapcsolata lineáris. Ezt 2,5-5,5 ng/ml nak találtuk. - Ugyanazon folt többszöri ismételt denzitometriás mérése során nyert adatokból számított 0,05-0,09% közötti variációs koeficiensek révén bizonyítottuk, hogy a muszeres mérések megfeleloen reprodukálhatók.? Gazdaságossági szempontokat figyelembe véve, jellemeztük a fekete eperfa levelél, valamint a gyermekláncfu növényrészek (gyökér, levél, virág) triterpén és fitoszterol tartalmának feldúsulását. Megállapítottuk, hogy: - Az általunk vizsgált Mori nigri folium megközelítoleg 1/10-ét tartalmazza (? -amirin=0,052 g/100g drog;? -szitoszterol=0,043 g/100g drog) a Taraxaci folium triterpén és fitoszterol tartalmának (? -amirin=0,551 g/100g drog;? -szitoszterol=0,385 g/100g drog). - A gyermekláncfu levél és gyökérdrogot összehasonlítva azt találtuk, hogy a Taraxaci folium jobb triterpén forrás osszel, a fitoszterolok viszont tavasszal halmozódnak fel elonyösebben a drogban. - A növény egyedeken belüli megoszlását vizsgálva megállapítottuk, hogy: a levél mindkét hatóanyagban bovelkedik (ß szitoszterol =8,9%; ß amirin =14,1%), a gyökér gazdagabb 12
triterpénekben (ß amirin =3,8%), a virágzat viszont magasabb fitoszterol tartalmú (ß szitoszterol =5,8%). Mérési eredményeink és következtetéseink fontos tájékozódási adatokat jelenthetnek annak eldöntéséhez, hogy melyik drogból és melyik évszakban érdemes a kívánt vegyületeket eloállítani.? Szuperkritikus extraktumokból oszlopkromatográfiával tisztított frakciók HPLC vizsgálatával is igazoltuk, hogy a Taraxacum officinale levél és gyökérdrogjaiból eloállított kivonatok valóban? -amirint és? -szitoszterolt tartalmaznak. Ugyanezt sikerült megerosíteni a Mori nigri folium extraktumai esetében. Tekintettel az eloállított kivonatok? -amirin tartalmára, ezek potenciálisan hasznosíthatók lehetnek gyulladásos folyamatok gátlásában (aktivitásuk a proteinkináz C gátlásától függ elsosorban, a neurogenetikus folyamatok teljes mellozésével). A? - szitoszterol tartalomnak köszönhetoen pedig nemcsak a gyulladáscsökkento hatás valószínusítheto, hanem lázcsökkento, daganatellenes, esetleg immunmodulátor aktivitás is feltételezheto, melyet a T-limfociták és killer sejtek tevékenységének serkentésével, a DHEAH/ kortizon arány mérséklésével (a túlzott ellenanyag termelés csökkentésével) fejtenének ki. A szuperkritikus extrakciós vizsgálataink legfontosabb eredményeit fentiek alapján az alábbiakban összegezhetjük:? Extrakciós kísérleti eredményeink rámutattak arra, hogy a szuperkritikus extrakció eredményesen alkalmazható nem illó terpenoidok eloállítására, illetve kivonatokban való dúsításukra. Ezzel a szuperkritikus extrakció felhasználási területe jelentosen bovülhet.? Kísérleti eredményeink alapján a szuperkritikus állapotú CO 2 -dal való extrakció alkalmas triterpénekben dús frakciók eloállítására. Az optimális extrakciós körülmények kidolgozásával termékeinket kívánatos irányba tudtuk módosítani.? Mivel az aktív anyagok a szuperkritikus kivonatokban többszörösen (tízszeresig) dúsultak a hagyományos extraktumokhoz képest, az SFE alkalmazása gazdaságos lehet a gyógyszeriparban is.? A gyógyszeripar természetes eredetu alapanyagok iránt támasztott igényét a szuperkritikus extrakció a legteljesebb mértékig ki tudja elégíteni, mivel az eloállított termékekben található vegyületek a kíméletes kinyerési körülményeknek köszönhetoen nem bomlottak el, ugyanakkor szelektíven feldúsultak; a kivonatok jó minoséguek voltak és oldószereket nyomokban sem tartalmaztak. A szuperkritikus extrakció a környezet megóvása szempontjából is elonyös alternatíva.? Kísérleti adatainkkal hozzájárultunk egy szuperkritikus kivonatok minoségbiztosítását segíto adatbázis kialakításához. 13
? Tekintettel a Taraxacum és Morus fajok gyulladásgátló hatásának terápiás felhasználására, valamint a flavonoidok, mint potenciális hatóanyagok jelenlétére részletesebben tanulmányoztuk a drogkivonataink antioxidáns hatásának jellemzoit: Mind a gyermekláncfu, mind az eperfalevél drogok liofilizátumai koncentrációfüggo hidrogén-donor aktivitást fejtettek ki (I 50 = 1150?g Mori nigri folium; I 50 = 750?g Taraxaci radix; I 50 =160?g Taraxaci folium). A tanulmányozott növényi drogokból származó minták redukáló képessége szintén koncentrációfüggo volt (740 ASE/mg Taraxaci folium; 212 ASE/mg Taraxaci radix; 760ASE/mg Mori nigri folium). Kemilumineszcenciás vizsgálatoknál a Taraxaci folium kivonatok (I 50 = 155?g) gátolták legerosebben a H 2 O 2 / OH? - mikroperoxidáz- luminol rendszer fénykibocsátását (I 50 = 210?g Taraxaci radix; Mori nigri folium I 50 = 270?g); a gyermekláncfu levélkivonatok eros membránprotektív hatást is kifejtettek mikroszomális rendszerben (IC 50 =1,0mg/ml). Minden esetben a gyermekláncfu levél kivonata bizonyult a legerosebb antioxidánsnak. Eredményeink a növényi minták in vitro antioxidáns és szabadgyökfogó aktivitását igazolták. A drogok nem tápanyag komponensei elso- és másodrendu antioxidánsként funkcionálnak, scavenger aktivitást mutatnak, preventív hatásúak lehetnek olyan megbetegedésekben, amelyek pathomechanizmusában a szabad gyökök kóroki szerepe bizonyított. A magasabb polifenol és flavonoid tartalmú Taraxaci folium bizonyult a leghatékonyabbnak. Mindazon vegyületek, amelyek az oxigén-központú szabad gyökök scavengelésére, befogására képesek és eredeti molekulaformájukban eljutnak a májba, a mikroszomális lipidperoxidációval, enzimredukcióval szembeni védelmet jelentik. A növényi extraktumok képesek stimulálni a NADPH-citokróm P-450 reduktáz aktivitását NADPH kofaktor nélkül is, de kisebb mértékben; valószínu képesek elektront átadni a citokróm P-450 nek (a citokrómnak és más szintetikus redox vegyületeknek in vitro) a flavoprotein NADPH-citokróm P- 450 reduktázon keresztül in vivo, ezért befolyásolhatják a gyógyszerek metabolizmusát, amely a szervezet egyik adaptációs mechanizmusa. A növényi minták (vizes kivonatok) szabadgyökfogó és antioxidáns hatását azonban nem csak az összpolifenol tartalom (ilyen körülmények között ezek oldódnak ki elsosorban, tehát a kivonatok nem tartalmaznak apoláris komponenseket, pl. triterpéneket) befolyásolja, hanem az alkotó flavonoidok jellemzo összetétele, illetve azok kémiai szerkezete.? A hatás és szerkezet összefüggések, valamint a módszer alkalmazhatóságának feltárásához nagynyomású folyadékkromatográfiás és kapilláris elektroforézis összehasonlító vizsgálatokat végeztünk. Tapasztalataink megerosítették azt a megállapítást, hogy a HPLC elsosorban alacsonyabb számú komponenst tartalmazó minták elválasztására alkalmas, amikor az analízist rövid ido alatt kell megvalósítani. Flavonoid tartalmú kivonatoknál ezek rendkívül komplex összetétele miatt általában az utóbbi esettel állunk szemben. Ha elsosorban nagy elméleti tányérszám szükséges, akkor a CZE a megfelelo választás?51?. A két módszer összehasonlításából 14
az is megállapítható volt, hogy a CE további általános elonnyökkel is jellemezheto a HPLC-vel szemben. A CE kisebb anyagigényu, rövidebb az analízis ido, kevesebb a reagens fogyasztás (? l/min), olcsóbb az oszlop, környezetkímélo (nincs szükség szerves oldószerekre), nagy hatékonyságú és kisebb a tömeg-kimutathatósági határ, mint a HPLC-nél. A kapillár-elektroforézis vizsgálataink eredményei jelentosen járultak hozzá a biológiai értékmérések eredményeinek értelmezéséhez. A gyermekláncfu levéldrog jelentosebb antioxidáns aktivitást mutatott, mint a gyökérdrog, ezért kivonatának kvalitatív analízisére koncentráltunk. Igazoltuk az apigenin-7-o-?-glükozid és luteolin-7-o-?-glükozid, valamint a fenolkarbonsavak közül a klorogénsav jelenlétét. HPLC analízissel a Taraxaci folium kivonatban 3,517 mg/g luteolin- 7-O-?-glükozid és 3,052 mg/g klorogénsav koncentrációt határoztunk meg. Mori nigri folium extraktumok CE analízise rutin, izokvercitrin és klorogénsav jelenlétét igazolta, viszont nem tudtuk bizonyítani a kvercitrin összetevot, amit az irodalmi adatok jeleztek. A fekete eperfa levél kivonatokban HPLC analízissel: 1,162 mg/g rutin; 3,164 mg/g izokvercitrin és 1,836 mg/g klorogénsav koncentrációkat mértünk. Az eredmények alapján feltételezzük, hogy a Morus nigra kivonatok szabadgyökfogó aktivitása a rutin és más kvercetin glikozidok (izokvercitrin) szabadgyökfogó és kelátképzo aktivitásán alapul. Ugyanakkor mivel a kvercetin glikozidok formájában fordul elo és nem aglikonként magyarázza azt a tényt is, hogy aktivitása nem volt kiemelkedo. A Taraxacum officinale levéldrogjának jelentosebb antioxidáns tulajdonsága feltételezhetoen az apigenin-7-o-?- glükozid és luteolin-7-o-?-glükozid szuperoxid anion scavenger aktivitásának tudható be. Antioxidáns és kapillár-elektroforetikus vizsgálataink legfontosabb eredményeit az alábbiakban foglaljuk össze:? Megállapítottuk, hogy a vizsgált növényi (vizes) kivonatok/ liofilizátumok szabadgyökfogó és antioxidáns hatását nem csak az összpolifenol tartalom befolyásolja, hanem az alkotó flavonoidok szerkezete is. Ennek köszönhetoen a vizsgált növényi drogok valószínuleg másmás hatásmechanizmussal fejthetik ki aktivitásukat, ami lehetoséget nyújthat kivonataik indikációjának megkülönböztetésére.? A kapillárielektroforézist a növénykémiában ez idáig korlátozottan alkalmazták. Flavonoidkémiai vizsgálatainkkal adatokat tudtunk szolgáltatni ezen új analitikai módszer alkalmazhatóságának megismeréséhez.? Megállapítottuk, hogy a kapilláris elektroforézis elonyös az összetett növényi minták, illetve fenoloid keverékek fo komponenseinek gyors azonosítására. Eredményesen járulhat hozzá az összetett növényi gyógyszerek standardizálási kérdéseinek megoldásához. 15
KÖZLEMÉNYEK BIBLIOGRAFIAI ADATAI Az értekezés témájában Hagymási, K., Blázovics A., Kristó, T., Sz., Fehér, J., Kéry, Á.: Taraxacum officinale - az orvos szemével. Fitoterápia, 1999. 4, 51-56. Kristó, T., Sz., Terdy, P., P., Simándi, B., Kéry, Á.: Taraxacum officinale (gyermekláncfu) hatóanyagainak kivonása különbözo extrakciós módszerekkel. Olaj, Szappan, Kozmetika, 2000. 49, 93-97. Hagymási, K., Blázovics, A., Lugasi, A., Kristó, T., Sz., Fehér, J., Kéry, Á.: In vitro antioxidant evaluation of dandelion (Taraxacum officinale Web.) water extracts. Acta Alimentaria, 2000. 29, 1-7. (If: 0,246/ 2000) Hagymási, K., Blázovics, A., Fehér, J., Lugasi, A., Kristó, T., Sz., Kéry, Á.: The in vitro effect of dandelions antioxidants on microsomal lipid peroxidation. Phytotherapy Research, 2000. 14, 43-44. (If:0,422/ 2000) Prechl, A., Simándi, B., Kéry, Á., Lemberkovics, É., Kristó, T., Sz., Balázs, A., Deák, A.: Materials with Supercritical Fluid Extraction using carbon dioxide. Olaj, Szappan, Kozmetika, 2000. 49, 102-105. Kristó, T., Sz., Terdy, P., P., Simándi, B., Szoke, É., Lemberkovics, É., Kéry, Á.: Szuperkritikus extrakció hatékonysága a Taraxaci radix nem illó növényi terpenoidjainak eloállítására. Acta Pharmaceutica Hungarica, 2001. 71, 318-324. Kéry, Á., Blázovics, A., Fejes, Sz., Nagy, É., Lugasi, A., Kursinszki, L., Czinner, E., Kristó, T., Sz., Apáti, P., Balázs, A., Szoke, É.: Antioxidant activity of medicinal plants used in phytotheraphy. International Journal of Horticultural Science, 2001. 7, 28-35. Lemberkovics, É., Kéry, Á., Simándi, B., Kristó, T., Sz., Kakasy, A., Szoke, É.: Evaluation of supercritical plant extracts on volatile and non volatile biologically active lipophil components. International Journal of Horticultural Science, 2001. 7, 78-83. Kristó, T., Sz., Ganzler, K., Apáti, P., Szoke, É., Kéry, Á.: Analysis of antioxidant flavonoids from Asteraceae and Moraceae plants by Capillary Electrophoresis. Chromatographia, 2002. 56, S121-S126. (If: 1,317/ 2001) Simándi, B., Kristó, T., Sz., Kéry, Á., Selmeczi,L., K., Kmecz, I., Kemény, S.: Supercritical fluid extraction of dandelion leaves. Journal of Supercritical Fluids, 2002. 23, 135-142. (If: 1,975/ 2001) Kristó, T., Sz., Terdy, P., P., Selmeczi, L., K., Szoke, É., Simándi, B., Kéry, Á.: Production and caracterisation of Taraxacum officinale extracts prepared by supercritical and solvent extractions. Acta Horticulturae, 2002. 597, 57-62 16
Az értekezés témájához részben kapcsolódók Prechl, A., Simándi B., Kéry Á., Lemberkovics É., Kristó, T., Sz., Balázs, A., Deák, A., Keve, T.: Illatos barátcserje szuperkritikus extrakciója. Olaj Szappan Kozmetika, 2000. 49, 106-108. Apáti, P., Szentmihályi, K., Balázs, A., Baumann, D., Hamburger, M., Kristó, T., Sz., Szoke, É., Kéry, Á.: HPLC Analysis of the Flavonoids in Pharmaceutical Preparations from Canadian Goldenrod (Solidago canadensis) Chromatographia, 56, 65-68. 2002. (If: 1,317/ 2001) Apáti, P., Szentmihályi, K., Kristó, T., Sz., Papp, I., Vinkler, P., Szoke, É., Kéry, Á.: Herbal remedies of Solidago. Correlations of phytochemical characteristics and antioxidant properties. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2002., Közlésre elfogadva (If: 1,177/ 2001) Apáti, P., Szentmihályi, K., Kristó, T., Sz., Szoke, É., Vinkler, P., Kéry, Á.: Comprehensive evaluation of different Solidaginis herba extracts. Acta Horticulturae, 2002. 597, 69-74 Fejes, Sz., Lemberkovics, É., Balázs, A., Apáti, P., Kristó, T., Sz., Szoke, É., Blázovics, A., Kéry, Á.: Antioxidant activity of different components from Anthriscus cerefolium L. Hoffm. Acta Horticulturae, 2002. 597, 191-198 ELOADÁSOK, POSZTEREK Folyóiratokban megjelent idézheto eloadás-kivonatok Kéry, Á., Fejes, Sz., Kristó, T., Sz., Hagymási, K., Blázovics, A., Czinner, E., Lemberkovics, É., Szoke, É.: Preventive value of some medicinal plants due to their antioxidant and free radical scavenging activities. First Congress of International Society of Prevention in Clinical Medicine, Budapest, 1998. december 3-5. Abstract: Journal of Prevention in Clinical Medicine, 1998. l, 16. Kéry, Á., Kristó, T., Sz., Simándi, B., Lemberkovics, É., Szoke, É.: Quality of medicinal plant products prepared by supercritical fluid extraction. 50th Annual Congress of Society for Medicinal Plant Research, Barcelona, September 8-12. 2002. Abstract: Revista Fitoterapia 2002. 2 (1), 339. (B249). Abstract kötetben megjelent összefoglalók Kristó, T., Sz., Hagymási, K., Blázovics, A., Kéry, Á., Szoke, É.: Morus alba L. levéldrog hagyományos és szuperkritikus extrakcióval eloállított kivonatainak fitokémiai vizsgálata. Pécsi Fitoterápiás Napok, Pécs, 1998. április 18-19. Összefoglaló: Programfüzet (P11). 33. Hagymási, K., Kristó, T., Sz., Lugasi, A., Kéry, Á., Fehér, J., Blázovics, A.: Gyógynövények antioxidáns aktivitásának in vitro screenelése. Pécsi Fitoterápiás Napok, Pécs, 1998. április 18-19. Összefoglaló: Programfüzet 10. 17
Kéry, Á., Fejes, Sz., Kristó, T., Sz., Hagymási, K., Blázovics, A., Czinner, E., Lemberkovics, É., Szoke, É.: Screening of medicinal plants for free radical scavanging effects. Society for Medicinal Plant Research, Vienna, Austria, August 31st - September 4th, 1998. Abstract: in Abstracts of Plenary Lectures, Short Lectures and Posters: J. 44. Kristó, T., Sz., Terdy, P., P., Simándi, B., Kéry, Á.: Szuperkritikus extrakció alkalmazása Taraxacum officinale (gyermekláncfu) hatóanyagainak eloállítására. Szuperkritikus oldószerek analitikai és muveleti alkalmazása. Konferencia, Budapest 1999. május 20. Összefoglaló: Eloadáskivonatok 29. Kristó, T., Sz., Terdy, P., P., Simándi, B., Kéry, Á.:A szuperkritikus extrakció, mint lehetoség a Taraxacum officinale hatóanyagainak eloállítására. Congressus Pharmaceuticus Hungaricus XI., Gyógyszerészek Országos Kongresszusa XI. Siófok, 1999. október 6-10. Összefoglaló: Programfüzet, 1999. Eloadásösszefoglalók (E-54) 39. Prechl, A., Simándi, B., Kéry, Á., Lemberkovics, É., Kristó, T., Sz., Balázs, A., Deák, A., Keve, T.: Illatos barátcserje (Vitex agnus castus L.) szuperkritikus extrakciója. Szuperkritikus oldószerek analitikai és muveleti alkalmazása. Konferencia, Budapest, 1999. május 20. Összefoglaló: Eloadáskivonatok 32. Kristó, T., Sz., Terdy,P., P., Simándi, B., Balázs, A., Kéry, Á.: The preparation of bioactive constituents from Taraxacum officinale by means of various extraction methods. 8th Semmelweis Symposium, Budapest, 1999. november 4-5. Összefoglaló: Pant. Pressent and Future in Neuroendocrynology, 140. 2000. Szoke, É., Blázovics, A., Hagymási, K., Kristó, T., Sz., Apáti, P., Czinner, E., Fejes, Sz., Fehér, J., Kéry, Á.: Antioxidant activity of medicinal plants with phytotherapeutical significance. SFRR Europe Winter Meeting, Dinard, France 1999. december 2-5. Kristó, T., Sz., Terdy, P., P., Simándi, B., Kéry, Á.: A szuperkritikus extrakció hatékony alkalmazása nem illó terpenoidok eloállítására. Ph.D. Tudományos Napok 2000 Semmelweis Egyetem, Budapest, 2000.február 16-17. Kristó, T., Sz., Terdy, P., P., Simándi, B., Kéry, Á.: Fitogyógyszeralapanyagok eloállítása szuperkritikus extrakcióval. Erdélyi Múzeum Egyesület Orvostudományi és Gyógyszerészeti Szakosztály X. Tudományos Ülésszaka, Székelyudvarhely, 2000. május 11-13. Kristó, T., Sz., Apáti,,P., Hagymási,,K., Blázovics,,A., Szoke,,É., Ganzler,,K., Kéry, Á.: Analysis of antioxidant flavonoids by capillary electrophoresis (CE). The 6th European Congress of Pharmaceutical Sciences EUFEPS 2000. Budapest, September 16-19. Book of Abstracts: European Journal of Pharmaceutical Sciences, 2000. 11, S 274. Apáti, P., Szentmihályi, K., Kristó, T., Sz., Szoke, É., Vinkler, P., Kéry, Á.: Comprehensive eveluation of different Solidaginis herba extracts. The 6th European Congress of Pharmaceutical Sciences. EUFEPS 2000. Budapest, September 16-19. Book of Abstracts: European Journal of Pharmaceutical Sciences, 2000. 11, S 18
Kristó, T., Sz., Apáti, P., Hagymási, K., Blázovics, A., Szoke, É., Ganzler, K., Kéry, Á.: Antioxidáns hatású gyógynövénykivonatok vizsgálata kapillárelektroforézissel. Semmelweis Egyetem Ph.D. Tudományos Napok, 2001. február 21-22. Összefoglaló: Eloadáskivonatok, 63 (P 12). Apáti, P., Szentmihályi, K., Kristó, T., Sz., Szoke, É., Kéry, Á.: Solidaginis herba kivonatok értékelése az ásványi elemek és flavonoid glikozidok kioldódása alapján. Semmelweis Egyetem Ph.D. Tudományos Napok, 2001. február 21-22. Összefoglaló: Eloadáskivonatok, 27 (P 01). Apáti, P., Szentmihályi, K., Kristó, T., Sz., Szoke, É., Vinkler, P., Kéry, Á.: Comprehensive evaluation of different Solodaginis herba extracts. World conference on medicinal and aromatic plants. Possibilities and Limitations of Medicinal and Aromatic Plants. Budapest, 2001. July 8-11. Abstract: Abstracts - MAP Hungary, 2001. (P.IV.1.) 275. Kristó, T., Sz., Terdy, P., P., Selmeczi, L., K., Simándi, B., Kéry, Á.: Production and characterisation of Taraxacum officinale extracts prepared by supercritical fluid and solvent extractions. World conference on medicinal and aromatic plants. Possibilities and Limitations of Medicinal and Aromatic Plants. Budapest, 2001. July 8-11. Abstract: Abstracts - MAP Hungary, 2001. (P.IV.12.) 286. Apáti, P., Szentmihályi, K., Balázs, A., Baumann, D., Hamburger, M., Kristó, T., Sz., Szoke, É., Ganzler, K., Kéry, Á.: HPLC analysis of the flavonoids in pharmaceutical preparations from Solidago canadensis. Balaton Symposium'01 on High Performance Separation Methods. Siófok, 2001.September 2-4. Abstract: Book of Abstracts, Kristó, T., Sz., Apáti, P., Szoke, É., Kéry, Á.: Analysis of antioxidant flavonoids from Asteraceae and Moraceae by Capillary Electroforesis. Balaton Symposium'01 on High-Performance Separation Methods. Siófok, 2001.September 2-4. Abstract: Book of Abstracts, 18 Kéry, Á., Kristó, T., Sz., Simándi, B., Lemberkovics, É., Szoke, É.: Supercritical fluid extraction of some non-volatile bioactive terpenoids. International Congress and 49th Annual Meeting of the Society for Medicinal Plant Research. Erlangen, September 2-6. 2001. Abstract: Traits, Tracks and Traces. Abstract Book. 4.39., 172. Simándi, B., Kéry, Á., Kristó, T., Sz., András, Cs., Prechl, A., Fekete, J.: Supercritical fluid extraction of non-volatile terpenoids from medicinal plants. 4 th International Symposium on High Pressure Technology and Chemical Engineering, Venice, Italy 2002. szeptember 22-25 19