!HU00000787T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 007 87 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 08 12 (22) A bejelentés napja: 0. 0. 17. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 08012 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1927292 A1 08. 06. 04. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1927292 B1 09. 08. 26. (1) Int. Cl.: A23L 1/028 (06.01) A23L 1/09 (06.01) A23L 1/29 (06.01) A23L 1/ (06.01) A61K 31/01 (06.01) A61K 31/702 (06.01) A61K 31/7 (06.01) A61K 31/733 (06.01) () Elsõbbségi adatok: 076479 04. 0. 17. EP (72) Feltalálók: Speelmans, Gelske, 6708 LW, Wageningen (NL); Govers, Maria Johanna Adriana Petronella, 6721 AJ, Bennekom (NL); Knol, Jan, 6708 SM, Wageningen (NL); Van Tol, Eric Alexander Franciscus, 6824 MZ, Arnhem (NL) (73) Jogosult: N. V. Nutricia, 2712 HM Zoetermeer (NL) (74) Képviselõ: dr. Pethõ Árpád, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest (4) GOS és polifruktóz szinergizmusa (7) Kivonat A találmány tárgyát galakto-oligoszacharidok (GOS, például TOS) és polifruktóz (például inulin) új szinergista keverékei, valamint az ezeket tartalmazó prebiotikus élelmiszer-készítmények képezik. Ezek az élelmiszerkészítmények kedvezõ hatást gyakorolnak a részben vagy kizárólag tápszerrel táplált csecsemõkre, de elfogyasztásuk az allergiás problémákkal, például ekcémával vagy atópiával küzdõ felnõttek egészségi állapotát is javítja. HU 007 87 T2 A leírás terjedelme 22 oldal (ezen belül 6 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 199. évi XXXIII. törvény 84/H. -a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1 HU 007 87 T2 2 A találmány tárgyköre A találmány tárgya humán egészségüggyel és táplálkozással kapcsolatos. A találmány tárgyát prebiotikus szénhidrátok, elsõsorban galakto-oligoszacharidok (GOS, például TOS) és polifruktóz (például inulin) új szinergista keverékei, valamint az ezeket tartalmazó élelmiszer-készítmények képezik. Az élelmiszer-készítmények kedvezõ hatást gyakorolnak a részben vagy kizárólag tápszerrel etetett csecsemõkre. 2 3 4 0 A találmány háttere A vakbélre, colonra és végbélre osztott emberi vastagbél mikroflórája alapvetõ szerepet tölt be a humán táplálkozásban és egészségben. A baktériumflóra összetételét a felvett táplálék befolyásolja, ezen keresztül az módosítható is. A gyomron és a vékonybélen keresztüljutott szénhidrátokat ezek a baktériumok metabolizálják, a metabolizmus fõ végtermékeként rövid szénláncú zsírsavak (SCFA), pl. acetát, propionát, butirát és valerát keletkeznek, amelyek késõbb a véráramba kerülnek. A bakteriális fermentáció további végtermékei például a laktát és a szukcinát. Ezeknek a végtermékeknek az összmennyisége és összetétele (relatív mennyisége) ugyanakkor jelentõs hatást gyakorol a baktériumnövekedésre, a ph¹ra, a kórokozó fajok kizárására stb. A mikrobiális flóra és azon keresztül az emberi egészség elõnyös befolyásolásának módja a prebiotikumok alkalmazása. A prebiotikumok definíciójuk szerint nem emészthetõ élelmiszer-összetevõk, amelyek elõnyös hatást gyakorolnak a gazdaszervezetre azáltal, hogy egy vagy korlátozott számú colonbeli baktérium szaporodásának és/vagy aktivitásának szelektív stimulálásán keresztül javítják a gazdaszervezet egészségi állapotát (Gibson és Roberfroid 199, J. Nutr. 12, 11 1412). Prebiotikum olyan vegyület lehet, amely 1. nem hidrolizálódhat vagy szívódhat fel a gyomor-bél rendszer felsõ szakaszában (a gyomorban és a vékonybélben), 2. egy vagy több potenciálisan elõnyös baktérium hatására szelektíven fermentálódnia kell a colonban, 3. a colonbeli mikroflórát egészségesebb összetétel irányába kell módosítania, továbbá 4. a páciens egészségi állapota szempontjából elõnyös hatásokat kell kiváltania. Gyakran alkalmazott prebiotikumok az úgynevezett nem emészthetõ szénhidrátok (vagy oldható élelmi rostok ), amelyek emésztetlenül haladnak át a gyomor-bél rendszer felsõ szakaszán keresztül a vastagbélbe. Ilyenek például a frukto-oligoszacharidok (a FOS¹ok), az oligofruktóz, az inulin és a transzgalakto-oligoszacharidok (a TOS¹ok). Megjegyzendõ, hogy a szakirodalomban a különféle elnevezések, pl. a frukto-oligoszacharid, az inulin, az oligofruktóz és az inulooligoszacharidok használata gyakran nem következetes, és ugyanazt a megnevezést elõfordulhat, hogy különbözõ vegyületekre vagy készítményekre alkalmazzák. A felvett prebiotikumok által stimulált, és ezáltal egészségügyi szempontból igazoltan hasznos jól ismert baktériumok a tejsavbaktériumok, például a lactobacillusok és a bifidobacteriumok. Beszámoltak például az inulin és az inulinszerû fruktánok, pl. az oligofruktóz bélmûködésre gyakorolt kedvezõ hatásáról (Jenkins és mtsai., 1999, J. Nutrition 129, 14 3 14 33), ami feltételezhetõen ezek úgynevezett bifidogén aktivitásának, vagyis a teljes bifidobacteriummennyiség szaporodása szelektív elõsegítésének köszönhetõ, ezen hatás mérésére pedig vagy a székletbeli bifidobacteriumok számának in vivo megállapítása, vagy in vitro meghatározás alkalmazható [lásd például Roberfroid, Am. J. Clin. Nutr. 01, 73(suppl), 6S 9S]. Az anyatejet is bifidogén hatásúnak tartják, mivel az anyatejjel nevelt csecsemõkben a bifidobacteriumok válnak dominánssá. Ezzel szemben a tejpótló tápszerrel nevelt csecsemõk bélflóráját nem bifidobacteriumok dominálják, az baktériumfajokban gazdagabb (Harmsen és mtsai., 00, J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr., 61 67). Feltételezik, hogy az anyatejben található oligoszacharidok felelõsek a bifidogén vagy prebiotikus hatásért, ezért erõfeszítéseket tettek annak érdekében, hogy a tejpótló tápszerek összetételét úgy módosítsák, hogy az a lehetõ legközelebb álljon az anyatejéhez, közelebbrõl, hogy az anyatejjel megegyezõ, vagy ahhoz nagyon hasonló prebiotikus hatással rendelkezzen. Ezt csecsemõ tejpótló tápszerek prebiotikumokkal történt kiegészítésével érték el (Boehm és mtsai., Acta Paediatr. Suppl. 03, 441, 64 67 és Moro és mtsai., 02, J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 34, 291 29). Például tehéntejalapú tejpótló tápszer transz-galaktooligoszacharidokat (TOS-okat) és inulinhp¹t tartalmazó oligoszacharidkeverékkel történt kiegészítése a tápszerrel nevelt csecsemõkben növelte a bifidobacteriumok székletbeli számát (Boehm és mtsai. 02, Arch. Dis. Child 86, F178 F181). Csecsemõ tejpótló tápszer TOS-sal és inulinnal történt kiegészítése bifidogén hatásúnak bizonyult és csökkentette a széklet ph¹ját (Boehm és mtsai., 03 lásd fent; Moro és mtsai. 03, Acta Paediatr. Suppl. 441:77 79; Marini és mtsai. 03, Acta Paediatr. Suppl. 441:80 81; Boehm és mtsai., 02, Arch. Dis. Child Fetal Neonata. Ed. 86:F178 F181; Moro és mtsai. 02, J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 34:291 29; Schmelzle és mtsai., 03, J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 36:343 1). A prebiotikumok tejsavbaktériumok által végzett fermentálása során szerves savak keletkeznek és csökken a ph. A lactobacillusok tejsavat vagy tejsavat és acetátot (rövid láncú zsírsavat, SCFA¹t) termelnek. A tejsav L¹ vagy D¹izomer lehet; ezzel szemben a bifidobacteriumok L¹tejsavat és acetátot termelnek, D¹tejsavat viszont nem. A bifidobacteriumok (és más tejsavbaktériumok) aktivitása rendszerint nem idéz elõ pl. H 2 ¹ vagy CH 4 -gáz-képzõdést. Nem termelnek továbbá egyéb SCFA-kat, pl. propionátot, butirátot, izobutirátot, valerátot és izovalerátot. Az SCFA¹k, pl. izobutirát és izovalerát jelenléte a szénhidrátok más baktériumfajok, pl. clostridiumok, Bacteroides vagy az Enterobacteriaceae családba tartozó egyéb fajok általi fermentálására utal, vagy proteinek fermentációját jelzi (amire a bifidobacteriumok csak korlátozottan alkalmasak). Egyéb bélbaktériumok is képesek acetát vagy tejsav elõállítá- 2
1 HU 007 87 T2 2 sára, ilyenek a propionibacteriumok, az enterococcusok és a pediococcusok. Korábban beszámoltak arról, hogy bizonyos prebiotikus szénhidrátok felvétele növeli a bifidobacteriumok és/vagy lactobacillusok (relatív) mennyiségét. Ezzel egyidejûleg fokozott SCFA-képzõdést és ph¹csökkenést figyeltek meg. Emellett azonban a prebiotikumok, például az inulin vagy GOS táplálékhoz adásakor nemkívánatos tünetekhez, flatulenciához és hasi fájdalomhoz vezetõ fokozott gázképzõdés is jelentkezett. Mindezeken túl nemcsak az acetát, hanem például a butirát mennyiségének fokozódásáról is beszámoltak, ami nemkívánatos fejlemény. Mindezek alapján bizonyos prebiotikumokkal kiegészített táplálék elfogyasztása különféle nemkívánatos hatásokhoz vezetett. Az anyatejjel nevelt csecsemõk vastagbelében és székletében a domináns SCFA az acetát, de ezekben a mintákban magas koncentrációban fordul elõ laktát is. Ezek a (relatív) mennyiségek magasabbak, mint felnõttekben (akik esetében a laktátkoncentráció rendszerint elhanyagolhatóan alacsony), vagy a standard tejpótló tápszerrel etetett csecsemõkben megfigyeltek. Ennek következtében az anyatejjel nevelt csecsemõk vastagbelében és székletében a propionát és különösen a butirát mennyisége jóval alacsonyabb, mint felnõttekben, és alacsonyabb a standard tejpótló tápszerrel etetett csecsemõknél tapasztalható mennyiségeknél is. Az anyatejjel nevelt csecsemõk székletének ph¹ja a legalacsonyabb. Amint a fentiekben említettük igény mutatkozik tápszerkészítmények, különösen tejpótló tápszerkészítmények iránt, amelyek elfogyasztása az anyatejjel nevelt csecsemõkéhez nagyban hasonló bélbeli mikroflóra kialakulásához vezet. Az SCFA¹k és a laktát, valamint az alacsony vastagbélbeli ph számos egészségügyi hatásáról beszámoltak már. Az alacsony ph és a szerves savak jelenléte a beszámolók szerint patogénellenes hatással bír, valamint elõnyhöz juttatja a savtoleráns baktériumokat, például a tejsavbaktériumokat (ideértve a bifidobacteriumokat). Az SCFA¹k bélfalra gyakorolt hatásáról is beszámoltak korábban. Az SCFA¹k energiaforrást jelentenek a vastagbél-nyálkahártya hámsejtjeinek, így elõsegítik a bélfalbeli védõgát egységét. Az SCFA¹k hatással vannak a perisztaltikus mozgásokra, az epesavak metabolizmusára, a vízabszorpcióra és a sejtdifferenciálódásra (lásd például EP002 számú európai szabadalmi bejelentés). Az SCFA¹k ismereteink szerint stimulálják a nyálkaképzõdést, szerepet játszanak az ásványi anyagok felszívásában és a nyálka termelésében is. A korábban nem közölt WO 0/039319 számú nemzetközi közzétételi irat Bifidobacterium breve-t, galakto-oligoszacharidokat és polifruktózt tartalmazó készítményeket mutat be, amelyek jótékony hatással voltak immunológiai rendellenességekre, pl. allergiára, ekcémára vagy atópiás megbetegedésre. A korábban nem közölt WO 0/03997 számú nemzetközi közzétételi irat savas oligoszacharidokat és két különbözõ neutrális oligoszacharid, pl. galaktooligoszacharid és polifruktóztartalmú készítményeket 2 3 4 0 mutat be, amelyek jótékony hatással voltak immunrendszerrel kapcsolatos rendellenességekre, pl. allergiára, ekcémára vagy atópiás megbetegedésre. A találmány szerinti megoldás részletes ismertetése Azt a meglepõ felfedezést tettük, hogy GOS (különösen a TOS) és polifruktóz (különösen az inulin) együtt adagolva számos jótékony hatást fejt ki, amelyek nem magyarázhatók a bélbeli bifidobacteriumok számának növekedésével, és amelyek ennélfogva nem a TOS vagy az inulin¹hp esetében a tudomány jelenlegi állása szerint leírt bifidogén hatásnak köszönhetõk (lásd pl. Boehm és mtsai., 02, fentebb). Közelebbrõl, azt a meglepõ felfedezést tettük, hogy GOS és polifruktóz keverékek beadását követõen csecsemõkben nõtt az SCFA¹k képzõdött összmennyisége, nõtt az acetát és laktát relatív mennyisége és csökkent a széklet ph¹ja, ugyanakkor ezek a hatások nem álltak arányban a bifidobacteriumok számának (relatív) növekedésével. Az SCFA¹k mennyiségének jótékony hatású emelkedése és kedvezõ összetételük, valamint a laktátkoncentráció emelkedése mellett csökkenõ gázképzõdést tapasztaltunk. Mindemellett a laktátnak a vastagbélre gyakorolt, mind ez idáig ismeretlen jótékony hatásáról is beszámoltunk, ugyanis kimutathatóan fokozta a prosztaglandin E1 és prosztaglandin E2 szekrécióját. Errõl a hatásról korábban csak SCFA¹k, elsõsorban acetát esetében számoltak be (Willemsen és mtsai., 03, Gut 2, 1442 1447). A laktátot és a laktáttermelést fokozó prebiotikumokat tartalmazó készítmények mindezek alapján igénybe vehetõk a nyálkatermelés fokozására és a nyálkahártya védõrétege épségének támogatására (nyálkavédelemre). Kimutattuk a laktátról, hogy csökkenti a vastagbélizmok spontán összehúzódásait és feszülését, ami csökkenti a görcskészséget és a fájdalmat. A találmány szerinti prebiotikus készítmények újnak tekinthetõk, abban az értelemben, hogy nem, vagy nem lényeges mértékben fokozzák a bifidobacteriumok számát, ezzel szemben növelik az összes SCFA mennyiségét, elõnyösen módosítják az SCFA-összetételt (növelik az acetát és csökkentik a butirát és propionát mennyiségét), növelik a tejsav mennyiségét (ebbõl eredõen görcs- és feszüléscsökkentõ hatással és nyálkatermelést fokozó hatással bírnak), csökkentik a széklet ph¹ját, csökkentik a gázképzõdés mértékét, fokozatosabb SCFA-képzõdést okoznak (ideértve a vastagbél távolabbi szakaszaiban történõ SCFA-képzõdést), vagyis összességében fermentációs termékek optimális összetételét eredményezik (több L¹laktát, kevesebb butirát stb.). Mindezek a változások a vastagbélbeli környezetet hasonlatosabbá teszik az anyatejjel nevelt csecsemõkéhez. A találmány egy megvalósítási módjában a találmány tárgyát GOS és polifruktóz keverékek hatékony mennyiségekben az anyatejjel nevelt csecsemõkéhez alapvetõen hasonló vastagbélbeli környezetet kialakító készítmények elõállítására történõ alkalmazása képezi. Az elõnyös hatások lényegesen kifejezettebbek voltak együttes beadás esetén, ahhoz képest amikor GOS 3
1 HU 007 87 T2 2 vagy polifruktóz (pl. TOS vagy inulin) különálló beadására került sor, mindez a GOS és polifruktóz közötti szinergizmusra utal. Ezidáig nem végeztek olyan vizsgálatokat, ahol a TOS és inulin önálló adagolásának hatását közvetlenül e két vegyülettípus együttes adagolásának hatásával hasonlították volna össze, az ilyen különálló vizsgálatok értelemszerûen nem hasonlíthatók össze egymással és alkalmatlanok szinergista hatások kimutatására. A GOS és polifruktóz (pl. TOS és inulin) újonnan kimutatott szinergista kölcsönhatása, és együttes beadásuk in vivo hatásai a GOS¹t és polifruktózt megfelelõ (szinergista) mennyiségben tartalmazó készítmények új alkalmazásai elõtt nyitják meg az utat, ilyenek például az allergia gyógykezelése vagy megelõzése. Mindezek mellett laktátot (D¹laktátot és/vagy L¹laktátot, elõnyösen L¹laktátot) tartalmazó készítmény is alkalmazható egy vagy több említett tünet vagy rendellenesség kezelésére vagy megelõzésére. Mindezek alapján a prebiotikumok (GOS és polifruktóz) specifikus keverékeinek bélflóra általi fermentációja nem várt módon fokozott és kinetikailag elõnyös SCFA és laktátképzõdéshez, valamint kedvezõbb összetételû végtermékhez vezet. Ez számos kedvezõ hatást eredményez, ilyenek például a nyálkatermelésre gyakorolt hatás, a gyulladáscsökkentõ hatások, a fájdalomérzetre és a hasi görcsökre/kólikára gyakorolt hatások (utóbbiak a vastagbél relaxációján és a spontán összehúzódásainak csökkentésén keresztül alakulnak ki). 2 3 4 0 Meghatározások Poliszacharidok alatt monoszacharidegységekbõl felépülõ, legalább egység hosszúságú szénhidrátláncokat értünk. Ezzel szemben az oligoszacharidok lánchosszúsága tíz egységnél kisebb. A polimerizáció foka vagy DP meghatározás egy oligo- vagy poliszacharidlánc szacharidegységeinek összmennyiségét jelöli. Az átlagos DP egy készítmény oligoszacharid- vagy poliszacharidláncainak átlagos DP¹jét jelöli, az esetleg jelen lévõ (ebben az esetben elõnyösen eltávolításra kerülõ) mono- és diszacharidok figyelembevétele nélkül. A készítmények átlagos DP¹értéke a készítmények megkülönböztetésére használható. Emellett az elkülönítést segíti a szacharidegységek százalékos mennyisége, például a glükózvagy fruktózegységek egy készítményen belüli százalékos aránya is. A polifruktóz vagy polifruktán vagy fruktopoliszacharid megnevezés ¹kapcsolt fruktózegységekbõl álló láncot tartalmazó, vagy nagyobb értékû polimerizációval rendelkezõ poliszacharid szénhidrátot jelöl, ilyenek például az inulin (pl. az inulin HP), a leván és/vagy a vegyes típusú polifruktán (lásd lentebb). Az inulin vagy nem hidrolizált inulin vagy inulin HP megnevezés glükózvégû fruktózláncokat jelöl, ahol a láncok többsége (legalább 90%¹a, elõnyösen legalább 9%¹a) esetében a polimerizáció foka (DP) vagy magasabb. Az inulin ennek megfelelõen a GF n képlettel írható le, ahol a G glikozilegységet, az F fruktozilegységet jelöl, az n pedig az egymáshoz kapcsolódó fruktozilegységek számát jelenti, amelynek értéke 9 vagy több. A G/F arány kb. 0,1 és 0 közötti. Az inulinmolekulák kis hányada ugyanakkor nem rendelkezik terminális glükózegységgel. Az átlagos DP elõnyösen legalább, elõnyösebben vagy több, pl., 21, 22, 23, 2,,,, 70, 0, 0 vagy több. Az inulinban a fruktózegységek (2 1) kötéssel kapcsolódnak egymáshoz. Megfelelõ inulin például a kereskedelmi forgalomban beszerezhetõ Raftiline HP (Orafti), amelynél az átlagos DP>23. A hidrolizált inulin vagy oligofruktóz megnevezés glükóz- és fruktózvégû fruktózláncokat jelöl, amelyek DP¹je alatti. Ennek megfelelõen a hidrolizált inulin GF n láncok és F n láncok keveréke (ahol a G glikozilegység, az F fruktozilegység és az n=1 8). A hidrolizált inulin az inulin (enzimes vagy savas) hidrolízisének vagy részleges hidrolízisének terméke, a (1 2) fruktozil-fruktóz kötések hasításának eredménye. A hidrolizált inulin megnevezés magában foglalja az azonos szerkezeti felépítéssel rendelkezõ, szintetikus vagy rekombináns úton elõállított inulint is. A leván, vagy levulán, vagy levulin, vagy levulozán megnevezések (2 6) kötésekkel összekapcsolt fruktózegységekbõl felépülõ polifruktózt tartalmazó poliszacharidot jelölnek. A molekula tartalmazhat egy kezdõ glükózgyököt is, de ez nem szükségszerû. A polimerizáció foka feletti. A vegyes típusú polifruktánokban a fruktózegységeket (2 1) és (2 6) kötések kapcsolják össze. A vegyes típusú polifruktánok elágazó láncú molekulák, esetükben a DP>. A GOS, vagy galakto-oligoszacharidok, vagy transz-galakto-oligoszacharidok, vagy TOS megnevezés galaktózegységekbõl felépülõ oligoszacharidokra utal, amelyek esetében a DP vagy kevesebb, az átlagos DP pedig 2, 3, 4, vagy 6. A lánc redukálóvégén glükózegység is jelen lehet. A GOS elõnyösen legalább 2/3 arányban galaktózegységeket tartalmaz. Legelõnyösebbek a ¹(1 4) glikozidkötésekkel rendelkezõ transz-galakto-oligoszacharidok (TOS¹ok). Ilyen például a Vivinal GOS-ban (kereskedelmi forrása a Borculo Domo Ingredients, Zwolle, Hollandia) található, ¹(1 4) glikozidkötéseket és ¹(1 6) glikozidkötéseket tartalmazó transz-galakto-oligoszacharidokból álló GOS. Az SCFA vagy rövid láncú zsírsavak megnevezés legfeljebb C6 hosszúságú szénlánccal rendelkezõ, bélbeli bakteriális fermentáció végtermékeként keletkezõ zsírsavakat jelöl, ilyenek az acetát (C2), a propionát (C3), a butirát és izobutirát (C4), a valerát és izovalerát (C) stb. Az ic4 kifejezés összefoglalóan izobutirátot, valerátot és izovalerátot jelöl. A szinergizmus szempontjából hatékony mennyiség GOS és polifruktóz (például TOS és inulin) olyan mennyiségeire utal, amelyek együttesen beadva egy (vagy több) specifikus (e leírásban máshol részletezett) élettani hatást váltanak ki, ahol az együttes beadás teljes hatása szignifikánsan nagyobb mértékû, mint a GOS és polifruktóz külön-külön történõ alkalmazásá- 4
1 HU 007 87 T2 2 nak eredményeként létrejövõ hatások összege. Így például, ha a GOS önálló alkalmazásának hatása X értékû, a polifruktózé pedig Y, akkor a GOS és a polifruktóz együttes alkalmazásának hatása nagyobb, mint X+Y, és például a GOS 1/2 mennyisége és a polifruktóz 1/2 mennyisége együttes alkalmazásának hatása nagyobb, mint 1/2X+1/2Y stb. Két vagy több anyag együttes beadása alatt ezen anyagok egyazon egyednek, vagy egy készítményben, vagy különálló készítményekben (részekbõl álló kittel, kombinált készítményként), egyazon idõpontban (szimultán) vagy rövid idõn belül (elkülönített vagy szekvenciális alkalmazás, pl. perceken vagy órákon belül) történõ beadását értjük. Enterális beadás alatt közvetlenül egy páciens gyomor-bél rendszerébe (pl. orálisan, szondán, katéteren vagy sztómán keresztül) történõ beadást értünk. A magában foglalja kifejezés adott részek, lépések vagy összetevõk jelenlétét határozza meg, de nem zárja ki egy vagy több további rész, lépés vagy összetevõ jelenlétét. Csecsemõ alatt 0 36 hónapos életkorú, elõnyösen 0 18 hónapos életkorú, vagy még elõnyösebben 0 12 hónapos életkorú embert értünk. Az anyatejjel táplált csecsemõk meghatározás kizárólag emberi anyatejjel táplált csecsemõkre vonatkozik. A nem vagy részben anyatejjel táplált csecsemõk meghatározás nem kizárólag emberi anyatejjel táplált csecsemõket jelöl. Idetartoznak a legalább napi egy üveg (kb. 80 ml) tejpótló tápszert fogyasztó csecsemõk is. A százalék vagy átlag kifejezések ellenkezõ értelmû meghatározás, vagy nyilvánvalóan más számítási alap hiányában általában tömegszázalékra vagy ¹átlagra vonatkoznak. A találmány egy megvalósítási módjában a találmány tárgyát GOS¹t és polifruktózt megfelelõ (szinergizmus szempontjából hatékony) mennyiségben tartalmazó készítmények új felhasználásai képezik. 2 3 4 0 A találmány szerinti alkalmazások és eljárások A találmány szerinti különbözõ alkalmazásokban a páciens elõnyösen emberi páciens, még elõnyösebben csecsemõ, például újszülött vagy legfeljebb 12 hónapos életkorú csecsemõ. A páciensek elsõsorban részben vagy egészen tejpótló tápszerrel táplált csecsemõk. Alternatív módon a páciens kisgyermek, tizenéves vagy felnõtt is lehet. A bél optimálistól elmaradó mûködésébõl eredõ allergiás panaszok is megelõzhetõk vagy kezelhetõk a segítségükkel. Egy további megvalósítási módban a találmány tárgyát galakto-oligoszacharidok és polifruktózallergia, ekcéma vagy atópiás megbetegedések kezelésére vagy megelõzésére szolgáló készítmény elõállítására történõ alkalmazása képezi. Egyéb meghatározás hiányában a (pl. SCFA, acetát vagy laktát mennyiségének) lényeges mértékû növelése jelen leírásban a GOS vagy polifruktóz (pl. inulin) külön-külön történt beadásának hatására képzõdõ mennyiséghez képest legalább %¹os, elõnyösen legalább %¹os, még elõnyösebben legalább %¹os vagy nagyobb mértékû növelést jelent. Hasonlóképpen, egyéb meghatározás hiányában a (pl. képzõdött gáz mennyiségének) lényeges mértékû csökkenése jelen leírásban a polifruktóz (pl. inulin) külön történt beadásának hatására képzõdõ mennyiséghez képest legalább %¹os, elõnyösen legalább %¹os, még elõnyösebben legalább %¹os, 2%¹os, 0%¹os vagy nagyobb mértékû (pl. 70%¹os, 80%¹os, 90%¹os vagy 0%¹os) csökkenést jelent. A GOS- és polifruktózkészítmények fermentációs termékeként keletkezõ SCFA összmennyiség növekedése a páciensek széklet ph¹értékeinek lényeges mértékû csökkenése alapján is meghatározható, utóbbi a vastagbélbeli ph in vivo csökkenésére utal. Csecsemõkben megállapítottuk, hogy a széklet ph¹értéke kb. ph=,8¹re vagy az alá csökkent, így ph=,6,,, vagy,4, vagy,2 értéket ért el TOS és polifruktóz (pl. inulin) együttes adagolását követõen, míg a standard tejpótló tápszerrel etetett csecsemõknél a ph=6 környékén vagy a felett volt, így pl.,9, 6,8 vagy akár 7,0 értéket ért el. A ph¹érték lényeges mértékû csökkenése ennélfogva a standard tejpótló tápszerrel etetett csecsemõknél mért értékekhez képest legalább %¹os, vagy 0,9 egységet kitevõ csökkenést jelent. A székletminták elemzésével kapcsolatban figyelembe kell venni, hogy az csak az aktuális in vivo hatás indirekt mérésére alkalmas. Ehhez hasonlóan in vitro vizsgálati eljárások is végezhetõk, ahol baktériumpopulációkat in vitro szaporítunk és a tenyészetekhez a készítmények megfelelõ mennyiségét adagoljuk. Közelebbrõl, a Példákban bemutatott in vitro fermentációs rendszer is igénybe vehetõ erre a célra. A találmány szerinti szinergista hatású készítmények szinergizmus szempontjából hatékony mennyiségben beadva mindezek alapján különösen alkalmasak csecsemõ vastagbelében egészséges mikroflóra kialakítására és/vagy fenntartására. A találmány egy elõnyös megvalósítási módjában a csecsemõ táplálása kizárólag egy alapkészítménnyel, pl. tejpótló tápszerrel történik, amelyet a születés utáni elsõ hetekben GOSés polifruktózszinergizmus szempontjából hatékony mennyiségével egészítenek ki. A találmány szerinti megoldás szempontjából elõnyös készítmény ennek megfelelõen csecsemõknek szánt élelmiszer-készítmény. A találmány egy további megvalósítási módjában a csecsemõ táplálása csak részben történik találmány szerinti készítménnyel. A találmány egy megvalósítási módjában a készítményt allergia kezelésére vagy megelõzésére vesszük igénybe. GOS és polifruktóz tehát igénybe vehetõ allergia kezelésére szolgáló, egyidejû, elkülönülõ vagy egymást követõ alkalmazásra szánt készítmény vagy kombinált készítmény elõállítására. A páciens ebben az esetben tetszõlegesen lehet csecsemõ, gyermek, tizenéves vagy felnõtt. Egyértelmû, hogy a GOS és polifruktóz szinergizmus szempontjából hatékony mennyiségével kiegészített alap készítmények a páciens életkorának, a beadás módjának és a kezelni vagy megelõzni kívánt fõ tüneteknek megfelelõen változnak. Csecsemõk esetében például
1 HU 007 87 T2 2 az alapkészítmény elõnyösen folyékony vagy por alakú csecsemõ- vagy nevelõtápszer ( follow¹on formula ), míg felnõttek esetében alkalmasabb lehet a (folyékony, félfolyékony vagy szilárd) táplálékkiegészítõ készítményben vagy szondán keresztül történõ beadás. A találmány tárgyát képezi szinergizmus szempontjából hatékony mennyiségben GOS¹t és polifruktózt tartalmazó készítmények allergia kezelésére és/vagy megelõzésére történõ alkalmazása. Figyelembe kell venni, hogy nem szükségszerûen egy készítményrõl van szó, hanem a GOS¹t és a polifruktózt különálló készítmények is tartalmazhatják, amelyek együttes beadása szinergizmus szempontjából hatékony mennyiséget biztosít. Egy szinergizmus szempontjából hatékony mennyiségû GOS¹t és polifruktózt tartalmazó készítmény mindezek alapján felhasználható (pl. újszülött, koraszülött vagy idõre született csecsemõben, vagy részben vagy teljesen tejpótló tápszerrel táplált csecsemõben, vagy más páciensekben, pl. felnõttekben) a fenti élettani hatások közül egy vagy több fenntartására vagy kialakítására, és egészséges vastagbélbeli környezet és a vastagbél optimális aktivitásának biztosításán, vagy kialakításán keresztül a páciens egészségi állapotának fenntartására, vagy javítására. Egy találmány szerinti készítmény alkalmazásával csökkenthetõk, megszüntethetõk vagy megelõzhetõk különféle megbetegedések, rendellenességek vagy tünetek, így pl. az allergia, az ekcéma, az allergiás eredetû asztma vagy egyéb atopiás megbetegedés, és/vagy a székrekedés elõfordulási gyakorisága, idõtartama és/vagy súlyossága. 2 3 4 0 A találmány szerinti készítmények A fentiekben bemutatott alkalmazásokra megfelelõ készítmények szinergizmus szempontjából hatékony mennyiségekben tartalmaznak GOS¹t és polifruktózt. A készítmények GOS/polifruktóz aránya 3/97 97/3 közötti, elõnyösen /9 9/ közötti, elõnyösebben 90/ 4/ közötti. A találmány tárgyát képezi az elõbbiekben említett végpontok közötti összes további lehetséges arány is, így pl. a /90, a /80, a /70, a /, az 0/0, az /4, a /, a 70/, a 80/, a 8/ és a 90/ stb. Az (optimális) szinergista hatás eléréséhez szükséges adag és GOS/polifruktóz arány a készítmény típusának, a beadás módjának és gyakoriságának függvényében változhat. Az alábbiakban ennek ellenére néhány példát mutatunk be erre vonatkozóan. Szakember könnyen megállapíthatja, hogy az egyes összetevõk milyen dózisára van szükség a legjobb élettani hatás eléréshez és melyik a legmegfelelõbb GOS/polifruktóz arány. Például ha a fõ cél az SCFA összmennyiségének növelése egy GOS¹t és polifruktózt tartalmazó készítmény szájon át történõ beadását követõen, szakember különféle (GOS¹t és polifruktózt, csak GOS¹t vagy csak polifruktózt tartalmazó) készítményeket fog elõállítani, majd szakember számára ismert in vivo vagy in vitro vizsgálati eljárásokkal összehasonlítja magas SCFA mennyiségeket indukáló hatékonyságukat. Megjegyzendõ, hogy a napi adag, vagy adag per nap kifejezések nem arra utalnak, hogy az adagot egy alkalommal kell a páciensnek beadni. Egy szinergizmus szempontjából hatékony csecsemõtápszer például egy alapkészítménybõl (pl. standard csecsemõtápszerbõl), és benne kb. 4 g/l, g/l vagy nagyobb mennyiségû GOS és polifruktóz keverékbõl áll, ahol a GOS polifruktózhoz viszonyított aránya az itt korában leírtak szerint változhat (pl. 90% GOS:% polifruktóz). A polifruktóz például leván és/vagy inulin lehet. A készítményekben felhasznált polifruktóz, így a leván vagy inulin kivonható természetes forrásokból (növényekbõl vagy baktériumokból), vagy elõállítható szakember számára ismert de novo szintézissel, vagy rekombináns DNS technológiákkal. Az inulin extrakciójára, méretalapú szeparálására és tisztítására szolgáló eljárások leírása megtalálható például a következõ forrásokban: De Leenheer (1996), US 669488 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom, US96836 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom. A rekombináns elõállításra szolgáló eljárások leírása megtalálható például az US 6936 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalomban. A szintézishez általában szacharózmolekulák és fruktozil-transzferáz-aktivitással rendelkezõ enzimek szükségesek. A találmány szerinti készítményekben való felhasználásra alkalmas inulin már kereskedelmi forgalomban is beszerezhetõ, ilyen pl. a Raftiline HP, Orafti. A növényi eredetû inulinok általában sokkal kisebb fokú polimerizációt mutatnak, mint a bakteriális inulinok (legfeljebb 0, a baktériumokban tapasztalható akár 0 000-rel szemben). Növényi inulinforrások például kétszikû fajok lehetnek, ilyenek például a Compositae (fészkesvirágúak). Fõként gyökerükben, hagymájukban vagy gumójukban viszonylag nagy mennyiségû inulint termelõ fajok például a cikória, a spárga, a dália, a csicsóka, a fokhagyma stb. (lásd Kaur és Gupta, J. Biosci. 02, 27, 703 714). Mivel az inulin elõnyösen nem tartalmazhat oligofruktózt, hidrolízise kerülendõ, vagy a jelen lévõ oligofruktózt és/vagy mono- vagy diszacharidokat a felhasználás elõtt el kell távolítani. A találmány szerinti megoldás szempontjából különösen elõnyös a legalább,,, 0, 70, 0, 1, 1, 0, 0, 0, 00 vagy magasabb PD¹értékkel rendelkezõ polifruktóz alkalmazása. Egyes polifruktózok, mint például a levánok a túlságosan hosszú láncokból eredõ viszkozitás-problémák elkerülése érdekében hidrolizálhatók, amennyiben PD¹értékük vagy az feletti marad. Levánok természetes forrásokból, pl. növényekbõl (pl. egyszikûekbõl), élesztõgombákból, gombákból, baktériumokból is kinyerhetõk, vagy kémiai úton, vagy rekombináns DNS technológia alkalmazásával is elõállíthatók. A GOS természetes forrásokból, pl. növényekbõl (pl. csicsókából, szójából) vagy baktériumokból nyerhetõk ki, vagy szakember számára ismert szintetikus úton vagy rekombináns DNS technológiával állíthatók elõ. A GOS ¹galakto-oligoszacharid vagy ¹galakto- 6
1 HU 007 87 T2 2 2 3 4 0 oligoszacharid vagy e kettõ keveréke lehet. Közelebbrõl, a galaktózegységeket (1 4) és (1 6) glikozidkötések kapcsolják össze (transz GOS vagy TOS). A találmány szerinti készítményekben történõ felhasználásra alkalmas GOS már kereskedelmi forgalomban is beszerezhetõ, ilyen pl. a Vivinal GOS, Borculo Domo Ingredients, Zwolle, Hollandia. GOS laktóz ¹galaktozidázzal végzett enzimatikus emésztésével, vagy poliglukán hidrolízisével is elõállítható. A találmány egy elõnyös megvalósítási módjában TOS alkalmazására kerül sor. A találmány egy megvalósítási módjában a polifruktóz elõnyösen inulin HP, így a TOS és az inulin HP kombinációja is a találmány elõnyös megvalósítási módját jelenti. A találmány szerinti további készítmények megfelelõ mennyiségû laktátot tartalmaznak, különösen a fentiekben leírt alkalmazások céljára. A laktát megfelelõ mennyisége például napi 1 g között változhat. A találmány szerinti készítmények lehetnek élelmiszer-készítmények, táplálékkiegészítõ készítmények vagy gyógyászati készítmények. A polifruktóz és GOS (és/vagy laktát) mellett további összetevõket is tartalmazhatnak. Élelmiszer-készítmények és táplálékkiegészítõ készítmények esetében ezeknek élelmiszer minõségûnek és élettani szempontból elfogadhatónak kell lenniük. Az élelmiszer kifejezés folyékony, szilárd vagy félig szilárd dietetikus készítményekre utal, elsõsorban teljes értékû élelmiszer-készítményekre (élelmiszer-helyettesítõkre), amelyek mellett nincs szükség további tápanyagfelvételre vagy táplálékkiegészítõ készítményekre. A táplálékkiegészítõ készítmények nem helyettesítik teljes mértékben a más forrásból származó tápanyagfelvételt. A találmány egy elõnyös megvalósítási módjában az élelmiszer- és a táplálékkiegészítõ készítmény csecsemõtápszer vagy táplálékkiegészítõ, koraszülött csecsemõk számára készült tápszer vagy táplálékkiegészítõ, csecsemõtápszer vagy kisgyermektápszer, amelyek beadására elõnyösen enterálisan, elõnyösen naponta több alkalommal kerül sor. A tápszerek vagy táplálékkiegészítõk különösen alkalmasak nem, vagy csak részben anyatejjel táplált csecsemõk etetésére. A készítmények elõnyösen adagolhatók csecsemõknek a szilárd táplálékra történõ átállás, vagy az anyatejes táplálásról a tápszeres etetésre való átállás idõszakában. A találmány szerinti készítmény anyatej beltartalmát növelõ kiegészítõ összetevõje is lehet. A találmány egy megvalósítási módjában a készítmény pl. szakember számára ismert, közelebbrõl az Európai Bizottság 91/321/EEC számú direktívájában és annak kiegészítéseiben meghatározott csecsemõtápszer vagy nevelõtápszer, de kiegészíthetõ annak érdekében, hogy hatékony mennyiségû polifruktózt és GOS¹t tartalmazzon. A csecsemõtápszer vagy nevelõtápszer alapja lehet tej (tehéntej, kecsketej stb.), csecsemõ tejpótló tápszer (IMF), laktóz intoleráns csecsemõk esetében szója, valamint allergiával vagy felszívási problémákkal küzdõ csecsemõk esetében nitrogénforrásként aminosavakat tartalmazhat. A kereskedelmi forgalomban beszerezhetõ csecsemõ- vagy nevelõtápszerek ennek megfelelõen tejprotein vagy szójaproteinalapot, ajánlott napi mennyiségeknek megfelelõ adagokban zsírt, vitaminokat, emészthetõ szénhidrátokat és ásványi anyagokat tartalmazhatnak, kiszerelésük pedig por, folyékony koncentrátum vagy etetésre kész készítmény lehet. A módosított csecsemõ- vagy nevelõtápszer beadása olyan vastagbélbeli környezetet eredményez, ami hasonlít az anyatejjel nevelt csecsemõkére, amint az a széklet ph¹jából, baktérium-összetételébõl, az SCFA-termelésbõl és ¹összetételbõl, gáztermelésbõl megállapítható. Ital formájú készítmény esetében (a napi hatékony adagot tartalmazó) naponta felvett vagy beadott mennyiség elõnyösen 0 ml és 00 ml közötti, elõnyösen ml és 00 ml közötti. Szilárd formájú készítmény esetében (a napi hatékony adagot tartalmazó) naponta felvett vagy beadott por alakú tápszer mennyisége elõnyösen és 2 g/nap közötti, elõnyösen 70 és 0 g/nap közötti. A GOS és polifruktóz napi hatékony adagja kb. 1 és g/nap közötti, csecsemõk számára elõnyösen kb. 2 és g/nap közötti, felnõtteknek elõnyösen kb. és g közötti. A találmány szerinti élelmiszer-készítmények vagy táplálékkiegészítõ készítmények tartalmazhatnak további aktív összetevõket, például (A¹, B1¹, B2¹, B3¹, B¹, B12¹, C¹, D¹, E¹, K¹ stb.) vitaminokat, probiotikumokat (pl. bifidobacteriumokat, lactobacillusokat stb.), egyéb prebiotikumokat, rostokat, laktoferrint, immunglobulinokat, nukleotidokat stb. Változó mennyiségben tápanyagok, pl. proteinek, lipidek és egyéb szénhidrátok (pl. emészthetõ szénhidrátok, nem emészthetõ szénhidrátok, oldható vagy oldhatatlan szénhidrátok) is jelen lehetnek a készítményekben. A csecsemõtáplálásban jellemzõen alkalmazott oldhatatlan, nem emészthetõ szénhidrátok a szójaeredetû poliszacharidok, a rezisztens keményítõ, a cellulóz és a hemicellulóz. A csecsemõtáplálásban jellemzõen alkalmazott oldható és emészthetõ szénhidrátok például a maltodextrin, a laktóz, a maltóz, a glükóz, a fruktóz, a szacharóz, valamint egyéb mono- és diszacharidok vagy mindezek keverékei. A készítmény tartalmazhat továbbá egyéb inaktív összetevõket és vivõanyagokat, így pl. glükózt, laktózt, szacharózt, mannitolt, keményítõt, cellulózt vagy cellulózszármazékokat, magnézium-sztearátot, sztearinsavat, nátrium-szacharint, talkumot, magnézium-karbonátot stb. A készítmények tartalmazhatnak továbbá vizet, elektrolitokat, esszenciális és nem esszenciális aminosavakat, nyomelemeket, ásványi anyagokat, rostokat, édesítõszereket, ízesítõszereket, színezõanyagokat, emulgeálószereket és stabilizálószereket (pl. szójalecitint, citromsavat, mono- vagy diglicerid-észtereket), tartósítószereket, kötõanyagokat, illatanyagokat stb. A találmány szerinti készítményekben, különösen a csecsemõtápszerekben vagy táplálékkiegészítõkben alkalmazható lipidek a tejzsírok, a növényi lipidek, amilyen pl. a kanolaolaj, a pórsáfrányolaj, a napraforgóolaj, az olívaolaj, továbbá a tengeri állatok olaja stb., vagy mindezek megfelelõ (többszörösen telítetlen és/vagy telített) zsírsavakat tartalmazó frakciói vagy keverékei. 7
1 HU 007 87 T2 2 A találmány szerinti készítményekben, különösen a csecsemõtápszerekben vagy táplálékkiegészítõkben alkalmazható proteinek pl. a kazein, a savó, a sûrített sovány tej, a szója, a marhahús, a kollagén, a kukorica vagy egyéb növényi proteinek vagy hidrolizált proteinek, a szabad aminosavak stb. A csecsemõtápszerekben vagy táplálékkiegészítõkben alkalmazott proteinek az allergizálódás veszélyének csökkentése érdekében elõnyösen erõteljesen és/vagy részben hidrolizáltak. A találmány szerinti a csecsemõtápszerek vagy táplálékkiegészítõk táplálkozási szempontból lényeges mennyiségben, pl. minimálisan ajánlott napi adagban tartalmazzák a napi vagy heti táplálkozáshoz szükséges összes vitamint és ásványi anyagot. A találmány egy megvalósítási módjában az élelmiszer-készítmény vagy táplálékkiegészítõ készítmény élelmiszeralapon (élelmiszerbõl vagy élelmiszert tartalmazva) is készülhet. Tartalmazhat pl. tejterméket, pl. fermentált tejterméket, ideértve többek között, de nem kizárólag tejet, joghurtot, joghurtalapú italt vagy buttermilket. Ilyen készítmények elõállíthatók például magától értetõdõ módszerrel, pl. megfelelõ élelmiszer vagy élelmiszeralap polifruktóz és GOS vagy TOS hatékony mennyiségével történõ kiegészítésével. Egyéb megfelelõ élelmiszeralapok lehetnek pl. a növényi és a húseredetû élelmiszeralapok. A találmány szerinti élelmiszer- vagy táplálékkiegészítõ készítmények kezelésként és/vagy megelõzõ céllal egyaránt alkalmazhatók. Ez úgy értendõ, hogy beadásuk történhet azután, hogy egy páciensben gyomor-bél rendszeri problémákat vagy betegségeket diagnosztizáltak, vagy alternatív módon a tünetek jelentkezését megelõzõen (pl. nagy veszélynek kitett, gyomor-bél rendszeri panaszokban nagy valószínûséggel megbetegedõ páciensekben). Például ha a vastagbél megbetegedésével vagy optimálisnál rosszabb mûködésével kapcsolatos tünetek, pl. székrekedés, flatulencia, allergiás megbetegedések, kólika, hasi fájdalom, hasgörcsök, IBD, IBS jelentkeztek, a készítmény beadása elõsegíti az egészséges vastagbélbeli környezet újra kialakulását, vagy a további tünetek megelõzését. A találmány egy megvalósítási módjában a készítmények beadására profilaktikus céllal, egészséges mikroflóra és/vagy egészséges vastagbélbeli környezet kialakulásának elõsegítése céljából kerül sor. Az egészséges vastagbélbeli környezet a bél normál, élettani mûködésére és aktivitására, elsõsorban a tápanyagok és a víz normál abszorpciójára, a nyálkahártya-kórokozók megtapadásával, kolonizációjával és fertõzéssel szembeni ellenállására stb. utal, amirõl székletvizsgálattal és a gázképzõdés vizsgálatával lehet megbizonyosodni. A fenti meghatározás elsõsorban optimális élettani mûködésre és aktivitásra utal. A vastagbél bármely, optimálistól elmaradó mûködése a fentiekben leírt tünetek kialakulásához vezet, amirõl székletvizsgálattal és/vagy a gázképzõdés vizsgálatával lehet megbizonyosodni. A találmány hatóköre kiterjed az optimálistól elmaradó mûködésbõl 2 3 4 0 eredõ bélmegbetegedésekre vagy ¹rendellenességekre. Az optimálistól elmaradó bélmûködésbõl eredõ bélrendellenességek vagy tünetek, így az IBD, a vastagbélgyulladás, az IBS és/vagy a megnõtt bél-gát integritás kezelésére vagy profilaxisára szolgáló gyógyászati készítmények tartalmazhatnak további biológiailag aktív összetevõket, így drogokat, biológiailag aktív proteineket vagy peptideket, probiotikumokat stb. Az élelmiszer- vagy táplálékkiegészítõ készítményekkel kapcsolatos megvalósítási módok a gyógyászati készítményeket is magukban foglalják. A találmány szerinti készítmények dózisalakja tetszõleges, így a beadás módjától függõen az lehet pl. folyékony, szilárd, félig szilárd, tabletta, ital, por stb. A páciensnek történõ beadás módja elõnyösen orális, bár egyes alkalmazásokban a rectalis vagy szondán keresztül történõ táplálás (a szondának közvetlenül a gyomorba, duodenumba, a vékonybélbe vagy vastagbélbe juttatásával) is megfelelõ lehet. A találmány további megvalósítási módját képezi egy találmány szerinti készítmény elõállítására szolgáló eljárás, amelyben szinergizmus szempontjából hatékony mennyiségû GOS-nak (vagy TOS-nak) és polifruktóznak a fentiekben leírtak szerint megfelelõ készítményalaphoz adására kerül sor. Az alábbi, nem korlátozó hatókörû példák a GOS és polifruktóz szinergista hatását szemléltetik. Egyéb értelmû közlés hiányában a találmány megvalósítása standard hagyományos molekuláris biológiai, gyógyszerészeti, immunológiai, virológiai, mikrobiológiai és biokémiai eljárásokkal történik. Ezeknek az eljárásoknak a leírása megtalálható a következõ forrásokban: Sambrook és Russel (01) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Ausubel és mtsai. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA, 1. és 2. kötet; Remington s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17. kiadás (198); Microbiology: A Laboratory Manual (6. kiadás), James Cappuccino: Laboratory Methods in Food Microbiology (3. kiadás), W. Harrigan (szerzõ) Academic Press. Az ábrák rövid ismertetése 1. ábra Acetát, propionát és butirát képzõdése TOS, inulin, TOS/inulin 9/1 keverékének, valamint oligofruktóz és inulin 1/1 keverékének csecsemõktõl nyert friss széklet általi 48 órás in vitro fermentációja után. 2. ábra A képzõdött acetát, propionát és butirát relatív mennyiségei TOS, inulin, TOS/inulin 9/1 keverékének, valamint oligofruktóz és inulin 1/1 keverékének csecsemõktõl nyert friss széklet általi 48 órás in vitro fermentációja után. A képzõdött acetát plusz propionát plusz butirát összmennyiségét a vizsgált rostok mindegyike esetében 0%-nak vettük. 8
1 HU 007 87 T2 2 3. ábra Gázképzõdés TOS, inulin, TOS/inulin 9/1 keverékének, valamint oligofruktóz és inulin 1/1 keverékének csecsemõktõl nyert friss széklet általi 48 órás in vitro fermentációja után. A képzõdött gáz mennyiségét (ml) az összes képzõdött SCFA mennyiségéhez (mmol/g rost) viszonyítottuk. 4. ábra SCFA keverék (moláris bázison 90// arányú acetát/propionát/butirát) és L¹laktát hatásai. 4A. ábra: 0, 0,1, 0,, 1 és 4 mm SCFA keverék vagy L¹laktát muc¹2 expresszióra gyakorolt hatása CCD18/T84 vegyes tenyészetben (n=6). A hibasávok a SEM¹et jelzik. Az 1 és 4 mm SCFA keverék és a 0,, 1 és 4 mm L¹laktát esetében tapasztalt emelkedés statisztikailag lényeges mértékû. 4B. ábra: 0, 0, 0, 20 és 00 M SCFA keverék vagy L¹laktát spontán PGE1- és PGE2-válaszra gyakorolt hatása CCD18 sejtekben (n=7). A hibasávok a SEM¹et jelzik. A 0, 20 és 00 M SCFA keverék és a 0 M L¹laktát esetében tapasztalt PGE1-növekedés statisztikailag lényeges mértékû. A 0, 20 és 00 M SCFA keverék és a 20 M L¹laktát esetében tapasztalt PGE2-növekedés statisztikailag lényeges mértékû (p<0,0).. ábra Nátrium-acetát és nátrium-l-laktát hatása a vastagbél disztális és proximális részén tapasztalható spontán összehúzódásokra. Az (1 g húzóerõre állított) negatív kontroll 0%. A mm KCl hozzáadása után tapasztalt húzóerõt 0%-nak vettük. Példák 1. példa In vitro fermentációs vizsgálatok szinergista hatást mutattak ki a fermentációs mintázatokban 1.1 Anyag és Módszer Mikroorganizmusok A mikroorganizmusokat tápszerrel nevelt csecsemõk friss székletébõl nyertük. Az 1 4 hónapos korú csecsemõktõl származó friss székletmintákat összevontunk, majd 2 órán belül tartósítóközegbe helyeztük. Készítmények/szubsztrát Szubsztrátként 9/1 (w/w) arányú prebiotikum [TOS; TOS (VivinalGOS, Borculo Domo Ingredients, Hollandia)] és inulin (raftilinhp, Orafti, Belgium) keveréket; inulint; 1/1 arányú oligofruktóz és inulin keveréket alkalmaztunk, negatív kontrollként nem használtunk szubsztrátot. Tápközegek McBain & MacFarlane tápközeg: pufferelt peptonvíz 3,0 g/l, élesztõkivonat 2, g/l, mucin (kefeszegély) 0,8 g/l, tripton 3,0 g/l, L¹cisztein-HCl 0,4 g/l, epesavas sók 0,0 g/l, K 2 HPO 4.3H 2 O 2,6 g/l, NaHCO 3 0,2 g/l, NaCl 4, g/l, MgSO 4.7H 2 O 0, g/l, CaCl 2 0,228 g/l, Fe- 2 3 4 0 SO 4.7H 2 O 0,00 g/l. A tápközeggel 00 ml¹es Scottüvegeket töltöttünk meg, majd azokat 121 C¹on percig sterilizáltuk. Pufferelt tápközeg: K 2 HPO 4.3H 2 O 2,6 g/l, NaHCO 3 0,2 g/l, NaCl 4, g/l, MgSO 4.7H 2 O 0, g/l, CaCl 2 0,228 g/l, FeSO 4.7H 2 O 0,00 g/l. A ph¹t K 2 HPO 4 vagy NaHCO 3 segítségével ph=6,3±0,1 értékre állítottuk be. A tápközeggel 00 ml¹es Scott-üvegeket töltöttünk meg, majd azokat 121 C¹on percig sterilizáltuk. Tartósító tápközeg: pufferelt pepton,0 g/l, L¹cisztein-HCl 0, g/l, nátrium-tioglikolát 0, g/l, 1 rezazurintabletta per liter. A ph¹t 1 M NaOH vagy HCl segítségével ph=6,7±0,1 értékre állítottuk be. A tápközeget mikrohullámú sütõben felforraltuk. A tápközeg 2 ml¹ével ml¹es szérumüvegeket töltöttünk meg, majd azokat 121 C¹on percig sterilizáltuk. A friss székletmintákat a tartósító tápközeggel elkevertük. A friss széklet ebben a formában 4 C¹on több óráig eltartható. Székletszuszpenzió: a tartósított székletoldatot 13 000 rpm mellett percig centrifugáltuk. Eltávolítottuk a felülúszót, majd a székletet a McBain & MacFarlane tápközeggel 1: tömegarányban elkevertük. Fermentáció Egy üvegben a székletszuszpenzió 3,0 ml¹ét 8 mg glükózzal vagy prebiotikummal vagy negatív kontrolloldattal kombináltuk, majd gondosan összekevertük. A t=0 idõpontban mintát vettünk. A kapott szuszpenzió 2, ml¹ét dialíziscsõben ml pufferelt tápközeggel töltött ml¹es üvegbe juttattuk. Az üveget gondosan lezártuk, majd 37 C¹on inkubáltuk. A mintákat 3, 24 és 48 óra elteltével injekciós fecskendõvel a dialíziscsõbõl (0,2 ml) vagy a dialízispufferbõl (1,0 ml) vettük, majd a fermentáció leállítása érdekében azonnal jégre helyeztük. A rövid láncú zsírsavak és a laktát mennyiségi meghatározása Lásd a 2. példát. Az értékeket a negatív kontrollra korrigáltuk. A gázmennyiség megállapítása A t=3, t=24 és t=48 idõpontokban a ml¹es üveg felsõ részében tapasztalható gáznyomást gáznyomásmérõ berendezés (Druckmessumformer, Ecotronic, Németország) segítségével állapítottuk meg úgy, hogy 6 ml¹es injekciós fecskendõt szúrtunk keresztül az üveg gumikupakján, majd azzal eltávolítottuk a gázt az üveg felsõ részébõl, amíg a gáznyomás 0 bar értékre nem csökkent. A fecskendõbeli térfogat a termelt gáz mennyiségével egyezett meg. Az értékeket a negatív kontrollra korrigáltuk. 1.2. Eredmények Az in vitro fermentációt a következõ minták alkalmazásával végeztük: 1. 8 mg TOS (VivinalGOS, Borculo Domo Ingredients, Hollandia). 2. 8 mg inulin (RaftilinHP, Orafti, Belgium). 9
1 HU 007 87 T2 2 3. 8 mg TOS/inulin, 9/1 (w/w) TOS/inulin aránynál. 4. 8 mg OF (raftilosep9, Orafti, Belgium)/inulin (RaftilinHP), 1/1 (w/w) OF/inulin aránynál. Termelt összes SCFA-mennyiség Az eredményeket az 1. ábrán mutatjuk be. Az 1. ábráról leolvasható, hogy a TOS/inulin keverék gramm rostonként lényegesen nagyobb mennyiségû SCFA-termelést eredményezett, mint különálló összetevõi, és magasabbat, mint az oligofruktóz (OF) és inulin keveréke. Így vizsgáltuk továbbá a TOS/inulin 1/1 arányú keverékét is (nem közölt adatok) amely szintén szinergista hatásúnak bizonyult. L- és D¹laktát-termelés Az L¹ és D¹laktát jelenlétét csak a t=3 idõpontban lehetett kimutatni. Az 1. táblázat az ebben az idõpontban kialakult metabolikus végtermékeket mutatja be. 1. táblázat 3 órás in vitro fermentációt követõen képzõdött metabolikus végtermékek (mmol/g rost) Acetát Butirát Propionát L-laktát D-laktát TOS 0,23 0 0 0,14 0,03 Inulin 0 0 0 0,00 0,00 TOS/inulin 0, 0 0 0,17 0,04 OF/inulin 0, 0 0 0,04 0,02 A TOS/inulin keveréknél szinergizmusra utaló módon ismételten nagyobb mennyiségû laktát képzõdését figyeltük meg, mint komponensei, a TOS és az inulin esetében. Az OF és inulin keverékével összehasonlítva a laktát (összes savmennyiségen alapuló) százalékos aránya és az L¹/D¹laktát arány magasabbnak mutatkozott a TOS/inulin keverék esetében. SCFA¹k relatív mennyiségei A 2. ábrán a fermentációs termékek összetétele látható 48 óra elteltével. A TOS/inulin keveréknél az acetát lényegesen nagyobb százalékos arányban figyelhetõ meg, mint a keverék összetevõinél, valamint az oligofruktóz (OF) és inulin keverékénél. Az anyatejjel táplált csecsemõk székletében az acetát magas százalékos arányban mutatható ki, ezért a TOS/inulin keverék esetében kialakuló fermentációstermékösszetétel hasonlít leginkább az anyatejjel táplált csecsemõkéhez. Gázképzõdés Az eredményeket a 3. ábrán mutatjuk be. A gázképzõdés tekintetében a TOS és a TOS/inulin keverék eredményezte az egy mmol képzõdött SCFA¹ra esõ legkisebb gázmennyiséget. Az inulin és az OF/inulin keverék sokkal nagyobb mértékû gázképzõdést eredményezett. Az egy mmol képzõdött SCFA¹ra esõ gázmennyiség a TOS/inulin keverék esetében volt a legalacsonyabb. 2 3 4 0 Az SCFA-képzõdés kinetikája A 2. táblázat az SCFA-képzõdés kinetikáját mutatja be. A TOS/inulin kombináció hatására 24 és 48 óra között nagy mennyiségû SCFA keletkezett, ami arra utal, hogy még a vastagbél disztális részében is képzõdött SCFA, ami jótékony hatással van a vastagbél-nyálkahártya áteresztõképességére, a nyálkaképzésre, a kórokozó-ellenes hatásokra stb. Az elsõ 3 órában képzõdött a legnagyobb mennyiségû SCFA, mint az emberi tejben található oligoszacharidok esetében (nem közölt adat). A vastagbél kezdeti szakaszán bekövetkezõ gyors fermentáció jelentõsége kórokozó-ellenes hatásából következik. 2. táblázat Az SCFA-képzõdés (mmol) kinetikája (negatív kontrollra korrigált adatok) Prebiotikum Idõintervallum (óra) 0 3 óra 3 24 óra 24 48 óra TOS 0,23 3,8 0,13 TOS/inulin HP 0, 4,49 0,24 Inulin HP 0,00 3,0 0,0 OF/inulin HP 0,11 4,26 0,00 OF=oligofruktóz 2. példa TOS/inulin klinikai hatásvizsgálata: az acetát mennyiségének relatív növekedése és a butirát mennyiségének relatív csökkenése nem korrelál a bifidobacteriumok számának növekedésével. A TOS és az inulin szinergista hatásúak 2.1. Anyag és módszer Terhességük utolsó trimeszterében lévõ 63 szoptatást választó és 7 tápszeres etetést választó terhes anyát soroltunk be a vizsgálatban való részvételre. Normál testtömeggel, fejlõdési rendellenesség, veleszületett betegség vagy gyomor-bél betegség nélkül született csecsemõket vettünk fel születésük után három napon belül. A vizsgálatot az illetékes etikai bizottság jóváhagyásával végeztük (Medical Center, St. Radboud, Nijmegen, Hollandia). Besorolásukat megelõzõen a szülõk megfelelõ tájékoztatás után írásos beleegyezésüket adták a vizsgálatban történõ részvételhez. A tápszeres etetést választó anyák csecsemõit véletlenszerûen, kettõs vak elrendezésben, két tápszeres csoport valamelyikébe soroltuk be (OSF, SF). A standard tápszeres csoport (SF; n=19) hagyományos, kiegészítés nélküli csecsemõtápszert kapott (Nutrilon I, Nutricia, Hollandia). A standard tápszer fõbb összetevõi 131 g/l¹es standard hígítása esetén a 3. táblázat tartalmazza. A prebiotikus tápszeres csoport (OSF; n=19) ugyanezen standard csecsemõtápszert kapta, kiegészítve 6 g/l transz-galakto-oligoszacharid (TOS; Vivinal GOS, Borculo Domo Ingredients, Zwolle, Hollandia) és inulin (PF; RaftilineHP, Orafti active food ing-
1 HU 007 87 T2 2 redient, Tienen, Belgium) keverékével. A keverék 90% TOS¹t és % inulint tartalmazott. A kísérleti tápszereket ad libitum etették a vizsgálati periódus alatt. A szoptatást választó anyákat a vizsgálat idõtartama alatt szükség esetén szoptatási tanácsadó segítségének igénybevételével támogatták abban, hogy folytassák a szoptatást. A szoptatás befejezését követõen csecsemõik a két tápszer egyikét kapták. Az anyák együttmûködését a látogatások során az el nem használt tápszeres dobozok száma, valamint a felhasznált tápszer és a lejegyzett táplálékfelvétel alapján ellenõrizték. 3. táblázat A standard tápszer összetétele literenként Energia kcal 670 Protein g 14 Kazein/savó arány / Zsír g 3 Összes szénhidrát g 7 Laktóz g 7 Ásványi anyagok Kalcium mg Foszfor mg 270 Magnézium mg 0 Nátrium mg 190 Kálium mg 680 Klorid mg 4 Vas mg Cink mg Kérdõívek A szülés elõtt demográfiai, klinikai és antropometriai adatokat gyûjtöttek az anyákról. A szüléssel kapcsolatos információt öt nappal a szülést követõen az anyáktól szerezték be. A csecsemõ táplálékfelvételét, tápszer-toleranciáját, székletének jellemzõit, egészségügyi és antropometriai adatait a születés utáni.,., 28. napon és a kísérlet végéig négyhetente egyszer, kérdõíves felméréssel gyûjtötték be. Székletminták A szülõket megkérték, hogy gyûjtsenek székletmintát csecsemõjüktõl a születést követõ.,., 28. napon, illetve késõbb négyhetente egy alkalommal. A mintákat a szülõk a pelenkából, a székletürítés után a lehetõ legrövidebb idõn belül székletgyûjtõ edényekbe (Greiner Labortechnik, Hollandia) vették és azonnal C¹ra hûtötték, majd azokat késõbb a kísérletben részt vevõ munkatársak hordozható fagyasztóládában a laboratóriumba juttatták. Székletminták elkészítése Az SCFA-meghatározás érdekében a minták 1 grammját MilliQ-val tízszeresére hígított jeges vízben 2 3 4 0 kiolvasztottuk és stomacher (IUL Instruments, Barcelona, Spanyolország) alkalmazásával perc alatt homogenizáltuk. A homogenizált székletmintából l¹t 0 l %¹os (v/v) hangyasavval, 0 l 1,2 g/l¹es 2¹etil-vajsavval (Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, Hollandia) és l MilliQ-val kevertünk össze. A nagyméretû részecskék eltávolítása érdekében a mintákat percig 14 000 rpm-nél centrifugáltuk, majd a felülúszót C¹on tároltuk. A FISH-elemzés és a tejsav mennyiségi meghatározása érdekében a mintákat jeges vízben kiolvasztottuk, foszfátpufferelt sóoldatban (PBS-ben; ph=7,4) tízszeresére hígítottuk, majd stomacher alkalmazásával percen át homogenizáltuk. A homogenizált székletmintákat C¹on tároltuk. Fluoreszcens in situ hibridizáció A FISH-elemzést a szakirodalomban leírtak szerint, kis módosításokkal végeztük (Lagendijk és mtsai., 199, Appl. Environ. Microbiol. 61:69 7). A paraformaldehidben fixált mintákat zselatinnal bevont üveglemezekre vittük [PTFE-bevonatú 8 üregû (1 cm 2 /üreg) tárgylemezek, CBN labsuppliers, Drachten, Hollandia], majd levegõn megszárítottuk. A megszárított mintákat percig 96%¹os etanolban dehidráltuk. A Bif164 mod jelû, ng/1 Cy3-mal jelölt Bifidobacterium-specifikus próbát ( -CAT CCG GYA TTA CCA CCC) tartalmazó hibridizációs puffert [ mm Tris-HCl, 0,9 M NaCl, 0,1% SDS (ph=7,1)] elõmelegítettük, majd a megszárított mintákra vittük. A Bif 164 mod az S¹G-Bif-a-0164-a- A 18 jelû próba módosított változata (Lagendijk és mtsai., 199, Appl. Environ. Microbiol. 61:69 7). A lemezeket egy éjszakán át sötétített nedveskamrában 0 C¹on inkubáltuk. A hibridizációt követõen a lemezeket percig 0 ml elõmelegített mosópufferrel [ mm Tris-HCl, 0,9 M NaCl (ph=7,2)] mostuk, majd rövid ideig MilliQ-val öblítettük. Az összes baktérium megfestése érdekében a mintákat PBS-ben lévõ 0,2 ng/l 4,6-diamidino-2-fenil-indollal (DAPI) szobahõmérsékleten percig mostuk. A DAPI-festés után a lemezeket rövid ideig MilliQ-val öblítettük, megszárítottuk, Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) segítségével tárgylemezre vittük majd fedõlemezzel fedtük. A lemezeket Olympus AX70 epifluoreszcens mikroszkóppal, automatizált képelemzõ szoftver (Analysis 3.2, Soft Imaging Systems GmbH, Münster, Németország) alkalmazásával automatikusan bíráltuk. A mintánként jelen lévõ bifidobacteriumok számát 2 véletlenszerûen kiválasztott látótér elemzésével állapítottuk meg. Mindegyik látótérben a bifidobacteriumok százalékos arányát az összes sejt DAPI szûrõkészlet (SP0, Chroma Technology Corp., Brattleboro, USA) segítségével, illetve az összes Bifidobacterium Cy3 szûrõkészlet (7, Chroma Technology, Brattleboro, USA) alkalmazásával történt megszámlálásával állapítottuk meg. Rövid láncú zsírsavak elemzése A rövid láncú zsírsavak (SCFA): ecetsav, propionsav, n¹vajsav, izovajsav és n¹valeriánsav mennyiségi meghatározását lángionizációs detektorral felszerelt 11
1 HU 007 87 T2 2 Varian 3800 gázkromatográffal (GC) (Varian Inc., Walnut Creek, USA) végeztük el. A minta 0, l¹ét hélium vivõgáz (3,0 psi) segítségével 80 C¹on az oszlopra injektáltuk (Stabilwax, 0,3 mm, filmvastagság 1,00 m, Restek Co., USA). A minta befecskendezését követõen a kemencét 16 C/perc sebességgel 1 C¹ra melegítettük, majd C/perc sebességgel 2 C¹ra melegítettük, végül 1, percig a hõmérsékletet 2 C¹on tartottuk. Az injektor és a detektor hõmérséklete egyaránt 0 C volt. Belsõ standardként 2¹etilvajsavat alkalmaztunk. Laktátanalízis Homogenizál székletmintákat jégen felolvasztottunk és percig 14 000 rpm mellett centrifugáltunk. A felülúszó 0 l¹ét az összes enzim inaktiválása érdekében percig 0 C¹ra melegítettük. A laktátmennyiséget enzimatikus úton, D¹ és L¹tejsav dehidrogenázt tartalmazó L¹tejsav detekciós reagenskészlet (Boehringer Mannheim, Mannheim, Németország) alkalmazásával állapítottuk meg. A laktátmennyiséget csak a megfelelõen nagyméretû székletmintákból határoztuk meg. ph-elemzés A C¹on történt tárolás után a székletmintákat felolvasztottuk, majd a széklet ph¹ját közvetlen módon, szobahõmérsékleten, Inlab 423 ph¹elektródával (Mettler-Toledo, Columbo, USA) felszerelt Handylab ph¹mérõ (Scott Glas, Mainz, Németország) segítségével állapítottuk meg. 2 3 Adatelemzés A vizsgálatot megelõzõ statisztikai ( power ) számítások arra vezettek, hogy a vizsgált és a standard tápszert kapott csoportok között a bifidobacteriumok számában tapasztalható % különbség (2% SD mellett) kimutatásához csoportonként 13 csecsemõre van szükség. A tápszeres csoportokban várt %¹os kiesés miatt a vizsgálatot a számítottnál több csecsemõn végeztük el. Az eredmények statisztikai elemzésére az SPSS (11.0 verzió) statisztikai programcsomagot alkalmaztuk. Az összes adat normalitását a normál valószínûségi grafikonok megtekintésével ellenõriztük. A bifidobacteriumok, a ph, az SCFA¹k és a laktát relatív mennyisége közti százalékos különbségek szignifikanciáját varianciaanalízissel vizsgáltuk. Szignifikáns különbség (p<0,0) esetén a csoportokat Bonferroni post hoc teszt segítségével hasonlítottuk össze. Mivel a szoptatás és a tápszeres etetés esetében kettõs vak módszerû csoportba osztás nem lehetséges, és a megfelelõ randomizálás sem biztosítható, az anyatejjel és a tápszerrel táplált csoportok statisztikai összehasonlítását nem végeztük el. Az anyatejes csoport adatait csak abban az esetben közöltük, ha az adott idõpillanatban a csecsemõ kizárólag anyatejet fogyasztott. 2.2 Eredmények Összesen 1 csecsemõt válogattunk be a vizsgálatba. 7 csecsemõt születését követõen tápszerrel kezdtek etetni, õket egyenlõen osztottuk el a csoportok között. A születésük után kezdetben anyatejjel táplált 63 csecsemõ közül 24 esetében tápszeres etetésre tértek át 16 hetes életkor elõtt, pedig kiesett a kísérletbõl. A kísérleti alanyok jellemzõit a 4. táblázat tartalmazza. A tápszeres csoportból 9 csecsemõ esett ki életük elsõ 16 hetén belül (4 az SF, az OSF csoportból). A kiesés okai a következõk voltak: kólika, tehéntej-allergia gyanúja, székrekedés és technikai problémák. 4. táblázat A kísérleti alanyok jellemzõi Standard tápszer (SF) N=19 Prebiotikus tápszer (OSF) N=19 Anyatej, (BF) N=63 Nem fiú 12 33 lány 14 7 Születés helye otthon 7 8 kórházban 12 11 23 Születés módja hüvelyi szülés 14 16 9 császármetszés 3 4 Születési testtömeg 30±01 3318±2 361±1 Székletbeli bifidobacteriumok A bifidobacteriumok székletbeli százalékos arányát az egyes táplálási csoportokban napos, napos, 4, 8, 12 és 16 hetes életkorban az. táblázat tartalmazza, mennyiségüket a 6. táblázatban ismertetjük. Az OSF csoportban az SF csoporthoz képest mindegyik életkornál az összes baktérium nagyobb százalékos arányában találtunk bifidobacteriumokat, de ezek a különbségek nem bizonyultak statisztikailag lényeges mértékûnek. Nem várt módon, a bifidobacteriumok száma az anyatejjel táplált csecsemõkben is viszonylag alacsony volt, hasonló volt a tápszerrel nevelt csoportokban kapott értékekhez. Az elõzetes adatok a lactobacillusok számának emelkedését mutatták a BF és OSF csoportokban, de a lactobacillusok a székletflórából legalább egy nagyságrenddel kisebb részt képvi- 12
1 HU 007 87 T2 2 selnek, mint a bifidobacteriumok, így a teljes mintázatra gyakorolt hatásuk csekély. ph-eredmények A tápszerrel etetett csecsemõk székletmintáinak ph¹értékeit a 6. táblázat tartalmazza. A legalacsonyabb ph¹értéket az anyatejjel táplált csecsemõk esetében tapasztaltuk. Az OSF tápszerrel etetett csecsemõk székletének ph¹értéke alacsonyabb volt, mint az SF csoportban (p<0,04 mindegyik korcsoportban, kivéve az. napon). SCFA eredmények A székletbeli összes SCFA mennyiségét az. táblázat tartalmazza. Az összes SCFA¹n belül az egyes SCFA¹k százalékos arányát a 6. táblázatban foglaltuk össze. Az egyes tápszeres csoportok között az összes SCFA-koncentráció tekintetében nem lehetett statisztikailag lényeges mértékû különbözõséget megállapítani. Az SCFA mennyisége is összehasonlítható volt az egyes táplálási csoportok között. Ugyanakkor már nap elteltével eltéréseket tapasztaltunk az SCFAprofil tekintetében az anyatejjel vagy OSF tápszerrel és a standard tápszerrel etetett csecsemõk csoportjai között. A GOS- és polifruktóztartalmú tápszerrel vagy anyatejjel etetett csecsemõknél magasabb acetát arányt és alacsonyabb propionát, butirát, és ic4 6 SCFA arányt lehetett megállapítani, mint a standard tápszerrel etetett csecsemõk esetében. Laktáteredmények Az összes csoportra vonatkozó laktátkoncentrációt (mmol/kg széklet) az. táblázat tartalmazza. Már napos kortól kezdõdõen az OS tápszerrel (nem lényeges mértékben) és az anyatejjel táplált csoportok esetében a standard tápszerrel etetett csoporthoz képest nagyobb laktátmennyiséget állapítottunk meg. A laktát relatív mennyisége (az összes SCFA és laktát összegének százalékában kifejezve) az anyatejjel táplált csoport esetében volt a legmagasabb és a standard tápszerrel táplált csoport esetében volt a legalacsonyabb. A TOS/inulin tartalmú tápszerrel etetett csecsemõk csoportjában közepes relatív mennyiségû acetátot lehetett kimutatni. Az OSF tápszerrel etetett csecsemõk esetében 16 hetes életkorban a laktát (összes savhoz viszonyított) százalékos aránya lényeges mértékben különbözött az SF csoportba tartozó csecsemõkétõl.. táblázat A laktát, az összes SCFA (mmol/kg széklet), a bifidobacteriumok számának (*1, 13 /kg széklet), és a ph alakulása születéstõl 16 hetes életkorig. Átlag±SEM értékek. A ph¹t kivéve nem lehetett statisztikailag lényeges mértékû különbségeket megállapítani Laktát SCFA ph Bifidobacteriumok nap SF 13,±7,7 4,7±12,6,93±0, 0,8±0,49 OSF,7±4,3 6,±7,7,49±0, 1,±2,24 BF 13,3±2,8 48,7±4,4,27±0,07 0,47±0,39 nap SF 4,6±3,0 62,0±7,9 6,88±0, 0,96±0,83 OSF 9,7±3,6 62,3±+7,2,9±0, 1,±0,99 BF,1±3,2 4,7±4,9,3±0,07 0,48±0,61 4 hét SF 2,6±1,4 68,3±,3 6,77±0,21 0,97±0,96 OSF 9,9±3,4 83,1±8,8,88±0,18* 1,±0, BF 22,8±4,4 9,8±4,8,4±0,12 0,6±0,64 8 hét SF 7,6±6,8 76,±13,2 6,80±0, 0,89±0,6 OSF 24,4±,3 76,0±8,4,68±0,18* 1,00±0,2 BF,9±,3 62,8±,4,27±0, 0,8±0,9 12 hét SF 14,1±9,4 73,9±11,9 6,88±0, 0,91±0,80 OSF 18,4±7,0 76,1±12,1,±0,18* 1,±0,99 BF 42,1±7,1,4±4,9,29±0,17 1,±1,38 16 hét SF 1,7±1,2 68,6±14,0 7,09±0, 1,00±0,80 OSF 18,±,7 67,7±11,7,±0,* 1,±0,76 BF 4,1±9,0 9,2±6,9,68±0,24 0,89±0,78 13
1 HU 007 87 T2 2 6. táblázat Az SCFA¹k relatív mennyisége (az összes SCFA %¹ában), a laktát relatív mennyisége (az összes sav %¹ában), a bifidobacteriumok százalékos aránya születés és 16 hetes életkor között Nap/hét Acetát Propionát Butirát Szum ic4 C % Bifidobacterium Laktát nap SF 84,3±3,4 12,9±3,2 1,7±0, 1,1±0,4 4±3,6 13,8±18, OSF 8,8±,1 12,0±4,7 0,±0, 1,7±0,7 0±8,6 8,7±13,3 BF 89,±1,8 7,0±1, 1,6±0,4 2,0±0,4 4±4,1 12,±14,0 nap SF 70,9±2,0 21,3±2,6 4,6±1,1 3,2±0, 6±6,0 4,3±,8 OSF 84±2,4* 13,±2,3 1,4±0,4* 1,1±0,4 61±6,3 8,2±9,8 BF 89,3±1,9,8±1,3 2,3±0,3 2,6±0,4 42±4,1 13,4±13,8 4 hét SF 71,8±2,8 17,8±3,3,0±1,1,±2,6 2±,4 6,9±16,4 OSF 77,7±2,2,4±2,0,8±2,2 1,1±0,3 71±4, 8,4±,7 BF 91,0±1,8 4,3±1,2 2,6±0,6 2,1±0,4 47±,4 19,6±17,0 8 hét SF 74,6±2,9 16,4±2,0 6,1±1,2 2,9±0,7 0±6,3 3,±9,9 OSF 83,±2,7 11,4±2,1 3,7±1,2 1,4±0,4 64±4,1 17,7±,2 BF 91,2±1,6,4±1,4 1,9±0, 1,6±0,3 41±4, 21,7±13,4 12 hét SF 73,9±2,9 17,8±3,3,0±1,1 3,2±0, 6±,4,4±11,9 OSF 86,±2,1 11,2±1,8 1,2±0,3* 1,0±0,4 ±,0 13,6±13,2 BF 86,1±3,3 7,±2,2 3,0±0,7 3,±0,8 9±4,,2±16,3 16 hét SF 69,9±3,9 19,6±2,7,6±0,9 4,9±0,8 2±6,3 0,6±0,9 OSF 82,2±,3 14,3±4,9 2,1±0,* 1,±0,4* 69±7,7 16,4±12,0* BF 89,7±2,7 6,4±2,1 1,6±0,4 2,2±0, 47±6,3 3,6±,4 Az SF¹fel összehasonlítva p<0,0; SF=standard tápszer, OSF GOS+inulin kiegészített SF; BF=anyatejjel táplált A fentiek alapján az ezzel a GOS és polifruktóz kombinációval táplált csecsemõk székletében csökkent a ph, több laktát termelõdött, savas (acetát és laktát) mintázat alakult ki, amely jobban hasonlít az anyatejjel táplált csecsemõknél tapasztalhatókhoz és ez a hatás nem köthetõ a bifidobacteriumok számának növekedéséhez. 3. példa A laktát és SCFA keverék jótékony hatása a Muc¹2¹, PGE1- és PGE2-expresszióra. 3.1. Anyag és módszer A laktát és SCFA-keverék hatását a Willemsen, LEM, Koetsier MA, van Deventer SJH, van Tol EAF (03), Gut 2:1442 1447 által leírtak szerint, a következõ módosításokkal végeztük: laktát és acetát/propionát/butirát 90// arányú keverékét vizsgáltuk. A nyálkatermelésre vonatkozó kísérletekben CCD18 és T84 sejtek együttes tenyészetét alkalmaztuk, míg a PGE1- és PGE2-termelésre vonatkozó kísérletekben CCD18 sejtek önálló tenyészetét használtuk fel. 3 4 0 3.2. Eredmények Az acetát/propionát/butirát 90// arányú keverékébõl álló SCFA és az L¹laktát dózisfüggõ módon indukálja az MUC-2-expressziót CCD18 és T84 sejtek együttes tenyészetében, amint az a 4A. ábrán látható. Hasonló módon, amint az a 4B. ábrán látható, hatásukra a PGE1- és PGE2-koncentráció emelkedik a CCD18 sejtekben. 4. példa: Laktát hatása a vastagbél összehúzódására 4.1 Anyag és módszer Hím Wistar-patkányokat (CKP/Harlan, Wageningen/Horst, Hollandia) szabályozott hõmérsékleti viszonyok és megvilágítási ciklus mellett tartottunk, pelletált takarmányt és vizet ad libitum biztosítottunk számukra. Az állatokat N 2 O, O 2 és izoflurán gázkeverékkel elaltattuk, kinyitottuk a hasüreget, majd a vastagbelet azonnal eltávolítottuk. A szövetet ph=7,4 értékû Krebs Henseleit-pufferbe helyeztük (a puffer összetétele/mm: 118,0 NaCl, 4,7 KCl, 1,18 MgSO 4, 2, CaCl 2, glükóz, 1,17 KH 2 PO 4 és 24,9 NaHCO 3 ). A vastagbelet egy disztális és egy proximális részre vágtuk, majd miközben óvatosan kipréseltük belõle a béltartalmat, Krebs Henseleit-pufferrel mostuk. Az in vivo feltételek lehetõ legjobb megközelítése érdekében 1 cm¹es teljesen ép szegmenseket ml¹es, 9% CO 2 % O 2 tartalmú gázkeverékkel folyamatosan átáramoltatott Krebs Henseleit-puffert tartalmazó vízköpenyes (37 C) szervfürdõkben (Schuler, HSE, Németország) hosszirányban izometrikus erõátvivõ berendezéshez (F type 372, HSE, Németország) kapcsoltunk. A szegmenseket fokozatosan 1 g nyugalmi feszülésig nyújtottuk, majd idõszakos mosás mellett 4 per- 14
1 HU 007 87 T2 2 cig ekvilibrálni hagytuk. A szegmensek nyugalmi állapotban és különbözõ stimulusok hatására mutatott feszülését transzducer erõsítõ modul (HSE, Németország) segítségével felerõsítettük, majd többcsatornás íróberendezéssel lejegyeztük (Rikadenki, HSE, Németország). A szegmenseket percig mm KCl-oldatban inkubáltuk, majd lejegyeztük az összehúzódásos válaszreakciókat. A KCl¹ot ötperces idõközökkel végzett három egymást követõ mosással távolítottuk el. A szegmenseket ezek után fokozatosan növekvõ, de legfeljebb 0 mm koncentrációjú acetáttal vagy nátriumacetáttal inkubáltuk. A savoldatokat frissen, desztillált vízzel készítettük. A semleges ph eléréséhez NaOH¹t adtunk az acetáthoz. A zsírsavval végzett inkubálás végén mm KCl¹ot adtunk a rendszerhez, annak megállapítása érdekében, hogy a zsírsav befolyásolta¹e a KCl¹ra adott összehúzódásos válaszreakciót. Az újabb inkubálásokat megelõzõen a szegmenseket szakaszos mosás mellett 4 percig friss Krebs Henseleitpufferben ekvilibráltattuk. A kísérletes protokollban a vastagbél két proximális és két disztális részlete szerepelt. Az adatelemzéshez (n=3) a stimulusok által kiváltott kontrakció mértékét perces inkubációt követõen mért, grammban kifejezett feszülésben adtuk meg. Az azonos (proximális vagy disztális) szegmensekkel nyert adatokból átlagértéket számítottunk, mindegyik szegmens saját kontrolljaként szolgált. 4.2 Eredmények Amint az. ábrán látható, a nátrium-acetát és különösen a nátrium-l-acetát csökkenti a tonikus összehúzódások erejét. A relaxációs hatás nagyobb mértékû a disztális, mint a proximális vastagbélszakaszban. Hasonlóképpen, a spontán, fázikus kontrakciók száma is csökken a vastagbél proximális szakaszában a nátrium-acetát és a nátrium-l-acetát hatására, a vastagbél disztális szakaszában ugyanakkor ilyen hatást nem lehetett megfigyelni. A vastagbél proximalis szakaszában a KCl¹ra adott válaszreakcióként kialakuló tonikus kontrakciók hasonló mértékûek voltak 2 mm nátriumacetát vagy nátrium-l-acetát jelenlétében vagy hiányában. Magasabb koncentrációknál ugyanakkor még KCl hozzáadását követõen is szignifikáns mértékû relaxációt tapasztaltunk. 2 3 4 SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Galakto-oligoszacharidok és polifruktóz alkalmazása allergia, ekcéma vagy atópiás betegségek kezelésére vagy megelõzésére szolgáló készítmény gyártására, ahol a készítmény élelmiszer-készítmény, amely proteint, lipideket, és galakto-oligoszacharidtól és polifruktóztól eltérõ szénhidrátokat is tartalmaz, és amely készítmény nem tartalmaz Bifidobacterium bereve-t, és nem tartalmaz legalább egy terminális uronsavegységet magában foglaló savas oligoszacharidot. 2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ekcéma vagy atópiás betegségek kezelésére vagy megelõzésére szolgáló készítmény gyártására. 3. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, allergia kezelésére vagy megelõzésére szolgáló készítmény gyártására. 4. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a galakto-oligoszacharid:polifruktóz mennyiségi aránya 3:97 és 97:3 közötti.. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a galakto-oligoszacharid transz-galaktooligoszacharid és/vagy a polifruktóz inulin. 6. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a polifruktóz vagy a feletti átlagos polimerizációs fokkal rendelkezõ inulin. 7. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a galakto-oligoszacharidok és a polifruktóz napi adagja a körülbelül 1 és g/nap közötti, elõnyösen pedig a körülbelül 2 és g/nap közötti tartományban van. 8. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a készítmény a készítmény csecsemõ táplálására szolgál. 9. A 8. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a készítmény csecsemõtápszer vagy nevelõtápszer.. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a készítmény legalább 4 g/l galakto-oligoszacharid és polifruktóz keveréket tartalmaz. 11. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a készítmény naponta beadott térfogata a körülbelül 0 és 00 ml közötti tartományban van. 12. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a proteinek nagymértékben hidrolizáltak és/vagy részlegesen hidrolizáltak.
HU 007 87 T2 Int. Cl.: A23L 1/028 16
HU 007 87 T2 Int. Cl.: A23L 1/028 17
HU 007 87 T2 Int. Cl.: A23L 1/028 18
HU 007 87 T2 Int. Cl.: A23L 1/028 19
HU 007 87 T2 Int. Cl.: A23L 1/028