GÉNKLÓNOZÁS ÉS GÉNMANIPULÁCIÓ Génklónozás Bármilyen klónozási eljárás célja, hogy egy ún. klónt, azaz tökéletesen egyforma szervezetek csoportját állítsák elő. Néhány növény, egyszerűen dugványozással klónozható, míg más növényfajokat klónozhatunk az egyed elkülönített sejtjeiből is. Még a gerinceseket is klónozhatók. A génklónozási kísérletekben rendszerint baktériumsejtbe viszik be az idegen gént, majd a módosított baktériumok szaporításával klónt állítanak elő. A klónozott sejtek mindegyike tartalmazza a bevitt idegen gént, és amíg biztosított a gén replikációja, a gazdasejt klónozásával klónozzuk a gént is. Az első klónozási kísérletet Stanley Cohen, Herbert Boyer és a munkatársaik végezték 1973-ban. Klónozás A restrikciós endonukleázok Cohen és Boyer kísérletét a felbecsülhetetlen jelentőségű enzimek, a restrikciós endonukleázok tették lehetővé. Nevüket arról kapták, hogy megakadályozzák az idegen DNS, például a baktériumot fertőző vírus DNS-ének invázióját, a molekula feldarabolásával (restrict = korlátozni). Az endonukleáz megjelölése, pedig arra utal, hogy az idegen DNS-t a molekula belsejében levő helyeken hasítják el, és nem a végén kezdik lebontani ( görög: endo=belső).
A restrikciós endonukleázok legfőbb előnye, hogy reprodukálhatóan, mindig ugyanott vágják el a DNS-t. Ezen a tulajdonságon alapul sok, a gének szerkezetét és működését vizsgáló módszer. De nem ez az egyetlen előnyük a restrikciós endonukleázoknak. Sokuk nem pontosan szemben vágja el a DNS két szálát, hanem kissé eltolódva, tehát egyfonalas túlnyomó szálakat, ún. ragadós végeket képez, ami megkönnyíti két DNS in vitro összekapcsolását rekombináns DNS-sé. A restrikciós enzimek azért alakíthatnak ki túlnyúló végeket, mert az általuk felismert szekvenciák rendszerint szimmetrikusak, azaz visszafelé olvasva is azonosak. Az ilyen szimmetrikus szekvenciákat palindromoknak is nevezik. Minden génklónozási kísérletben szükséges hordozó ún. vektor. A legtöbb eljárásban csak egy vektor szerepel és egy idegen DNS-darab, aminek replikációja a vektortól függ. Két nagy csoportjukat különböztetjük meg: plazmid és a fág vektorokat. Ragadós végek A plazmid vektorok A plazmidot úgy tervezték meg, hogy a gyakran használt restrikciós enzimeknek csak egy-egy hasítási helyük legyen rajta. Ez azért előnyös, mert mindegyik enzim használható idegen DNS beépítésére anélkül, hogy közben a plazmid egy része elveszne. A plazmid vektorba úgy építjük be az idegen DNSdarabot, hogy a plazmidot adott helyen megfelelő restrikciós endonukleázzal elhasítjuk. Ilyenkor pl. a psc101 jelű plazmid EcoRI hatására egy helyen hasad és komplementer ún. ragadós végek keletkeznek. Ha a beillesztendő DNS-darabot is ugyanilyen restrikciós enzimmel hasítottuk ki valahonnan, akkor annak is ugyanilyen ragadós végei lesznek. A kettőt összekeverve kétfajta rekombináns molekula is keletkezik, amelyek DNS-ligáz révén kovalensen is összekapcsolódnak. Kémiai szintézis révén is lehet olyan kettős szálú DNS-t szintetizálni, ami hasítóhelyet tartalmaz egy restrikciós endonukleáz számára. T4 ligáz révén az egy tompa végű DNS kettős lánc 3 OH és 5 P végéhez hozzákapcsolható. Adapterek használata is lehetséges. Ilyenkor olyan kettős szálú DNS-darabot szintetizálnak, ami eleve tartalmazza a ragadós véget, és ezt kapcsolják fel a DNS-fragmentre vagy vektorra, szintén T4 ligázzal a tompa végek révén Az egyik hasznos klónozó plazmid a pbr322. ez kétféle rezisztenciagént hordoz (tetraciklin, ampicilin). Az is lehet, hogy a klónozó plazmid csak egy rezisztenciagént tartalmaz, ami majd azt jelzi, hogy a plazmidot felvette a transzformált E.coli sejt. Azt viszont, hogy az idegen DNS-t felvette-e a plazmid, az jelzi, hogy az E.coli sejttenyészetek színtelenek lesznek megfelelő táptalajon.
A fág vektorok A λ-fágot is gyakran használják klónozó vektorként. Ehhez speciális λ-fág mutánst készítettek. Ennek a DNS-e csak két hasítóhelyet tartalmaz az EcoRI enzim számára. EcoRI-vel hasítva a λ-fág DNS-ét izolálni lehet a rúdszerű fág-dns bal és jobb karját a kihasadó középső résztől. Ennek helyére pedig beépíthető a ragadósvég módszerrel az ugyanilyen enzim hasítása révén nyert idegen DNS. A plazmidokkal szemben a λ-vektorok óriási előnye hogy sokkal több idegen DNS-t képesek befogadni. A Charon-fágok például, mintegy 20 kilobázisnyit. Ezeket a fágokat leggyakrabban génkönyvtárak készítésekor alkalmazzák. DNS könyvtár
A kozmidok A vektorok másik, kifejezetten a nagyobb DNS fragmentumok klónozására kifejlesztett csoportját a kozmidok alkotják, amelyeknek a plazmidokra, illetve a fágokra jellemző tulajdonságaik is vannak. A kozmidok, a Charon-fágoknál is nagyobb, akár 50 kilobázisnyi darabokat is felvehetnek, ezért szintén a génkönyvtárak készítésének eszközei. M13 fág vektorok A fág vektorok másik nagy csoportja az M13 fágokból készült. Jól használható sokszoros klónozóhelyük mellett további előnyük, hogy egyszálú rekombináns DNS-t termelnek, ami alkalmassá teszi őket a DNS szekvenálására és a helyspecifikus mutagenezisre. Fágmidok Ezek annyiban hasonlítanak a kozmidokra, hogy fág- és plazmidjellegzetességeik is vannak, erre utal nevük is. A fágmidok helperfágjaik jelenlétében ugyancsak egyfonalas DNS-t termelnek. Specifikus klón azonosítása, specifikus próbával A specifikus klónok olyan polinukleotid próbákkal azonosíthatók, amelyek magához a génhez kapcsolódnak. Egy géntermék aminosavsorrendjének ismeretében megtervezhető a polipeptidlánc egy darabját kódoló oligonukleotid. Ez utóbbi egy adott klón azonosításának egyik leggyorsabb és legpontosabb módszere. A cdns klónozása A cdns-nek egy időben csak egy szála szintetizálható. Az első szál templátja az mrns, a másodiké, pedig az első szál. A kétfonalas cdns-t olyan oligonukleotid-végekkel látják el, amelyek kapcsolódhatnak a klónozó vektor komplementer végeihez, majd az így összeállított rekombináns DNSsel baktériumokat transzformálnak. A pozitív klónokat radioaktív DNS-próbákkal telephibridizálás során azonosítják, vagy pedig ellenanyagokkal, ha expressziós vektort, például λgt11-et használnak Expressziós vektor Az expressziós vektorokat úgy szerkesztik meg, hogy a lehető legnagyobb mennyiségben képződjön a klónozott gén fehérjeterméke. A működés optimalizálására a vektorokba erős bakteriális promotereket és bakteriális riboszómakötő helyeket építenek, ezek ugyanis hiányozhatnak a klónozótt eukarióta génekből. A legtöbb klónozó vektor indukálható, így elkerülhető az idegen géntermék idő előtti túltermelése, ami toxikus lehet a baktériumsejtre. Az expressziós vektorokkal gyakran fúziós fehérjéket állítanak elő, amelyek N-terminálását a vektorban lévő kódoló szekvenciák, C-terminálását pedig a klónozott gén határozza meg. A fúziós fehérjéknek előnyeik is vannak: a prokarióta sejtekben stabilabbak, mint az eredeti eukarióta fehérjék, és izolálásuk is egyszerűbb lehet. A λgt11 vektorral előállított fúziós fehérjék specifikus antiszérummal mutathatók ki a plakkokban. Műveletek klónozott génekkel A klónozótt gének alkalmazásával bármilyen változás megvalósítható a fehérjetermék aminosavsorrendjében. Ez legegyszerűbben bakteriofág vagy fágmid vektorokba klónozott egyszálú DNS-sel és a megtervezett báziscserét tartalmazó szintetikus oligonukleotid primerekkel végezhető el.
DNS-próbák alkalmazása A klónozott DNS-ek kitűnő próbák, mert ugyanolyan vagy nagyon hasonló szekvenciájú DNS-hez és RNS-hez hibridizálhatók. Megjelölhetők radioaktív izotóppal, de nem-radioaktív jelölés is kötehtő rájuk. A jelölt próbát Southern-bloton DNS-sel hibridizálva meghatározható a hasonló szekvenciájú DNSfragmentumok mérete. A Northern-blot a komplementer RNS-ek méretének és mennyiségének megállapítására szolgál. A próbák teljes kromoszómákhoz is hibridizálhatók, ha a cél a gének helyének azonosítása. A gének bázissorrendjének meghatározása A klónozott gének olyan homogén DNS-molekula populációkat biztosítanak, amelyekből lehetővé válik a nukleotidszekvencia meghatározása. A Sanger-módszer didezoxi-ribonukleotidokat használ a DNSszintézis véletlenszerű megszakítására. A keletkező fragmentumok méretük alapján elektroforézissel választhatók szét egymástól. A fragmentumok utolsó bázisa ismert, mert tudják, melyik didezoxiribonukleotid állította meg a replikációt. A fragmentumokat méretük szerint sorba rendezik-mindegyik fragmentum egy (ismert) nukleotiddal hosszabb az előzőnél-,és megkapják a DNS bázissorrendjét. A GÉNKLÓNOZÁS GYAKORLATI ALKALMAZÁSA Az emberi génterápia A génterápia olyan eljárásokat jelent, amikor klónozott génekkel próbálnak kezelni, és esetleg gyógyítani emberi betegségeket, köztük öröklődő rendellenességeket, rákot, AIDS-t stb. A klónozott géneket vektorokkal, rendszerint fertőzésre képtelen retrovírusokkal juttatják a célsejtekbe. A génterápia eddig két esetben bizonyult sikeresnek, de jelenleg még nem elég hatékony, és rendkívül költséges. Klónozott gének termékeinek felhasználása Lehetségessé vált a baktériumok vagy más sejtek manipulálása abból a célból, hogy klónozott gének termékeit állítsák elő. A fehérjetermékek között van néhány nagyon hasznos, vagy nagyon ritka, esetleg egyszerre mindkettő, amelyek éppen ezért értékesek lehetnek. A klónozott gének és termékeik alkalmazása új lehetőségeket nyitnak az orvostudományban, a mezőgazdaságban és a genetikában. Fehérjék- Új korszak a gyógyszergyártásban Milyen fehérjék nagy mennyiségben való előállítása lehet fontos? Elsőként az emberi inzulint gyártották klónozással. A módszer kidolgozása két szempontból is lényeges volt: - először is azért, mert a cukorbetegek egy része allergiás lett a hagyományos eljárással készült sertésés szarvasmarha-inzulinra. A sertésinzulin kismértékben eltér az emberi inzulintól, az immunrendszer érzékeli ezt a különbséget, ezért immunválaszt, néha allergiás reakciót is indíthat az idegen fehérjével szemben. Elvben az emberi inzulin nem okoz ilyen problémát, hiszen a szervezet nem azonosítja antigénként. - másodszor, a klónozott gén szinte korlátlan inzulinforrást jelent, és így a gyártás független az állati termékek piacának ingadozásaitól. A klónozással előállított fehérjék másik példája az emberi növekedési hormon (hgh). A gyermekek egy része örökletes hipofizer törpeségben szenved, aminek oka, hogy agyalapi mirigyükben túl kevés növekedési hormon képződik, ezért kezelés hiányában testmagasságuk jelentősen elmarad az átlagostól. Az állati eredetű növekedési hormonok nem hatékonyak. Korábban a gyermekeket halott emberek agyalapi mirigyéből kivont hormonnal kezelték, de ez nagyon költséges volt. Ráadásul az első hormonkészítmények szennyezettek voltak. A megoldást tehát, a hgh génjének klónozása jelentette. A jövőben várható olyan tisztított vírusfehérjék előállítása is, amelyek biztonságos és hatékony oltóanyagként használhatók a halálos fertőzések ellen. Elképzelhető, hogy ártalmatlan vírusok módosításával immunizálni lehet a szervezetünket más rokonsági körbe tartozó, veszélyes vírusok ellen is.
Klónozott gének alkalmazása a mezőgazdaságban 1983-ban Richard Palmiter és Ralph Brinster korai stádiumú egérembrióba juttatták az ember növekedési hormon génjét. Az eredmény a sajtó által szuperegérnek becézett, az átlagosnál kétszer nagyobb testű óriás egér volt. Az ilyen állatokat transzgenikusnak nevezzük, mert egy másik élőlényből átültetett gént hordoznak. Hangsúlyozni kell, hogy a transzgenikus állatokba az idegen eredetű gén, az ún. transzgén bejuttatása az embrionális fejlődési igen korai stádiumában történik, így a transzgén beépülhet a gazda sejtjeibe, beleértve a csíravonalat is, és a normális génekhez hasonlóan továbbadható az utódokba. Amikor nyilvánosságra került a szuperegér létrehozása az emberek csodálkoztak. Miért nem szupertehén vagy szupersertés?. Az igazság az, hogy Palmiter és Brinster megkísérelték a szupersertés előállítását, de nem sok sikerrel. Létrehoztak transzgenikus sertéseket oly módon, hogy az ember hgh, illetve a szarvasmarha növekedési hormon bgh génjét injektálták sertés petesejtekbe. A szarvasmarha hormonja hatásosabbnak bizonyult, de a transzgenikus malacok nem szolgáltak rá a szuper jelzőre. Nem nőttek a normális méret többszörösére, de a takarmányhasznosításuk jobb volt. Ez fontos szempont, hiszen a takarmány teszi ki a sertéstartás költségeinek 70%-át. Előnyt jelentett az is, hogy tanszgenikus állatok bő alatti zsíéteg vékonyabb volt. Az étkezési szokások változása miatt ugyanis az állati eredetű zsiradékok fogyasztása jelentősen visszaszorult. Az előnyös tulajdonságok mellett a transzgenikus sertések súlyos egészségügyi problémákkal küszködtek. Gyomorfekély, izületi gyulladások, bőrgyulladás, vesebetegség.
KIEGÉSZÍTŐ ANYAGOK: - PCR - Vektorok