2013 január Abszorpciós fotometria Elektron-spektroszkópia alapjai Biofizika. szemeszter Orbán József PTE ÁOK Biofizikai ntézet Definíciók, törvények FÉNYTAN ALAPOK SMÉTLÉS - Elektromágneses sugárzás, kettős természet, foton, elektromos/mágneses térerősség - Fény-anyag kölcsönhatás típusok - Spektrum típusok (abszorbciós/emissziós és vonalas/sávos/folytonos) FOTOMETRA - Fehér fény, spektrum, intenzitás - Detektálás, PMT, - Abszorbancia (optikai denzitás, etinkció), transzmittancia, etinkciós koefficiens - Lambert-Beer törvény, additivitás - Atomok energiaszintje, foton energia rezonancia feltétel, MOLEKULÁK (FEHÉRJÉK) SPEKTRUMA - Sávos színkép és magyarázata, molekuláris energiarendszer Jablonsky termséma s m é t l é s Fény elektromágneses sugárzás foton (fénykvantum), energiája: E = h f A fény kettős természete: Elektromágneses hullám (terjedéskor) Elhajlás (diffrakció) nterferencia Polarizáció Részecske (kölcsönhatáskor) Fotoeffektus Compton-effektus A b s z o r p c i ó R e f l e i ó Elektromágneses hullám terjedése ha = 600 nm, akkor f = = 5 10 14 Hz mágneses mező elektromos mező terjedési irány E Elektromágneses hullám terjedése Elektromos térerősségvektor Mágneses térerősségvektor B transzverzális hullám mágneses mező elektromos mező hullámhossz c = f Az elektromos, és a mágneses térerősség vektorai mindig merőlegesek egymásra és a haladási irányra! 1
Az elektromágneses sugárzások teljes spektruma Energia, frekvencia (E=hf Hullámhossz (=c/f) Fény és anyag kölcsönhatása Sugárzás anyag kölcsönhatás elektromágneses (vagy radioaktív) sugárzás Gamma Röntgen Mikro- hullám Rádió sugárzás Látható tartomány Hogyan mérjük az abszorpciót? Egy fotométer működésének elméleti sémája Az alapelv Fényforrás monokromátor (rács v. prizma) Minta Detektor 1 PMT Minta Diffrakciós rács Referencia csatorna Referencia (blank) Detektor 2 Rés Fény Elektromos jel Kiértékelés (PC) A mérés során hullámhosszonként határozzuk meg az abszorbancia értékét egy széles (spektrális) tartományban. Fény detektálás: Elektromágneses sugárzás átalakítása elektromos jellé (feszültségváltozássá). foton Fotoelektron sokszorozó (cső) Photomultiplier tube (PMT) Fotoeffektus (foton lök ki elektront, ionizáció!) fotokatód dinódák Sugárzás anyag kölcsönhatás 0 (kezdeti intenzitás) anyag elektron gyorsító nagyfeszültség elektron lök ki (1-6) elektront J E L Ha: 1 2 akkor az erősítés: 2 n (n: dinódaszám) áram/feszültségmérő Erősítés: 1 foton (fotoelektron) 1-10 millió elektron! Refleió Transzmisszió Abszorpció Szórás Rayleigh-féle ~n n: fotonszám Mi határozza meg az elnyelés mértékét? 2
Abszorbció - elnyelés anyag 0 Eponenciális függvény!!! fotonszám: intenzitás: N ( ) ( ) 0 N 0e 0 e 1 2 3 vastagság Melyik függvény írja le a csökkenést? 0 enzitás nte A fény elnyelődése anyagban homogén minta 0 úthossz (vastagság) Mindig igaz, hogy: 0 0 > reflektált: R = 0-0 abszorbált: A = 0- transzmittált : T = A refleió mértéke általában elhanyagolható! 0 = 0 T 0 0 Transzmittancia anyag, általában százalékban (%) adják meg. DETEKTOR A szórás mértéke alacsony koncentráción elhanyagolható! A megfelelő higítás fontos! Abszorbancia definíciója 0 általános egyenlet: Lambert-Beer törvény (híg oldatok) minta = 0 e - = 0 10 -() c DETEKTOR Miért () és nem csak? Megjegyzés: Hasonló abszorpciós jelenség figyelhető meg a radioaktív sugárzás anyagba hatolásakor is. Abszorbancia definíciója 0 Lambert-Beer törvény (oldatok) minta = 0 10 -() c DETEKTOR E= OD = A = - log 10 ( / 0 ) = - log 10 T= () c etinkció optikai denzitás abszorbancia Mértékegység nélküli, additív mennyiség! (): az etinkciós koefficiens (anyagi minőségtől és hullámhossztól függ), c: a minta koncentrációja, : az optikai úthossz P é l d a 10 % transzmittanciájú anyag abszorbanciája? A = OD = - log (/ 0 ) = - log (0,1) = 1 50 % transzmittanciájú anyag abszorbanciája? A = 0,301 1%transzmittancia (99% abszorbeált) 1 % transzmittancia (99% abszorbeált) A = 2 Ha a 10 % és az 1 % transzmittanciájú anyagot együtt használjuk, mennyi az eredő transzmittancia és abszorbancia? A = 2+1 = 3, T = 0,01 0,1 = 0,001 = 0,1 % 3
Színképek - spektrumok Abszorpció és Emisszió atomoknál 1. abszorpció állapot: alapállapot gerjesztett állapot Hidrogén Nátrium e - e - + E abs = h + e - + Hélium Neon Higany folyamat: (foton) Abszorpció (elektron) Ecitáció (gerjesztés) A foton abszorpciója és az elektron gerjesztése egyszerre zajlik le! Hullámhossz (nm) (vonalas emissziós spektrumok) Atomok energiaszint-rendszere Bohr illetve kvantummechanikai atommodell szerint energia (szintek) energia különbség R H = -13,6 ev Energiaszintek H-atom Rydberg állandó E n R H 1 2 n 1 ev =? J 1 ev = 1,6 10-19 J, mert q e = -1,6 10-19 C Az elektronok kvantált (meghatározott) energiával rendelkeznek. energiaszintek! Az ábra csak szemléltetés! Mit mond Bohr posztulátuma az energiakibocsátásról / elnyelésről? Energiaszintek H-atom Energiaszintek H-atom R H = -13,6 ev Számoljuk ki a 2. pálya energiáját! R H = -13,6 ev 1 En RH 2 n 1 13,6 E2 RH 3, 4eV 2 2 4 Mekkora energiájú fotont tud elnyelni / kibocsátani a H-atom az 1-es 2-es pályák közötti átmenetkor? E E E 3,4 ( 13,6) 10, 2eV 2 1 Milyen hullámhosszú a fény, amit elnyel / kibocsát a H-atom? E E E 3,4 ( 13,6) 10, 2eV 2 1 Milyen hullámhosszú a fény, amit elnyel / kibocsát a H-atom? E foton h f és c f 1 ev = 1,6 10-19 J 10,2 ev 16,3210 hc E 19 J 34 6,6 10 310 19 16,3210 ahol c 3 10 8 m/s 8 1,2110 7 m λ=121 nm UV!!! 4
Spektrum - színkép Spektrum: (fény)intenzitás v. azzal analóg mennyiség hullámhossz vagy frekvencia függvényében A spektrumok megjelenési formái. Típusok: vonalas (atomok) sávos (molekulák) folytonos (magas hőmérsékletre hevített anyagok, pl. abszolút fekete test, csillagok) Folytonos sugárzások vizsgálata és leírása: Planck A spektrumok megjelenési formái. emissziós T abszorpiós Folytonos emissziós Fehérjék abszorpciós spektruma Vonalas emissziós Vonalas abszorpciós (folytonos alapon) Kép forrása: http://csep10.phys.utk.edu/astr162/lect/light/absorption.html 2013 január Biofizika. szemeszter Orbán József PTE ÁOK Biofizikai ntézet Aktin molekula sávos (abszorpciós) spektruma Fehérjék abszorpciója - aminosavak ia vagy OD n Abszorbanc Absorptio 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 Ez melyik típusú színkép? Hogyan alakul ki? Az atomok vonalas- és a molekulák sávos színképe karakterisztikus! k ik!(az anyagi minőségtől függ) 260 270 280 290 300 310 320 hullámhossz Wavelength (nm) aktin A három fontos aminosav, amelyek UV-ban mért abszorpciója segítségével szokták pl. az oldatok fehérje koncentrációját meghatározni. (Feltételezve azt, hogy az etinkció mértéke egyenesen arányos a fehérje koncentrációjával.) kció etink hullámhossz 5
Molekulák színképe Molekuláris mozgások A Born-Oppenheimer közelítés: Az elektronok mozgása sokkal gyorsabb az atommagokénál, mert az atommagok nehezek, ezért a molekuláris mozgások modellezésénél a molekulát klasszikus rendszernek tekinthetjük: rugókkal összekötött, töltéssel rendelkező tömegpontok. E össz = E elektromos + E vibrációs + E rotációs. Molekula energiája sávos színkép E össz = E elektromos + E vibrációs + E rotációs Az egyes energiaszintek közötti átmenetek egymástól függetlenül mehetnek végbe. A szintek közötti energiakülönbség összegeződik: E össz = E elektromos + E vibrációs + E rotációs. Két meghatározott elektromos energiaszinthez sok vibrációs és sok rotációs energiaszint tartozhat, ezért a molekulák színképe nem vonalas, hanem kiszélesedett sáv! Az energiakülönbségek nagyságrendje: E elektromos ~ 1000 * E vibrációs ~ 1000000 * E rotációs 0 Energ gia Jabłonsky-féle termséma molekuláris rendszer rotációs szintek vibrációs szintek S 2 S 1 S 0 Az egyes energiaszintek a nullaszint alatt vannak. Minden vízszintes vonal a molekula egy jól definiált energiával rendelkező állapotát reprezentálja Az elektromos, az azokra épülő vibrációs, valamint rotációs energiaszintek sematikus ábrája látható. Alapállapotban: az e - az S 0 valamely vibrációs szintjén helyezkedik el. elektromos szintek: S 0, S 1, S 2 0 Jabłonsky-féle termséma molekuláris rendszer S 2 1. Ecitáció (gerjesztés) Abszorpció (elnyelés) 0 Miért sávos a molekulák színképe? molekuláris rendszer S 2 gia Ener h S 1 Abszorpció S 0 A gerjesztés/abszorpció feltétele: E = h (rezonancia feltétel) A foton energiájától függően létrejöhet: elektromos vibrációs rotációs átmenet ezek keveréke Energ gia S 1 S 0 elektromos szintek: S 0, S 1, S 2 rotációs szintek vibrációs szintek vibrációs szintek 6
P é l d a Miért jó az Abszorbancia additivitása? fehérjekoncentráció meghatározása Szükség van egy referencia számra (kalibráció): etinkciós koefficiens: szokásos egységei: M -1 cm -1, vagy (mg/ml) -1 cm -1 absz zorbancia fehérje Fluoreszcens jelölő Ha A = 0,55 és = 1,1 (mg/ml) -1 cm -1 c = (A/ ) mg/ml-ben megadva c = 0,5 mg/ml (nm) Kiszámolható a fehérje és a jelölő koncentrációja és így a jelölési arány. Kiegészítés A fehér fényt színösszetevőire bonthatjuk egy prizma, vagy optikai rács segítségével. Vörös Narancs Sárga Zöld Kék bolya V N S Z K A környezetünk sokszínűségét megérthetjük, ha észben tartjuk, hogy a dolgok színét a szemünkbe jutó fotonok energiája (színe) határozza meg. Csak az érzékelt fotonoké! Vörös Narancs Sárga Zöld Kék bolya Kiegészítés Refleió által meghatározott FELÜLET SZÍN Milyen színű az alábbi tárgy? Keress a következő kifejezésre: Additív / konstruktív színkeverés pl.: bútorok, falak, tinta, papír, haj, szivárványhártya színe Kiegészítés Abszorpció (transzmisszió) által meghatározott TEST SZÍN Vörös Narancs Sárga Zöld Kék bolya Milyen színű az alábbi tárgy? pl.: vörös vértestek, falevelek, ólomüveg ablakok színe 7
Megfigyelés: A fotométer linearitása: stray light effect A fotométer linearitása; stray light effect A probléma eredete: nem tökéletesek a monokromátorok! abszorpció Várható tendencia Meredekség: Második, harmadik felharmonikusok! Koncentráció Optikai rács Az anyag csak a kiválasztott (alapharmonikus) hullámhosszon nyel el! Nagy abszorbció mellett. A detektor pedig az összes hullámhosszon mér! 0 0 99% választott és anyag 89% választott és 99% választott és anyag 1% választott és 1% felharmonikus 1% felharmonikus 1% felharmonikus 1% felharmonikus Kicsi abszorbció mellett. Az arányok jelentősen eltolódnak! Az átmenő (transzmittált) fény: a mért érték és valódi érték aránya Kicsi abszorbció mellett: / 0 = 90 / 100 = 0.9 valódi érték = 89 / 99 ~ 0.9 A mért és a valós érték közel azonos! Relatív hiba ~ 0,1% Nagy abszorbció mellett: / 0 = 2 / 100 = 0.02 valódi érték = 1 / 99 ~ 0.01 Az eltérés nagy! Relatív hiba 200%!!! 8