Magyari E. K., Bálint M., Parducci L., Major Á., Nédli J., Rácz I. 2011.03.28. 1

İSI DNS ÉS POPULÁCIÓTÖRTÉNET: 11 ezer év demográfiai változásinak negatív hatása a lucfenyı (Picea abies) genetikai variabilitására egy kárpáti refúgium-területen Magyari E. K., Bálint M., Parducci L., Major Á., Nédli J., Rácz I. 2011.03.28. 1

MOTIVÁCIÓ 2005: Molekuláris Taxonómiai Labor nyílik az MTM-ben Potenciális hasznosítás lehetıségei fosszilis témában? tavi üledékbe zárt fosszilis pollenek és makrofosszíliák

İSI DNS KUTATÁSOK rövid történeti áttekintés I. Özönvíz elıtti DNS 1984-1995 Fosszilis, erısen fragmentálódott DNS szálak, melyek sokszor posztmortem bázis-transzformáción esnek át Higutchi et al. 1984: 150 éves múzeumi kvaggából sikeresen vontak ki és amplifikáltakısi DNS-t (Fokföldön 1800-as években kipusztult zebra alfaj) Hihetetlen korúısi DNS maradványok ( özönvíz elıtti DNS ): 100 millió évesnél is idısebb fosszíliák látszólagosan sikeres DNS analízise: pl. oligocén és kréta borostyánban talált rovarok, növényi maradványok (1992-1994), miocén Magnolia fosszíliák (1990-1991), 80 millió éves dinoszaurusz csont (1994), kréta korú dínó-tojás (1995) Egyiket sem sikerült reprodukálni, a 2000-es évek kutatásai szerint a DNS megtartás maximálisan néhány százezer éves idıtartományban lehetséges

İSI DNS KUTATÁSOK rövid történeti áttekintés II. Özönvíz utáni DNS a 2000-es évek Az ısi DNS vizsgálatok kettéágazó vizsgálati célja: 1. Populációgenetikai kérdések vizsgálata: pl. hogyan hat az elterjedési terület fluktuációja a genetikai diverzitásra, fajképzıdés, evolúció 2. Az egykoron élt fajspektrum kiderítése, diverzitás változás vizsgálata, ısi DNS használata fajmeghatározásra (metagenomika) Barlangi medve - mitokondriális genom hosszú szakaszai ismertek, barnamedvétıl 1.5 millió éve vált el, többszöri géndiverzitás csökkenés az utolsó glaciálisban Gyapjas mamut - teljes mitokondriális genom hajszálból, rövidebb mtdns szaksazok vizsgálata több faj együttes jelenlétét bizonyították az utolsó glaciálisban, 2011: japán kutatók Oroszországban tárolt mamut tetem sejtmagjait akarják elefánt petesejtbe ültetni: Jurasic Park helyett Pleistocene Park 4000 éves grönlandi ember - 3 billió bázispár hajból 2010-ben, mai szibériaiakkal rokonítható Neandervölgyi ember 4 billió bázispárt közöltek 2010-ben, 99,7%-os egyezés a modern emberrel, elválsái idı: 500-700 ezr év, keveredhetett a modern emberrel Barlangi medve Gyapjas mamut Grönlandi emeber Neandervölgyi emeber

Taylor at al. (2010) Missing saiga on the taiga; Campos et al. (2010) Ancient DNA sequences point to a large loss of mitochondrial genetic diversity in the saiga antelope (Saiga tatarica) since the Pleistocene Szaiga antilop ısi DNS vizsgálat modern DNS vizsgálattal párhuzamosan - kihalás szélén álló fajról van szó, környezeti változásokra érzékenyen reagál, de kedvezı feltételek esetén gyorsan szaporodik és mobilis, kedvezıtlen környezetben viszont tömegesen pusztul - genetikia vizsgálat eredménye: hirtelen populációméret csökkenés 2000 és 11000 éve, elıbbit valószínőleg emberi hatásra utóbbit klimatikus hatásra bekövetkezı élıhely beszőkülés okozta. + dokumentált tömeges pusztulások betegség, téli nagy hóborítás hatására: 1971, 1987, 1993 -az ısi DNS vizsgálat konzervációbiológiai jelentısége: ez a faj drámai populációméret csökkenéseket képes túlélni köszönhetıen a botlleneck utáni gyors szaporodásának, következésképpen védelmét leginkább az szolgálná ha a terjedését segítenék elı és nem a hirtelen elhalálozásokat próbálnák megakadályozni (élıhely összekötı folyosók létrehozása) 2011.03.28. 5

İSI NÖVÉNYI DNS VIZSGÁLATOK -KIS SZÁMÚ VIZSGÁLAT elsısorban metagenomika: milyen fajok voltak jelen? + Archeobotanika (pl. fıbb gabonák, szılı, kukorica)

VIZSGÁLT NÖVÉNYFAJ - LUCFENYİ (PICEA ABIES) Miért a lucfenyıt választottuk? 1) Európai populációnak genetikai mintázata részletesen tanulmányozott (kloroplaszt, mitokondriális és nukleáris régiók) 2) Az utolsó eljegesedés során fontos erdıalkotó a Kárpát-medencében, bizonyos helyeken feltételezhetı a folyamatos jelenléte (pl. hegyvidéken) 3) Fosszíliáinak elıkerülése várható glaciális és holocén tavi üledékekben 4) Pollenje nagy mérető (100-150 mikron), relatíve könnyen izolálható az üledékbıl

Tollefsrud et al. (2008) A LUCFENYİ GENETIKAI CSOPORTJAI ÉS EZEK ALAPJÁN FELTÉTELEZETT POSZTGLACIÁLIS TERJEDÉSI ÚTVONALAK Mikor történt ez az elválás? Ezek a populációk nem terjedtek északra a holocén felmelegedés során, csak magassági övek közt mozogtak A PCA alapú lucfenyı genetikai csoportok földrajzi eloszlása, és a genetikai csoportok kapcsolata minimum-evolúciósfák alapján. 8 Retyezát-hegység 2011.03.28. Full glacial (LGM) distribution of Picea abies in the Carpathian Basin

Eemian interglacial (ca. 120 000 years BP) disribution of Picea abies in Central-Southern Europe. Taken from Ravazzi ( 2002) Maximum spruce expansion (Picea abies+picea omoricoides) during the early Weichselian (107 75 kyr BP) Maximum expansion of Picea abies in southern Europe during middle pleniglacial interstadials (55 35 kyr cal BP) A LUCFENYİ ELTERJEDÉSI TERÜLETÉNEK VÁLTOZÁSAI AZ ELMÚLT 120,000 ÉVBEN EURÓPÁBAN Tentative range map of Picea abies in central and southern Europe during the LGM (25 17.5 kyr cal BP). Ravazzi (2002) Lucfenyı (Picea abies) área

MOTIVÁCIÓ Ravazzi 2002 The time window used by most researchers (the postglacial) to evaluate the influence of historical events on genetic structure of European tree populations seems too short compared to the amount of genetic variability that was probably not eliminated by the restriction of populations during the LGM. This is especially important in the case of spruce, which was not reduced to a confined refugium but survived in large regions in southern Europe. Hope is now placed in fossil DNA extraction and identification, because this will allow a real integration of paleobotanical and molecular methods.

CÉLKITŐZÉSEK?? Az ısi és modern lucfenyı populáció DNS vizsgálata révén annak felderítése, hogy a késıglaciális és holocén idıszak (elmúlt ~ 15000 év) klímaváltozásai és az emberi tevékenység (erdıirtás) hogyan hatottak a fafaj genetikai összetételére a Déli-Kárpátokban, mely terület ma számos área-specifikus allélt hordoz közepes genetikai diverzitás mellett. A faj túlélése szempontjából kulcsfontosságú-e ezen área-specifikus allélek védelme? Hosszútávú cél: a paleobotanikai leletek alapján feltételezhetı DNY-ÉK irányú glaciális összeköttetés bizonyítása lucfenyı fosszíliák DNS vizsgálatával 2011.03.28. 11

KUTATÁSI TERÜLET - TAUL DINTRE BRAZI, RETYEZÁT-HG. T.sz.f.m. : 1740 m Terület : 0,5 ha Vízmélység: 80 cm ph: 5,7 Növényzet : Pinus mugo úszóláp, Rhododendron myrthillus, Sphagnum sp., Picea abies, Pinus cembra Fúrásmag: 5 m

A RETYEZÁT

MÓDSZER ÉS MUNKAFOLYAMAT Arche DNA lab Arche DNA lab A DNS laborban lucfenyıvel korábban nem dolgoztak A recens lucfenyı anyag elemzése a fosszilist követte (szennyezés elkerülése érdekében) A DNS ısiségének bizonyítása: minta kontroll, reagens kontroll, PCR reakciók és szekvenálás ismétlése külföldi laborban (Uppsala University) A pollen minták fagyasztást követıen közvetlen a PCR reakciók elıtt lettek összetörve (5 pollen egy PCR csıben)

Minták: 10 fosszilis lucfenyı mag 4 fosszilis tobozpikkely MÓDSZEREK PCR & SZEKVENÁLÁS 462 fosszilis lucfenyı pollen 58 modern lucfenyı tőlevél PCR mixes: 5 ul of the template solution), 1x reaction buffer, 1.5 mm MgCl2, 0.1 mm dntp (each), 0.255 pmmole F and R primer, and 0.4 U of AmpliTaq Gold polymerase. PCR produktum tesztelése agaróz gélen ráamplifikálás szekvenálás Marker választás: pszeudo-gének, mikroszatelliták, intergénikus spacer-ek és intronok (rövid 136-220 bázispáros szakaszok. ndhcp-ndhkp ndhk-for1 CACTTCAGTTCTTGTTGTTCC pseudogenes ndhc_ndhk-rev TCGCCACAGAACCAACGATG psbm-trnd psbm_trnd-f1 GTTCGAGTAACGGAATCTAAC intergene spacer psbm_trnd-rev1 CGAACGTCTTCTGGAGTAGC B: (ORF46b) B-for GCTTATGGCATTGTTGATGT B-rev TGGGCATTCTAGCTGTATTG D: Pt15169 D-for CTTGGATGGAATAGCAGCC D-rev GGAAGCGCATTAAGGTCATTA trnt-trnl trnt_trnl-sp-f1 CTGAGCTAAGCAGGCTCAATGG intergene spacer trnt_trnl-sp-brev GCATGTTATTATCCTCCCCTAG trnl-intron trnl-intron-f2 GAACGCTCTATTTACACC trnl-intron-rev ACACGTAGAATTGGACTCTATC trnl-trnf Aa_trnLF-for GGTTCAAGTCCCTCTATCCC intergene Aa_trnLF-rev ACTGATCAACTCAACTTGTCATAAG intron trnk2i-r1 CATGAGTCAGGAGAGCGATTGG 136 bp 200 bp 212-220 bp PCR profile: 10 min at 94 ºC, 45 cycles of 20 sec at 94 ºC, 30 sec at 237 bp 55 ºC, 1 min at 72 ºC, final elongation 7 min at 72 ºC, with 10 spacer ATGG 186 bp ºC as 2011.03.28. end-temperature. matk-trnk trnk2i-f1 GCCCTCGTTCATGAGAATAACC 17 124 bp 251 bp 197 bp

EREDMÉNYEK 58 modern szekvencia ~ 1550 bázispár össz-hossz + 2 Sweden 28 fosszilis pollen szekvencia 124-251 bázispár hosszúak (összesen 462 próbálkozás) 22 fosszilis mag és tobozpikkely szekvencia, 124-1016 bázispár hosszúak

Recent haplotypes: 9 Region (position): Position (total): B(88) M CK 424 1-200 1-136 B(107-126) 443-462 D(77) 629 D(78 630 D(82) 634 TL(168) 834 TL(196) 872 TL(197) 873 TL(206) 882 Li(154) 1081 Li(157) 1084 LF(115) 1279 LF(133) 1297 K2i(134) 1464 Length (bp) MUTÁCIÓS POZÍCIÓK B11?? C 12A+5G A A C G T C G T C T T C 1551 Buk9?? C 11A+6G A A C G T C G T C A T C 1551 CP2?? C 11A+6G C A C G T C G T C A T C 1551 Gtk24?? C 10A+6G A A C G T C G T A A T T 1550 KR8-2?? C 13A+5G A A C G T C G T C A T C 1552 P9?? C 12A+5G C A C G T C G T C A T C 1551 St15?? C 10A+6G A A C G T C G T C A T C 1550 Z7?? C 12A+5G A A C G T C G T C A T C 1551 H12?? T 12A+4G+3A+G A C T G T A G C C A G C 1554 Arche cone: cone? C A C G T C G A T C 901 Arche seeds: seed3 A A C 124 seed4 T A 237 seed8? C A C G T C G 575 seed9? C 10A+7G G T C G A T C 990 seed10? A A C G T A G T C C 1016 Arche pollen grains: a-b-p1 C 10A+6G 212 a-d-p2 C A C 124 a-d-p3 C A C 124 a-tl-p4 G T C G 251 a-tl-p5 G T C G 251 a-tl-p6 G T C G 251 a-tl-p7 G T C G 251 a-tl-p8 G T C G 251 a-tl-p9 G T C G 251 a-tl-p10 G T C G 251 a-tl-p11 G T C G 251 a-tl-p12 G T A G 251 a-tl-p13 A G A A 251 a-ck-p14? 136 a-ck-p15? 136 a-m-p16? 200 a-m-p17? 200 Két fosszilis szekvencia kizárólag a fosszilis anyagban fordult elı A mai populáció gyakori és a ritka alléljei egyaránt elıkerültek a fosszilis mintákból, és érdekes jelenség, hogy a mai ritka allélek a fosszilis mintákban gyakoribbak voltak 13 pont mutációt észleltünk 5 in/del polimofizmust

A İSI DNS SZEKVENIÁK AUTENTIKUSSÁGÁT TÁMOGATÓ EREDMÉNYEK A reagens és minta kontrollok nem amplifikáltak DNS-t Az agaróz gélen tiszta és egyértelmő csíkok Olyan haplotipusok voltak jelen az ısi anyagban amik ma hiányoznak a területrıl A vizsgálatok replikálhatóak voltak egy független külföldi laborban

Alapstatisztikák: polimorfizmus, populációk differenciáltsága és génáramlás mérése az ısi és recens populációk közt No. haplotype s Haplotype diversity (Hd) Nucleotide diversity (π) Average no. differences (k) Fst Ks Kst B Ancient Recent 2 5 1.0000 0.5758 0.0070 0.0026 4.0000 0.8020 0.1731 0.9104 0.0355 ** D Ancient Recent 2 3 0.5333 0.3001 0.5333 0.3410 0.5333 0.3409 0.3266 0.3592 0.0937 ** TL Ancient Recent 3 2 0.3846 0.0351 0.0026 0.0001 0.7912 0.0351 0.0580 0.1842 0.4248 * Li Ancient Recent 2 3 0.6667 0.0696 0.0028 0.0003 0.6667 0.0702 0.4569 0.1000 0.2304 ** LF Ki Ancient Recent Ancient Recent 1 3 1 2 0.0000 0.2500 0.0000 0.0351 A koraholocén 0.0000 0.0000 populáció0.0938 genetikai 0.0014 diverzitása 0.2544 magasabb volt mint a ma 0.0000 0.0000 élı0.0002 populációé0.0351 0.0000 0.2458 0.0333 0.0036 0.0000 ns ns ** - significant at p < 0.01 * - significant at p < 0.05 ns not significant

MAXIMUM PARSZIMÓNIA FÁK A KLOROPLASZT DNS SZEKVENCIÁK ALAPJÁN İsi DNS szekvenciák

A LUCFENYİ KÉSİGLACIÁLIS ÉS KORAHOLOCÉN POLLEN AKKUMULÁCIÓS RÁTÁJÁNAK (PAR) IDİBELI VÁLTOZÁSA A BRAZI-TÓ ÜLEDÉKSZELVÉNYÉBEN Picea abies PAR (grains cm-2 yr-1) 10000 8000 6000 4000 2000 0 9 2200-0 8 3900-2200 7 7200-3900 6 9180-7200 5 10100-9180 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Age (kyr cal yr BP) 4 11100-10100 3 12800-11100 2 13900-12800 1 15000-13900 PAR zones positions Az ısi DNS of the minták adna pozíciója samples Populáció méret csökkenés A piros szaggatott vonal a PAR 3-tagú mozgó átlagát mutatja

A LUCFENYİ KÉSİGLACIÁLIS ÉS KORAHOLOCÉN POPULÁCIÓDINAMIKÁJA POLLEN, SZTÓMA ÉS MAKROFOSSZÍLIA ANALÍZIS ALAPJÁN Depth cm 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600 10000 11000 12000 13000 14000 15000 Picea abies (stomata) Timescale (cal yr BP) Picea abies (periderm) Picea abies (leaves) Picea abies (bud scale) Picea abies (pollen) 5 10 20 5 5 10 0 10 20 Relative frequency (%) Concentration (number of remains per 10 cm 3 ) Sum Trees Sum Shrubs 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Concentration (number of remains on slide) First accurrance of Picea abies on lakeshore Sum Herbs TDB-1 (1770 m) Age cal yr BP 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 Depth cm 200 300 Picea abies Corylus Early Holocene warming 11,700-10,820 8000 cal yr BP rapid increase in woody 400 cover, dense Larix forest around the lake Younger Dryas cooling 12,900-11,700 9000 cal yr BP regional expanison of Artemisia and Chenopodiaceae; decreasing tree cover on the lakeshore, but Picea abies survives 10000 500 Bolling/Allerod warming 14,450-12,900 cal yr BP; establishment of Pinus mugo,larix decidua, Pinus cembra and Picea abies on the lakeshore 11000 12000 13000 14000 Carpinus betulus Fagus Oldest Dryas cold phase > 14,450 cal yr BP lakeshore 15000 treless, 600 steppe tundra and alpine herbs (Soldanella, Primula) 0 10 20 0 10 20 30 0 10 20 30 0 10 20 A lucefnyı 13,900 évvel ezelıtt telepedett meg a Brazi-tó partján, a késıglaciálisban majdnem folyamatos a jelenléte, a Fiatal Driász lehőlési fázis egy rövid szakaszán fosszíliái hiányoznak a térségben ekkor is jelen van, de a tó partjáról visszahúzódik 200 300 400 500 Taul Zanogutii (1900 m) Picea 600 Holocén pollenszelvények a Brazitóból és a Zenóga-tóból. Arra utalnak, hogy a lucfenyı a Farcas hegységben et al. 1999 az elmúlt 11000 évben gyakori volt, de kiterjedése jelentısen fluktuált

A RETYEZÁT-HEGYS HEGYSÉG ÉS A KÖRNYEZ RNYEZİ TERÜLETEK TÁJHASZN JHASZNÁLATI TÉRK RKÉPE A lucfenyvesek korlátozott kiterjedést érnek csak el a Retyezáthegységben, az északi oldalon nagyobb az állomány A hegyi rétek és legelık kiterjedés nagy a déli oldalon, erdıirtás? Forrás: Grodzinska et al. 2004

A Lolaia gleccser maximális kiterjedése 16 ezer éve A lucfenyı hipotetikus refúgiumai a gleccserek maximális kiterjedése idején Reuther et al. 2007 Reuther et al. 2007 Taul dinte Brazi (1740 m) A lucfenyı koraholocén expanziójának iránya A genetikai, pollen EREDMÉNYEK- akkumulációs fosszilis pollen, KONKLÚZIÓK ráták sztóma 3 és makrofosszília drasztikus Adataink arra populációméret utalnak, adatok együttesen hogy csökkenést a koraholocén, hogy még az elmúlt a terjedıben lucfenyı 11000 a lévı hegységben, évben lucfenyı arra utalnak, rögzítettek valószínőleg (bottleneck). populáció genetikai Ezek alacsonyabb nagy diverzitása tszf magasságokban nagyobb volt mint élte a túl hegységben az utolsó valószínőséggel hozzájárultak a ma élı eljegesedés populációé, maximumát, és a koraholocén a késıglaciális lucfenyı populáció több mára expanzió genetikai kihalt allélt ezekbıl variabilitásának is hordozott. a lokális populációkból csökkenéséhez, indult és elképzelhetı meg. hogy több ısi alléltípus is áldozatául esett a hirtelen állománycsökkenésnek, melyek közül a legerısebb a középkorra tehetı (antropogén erdıirtások sorozata).

KONZERVÁCIÓ-BIOLÓGIAI KÖVETKEZTETÉSEK A Kárpátokban a hegység szabdalt morfológiájának következtében, kis területen változatos génállományú fapopulációk élnek (a fenyıfajok esetében a populációk genetikai differenciáltsága is jóval nagyobb itt mint az Alpokban!!!) Ezt a különösen gazdag génállományt fokozottan védeni kell a jövı érdekében! İsi és modern DNS adataink a pollen alapú demográfiai rekonstrukcióval kiegészítve arra utaltak, hogy az erdıirtások MÁR CSÖKKENTETTÉK A LUCFENYİ GENETIKAI DIVERZITÁSÁT A RETYEZÁT- HEGYSÉGBEN, ami a faj alkalmazkodóképességének a csökkenését is maga után vonhatja. Fontos tehát a meglévı állományok fokozott védelme, a természetes terjedés elısegítése a déli oldalon a legeltetés korlátozásával. KORAHOLOCÉN (11000 ÉVE) MAI ÁLLAPOT

KÖSZÖNÖM M A FIGYELMET! Támogatóink: European Commission (MERG-CT-2006-041088 041088 Combining palaeoecology and palaeogenetics ), OTKA PD73234