Molekuláris biológiai gyakorlatok - 1 MOLEKULÁRIS BIOLÓGIAI GYAKORLATOK Putnoky Péter PTE, TTK Genetikai és Molekuláris Biológiai Tanszék Tartalom Balesetvédelem 2. 3. DNS koncentráció meghatározás 10. Mikrobiális technikák 2. 4. Plazmid DNS preparálás, "miniprep" 11. Alapvető eljárások, eszközök 2. 5. Fizikai térképezés restrikciós enzimekkel 15. Gyakorlatok: 6. DNS fragmentek összekapcsolása 19. 1. Összes DNS tisztítás 4. 7. Gyors DNS tisztítás PCR reakcióhoz 21. 2. DNS agaróz gélelektroforézis 6. 8. PCR - Polimeráz láncreakció 23.
Molekuláris biológiai gyakorlatok - 2 A molekuláris biológiában egy-egy kísérlet kivitelezése napokat, olykor heteket vesz igénybe. A közbülső időben "vakon" dolgozunk, ezért különösen fontos a módszer leírások hű követése, az oldatok pontos elkészítése és olyan kontrollok alkalmazása, melyből utólag megtudhatjuk, hogy milyen köztes lépés nem volt esetleg sikeres. Egy egyszerűbb hallgatói gyakorlatot is nehéz a rendelkezésre álló néhány óra alatt végigcsinálni. Gondoljunk csak arra, hogy a különböző DNS, RNS és fehérje tisztítási eljárások sok lépésből állnak, időigényes centrifugálási, kromatográfiás és egyéb elválasztási munkafolyamatokat foglalnak magukba, a végén pedig a tisztítás eredménye is például egy több órás gélelektroforézis révén válik láthatóvá. Fontos, hogy a gyakorlatokra előzőleg alaposan felkészüljük, tisztában legyünk az egyes lépések értelmével és az esetleges veszélyekkel is. Balesetvédelem A gyakorlatok részletezésénél megtalálható a veszélyesebb vegyszerek felsorolása és a használatuk közben betartandó szabályok leírása. Több gyakorlatnál is alkalmazzuk az agaróz gélelektroforézis módszert. Az agaróz gél készítésekor, hűtésekor ügyeljünk, nehogy leforrázzuk magunkat. Az áramütés elkerülése érdekében tartsuk be az alapvető szabályokat: ne nyúljunk vizes kézzel a tápegységhez; ne próbáljunk belenyúlni az elektroforézis kádba, ha áram alatt van; csak csatlakoztatás után kapcsoljuk be és az elválasztás ( futtatás ) befejeztével, mielőtt a gélt kivennénk, kapcsoljuk ki a tápegységet. A második veszélyforrás a rákkeltő etídium bromid, amit az agaróz gélbe teszünk a nukleinsavak láthatóvá tételére. Az elektroforézis alatt a vegyszer egy része az elektroforézis pufferbe kerül! A gél kezelésekor mindíg viseljünk gumikesztyűt. Arra is ügyeljünk, hogy a szennyezett kesztyűvel ne fogjunk meg olyan tárgyakat, amikkel kesztyű nélkül is érintkezésbe kerülhetünk (pipetták, kapcsolók, kilincs... stb). Sokszor célszerű csak az egyik kezünkre kesztyűt húzni és azzal mozgatni a gélt, így a másikat szabadon használhatjuk az egyéb munkákra. A harmadik veszélyforrás az ultraibolya (UV) fényt kibocsájtó lámpa, melynek nem körültekintő használata súlyos égési sérülésekhez vezethet. Különösen veszélyes az UV fény a szemünkre (!) a gél megtekintésekor. Mindig hajtsuk rá a gélre az UV fényt át nem eresztő védőfedelet, mielőtt a lámpát bekapcsoljuk! Ha ez nincs, viseljünk védőszemüveget! A centrifugákat csak kiegyensúlyozott állapotban indítsuk el és ne próbáljuk a fedelüket addig kinyitni, amíg a rotor forog. Mindíg viseljünk köpenyt, ha szükséges gumikesztyűt! A laborasztalon ne tároljunk fölösleges dolgokat, táskát, könyveket! Élelmiszert a laborba behozni és ott étkezni tilos! Mikrobiális technikák A gyakorlatok többségénél baktériumsejtekkel dolgozunk. A baktériumok steril tenyészetét a mikrobiológia gyakorlatokon megismert módon állítjuk elő. A steril szükség esetén a megfelelő antibiotikumot tartalmazó komplett táptalajba (LB) előző nap délután egy baktériumtelepet szuszpendálunk oltókacs segítségével. Ez a telep a megfelelő antibiotikumot tartalmazó petricsészén egy telepre szélesztett baktériumtenyészetből származik. Az antibiotikum alkalmazása a fertőzés veszélyének csökkentése és a törzsben jelenlévő plazmid megtartása miatt szükséges. Számos plazmid könnyen "eltűnhet" a törzsből, ha nem alkalmazunk antibiotikum szelekciót. A beoltott folyadékkultúrát 32-37 o C-on, éjszakán át rázatjuk (levegő biztosítása) és a felszaporodott baktériumokat használjuk fel a további munkához (összes DNS és plazmid DNS tisztítás). A gyakorlatoknál használt oldatokat és műanyag eszközöket autoklávozással (30-45 percig) sterilizáljuk. Ezzel nemcsak az oldatban lévő mikróbákat, hanem az esetleges enzim szennyeződéseket is inaktiváljuk. A továbbiakban az oldatokkal a steril munka szabályainak megfelelően bánunk, megelőzve ezzel a szennyeződések bejutását. Ez nagyon lényeges! Gondoljunk csak arra, hogy a DNS munkában használt desztillált víz alga fertőzése több hetes munkánkat teheti tönkre, akár sokszázezer forint kár is okozva. Alapvető eljárások, eszközök Törzsoldatok - oldat csere A munka során sokszor szükséges a sóösszetétel és -koncentráció és/vagy a ph változtatására. Ezt részben úgy oldjuk meg, hogy a végkoncentrációhoz képest ötször- tízszer töményebb (5x, 10x) törzsoldatot készítünk és ezt adjuk megfelelő arányban a reakcióelegybe (pl. 5. gyakorlat). Sokszor a tárolás miatt is praktikus egy oldatot töményebben elkészíteni és csak a szükséges mennyiséget kihigítan (pl. elektroforézis puffer). Az 5x vagy 10x tehát azt jelenti, hogy az adott oldat ennyiszer töményebb, mint a kísérletben szükséges végkoncentráció. A sóösszetétel változtatás másik útja az, amikor a tisztítandó biomolekulából (DNS, RNS, fehérje, poliszacharid...) csapadékot képezünk, majd ezt, centrifugálás után, egy más összetételű oldatban oldjuk fel (pl. 1. és 4. gyakorlat). Ez a lépés egyben a biomolekula-oldat töményítésére is felhasználható.
Molekuláris biológiai gyakorlatok - 3 Műanyag eszközök A műanyag pipettahegyeket (tip) és Eppendorf csöveket autoklávozással sterilezzük. Mindegyik egyszer használatos, de nem filléres holmi. A sterilezés elsősorban az esetleges DN-áz szennyezés inaktiválásához szükséges. A kezünkön (verejtékben, nyálban... stb) DNS bontó enzimek is vannak, melyeknek nem szabad a kísérlethez használt oldatokba kerülniük. Ezért úgy kell mindent megfogni, hogy ezt elkerüljük. Sose érintsük meg a tip hegyét és az Eppendorf cső kupakjának belsejét vagy peremét. Kényesebb munkáknál a gumikesztyű használata is ajánlatos. Automata pipetta: Segítségével tudjuk kimérni az igen kis térfogatokat. Általában három pipettával le lehet fedni az 1 µl - 1000 µl tartományt. Drága és kényes eszköz. 40-80 ezer forint körül van egy pipetta ára, ezért is óvatosan bánjunk vele. Pipettázáskor először beállítjuk a kimérendő mennyiséget a pipetta csavarógombjával. Vigyázzunk arra, hogy csak a pipetta oldalán megadott tartományon belül változtassuk az értékeket, különben a pipetta tönkre megy! A műanyag pipettahegyet kissé megnyomva szorítsuk rá a pipettára és a nyomógombot az első ütközésig nyomjuk le. Így a pipettával a beállított értéket tudjuk majd felszívni. A hegyet a kimérendő folyadékba téve, óvatosan és nem hirtelen eresszük vissza a nyomógombot. A felszívott mennyiséget a nyomógomb lenyomásával pipettázzuk bele a megfelelő csőbe úgy, hogy most az első ütközési ponton túlnyomjuk a gombot a második ütközésig ("kifújás"). A használt tiptől a tip eltávolító gomb segítségével szabadulunk meg. Új oldatot mindig új tippel mérjünk szét! Vigyázzunk, hogy ne szennyezzük össze az oldatokat! Eppendorf centrifuga: Asztali centrifuga, mely a műanyag Eppendorf csövekben lévő anyagok elválasztására szolgál. Általában 12.000 fordulat/perc (rpm) sebességgel használjuk. Az olcsóbb modellek értéke is 400.000 Ft körül van. Csak kiegyensúlyozott állapotban indítsuk el (csövek a rotorban szembe és azonos térfogatra töltve, kupak lezárva, rotor fedő felcsavarva)! A csöveket számozottan, "füllel" fölfele helyezzük be. Ha kiegyensúlyozatlanságra utaló hangot hallunk, a fugát azonnal állítsuk le! Szabályos kiegyensúlyozás esetén is előfordulhat néha, hogy egy Eppendorf cső kilyukad és a folyadék kifolyik belőle. Ez is okozhat bajt. Elektroforézis tápegység: Az elektroforézishez szükséges egyenáramot biztosítja. Normál agaróz gélelektroforézisnél általában nem alkalmazunk 120 V-nál nagyobb feszültséget és 60-80 ma-nél nagyobb áramerősséget (TBE puffer használatakor). Az alkalmazott körülmények között a nukleinsavak, fehérjék negatív töltésűek, így az elektromos erőtérben a (+) pólus felé vándorolnak. Ügyeljünk a (+) és (-) pólusok csatlakoztatására! A tápegységet bekapcsolni csak a minták felvitele és a védőfedél felhelyezése után szabad! (lásd Balesetvédelem) Elektroforézis készülék Az átlátszó műanyagból készült, és platina elektródokkal ellátott elektroforézis kád (tank) és alkatrészei törékenyek. Pótlásuk költséges, ezért vigyázzunk, nehogy leejtsük vagy leverjük őket. A modernebb berendezéseket úgy tervezték, hogy ne lehessen beléjük nyúlni, ha áram alatt vannak, de régebbi készülék használatakor ez a veszély fennáll. Ügyeljünk erre! Sose vigyük fel a mintákat áram alatt lévő gélre! Ez a kísérlet pontosságát is jelentősen rontja! Labornyelv (laborszleng) A kutatómunka mindennapjaiban senki nem fogalmaz választékosan, a magyar nyelv szabályainak mindenben megfelelő módon. Ez csak körülményessé tenné a gyors információ cserét, de nem lenne érthetőbb. Leírt formában természetesen kerülendők az angol kifejezések, magyartalan megfogalmazások, de a munka során alkalmazzuk őket, ezért szerepelnek a jegyzetben is. Általában idézőjelek között. Így lesz a gélelektroforézis segítségével való elválasztásból "futtatás", az elektroforézis kádból "tank", a minták felvitelét szolgáló "zsebek" kialakítására használt eszközből "fésű". Ezeket is ismerni kell
Molekuláris biológiai gyakorlatok - 4 1. gyakorlat: Összes DNS tisztítás A genetikai információ hordozója általában a dezoxiribonukleinsav (DNS) illetve egyes vírusok estében a ribonukleinsav (RNS). Vírusoknál általában csak egy néhány komponensből álló fehérjeburok védi, prokariótáknál a kromoszómális DNS közvetlenül a citoplazmában helyezkedik el és a genom részét alkothatják a különböző természetes vagy mesterséges plazmidok is (lásd 4. gyakorlat). Ezzel szemben az eukarióta genom a citoplazmától membránokkal elhatárolt kompartmenekben található. Fő tömegét a sejtmagban elkülönült nukleáris DNS, míg kisebb hányadát a sejtorganellumokban (mitokondrium, kloroplaszt) lévő organelláris DNS adja. A DNS tisztítására genomikus géntárak készítéséhez, hibridizációs és PCR kísérletek elvégzéséhez van szükség. Az összes DNS tartalom kivonása különböző képpen kezdődhet, aszerint, hogy mi a DNS kinyerés célja és milyen mintából kívánjuk kivonni azt. Vírusok esetében a részecskék centrifugálással való összegyűjtése után a fehérjeburok eltávolításával (denaturálás, fehérje bontó enzimek) általában megfelelő tisztaságú DNS oldathoz juthatunk. Baktériumokból a sejtek lizozimmel (sejtfal bontás) történő kezelése és/vagy detergensekkel való feltárása és a szennyező fehérjék eltávolítása után nyerhetünk viszonylag tiszta DNS oldatot. Eukarióta minták esetében a feltárás homogenizátor vagy folyékony levegőben való lefagyasztás és szétdörzsölés és/vagy sejtfalbontó enzimek (pl. pektinázok) segítségével történhet. Ha kizárólag sejtmagi vagy organelláris DNS izolálása a cél, akkor egy detergensek nélküli, kíméletesebb sejtfeltárás után differenciál centrifugálás segítségével különíthetjük el a megfelő sejtalkotókat (sejtmag, mitokondrium, kloroplaszt) és csak ezek után kezdjük a DNS izolálást (pl. genomikus géntár készítés sejtmagból). Mind esetben fontos, hogy a feltárt sejtekből kiszabaduló DN-ázok aktivitását gátoljuk. Mivel minden DN-áz Mg 2+ ionokat igényel a működéséhez, ezért a DNS tisztításkor a kétértékű kationokat megkötő (keláló) etiléndiamin tetraecetsav (EDTA) általánosan alkalmazott gátlószer. Ezen kívül amikor csak lehet a mintákat mindíg 0 o C-on (jégen) tartjuk. A gyakorlaton a DNS-t a gyorsabb kivitelezhetőség kedvéért Escherichia coli baktérium HB101 jelű törzséból izoláljuk, mely egy nem patogén, a molekuláris biológiában kiterjedten használt laboratóriumi törzs. A baktériumokat centrifugálás után EDTA tartalmú oldatban szuszpendáljuk fel, majd a sejteket sodium dodecil sulphate (SDS, vagy nátrium lauril szulfát) segítségével tárjuk fel. Az SDS erős detergens, mely szétroncsolja a membránokat, a bakteriális sejtfalat is és denaturálja a fehérjéket. A keletkezett sejtlizátumban egy fehérjebontó enzim (pronáz) segítségével a fehérjék egy részét le tudjuk bontani. A pronáz az alkalmazott viszonylag alacsony (1%) SDS koncentrációra nem érzékeny és az SDS által denaturált fehérjéket hatékonyan hidrolizálja. A baktérium szuszpenzió a feltárás és pronáz kezelés hatására áttetszővé válik és a sejtekből kiszabaduló DNS miatt erősen viszkózus lesz. A hoszabb emésztés tisztább DNS mintát eredményez. A pronáz kezelés után a maradék fehérjéket (a már nem kívánatos pronázzal együtt) fenolozás segítségével távolítjuk el, a fenolt pedig az illékony kloroform segítségével vonjuk ki az oldatból. Ezek után a DNS-t a szennyezésként jelen lévő RNS-sel együtt etanol hozzáadásával denaturáljuk (labornyelven "kicsapjuk"). A csapadékot centrifugálással összegyűjtjük és ismét feloldjuk RN-áz enzimet tartalmazó oldatban. Az RN-áz a jelen lévő RNS szennyezést lebontja, így tiszta DNS oldatot nyerünk, mely a további kísérlethez restrikciós enzimmel való emésztés és agaróz gélelektroforézis általában megfelelő minőségű. Ha szükséges, a DNS minta etanollal való ismételt kicsapással vagy CsCl egyensúlyi ultracentrifugálással tisztítható tovább. Veszélyek: A fenol tartalmú oldatok szembe, bőrre, ruhára ne kerüljenek. Fenolozáskor a gumikesztyű használata kötelező! A csöveket gondosan zárjuk le! A kloroform erősen illékony, ezért pipettázása nehéz, fokozottan tűzveszélyes, nagyobb mennyiségben belélegezve bódító hatású. A centrifugálást kiegyensúlyozott rotorral a szabályoknak megfelelően végezzük! (lásd: Alapvető laboreszközök/ Eppendorf centrifuga) A kísérlet menete: (Előkészítjük a pronáz, az SDS és az RN-áz oldatokat) 1,5 ml baktérium kultúrát Eppendorf centrifugacsőben kb. 20 másodpercig ülepítünk (12000 rpm) a felülúszót leöntjük úgy, hogy minél kevesebb folyadék maradjon a csőben 300 µl TE (50:20) oldatban felszuszpendáljuk a sejteket (kémcsőkeverő vagy a pipetta segítségével) 100 µl 5% SDS - TE oldatot adunk a szuszpenzióhoz és fel-le forgatva összekeverjük
Molekuláris biológiai gyakorlatok - 5 100 µl előinkubált pronase oldatot adunk minden csőbe és forgatással elkeverjük inkubálás 1-3 órát 37 o C - on. Közben néhányszor fel-le forgatva meg kell keverni az oldatot. Az emésztés nyomán viszkózus, víztiszta DNS oldat keletkezik. fenolozás: 500 µl TE oldattal telített fenollal a mintát erősen, többször összerázzuk. Ez a DNS molekulákat is töri, de így könnyebb lesz pipettázni a mintákat. Ha nagy molekulasúlyú DNS preparálása a cél, a fenolozást kíméletesebben kell végezni. 5 perc centrifugálás után (12000 rpm) a felső fázist, több részletben, óvatosan pipettázzuk át új csőbe, lehetőleg fehér csapadék nélkül. Mivel az oldat viszkózus ezért óvatosan, a pipetta hegyet a felső fázis tetején tartva, kis adagokat felszívva végezzük a műveletet. Ha túl sok fehér csapadék kerül az utolsó pipettázás végén a pipettahegybe, azt eresszük vissza. 500 µl fenol-kloroform, majd 500 µl kloroform oldattal külön-külön ismételjük meg az előző két lépést, erős összerázással, centrifugálással és óvatos pipettázással a DNS-t kloroformozás után ismét egy új csőbe gyűjtjük össze és 2 térfogat abs. etanollal kicsapjuk. Először rárétegezzük az etanolt, majd óvatos forgatással, lassan keverjük össze a két fázist. A DNS ekkor egy erősen kocsonyás, áttetsző, részben fehér cseppet alkot, melyet egy pipettahegy segítségével átteszünk egy 500 µl 70%-os etanolt tartalmazó újabb csőbe. 5 perc centrifugálás után (12000 rpm) a felülúszót óvatosan leöntjük, a csövet nyitott kupakkal, fejjel lefele fordítva kicsurgatjuk, szárítjuk (még enyhén nedves maradjon a DNS csapadék! ) 100-200 µl H 2 O vagy TE (10:1) oldatban felvesszük a csapadékot. A tökéletes oldódáshoz több óra, esetleg nap kell, ezért a további munkát legkorábban másnap folytathatjuk. Addig a mintákat tegyük hűtőszekrénybe (5 o C) későbbi felhasználás : DNS minta emésztése restrikciós enzimmel és a keletkező fragmentek agaróz gélen való elválasztása (2. gyakorlat) Anyag és módszer: H 2 O: az elektroforézis puffereket, táptalajokat ioncserélt vagy desztillált vízzel készíthetjük. A DNS munkához szükséges többi oldatot molekuláris munkára alkalmas desztillált vízzel ( nagyon kis vezetőképességű, többszörösen ioncserél és/vagy desztillált víz) segítségével kell elkészíteni, mert az egyszerű ioncserélt víz sem elég tiszta, a bene lévő esetleges szennyeződések gátolhatják a DNS-munkában használt egyes enzimek működését. Egy rossz oldattal több hét munkáját is tönkre tehetjük! Általában steril oldatokkal dolgozunk. TE (50:20): 100ml oldathoz 0.6 g tris (50 mm), 0.74 g EDTA-Na2 (20 mm), ph: 8.0 (NaOH segítségével állítjuk be) TE (10:1): 10 mm tris, 1 mm EDTA, ph: 8.0 pronáz: 1 órán át 37 o C-on előinkubált, 2.5 mg/ml pronáz TE (50:20) oldatban kloroform: kloroform és i-amil alkohol 24:1 arányú keveréke (vegyi fülke alatt összemérve) fenol: TE oldattal telített, 8-hidroxi quinolin tartalmú fenol (ph: 7.0-8.0). Hűtőben, fénytől védve tároljuk. fenol-kloroform: az előzőek szerint készített fenol és kloroform 1:1 arányban keverve. Hűtőben, fénytől védve tároljuk. DNáz mentes RN-áz: A törzsoldat 10 mg/ml RNázt tartalmaz. A por alakban szállított enzimet 10 mm TRIS, 15 mm NaCl (ph 7.5) oldatban feloldjuk és forrásban lévő vízben 15 percig hőkezeljük (az RN-áz ezt a hőkezelést elviseli, míg a szennyezésként jelen lévő DN-ázok nem). Ezek után a törzsoldatot Eppendorf csövekbe szétosztva -20 o C-on tároljuk. A DNS mintákat a törzsoldatból steril desztillált vízzel higított 0,01-0,05 mg/ml RN-áz oldatban oldjuk fel. Ezt is -20 o C tároljuk. A használat előtt időben vegyük ki, hogy felolvadjon. Baktériumtörzs: A DNS tisztításához Escherichia coli K12 (nem patogén) baktériumtörzset használunk (HB101), amelyet előző este LB tápfolyadékba oltottunk, és éjszakán át 32 o C-on szaporítottunk el. DNS koncentráció meghatározás fotométerrel ( 3. gyakorlat)
Molekuláris biológiai gyakorlatok - 6 2. gyakorlat: DNS agaróz gélelektroforézis Az agaróz a D-galaktóz és a 3,6 anhidro L- galaktóz lineáris polimere. Tengeri moszatból izolálják. Az esetleges szennyezések jelentősen befolyásolhatják a használhatóságát. DNS elválasztásra, visszaizolálásra nem minden forgalmazott változat alkalmas. Az agaróz gél 0,6-2,0 %-os (vegyes %) koncentrációban használatos. Koncentrációtól függően alkalmas a különböző hosszúságú (molekulatömegű) DNS molekulák elválasztására. A megfelelő koncentrációjú agaróz gélben egy lineáris duplex DNS molekula vándorlási sebessége (és ezért az adott idő alatt a megtett út) fordítottan arányos a molekula tömegének logaritmusával. Praktikus okokból a tömeget a legtöbb esetben a molekula hosszát jellemző bázispár (bp) vagy kilobázispár (kb) mértékegységek helyettesítik. Lineáris molekulák ("fragmentek") esetében érvényes a következő táblázat: koncentráció: 0,6 % 0,9 % 1,5 % 2,0 % felbontás: 1-20 kb 0,5-7 kb 0,2-3 kb 0,1-2 kb A DNS ph 7 érték körül negatív töltésekkel rendelkezik, így az elektromos erőtérben a (+) pólus felé fog vándorolni. Az elválasztás annál jobb, minél lassabb a vándorlás. Az ismeretlen hosszúságú fragment nagyságát úgy határozhatjuk meg, hogy mellette ismert hosszúságú fragmenteket tartalmazó kontrollt "futtatunk" és ennek segítségével lemérve a vándorlási távolságokat kalibrációs görbét készítünk. A DNS fragmentek a gélben csak akkor láthatók, ha etidium bromid interkaláló festéket alkalmazunk és a gélt ultraibolya (UV) fénnyel megvilágítjuk. A DNS 260 nm, a bázisok közé ékelődött fluoreszcens festék 300 nm illetve 360 nm hullámhossznál rendelkezik elnyelési maximummal. A festék a gerjesztés hatására a látható tartományban bocsájt ki fényt (590 nm, narancspiros). Veszélyek: A festési eljárás több veszélyt hordoz magában. Az etidium bromid mutagén vegyület! A gélt csak gumikesztyűben szabad megfogni és biztosítani kell, hogy ne szennyezzünk össze semmit a munka során (gélöntés, futtatás, fotózás). A másik veszélyt az UV fény jelenti, mely akár komoly égési sérüléseket is okozhat. Csak védőálarc vagy szemüveg, illetve a védőlemez (UV fényt át nem eresztő műanyag) használatával szabad a gélt megtekinteni! (lásd még: Balesetvédelem) A kísérlet menete: A géltálca előkészítése: A tálca végeit szigetelőszalaggal lezárjuk vagy szigetelő "léceket" alkalmazunk (nagyobb tálca esetén). A minták felvitelét szolgáló "zsebek" kialakítására használt "fésűt" úgy helyezzük el, hogy az alja kb. 1 mm-re legyen a tálcától. Gél készítés: Kimérünk 1 g agarózt, 200 ml-es laborüvegbe tesszük és hozzáöntünk 100 ml 1xTBE puffert (1%-os gél). Mikrohullámmal 1-2 percig (szakaszosan) melegítjük. Vigyázzunk, ne forrjon ki! Ha már homogén és teljesen víztiszta, akkor kb. 50-60 o C-osra hűtjük és hozzáadjuk az etidium bromid oldatot (100 ml gélhez 100 µl 100 µg/ml-es oldat kell). Ha ezt elkevertük, akkor a gélt beleöntjük az előre elkészített géltálcába. Legalább 40 perc dermedési időt kell hagyni, mielőtt a "fésűt" és a szigetelő szalagokat (léceket) eltávolítjuk. A megszilárdult gélt behelyezzük az elektroforézis kádba úgy, hogy a puffer ellepje (kb. 1 cm-rel). A minták felvitele: A minta felvitele automata pipettával történik. Ez nagyon pontos és drága eszköz. Ennek megfelelően bánjunk vele! (lásd Alapvető eszközök / automata pipetta). A mintába kevert ficoll (lásd STOP oldat) teszi sűrűvé az oldatot, mely óvatosan a zsebbe pipettázva nem keveredik a futtató pufferrel, hanem a zseb aljára süllyed. A STOP oldat kék színe a brómfenolkék (BFB) festéktől ered. Ez olyan jelzőfesték, melynek vándorlási sebessége egy kb. 30 bp nagyságú fragmentével egyezik, így mindíg a "futtatási front" helyzetét jelzi. 1 %-os gél esetén a 200-300 bp fragmentekkel együtt fut (lásd a gél felbontó képességét). Az összes minta és a DNS kontroll felvitele után kezdhetjük meg az elválasztást. Előre elkészített minták : 1. plazmid DNS (CCC, OC, lineáris) 2. plazmid DNS linearizált 3. plazmid DNS (több fragmentre vágott) Ennél a mintánál kell a kalibrációs görbe szerkesztésével meghatározni a fragmentek nagyságát 4. λ PstI kontroll 5. összes DNS - EcoRI emésztés 6. összes DNS minta, emésztetlen
Molekuláris biológiai gyakorlatok - 7 Elektroforézis ("futtatás"): A minták felvitele után beállítjuk a megfelelő feszültséget. (minigél max. 60 V, nagy gél max 120 V, ha a gél hossza kb 80 mm). Friss puffer használatakor az áramerősség (ma) értéke kb. fele a feszültség (V) értékének. A tápegységet be- és kikapcsolni a feszültség szabályzó gomb "0" állásában szabad (a gomb óramutató járásával ellentétes irányban ütközésig csavarva), a DNS a (+) pólus felé vándorol! Ellenőrizzük a pólusokat! Az elválasztás akkor kész, ha a "front" helyzetét jelző festék (BFB) eléri a gél alját. Ez, a javasolt maximális feszültség mellett, géltől függően 2-3 órát vesz igénybe. Ha a gél a minták felvitelekor még nem szilárdult meg tökéletesen vagy túl nagy feszültséget alkalmazunk, akkor a futtatás értékelhetetlen lesz. Ne nyúljunk a pufferbe az áram rákapcsolása után! (lásd veszélyek és Balesetvédelem). Fotózás : Az elválasztás után a gélt a kiértékeléshez le kell fényképezni. Csak védőfelszereléssel! (lásd fennt). A kalibrációs görbét a (kinagyított) fénykép alapján készítjük el. A felvétel elkészítéséhez számos berendezés használható, kezdve a hagyományos fényképezőgéptől a digitális berendezésekig. Napjainkra a digitális képrögzítési módok terjedtel el, melyekkel könnyen megoldható a készült kép tárolása, kontrasztosítása, vágása. A Biológiai Intézetben egy UVP BioDoc It nevű videokamerával felszerelt rendszert használunk, mely papírképet és JPEG vagy TIF fájlt egyaránt képes készíteni (ára 1.7 millió Ft). A berendezés használatát a gyakorlaton ismertetjük. Kalibrációs görbe: A megfelelően nagyított fényképen lemérjük a fragmentek vándorlási távolságát (mm-ben) a kezdő pontoktól (zsebek). A nagyításon a 0,5 kb kontroll fragment zsebtől mért távolsága 100-150 mm legyen. Az ismert hosszúságú fragmentek által megtett utat (mm) ábrázoljuk szemilogaritmusos milliméter papíron vagy a fragmentek hosszának (kb) logaritmusához tartozó vándorlási távolságokat ábrázoljuk normál mm papíron. Az így elkészített görbe segítségével meg tudjuk becsülni az ismert utat megtett, de eredetileg ismeretlen nagyságú fragment hosszát. Minden egyes gél (kísérlet) esetében egyedi kalibrációs görbét kell készíteni még akkor is, ha a futtatási körülmények (agaróz koncentráció, gél méretei, alkalmazott feszültség és idő) hasonlóak voltak több kísérletben! A méret meghatározása még így is viszonylag nagy hibával lehetséges (akár 10 %), ami erősen függ a kísérlet kivitelezésétől. A gyakorlatban a megtett út nemcsak a fragment hosszától függ. Befolyásolja azt a felvitt DNS mennyisége és szennyezettsége is, így előfordulhat, hogy ugyanabban a kísérletben két mintában az azonos hosszúságú fragmentek által megtett út szemmel láthatóan is különbözik. Anyag és módszer: 5x TBE : törzsoldat (54 g TRIS, 27.5 g bórsav, 20 ml 0.5 M EDTA (ph:8.0) 1000 ml oldathoz), melyből higítással állítjuk elő az elektroforézis puffert. Az elektroforézisnél alkalmazott oldat 1x vagy 0.5x TBE. Az elektroforézis tankba öntött puffer több elválasztási kísérletben is felhasználható. STOP: Egy emésztési reakció leállítása 1/5 rész (ált. 16 µl DNS + 4 µl ) 5x STOP pufferral történik (loading vagy mintafelviteli puffernek is nevezik). Ezt a mintával "higítjuk" 1x koncentrációjúra. Az általunk használt berendezéseknél minigél esetében 10 µl, normál gélnél 20 µl minta fér a "zsebekbe". A pufferben lévő ficoll teszi sűrűvé az oldatot, mely óvatosan a zsebbe pipettázva nem keveredik a futtató pufferrel, hanem a zseb aljára süllyed. Az oldatban lévő EDTA meggátolja a Mg 2+ ionokat igénylő DN-ázok működését. A STOP puffer hozzákeverése nélkül a minták nem süllyednek le a zseb aljára! 5xSTOP: 10 % ficoll-400, 0.25 M EDTA ph 8.0, 0.2 % brómfenolkék (BFB) 20 ml 5x STOP oldat készítéséhez szükséges: 2 g ficoll, 10 ml 0.5 M EDTA ph: 8.0, 10-40 mg BFB és kiegészítjük 20 ml-re (elkészítés után az oldatot autoklávozni szokták) Agaróz gél: a megfelelő pufferben fel kell olvasztani az agarózt (kuktában vagy mikrohullámú sütőben). Az agaróz 0.7% - 2 % között használatos. Általában 1 %-os gélt öntünk. Kis DNS fragmentek (200-500 bp) szétválasztására 1.3-1.5 % gél alkalmas, míg a nagyobb fragmentek szeparálásához a 0.7-0.8 %- os gél használandó (lásd a táblázatot). Etidium bromid:! mutagén! Az oldat készítéskor kimérése kesztyűben, fehér papírlap felett történik. Oldatot hallgató nem készíthet! Fényérzékeny. Gélfestéshez 100 µg/ml törzsoldatot alkalmazunk (10 mg/100 ml H 2 O, hűtőben tároljuk). A készítendő agaróz gélbe a törzsoldatból annyi µl kell, ahány ml a felmelegített agaróz oldat (1000x -es higítás = 0,1 µg/ml végkoncentráció). Egyes laborokban a futtató pufferba is ugyanennyi etidium bromidot raknak, hogy a kicsi fragmentek is biztonságosan kimutathatók legyenek, DE ez
Molekuláris biológiai gyakorlatok - 8 általában csak további, fölösleges veszélyforrást jelent. Általában nincs is rá szükség, így mi sem alkalmazzuk. λ (lambda) fág DNS kontroll: Kontrollként általában a PstI vagy HindIII restrikciós endonukleázzal megemésztett λ fág DNS-t alkalmazzuk. A restrikciós fragmentek mérete kilobázispár (kb) mértékegységben a következő: PstI kontroll: 11,5 5,0 4,7 4.5 2,8 2,5 2,45 2,44 2,1 1,98 1,7 1,15 1,09 0,805 0,514 0,468 0,448 (0,339 0,264 0,247 kb... a kis fragmentek szokványos gélen nem láthatók) HindIII kontroll: 23,1 9,4 6,5 4,3 2,3 2,0 0,564 (0,125) kb Gene Ruler kontroll: 1000 bázispárnál kisebb fragmentek nagyságának meghatározásához használják (lásd PCR gyakorlat). A fagmentek mérete (FERMENTAS,SM0322) bázispárban (bp): 3000 2000 1500 1200 1031 900 800 700 600 500 (vastagabb sáv) 400 300 200 100 bp Táblázat a kalibrációs görbe adatainak feljegyzésére (másoljuk át a jegyzőkönyvbe) megtett út (mm) λ PstI kontroll fragment méret (kb) 11,5 5,0 4,7 4,5 2,8 2,5 2,45-2,44 2,1 1,98 1,7 1,15 1,09 0,805 0,514 0,468 ismeretlen DNS
Molekuláris biológiai gyakorlatok - 9 Szemilogaritmusos mm papír a kalibrációs görbe szerkesztéséhez (nyomtassuk ki külön és ragasszuk be a jegyzőkönyvbe)
Molekuláris biológiai gyakorlatok - 10 3. gyakorlat: DNS koncentráció meghatározás A tisztított DNS oldat koncentrációjának meghatározását fotométer segítségével végezhetjük el. A pontos koncentráció ismerete sok esetben előfeltétele a további munkának. Más esetekben elég, ha az agaróz gélen elválasztott DNS minta (fragment) intenzitását vetjük össze ismert koncentrációjú kontroll mintáéval és így becsüljük meg a mintában lévő DNS mennyiségét. A pontos meghatározás a DNS UV fényben mutatott abszorbcióján alapszik. Tiszta DNS oldat 260 nm-en rendelkezik elnyelési maximummal. Ennek meghatározásával kiszámíthatjuk az oldatban lévő DNS (RNS) koncentrációját az alábbi táblázat szerint : ahol C az oligonukleotid számított koncentrációja µm vagy pmol/ml-ben, A 260 a 260 nm hullámhosszon mért elnyelés és N az oligonukleotid hossza bázisokban. Mivel egy átlagos bázis molekulatömege 333, ezért a koncentrációt ng/mlben is kiszámolhatjuk a következő összefüggés alapján: C (ng/ml) = A 260 x 333 x N / 0,01 x N vagyis C (µg/ml) = A 260 x 33,3 (lásd a táblázatot) Vigyázzunk! A mérést általában nem az eredeti oldattal, hanem annak 10x - 50x higított változatával végezzük, tehát az eredeti koncentráció kiszámolásakor a higítás mértékét is figyelembe kell venni. kétszálú DNS egyszálú DNS RNS 1 A 260 = 50 µg/ml 33 µg/ml 40 µg/ml A kísérlet menete: Az 1. gyakorlatnál tisztított DNS mintából 10x és 20x higított oldatot készítünk eppendorf csövekben az alábbiak szerint : Mivel a DNS oldat nagyobb mennyiségű fehérjét is tartalmazhat szennyezésként, aminek szintén van UV fényben elnyelése, ezért a mérési eredmények nem mindíg tükrözik a valós koncentrációt. A fehérje szennyezettség meghatározására az oldat elnyelését 280 nm hullámhosszon is meg kell állapítani. Akkor tekinthetjük tisztának a DNS oldatot és reálisnak a 260 nm alapján számított koncentrációt, ha az A 260 / A 280 arány 1,8 és 2,0 között van. Ha túl sok a fehérje szennyezés, akkor a DNS mintát további fenolozással és alkoholos kicsapással vagy CsCl egyensúlyi ultracentrifugálás segítségével tisztíthatjuk tovább. Vigyázzunk, mert a DNS oldatban esetleg lévő RNS szennyezés szintén nagyon torzíthatja az eredményeket! Az RNS jelenlétét agaróz gélen ellenőrizhetjük. Eltávolítani DN-áz mentesített RNáz enzimmel lehet (lásd ez és az 1. gyakorlat). A mérést szintén zavaró nukleotidoktól alkoholos kicsapással szabadulhatunk meg. Sokszor szükség van egy oligonukleotid oldat koncentrációjának ismeretére (PCR és szekvenálás estén alkalmazott primerek, hibridizációs próbák készítése). Ilyekor alkalmazhatjuk a következő összefüggést: C (µm) = A 260 / 0,01 x N 10x 20x 180 µl H 2 O + 20 µl DNS 190 µl H 2 O + 10 µl DNS A mintákat kvarcküvettába téve először a 260 majd a 280 nm-hez tartozó elnyeléseket mérjük meg. A fotométert mindkét esetben desztillált vízre "nullázzuk". A mérési és számolási eredményeket az alábbi táblázatba írjuk be. Az A 260 /A 280 arány és a koncentráció kiszámolását csak az egyik higításnál kapott értékekkel végezzük el. Lehetőleg ott, ahol az A 260 0,8 és 0,05 között van. A táblázatot a jegyzőkönyvben készítsük el az alábbi minta szerint. DNS minta száma 10x híg A 260 = 10x híg A 280 = 20x híg A 260 = 20x híg A 280 = A 260 /A 280 = C = (µg/ml) C = (µg/µl)
Molekuláris biológiai gyakorlatok - 11 4. gyakorlat: Plazmid DNS preparálás - "miniprep" A plazmidok a kromoszómától függetlenül, önállóan replikálódó cirkuláris DNS molekulák, amelyek nagyon sok baktériumfajban természetes módon előfordulnak. Általában olyan, különleges tulajdonságokat kódoló géneket hordoznak, amelyek a környezethez való jobb alkalmazkodást segítik, de nem szükségesek minden körülmények között a gazdaszervezet életben maradásához (nehézfém rezisztencia, toxin termelés, antibiotikum rezisztencia, speciális anyagcsereutak, restrikciósmodifikációs rendszerek... ). Méretük a néhány kilobázistól (10 3 bp) a megabázis (10 6 bp) nagyságrendig terjedhet, azaz meghaladhatják egy kisebb baktériumkromoszóma méretét. Összehasonlításként a Treponema pallidum 1,14 Mb, az Escherichia coli 4.7 Mb, míg a Pseudomonas aeruginosa 6.3 Mb méretű kromoszómával rendelkezik. A nitrogénfixáló Sinorhizobium meliloti egy 3.5 Mb nagyságú kromoszóma mellett egy 1,4 Mb és egy 1,7 Mb nagyságú ún. "megaplazmidot" is hordoz. Egy plazmid általában több példányban fordul elő a sejtben, akár több száz kópia is lehet belőle egy kromoszóma mellett. Többféle, különböző plazmid is lehet ugyanabban a sejtben. Ha két plazmid nem képes egy sejten belül együtt megmaradni, replikálódni, azaz "nem összeférhetőek" (inkompatibilisak), akkor azokat azonos inkompatibilitási csoportba tartozónak mondjuk. A csoportba tartozás például incp, incq, incw... stb. a replikációs kontroll mechanizmustól függ. A plazmidok a baktériumsejtben kovalensen zárt, cirkuláris DNS molekulaként vannak jelen, melyek még önmagukra is fel vannak csavarodva. Ezt a formát CCC (covalently closed circular) formának hívjuk. Különböző enzimek vagy fizikai erők hatására törés keletkezhet az egyik szálon és ekkor a plazmid nyitott cirkuláris formát (OC, open circle) vehet fel. Durvább fizikai behatásra vagy restrikciós endonukleázok alkalmazásával a plazmid DNS lineárissá tehető illetve több lineáris fragmentté darabolható. A CCC, OC és a lineáris molekulák azonos hosszúság esetén is különböző sebességgel mozognak az agaróz gélben, illetve CsCl grádiensen is elválasztható a CCC és a többi forma. Napjainkban számtalan, in vitro rekombináns DNS technikával mesterségesen "összeállított" plazmid létezik, melyek a molekuláris biológia fontos eszközeivé váltak. A génizolálás, a DNS szekvenálás, a génexpresszió vizsgálata és fokozása terén egyaránt hasznos eszközök. Minden mesterséges plazmidon van legalább egy szelektálható marker, amely a legtöbbször egy antibiotikum rezisztenciát meghatározó gén, így a megfelelő antibiotikum segítségével a plazmidot tartalmazó sejtek kizárólagosan felnöveszthetők és a plazmidot nem tartalmazó (nem rezisztens) sejtek elpusztíthatók. Mivel a plazmidok a vizsgálni kívánt DNS szakaszok (gének) megsokszorozására (is) szolgálnak, ezért fontos, hogy tartalmazzanak olyan egyedi restrikciós enzim hasítóhelyeket, melyek a beépítést (végső soron a "klónozást") lehetővé teszik. Általában előny, ha a plazmidnak nagy a kópiaszáma, mert így viszonylag kevés sejtből nagy mennyiségű plazmid DNS tisztítható és ezáltal a "klónozott" DNS is nagy mennyiségben áll rendelkezésre a további munkához. Hasznos az is, ha a beépített DNS szakasz meglétének valamilyen "látható" vagy szelektálható következménye van (a lacz gén vagy a tetr gén alkalmazása). Napjainkban a klónozás és szekvenciameghatározás céljából az egyik leggyakrabban használt plazmid a pbluescript, melynek felépítése az 1. ábrán látható. A gyakorlat során felnövesztjük a plazmidot tartalmazó E. coli törzset, a megfelelő antibiotikum jelenlétében. A plazmid DNS által kódolt antibiotikum rezisztenciára való szelekció nélkül esetleg a plazmid "elveszhet" a sejtekből a sok osztódás során. Eppendorf csőben a sejteket lecentrifugáljuk és a felülúszó eltávolítása után felszuszpendáljuk egy EDTA (etilén diamin tetraecetsav) tartalmú pufferben. Az EDTA a DNS lebontását végző enzimek inaktiválásához szükséges. Megköti (kelálja) a Mg 2+ ionokat, melyek a DN-ázok működéséhez elengedhetetlenek. A felszuszpendált sejteket NaOH - SDS tartalmú lúgos oldattal feltárjuk. A lúgos közegben a DNS denaturálódik, a szálak elválnak egymástól. A lineáris fragmentekre töredezett kromoszómális DNS komplementer szálai szabadon el is távolodnak egymástól, de a CCC formában jelen lévő plazmid DNS-nél ennek fizikai akadálya van, hiszen a komplementer két gyűrű egymásba fonódik. A denaturálás után egy savas, tömény Na-acetát oldattal hirtelen semlegesítve a ph-t a kromoszómális DNS és sok fehérje kicsapódik, míg a plazmid DNS és az RNS oldatban marad. A plazmidok komplementer szálai ugyanis gyorsan reasszociálnak. Centrifugálással eltávolítva a kromoszómális és fehérje csapadékot a plazmid DNS-t (és a számunkra szennyezésként jelen lévő RNS-t) akoholos kicsapással tisztítjuk tovább, több lépésben. A végén az RNS szennyezést RN-áz enzim segítségével elbontjuk, így viszonylag tiszta, restrikciós enzimekkel már emészthető plazmid DNS preparátumot kapunk.
Molekuláris biológiai gyakorlatok - 12 Veszélyek: Az etanol és izopropanol mérgező, tűzveszélyes. Tartsuk be a centrifugálás szabályait (lásd a bevezető fejezeteket)! A kísérlet menete: (rövidítések: cf = centrifugálás, O/N = over night, egy éjszakán át, 0 o C = jeges vízben, et-oh = etanol, tf = térfogat) 3 ml tápfolyadékban (LB + antibiotikum) leoltani a baktériumot - O/N 32-37 o C rázatás 1.5 ml baktériumot Eppendorf csőben kb. 20 másodpercig centrifugálunk (cf), majd a felülúszót leöntjük, a maradék cseppeket eltávolítjuk 100 µl TEG-ben szuszpendálni a baktériumokat (kémcső keverő vagy pipetta segítségével) 200 µl NS hozzáadása után jól összekeverni (fel-le fordítgatással) az oldatot 5 min., 0 o C inkubálás 150 (160) µl 0 o C-os NaAc és erős rázással keverni (egyenként, minden csövet, pelyhes csapadék keletkezik) 5 min., 0 o C inkubálás a mintáknak megfelelően közben új csöveket számozunk meg és 320 µl i-propanolt pipettázunk mindegyikbe a kivált SDS-es csapadékot lecentrifugáljuk és a felülúszót (kb. 400 µl) az új csövekbe öntjük az i-propanollal a DNS oldatot jól összekeverjük és 0 vagy -20 o C-on, 5 min. vagy O/N inkubáljuk cf 5 min., felülúszó leöntése mosás 75 % et-oh (400 µl), szárítás 100 µl TRIS-Ac oldatban feloldani a csapadékot ismét kicsapás : + 200 µl et-oh, 5 percig szobahőn áll 5 cf, mosás, szárítás + 30-50 µl H 2 O - RNase (50-100 µg/ml) oldatban feloldani a csapadékot A plazmid minipreparátum további tisztítása (a gyakorlaton nem végezzük el) A szekvenáló reakciókhoz általában tisztább DNS szükséges, mint a restrikciós emésztésekhez. Az alábbi eljárás az ABI automata szekvenáló rendszernél jól használható DNS mintát eredményez. Ha egy restrikciós enzimmel nem tudjuk a preparátumot megemészeteni, akkor is alkalmazhatjuk a következő tisztítási lépéseket. 0,1 tf. 10% SDS (5 µl 50 µl DNS-hez) és 1 tf. 7,5 M NH 4 -acetát 0 o C-os (55 µl 55 µl DNA-SDS oldathoz) 15 min. jégen áll cf 5 min. és a felülúszót azonnal átpipettázni új csőbe hozzáadni 0,6 tf. i-propanolt és 20 min. -20 o C cf, mosás, szárítás és felvenni a DNS-t 40 µl H 2 O -ban * * * Restrikciós endonukleáz emésztés: Egy emésztéshez 1-10 µl DNS oldat használható, a tisztított plazmid DNS kópiaszámától függően. pbs származék pbr, puc prk (kozmid klón). (lásd 5. gyakorlat) Anyag és módszer 1 µl /50 µl preparátum 2-5 µl /50µl preparátum 10 µl /30 µl preparátum Az oldatok készítéséhez 3x desztvizet használunk! TEG: 50 mm glükóz, 25 mm Tris, 10 mm EDTA, ph:8.0 (HCl), sterilezni NS: 0.2 N NaOH, 1 % SDS, frissen készítve 2 N NaOH és 5 % SDS oldatból vagy műanyag flaskában tárolni hosszabb távra! NaAc: 3 M NaAc, ph.:4.8, ecetsavval állítani a ph-t TRIS-Ac: 50 mm Tris, 100 mm NaAc, ph.: 8.0 (ph állításhoz HCl) i-propanol (100%-os) et-oh (etanol) A nukleinsavak kicsapásához 96-100 % oldatot használunk. A csapadék mosásához 70-75 %-os oldat (H 2 O-val) alkalmazandó. RNase törzsoldat (DNáz mentes RN-áz!) 10 mg/ml - 10 mm TRIS, 15 mm NaCl, ph 7.5, oldatban feloldani és forrásban lévő vízben 15 percig hőkezelni. A DNS mintákat a törzsoldatból steril desztillált vízzel higított 0,01-0,05 mg/ ml RN-áz oldatban oldjuk fel. Baktériumtörzs: A plazmid DNS tisztításához Escherichia coli K12 (nem patogén) baktériumtörzset használunk, amelyet előző este LB + ampicillin (100 µg/ml) tápfolyadékba oltottunk, és éjszakán át 32 o C-on szaporítottunk el. A törzs a pbs plazmid (1. ábra) egy származékát tartalmazza. Lásd később.
Molekuláris biológiai gyakorlatok - 13 DNS preparálás - alapműveletek DNS kicsapás: tizopropanollal: + 0.1 térfogat (tf) 3 M NaAc (ph 7.0) + 0.6 tf i-propanol etanollal : + 0.1 tf 3 M NaAc (ph 7.0) + 2 tf et-oh A csapadék képződést az alacsony hőmérséklet elősegíti, ezért az alkohol adása és az oldat összekeverése után jégbe vagy mélyhűtőbe tesszük a mintákat. (kis mennyiség esetén minimum 20 perc állás szükséges) cf 5 perc, 12.000 rpm, "mosás, szárítás" DNS csapadék "mosás" : Minden kicsapás után cf és mosás következik. A lecentrifugált DNS-ről leöntjük az alkoholos oldatot és leitatva a maradék folyadékot a csöveket fejjel lefelé papírtörülközőre tesszük. A maradék alkohol kifolyása/ leitatása után 200-400 µl 70%-os et-oh oldattal ( st H 2 O-val készíteni! ) körbemossuk a csövet (a csapadék maradjon a helyén). - Ha a csapadék látszik rövid cf után a felülúszót kiöntjük és szárítás, - ha nem látszik, akkor 5 perc cf után a felülúszót lehetőleg óvatosan öntsük ki, + szárítás. DNS tárolás: Kisebb méretű plazmid DNS preparátumokat mélyhűtőben (rövid távon hűtőben), nagyobb méretű DNS (kozmid klón, fág DNS, kromoszómális DNS) hűtőben és nem fagyasztva célszerű tárolni. DNS csapadék "szárítás" : A lecentrifugált DNS-ről leöntjük az alkoholos oldatot és leitatva a maradék folyadékot a csöveket fejjel lefelé papírtörülközőre tesszük. A maradék alkohol kifolyása / leitatása után vagy szobahőn vagy 37 o C-os termosztátban elpárologtatjuk a látható maradék folyadékot ( ne aszaljuk órákig a csapadékot, mert rosszabbul oldódik utána!
Molekuláris biológiai gyakorlatok - 14 1. ábra : A pbluescript plazmid felépítése. Az MCS (multi clonong site) szakasz az egyedi restrikciós hasítóhelyeket tartalmazza. Ennek a szakasznak a DNS szekvenciáját részletezi az ábra jobb oldala, a felhasználható restrikciós enzimek feltüntetésével. rep - replikációs origó bla - béta laktamáz gén (ampicillin rezisztencia) lacz - béta galaktozidáz gén eleje (alfa fragment), ami lehetővé teszi az inszert DNS jelenlétének (a béta galaktozidáz enzimaktivitás hiányának) detektálását IPTG és X-gal tartalmú táptalajon - lásd 9. gyakorlat
Molekuláris biológiai gyakorlatok - 15 5. gyakorlat: Fizikai térképezés restrikciós enzimekkel A restrikciós endonukleázok (röviden restrikciós enzimek) a kettős szálú DNS molekula meghatározott bázissorrendű szakaszait ismerik fel és ha az nincs a megfelelő módon metilálva akkor mindkét láncot egy adott ponton hidrolizálják ("hasítják"). A II. típusú restrikciós enzimek leggyakrabban 4-es vagy 6-os ún. palindrom szerkezetű (pontszimmetrikus) felismerőhellyel rendelkeznek és azon belül, az enzimre jellemző módon hasítanak. A keletkezett DNS fragmenteknek a hasítás következtében tompa végük (blunt end) vagy ragadós végük (cohesive vagy sticky end) lesz. Példa erre a SmaI enzim, melynek felismerési helye a 5'-CCCGGG-3' szekvencia és a hasítás nyomán tompa végű fragmentek keletkeznek: 5'--CCCGGG--3' --CCC GGG-- 3'--GGGCCC--5' --GGG CCC-- Az EcoRI nevű restrikciós enzim a 5'-GAATTC-3' szekvenciát ismeri fel és a reakció során keletkező fragmentek 5' túlnyúló ragadós véggel rendelkeznek. 5'--GAATTC--3' --G CTTAA-- 3'--CTTAAG--5' --AATTC G-- (Minden nukleotidszekvenciát 5-3 irányban kell felírni. DNS esetén is elég csak a felső szál szekvenciáját feltüntetni, hiszen az meghatározza a vele komplementer alsó szál bázissorrendjét is. Tehát egy restrikciós endonukleáz felismerőhelyét pontosan megadja a GAATTC betűsor, de a II. típusú enzimek esetében a GAA szekvencia is elégséges a palindrom szerkezet miatt. A hasítás helyét a felismerési helyen belül egy aposztróf jellel szokás feltüntetni: G AATTC.) A rekombináns DNS technika egyik lényeges eleme, hogy a restrikciós enzimek segítségével előállított, különböző eredetű DNS fragmenteket egymással össze tudjuk kapcsolni. Ez legegyszerűbben a "kompatibilis" - egymással tökéletes bázispárosodásra képes - ragadós végek felhasználásával tehető meg (6. gyakorlat). A plazmidok (4. gyakorlat) felfedezésével és a különböző célokra kifejlesztett mesterséges vektorok segítségével mód nyílt meghatározott DNS-szakaszoknak nagy mennyiségű felszaporítására ("DNS klónozás") és további elemzésére (pl. fizikai térképezés, DNS szekvencia meghatározás, hibridizáció). mennyi és milyen hosszúságú fragmentre hasítja az adott DNS-t (egyes emésztések). Ezek után, a megfelelő enzimeket párokba állítva (kettős emésztés), hasítjuk az adott DNS-szakaszt és a keletkezett fragmentek számából, méretéből következtetünk a két restrikciós enzim hasítóhelyeinek egymáshoz viszonyított elhelyezkedésére. Célszerű olyan enzimeket választani, melyek az adott szakaszon belül csak néhány helyen hasítanak, különben túl sok kombinációt kell megvizsgálni (lásd a Fizikai térképezés példát). A térkép elkészítését segítheti az egy enzimmel végzett részleges emésztés is, ahol két (esetleg több) egymás mellett lévő fragment hosszúságának megfelelő molekulák is megjelennek az emésztési képen. A részleges emésztés eredményeként létrejövő fragmentek méretének meghatározása révén megtudhatjuk, hogy milyen DNS fragmentek vannak egymás mellett a vizsgált DNS szakaszon belül. A legpontosabb fizikai térképet a DNS-szekvencia ismeretében szerkeszthetjük meg, amikor számítógép segítségével emésztési kísérletek nélkül pontosan kikereshetjük az össze ismert hasítóhelyet. A fizikai térképpel egyeztetjük a genetikai térképet akkor, amikor egy adott gén vagy géncsoport helyzetét genetikai, molekuláis biológiai kísérletek segítségével (komplementáció, irányított mutagenezis) a restrikciós térképen belül meghatározzuk. Egy gén (kódoló régió) elhelyezkedéséről, szerkezetéről teljesen pontos képet csak a DNS szekvencia meghatározása után, számítógépes elemzés (lásd bioinformatika) és további biológiai kísérletek révén kaphatunk. A mindennapi munkában sokszor csak azt kell megállapítani, hogy egy ismert fizikai térképű plazmidba milyen irányban épült be egy ismert fizikai térképű DNS-szakasz ("inszert"). Ezt nevezzük orientáció meghatározásnak. Szintén az egyszerűbb feladatok közé tartozik, amikor egy transzpozonnak ("ugráló gén" vagy inszerciós szekvencia) egy ismert DNS szakaszon belül elfoglalt helyzetét akarjuk meghatározni. A gyakorlaton ilyen eseteket vizsgálunk. Veszélyek: Tartsuk be a centrifuga használat szabályait (lásd a bevezetőt)! A fizikai (vagy restrikciós) térkép egy adott DNS szakaszon belül a restrikciós endonukleáz hasítóhelyek egymástól való távolságának és sorrendjének ábrázolása. Egy DNS szakasz fizikai térképének elkészítése a szakaszon belüli "tájékozódás", a további molekuláris munka előfeltétele. A fizikai térkép készítésekor először meghatározzuk azt, hogy egy restrikciós enzim
Molekuláris biológiai gyakorlatok - 16 A kísérlet menete: A pbs plazmid HindIII helyére (1. ábra) beépítettük a Tn5 transzpozonból (2. ábra) kivágott HindIII fragmentet, mely egy kanamicin rezisztencia gént hordoz. A plazmid DNS tisztításnál felhasznált PP2833 törzs tartalmazza az egyik illetve PP2834 a másik orientációjú fragmentet hordozó rekombináns plazmidot. A fizikai térképek ismeretében válasszunk ki olyan restrikciós enzimeket, melyekkel a HindIII fragment beépülésének irányát (a Km R gén orientációját) meg tudjuk állapítani. Végezzük el az emésztést a kiválasztott enzimmel és az emésztési kép alapján állapítsuk meg, hogy a tisztított plazmidok milyen orientációban tartalmazzák a HindIII fragmentet. Eco52 I Hinc II Sac II Xho I Eco52 I Not I Pst I HinD III Bgl II Eco52 I Pst I Sph I Sma I Pst I Sal I Acc I Hinc II Xho I Hinc II Bam H I Sac II Sac II BstX I Acc I Bgl II HinD III Pst I Eco52 I Not I Xho I Sac II Hinc II Eco52 I 250 500 750 1000 1250 1500 1750 2000 2250 2500 2750 3000 3250 3500 3750 4000 4250 4500 4750 5000 5250 5500 5750 IS50L neo ble str IS50R 2. ábra: A Tn5 transzpozon fizikai-genetikai térképe. Anyag és módszer: Restrikciós enzimeket ma már számos cég forgalmaz. Áruk az enzim tisztításának nehézségi fokától függően változik. Általában egy egység (U) ára 1 és 100 Ft között van, így az enzimet tartalmazó cső akár 100 ezer Ft értéket is képviselhet. 1 U enzim 1 óra alatt 1 µg DNS-t képes megemészte ni. A forgalmazott enzimek általában 10 U/µl koncentrációjúak, ezért higítani kell őket. Az emésztéshez megfelelő sóösszetételű és ph értékű puffert kell használni, melyet általában 10x-es töménységben mellékelnek az enzimhez. Az ideális puffer 1x tömény és az emésztés ideális hőmérséklete általában 37 o C. A megfelelő puffer és hőmérséklet kiválasztásához a forgalmazó cég katalógusaiban illetve az enzim dokumentációjában találunk adatokat. Az enzimeket szigorúan -20 o C-on tároljuk, Eppendorf csövekben (gyári kiszerelés). Használat esetén jég közé téve a csövet kivesszük a megfelelő mennyiséget, és utána az enzimet azonnal visszatesszük a mélyhűtőbe. Egy preparátum, megfelelő kezelés esetén, több évig is aktív marad. Emésztéshez általában 0.2-0.5 µg plazmid DNS és 1-2 µg össz DNS preparátumot kell felhasználni (a szokványos agaróz géleken ez a mennyiség jól látható). Az emésztéshez használt enzim mennyiségét úgy kell megválasztani, hogy az emésztés ideje alatt minden lehetséges felismerési helyen biztosan hasítson. Ha ez nem következik be, akkor részleges emésztési képet kapunk, melyen több fragment szerepel, zavarva a kiértékelést (fizikai térképezésnél jelenthet hasznos információt is). A megfelelő enzim mennyisége általában reakciónként 1-2 U. Össz DNS preparátumnál ennek kétszerese is adható. Plazmid miniprep esetén, ha az a 4. gyakorlatnak megfelelően készült, a plazmid kópiaszámától függően 1-10 µl DNS szükséges egy emésztéshez. Az emésztés összeállításához segítséget nyújt a következő táblázat. V (µl) e (µl) (A) pbs (pbluescript származékok) 50 1 (B) pbr322, puc és rokon 25 2 (C) prk és plafr kozmid klónok 30 10 V = 1,5 ml baktériumból készített preparátum térfogata; e = egy emésztéshez javasolt térfogat
Molekuláris biológiai gyakorlatok - 17 A reakciók összemérése : (A),(B) típus: (A) esetén 1 µl, (B) esetén 2 µl DNS-t mérünk az előre megszámozott Eppendorf csövekbe. (Minden preparátumnál és oldatnál új tipet használjunk!) 15 µl enzim mix-a1 oldatot adunk minden csőhöz enzim mix-a: 9/10 rész steril H 2 O 1/10 rész 10x enzim puffer, keverjük össze (cf) és ebbe mérjünk annyi enzimet, hogy minden 15 µl végtérfogatra (emésztésenként) 1 U jusson, majd ismét keverjük össze (cf) keverés (cf) és inkubálás 37 o C-on, legalább 1 órát (C) típus: 10 µl DNS + 1 µl 10x pufferrel összekeverünk (cf) enzim mix-c: 9/10 rész steril H 2 O 1/10 rész 10x puffer keverjük össze (cf) és ebbe mérjünk annyi enzimet, hogy minden 4 µl végtérfogatra (emésztésenként) 1 U jusson, majd ismét keverjük össze (cf) keverés (cf) és inkubálás 37 o C-on, legalább 1 órát Tanácsos 10%-kal vagy 1-2 reakcióval több "enzim mix"-et készíteni, hogy biztosan elég legyen. Inkubálás: általában 37 o C, 1-3 óra. Vannak enzimek, melyek alacsonyabb vagy magasabb hőmérsékletet igényelnek - lásd a FERMENTAS táblázatokat vagy az enzim leírását. STOP: a reakció leállítása 1/5 rész 5xSTOP puffer hozzáadásával történik (loading vagy mintafelviteli puffer). Ha emésztés után nem a "futtatás" a cél, akkor ne adjunk STOP oldatot a reakcióhoz, hanem azonnal tegyük a csövet: (1) -20 o C-ra vagy (2) 15 percig 68 o C-ra és utána -20 o C-ra vagy (3) csapjuk ki a DNS-t alkohollal (lásd 4. gyakorlat: DNS alapműveletek) Ez attól függ, hogy mi a preparátummal a további célunk. A DNS mintákat hűtőben vagy mélyhűtőben célszerű tárolni. 5xSTOP: lásd 2. gyakorlat Gélelektroforézis: A megemésztett mintákat TBE pufferrel készült 1 %-os agaróz gélre visszük. Kontrollként PstI enzimmel emésztett lambda DNS-t alkalmazunk (lásd 2. gyakorlat). 4 µl enzim mix-3
Molekuláris biológiai gyakorlatok - 18 Fizikai térképezés - példa Egy plazmid fizikai térképét kell elkészíteni. Ehhez egyes és kettős emésztéseket végeztünk és a fragmenteket agaróz gélen elválasztva a 3. ábrán látható emésztési képeket kaptuk. Az I és II kísérlet eredményei segítségével szerkessze meg a plazmid fizikai térképét, azaz határozza meg az EcoRI, BamHI és HindIII restrikciós enzimek hasítási helyeinek sorrendjét és egymástól való távolságát. Rajzolja fel a hasítóhelyek elrendeződését a 3. ábrán található körre. Eco Bam Eco+Bam Hind Eco+Hind Bam+Hind 11 8,0 7,0 6,0 5,0 6,0 4,0 3,8 3,0 3,2 3,2 2,0 2,0 1,2 0,8 3. ábra: Egy plazmid DNS emésztési képe EcoRI, BamHI, HindIII enzimekkel való egyes és kettős emésztések és agaróz gélen való elválasztás után. A kalibrációs görbe segítségével meghatározott méreteket a fragmentek mellé írtuk. (Ezek mért értékek. Eltérhetnek az elméletileg számítottól, tükrözve a kísérlet hibáját.)
Molekuláris biológiai gyakorlatok - 19 6. gyakorlat: DNS-szakaszok összekapcsolása (ligálás) A DNS klónozás során restrikciós enzimmel, esetleg fizikai tördeléssel előállított DNS fragmenteket építünk be "egyenként" valamilyen vektor molekulába. A vektor molekula és a klónozandó (elszaporítani kívánt) fragment találkozása az oldatban véletlenszerű, nem irányítható, csak az utólagos szelekcióra, a számunkra fontos termék kiválogatására van lehetőségünk. A vektor és a beépítendő (inszert) DNS közötti kapcsolódást általában a "kompatibilis" ragadós végek biztosítják. A vektor és az inszert DNS találkozása esetleges, összekapcsolódásuk még a megfelelő ragadós végek esetén is rövid ideig tart. A kötésben részt vevő komplementer bázispárok által létrehozott hidrogénhidak nem tudják hosszabb ideig a kapcsolatot stabilizálni. A tompa végekkel rendelkező fragmentek együtt maradását még ezek az erők sem segítik, így ez valóban csak pillanatszerű esemény. Ahhoz, hogy a vektor-inszert páros valóban egy kör alakú molekula legyen, kovalens kötéseknek kell kialakulnia a DNS lánc mindkét szálán és mindkét csatlakozási ponton. Ezt a reakciót katalizálják a DNS ligáz enzimek, melyek tehát a restrikciós endonukleázokkal ellentétesen a cukor-foszfát gerinc folytonosságát állítják helyre, egy 3'-OH és egy 5'-P DNS vég közötti foszfodiészter kötés kialakításával. A reakció a következő szerint összegezhető: 5' -----pg -OH papaptptpcp--- -----pcptptpapap OH-Gp--- 5' 5' ----pgpapaptptpcp--- ----pcptptpapapgp--- T4 DNS ligáz Mg 2+ ATP A kovalens kötés a két láncon külön-külön reakció eredményeként jön létre. Az enzim aktiválása az ATP molekula enzim-amp + PPi köztes lépésen keresztül valósul meg. Az ATP csak az energiát szolgáltatja! Nem datp! Lényeges, hogy az összekapcsolandó fragmentek 5' végein a DNS szál foszforilálva legyen, máskülönben nem alakul ki a kovalens kötés (lásd a vektor foszfatáz kezelése az "üres" vektor molekula keletkezésének megakadályozására). A gyakorlatban a T4 fág által kódolt DNS ligáz használata terjedt el, mert ezt lehet könnyen és nagyobb mennyiségben tisztítani. Ma már számos más enzimmel együtt a T4 ligázt is, expressziós vektor segítségével, egy megfelelő baktériumtörzsben termeltetik. A ligáz aktivitás ellenőrzésére a HindIII restrikciós enzimmel feldarabolt lambda fág DNS-t használjuk (a keletkező fragmentek méretét lásd a 2. gyakorlat leírásánál). Az enzim a 5'-AAGCTT-3' szekvencia első adeninje után hasít, tehát a keletkező fragmentek 5' túlnyúló ragadós véggel rendelkeznek. A megemésztett DNS-t etanollal kicsaptuk (lásd 4. gyakorlat - DNS preparálás - alapműveletek) és desztillált vízben oldottuk fel, hogy a restrikciós enzimtől és az emésztéshez szükséges sóktol megtisztítsuk. Ugyanis a ligáz működéséhez más reakciókörülmények szükségesek (lásd a T4 ligáz puffer összetételét). A gyakorlat során agaróz gélen jól látható mennyiségű DNS-t teszünk a ligálási reakcióba, így a molekulák összekapcsolódását gélelektroforézis segítségével követni tudjuk. A ligáz enzim hozzáadása után 2, 5, 10 és 20 perc elteltével veszünk mintát, így nyomon követhetjük a reakció előrehaladását. Kontrollként ligáz enzimet még nem tartalmazó (0 perces) mintát használunk. Tökéletes ligáláskor az eredeti HindIII restrikciós fragmentek eltűnnek és egy átlagosan nagy molekulatömegű, a fragmentek random összekapcsolódásával kialakult DNS populáció keletkezik. Előfordulnak kisebb molekulatömegű fragmentek is, melyek egy fragment cirkuláris molekulává kapcsolódásával vagy néhány fragment egymáshoz kapcsolódásával keletkeznek. Ezek aránya függ a reakcióban részt vevő DNS koncentrációjától. Veszélyek: Tartsuk be a centrifugálásra, az agaróz gélelektroforézisre és fotózásra vonatkozó szabályokat (lásd az előző fejezeteket)!
Molekuláris biológiai gyakorlatok - 20 A kísérlet menete: Elkészítjük a ligálás ellenőrzéséhez, a DNS minták elválasztásához szükséges 1 %-os agaróz gélt TBE pufferben és 40-60 percet hagyjuk dermedni. A kísérlethez 5 eppendorf csőre lesz szükség. A 20 jelű csőben állítsuk össze az alábbi táblázatban megadott ligálási reakciót, az enzim nélkül. Az üres csövekbe tegyünk 4 µl 5xSTOP oldatot. A reakcióhoz szükséges: perc H 2 O DNS 5x LIG T4 ligáz (0,2 µg/µl) puffer 1 U/µl 0 9 µl 2 µl 3 µl - 2 " " " 0,5 µl 5 " " " 0,5 µl 10 " " " 0,5 µl 20 " " " 0,5 µl 45 10 15 2,5 Anyag és módszer: T4 DNS ligáz enzim (1u/µl), Tárolni - 20 o C-on kell. Enzimaktivitás: Az aktivitás két különböző módon is meghatározható. (1.) Cohesive-end ligation unit. Megközelítőleg 1 U az az enzimmennyiség, mely 1 µg HindIII enzimmel vágott lambda DNS 50%-át, 30 perc alatt, 16 o C-on képes összeligálni. (Ennél precízebb a pontos meghatározás). A gyakorlatnál ezt a unit definíciót használjuk. (2.) A Weiss unit kísérletes meghatározása alapvetően más módon történik. 1 Weiss unit nagyjából 200 hagyományos egységnek felel meg. Az enzimaktivitást a NaCl vagy a KCl nagyobb koncentrációban gátolja (200 mm). Vegyünk ki 15 µl oldatot, és tegyük a 0 jelű csőbe. Adjuk a maradék oldathoz a T4 ligázt, és a megfelelő időpontokban vegyünk ki 15 µl újabb mintát a számoknak megfelelő csövekbe. Jól keverjük össze és a csöveket tegyük 68 o C-ra. 5x LIG puffer: 200 mm Tris, 50 mm MgCl 2, 50 mm dithiotreitol (DTT), 2.5 mm ATP (ph.:7,8) Az utolsó csőbe 20 perc elteltével mérjünk 4 µl 5x STOP oldatot, és a mintákat PstI enzimmel emésztett lambda DNS kontrol mellett vigyük az agaróz gélre. Gélelektroforézis. 60-80 V, 2 óra