Optika A fény egyrészt - fizikai jelenség: energiát szállító elektromágneses hullám, amely az anyaggal való kölcsönhatáskor részecske természetű; a részecske a foton, amelynek energiája ε = h f, h=6.6*10-34 Js, a Planck-féle állandó, f a hullám rezgésszáma. másrészt: szubjektív érzet, amely a látás és fény- és színérzékelés élettani folyamatiban jön létre Geometriai optika Alapfogalmai absztrakciók eredményei Fényforrások lehetnek méretük szerint pontszerűek, vonalasak és kiterjedtek, illetve elsődlegesek (fénykibocsátók) és másodlagosak (az elsődlegesek által kibocsátott fényt verik vissza) Fénynyaláb A rés szűkítésével lehet eljutni a fénysugár fogalmához. Térszög (dω ) definíciója: az r sugarú gömbfelületen a df felület elemet elosztjuk a sugár df négyzetével: dω = r, a mértékegysége a szteradián (sr). 4πr A teljes térszög ω = = 4π r Abszolút fekete test definíciója Az abszolút fekete test az összes ráeső sugárzást elnyeli. Megvalósítható oly módon, hogy egy üreg belsejét jól abszorbeáló fekete festékkel bevonják. Az üreg falán van egy nyílás. Ez a nyílás lesz az abszolút fekete test, hiszen a nyílásra eső sugárzás az üreg belső falán többszörös visszaverődés során teljesen elnyelődik, azaz a nyíláson nem jut ki. Kísérleti megvalósítása a Planck-sugárzó Felület normális vektora: A felülethez az adott pontban érintő síkot rajzolunk és az érintési pontban merőlegest állítunk a síkra. Ebbe az irányba mutató egységvektor lesz a felület normális vektora.
1. Fényerősség, I mértékegysége: 1 candela (cd): az 1/60 cm felületű, 04 K hőmérsékletű abszolút fekete test fényerőssége a felületre merőleges irányban. SI alapmennyiség Illetve, újabban a 04 K megvalósításának nehézségei miatt 1 candela a fényerőssége annak a fényforrásnak, amely 1 sr térszögbe 1/683 joule energiát sugároz ki 1 s alatt 540*10 1 Hz frekvencián 1. Sugárzáserősség, I e az egységnyi térszögbe kisugárzott teljesítmény mértékegysége: 1 W/sr. Fényáram, φ a fényerősség és a térszög szorzata: dφ = I * dω, mértékegysége 1 lumen = 1 cd *1 sr pontszerű fényforrás esetén: φ = I ω a fényárammal kifejezve a fényerősség: egységnyi térszögbe kibocsátott fényáram.. Energiaáram, φ e sugárzási teljesítmény dφ e = I e * dω mértékegysége: 1 W pontszerű fényforrás esetén: φ e = * ω I e 3. Fénysűrűség, B a fényt kibocsátó felületelem (df) fényerősségének (I) és a felületelem látszólagos nagyságának a hányadosa ϑ a felületelem normálisa és a kibocsátott fénysugár által bezárt szög I B = df *cosϑ 3. Energiasűrűség, B e az energia-kibocsátó felületelem (df) sugárzáserősségének (I e ) és a felületelem látszólagos nagyságának a hányadosa B e I e = df *cosϑ mértékegysége: 1 W / (sr m ) mértékegysége 1 nit = 1 cd / 1 m, illetve 1 stilb = 1 cd / 1 cm
4. Megvilágítás, E a df' felületelemre érkező, dω térszögű fényáram (d φ ) és a felületelem hányadosa df' *cos ϑ' E d I * φ I * dω r I *cos ϑ' = = = = df' df' df' r mértékegysége 1 lux = 1 lumen / 1 m 4. Besugárzottság, E e a df' felületelemre érkező, dω térszögű dφ e energiaáram és a felületelem hányadosa I df ' *cos ϑ' dφ e I e * dω e E r I e cos ϑ' e = = = = df' df' df' r mértékegysége: 1 W / m ϑ a df felület elem normálisa és a kibocsátott fényáram iránya közötti szög ϑ ' a megvilágított df' felületelem normálisa és a megvilágító fényáram iránya közötti szög. Fényforrásokat jellemző értékek: fényerősségek: 40 W-os izzólámpa fényerőssége 30 cd 500 W-os izzólámpa fényerőssége 1500 cd 50 W-os vetítőizzó fényerőssége 700 cd fénysűrűségek: Hold 0.3-1 stilb (sb) Nap 10 5 stilb wolfram izzószál 500-3500 stilb gyertya 1 stilb Törvényszerűségek 1. Lambert-féle 1. cosinus-törvény: I fényerősségű fényforrástól r távolságban a megvilágítás I E = r cos ϑ ', ahol ϑ' a megvilágított felület normálisa és a beérkező fény iránya közötti szög.. Lambert-féle. cosinus-törvény: ha egy df felületelem fényerőssége merőleges irányban I o, akkor ϑ irányban I ϑ = I 0 * cosϑ. a felületelem fénysűrűsége pedig I I * cos I B = ϑ o ϑ o ϑ = = = B const. df * cosϑ df * cosϑ df =, azaz a fénysűrűség független az iránytól. Ez az abszolút fekete testre igaz, de sok más fényforrásra is jó közelítéssel fennáll. Pl. a Napot is egyenletes fénysűrűségűnek látjuk. Azok a fényforrások, amelyekre a Lambert-f.. cosinus-törvény igaz, a Lambertféle sugárzók.
Egy Lambert-sugárzó df felületelem és egy df' megvilágított felületelem között a fényáram:!! df * cosϑ dφ = I * dω = B * df * cosϑ * = r!! df * cosϑ * df * cosϑ = B * r a. oldalon levő ábra alapján. Fotometriai mennyiségek mérése Vizuál fotometria A világosság érzetet keltő inger a vizuális világosság, H, az egy csapra érkező fényáram. Pontszerű fényforrás esetén a H arányos az I/r mennyiséggel. Ebben az esetben a kép nagysága a szemben kisebb, mint egy csap területe. Kiterjedt fényforrásra a H a B-vel arányos. A különböző világosságérzetek összehasonlítására a Weber-Fechner pszichofizikai törvény érvényes, azaz az érzeterősség az ingererősség logaritmusával arányos: világosságérzet erőssége = const * log (B/B o ) ahol a B o az ingerküszöb, a még észlelhető legkisebb fénysűrűség, B o =10-7 / π stilb. Izokromatikus fotometria Ismeretlen fényerejű, monokromatikus, pontszerű fényforrás fényerejének, I x -nek a meghatározásához az ismeretlen fényforrással és egy ismert fényerejű (I i ) fényforrással azonos megvilágítást hozunk létre. Az abszolút fekete test előállítása általában túl bonyolult, ezért ismert sugárzású, a fekete testhez hitelesített, ún. normál lámpákat használnak ismert fényerejű fényforrásként. A Ritchie-féle fotométernél egy vízszintes csőben levő gipsz prizma két lapját világítjuk meg a két fényforrással. A két prizmalap megvilágítását egy függőleges csövön keresztül figyeljük meg. A két lap azonos megvilágítását az r értékek változtatásával érjük el. Amikor a két lapon azonos a megvilágítás, akkor a prizma felső éle eltűnik.
I Azonos megvilágításkor: r I = r i x i x Fényforrások teljes fényáramát az Ulbricht-féle gömbbel lehet meghatározni. A gömb belseje jól reflektáló fehér festékkel van bevonva. Az E ernyő az A felületet eltakarja a fényforrásból közvetlenül érkező fénysugarak elől. Az A felületre csak diffúz fényvisszaverődéssel érkező fénysugarak jutnak. Az A felület megvilágításából a fényforrás teljes fényáramára, illetve fényerősségére lehet következtetni: φ = dφ = Id ω Heterokromatikus fotometria Különböző színű fényforrások csak akkor hasonlíthatóak össze, ha a színük a színképben közel van egymáshoz. Például, ha egy vörös és egy zöld fényforrást akarunk összehasonlítani, akkor először a vörös fényforrást egy narancssárga fényforráshoz hasonlítjuk, majd a narancssárgát egy sárgához és a sárgát pedig a zöld fényforráshoz. Az összehasonlítást villogó fotométerekkel lehet megvalósítani. Egy ernyőt felváltva világítanak a meg a két fényforrással. Növelve a frekvenciát egy bizonyos frekvenciánál megszűnik a színvillogás. Ekkor a két fényforrás keverék színe látható. Ezután gyengítve az egyik fényforrás fényerejét megszűnik a fényvillogás is. Ekkor a két fényintenzitás megegyezik. Sugárzás mérés (energia mérés) A fénysugárzás energiáját a fényelnyelést követő hatások alapján lehet meghatározni. Hőhatáson alapuló eszközök Termoelemek: a termoelem egyik hegesztési pontját megvilágítva a kérdéses fényforrással, a hegesztési pont elnyelve a megvilágító fénysugárzást felmelegszik. A felmelegedés következtében a termoelemben feszültség keletkezik, ami arányos a felmelegedés mértékével, azaz az elnyelt fényenergiával. A termoelem felépítése és működése: két fémhuzalt - egy A és egy B fémből készült huzalt - összeforrasztunk, vagy összehegesztünk a C és a D pontban.
Ha a C és a D pont különböző hőmérsékletű, T 1 és T, akkor a V voltmérő U feszültséget mutat, ami a T -T 1 hőmérsékletkülönbség függvénye: U = α1 *( T1 T ) + α *( T1 T ) +... Az α 1 és az α a termoelemet alkotó fémek fajtájától függő anyagi állandó, a termoelem hitelesítésével határozhatóak meg. A gyakorlatban T -t 0 C-nak választják és akkor a T 1 -T helyett a C pont hőmérséklete szerepel C-ban. Ha a hőmérsékletkülönbség kicsi, akkor elegendő csak az első fokú tagot figyelembe venni. Termisztorok: A termisztorok speciális félvezetők, amelyeknek az ellenállása exponenciálisan csökken, ha növekszik a hőmérsékletük. Hitelesítés után az ellenállás változásból a hőmérsékletváltozásra lehet következtetni. B R = R et 0 R a termisztor ellenállása T abszolút hőmérsékleten, R o és B konstansok (hitelesítéssel határozhatóak meg), e a természetes alapú logaritmus alapszáma. A hőhatáson alapuló energiamérő eszközöket mindig sugárzási egyensúlyban használhatjuk Fényelektromos hatáson alapuló eszközök A fényelektromos hatás szerint bizonyos fémekből megvilágítás hatására elektronok lépnek ki. A megvilágító foton energiája hf, ahol h a Planckállandó, f pedig a fényhullám frekvenciája. Az energia-megmaradás törvénye szerint: hf = A + 1/ m e v e, ahol A az elektron kilépéséhez szükséges munka, m e a kilépő elektron tömege, v e pedig a sebessége. Fotocella A fotocella egy vákuumcső, amelynek katódjából (K) fény hatására elektronok lépnek ki, amelyek az anódra (A) mennek a pozitív feszültség következtében fellépő vonzóerő miatt. Az R ellenálláson eső feszültséget mérve következtethetünk a megvilágító fénysugárzás energiájára. Fotoelektronsokszorozó A fotoelektronsokszorozó, vagy fotomultiplier katódjából szintén fényelektromos jelenség következtében elektronok lépnek ki megvilágítás hatására. A katóddal szemközti elektród (D 1 ) pozitív feszültségű a katódhoz képest és olyan anyagból készül, amelyből egy elektron beütközése egynél több elektront lök ki. Az ide belépő elektronok hatására több elektron lép ki, mint
amennyi beérkezett, azaz a kilépő elektronok száma sokszorozódik. A D elektród pozitívabb, mint a D 1, a D 3 elektród pozitívabb, mint a D,stb. Az elektródokat dinódáknak is nevezik, több tíz dinóda is lehet egy vákuumcsövön belül. Így egyetlen foton is mérhető elektromos áramot hoz létre az R ellenálláson. Az R ellenálláson fellépő feszültség értékéből a fotókatódra érkező megvilágítás energiájára lehet következtetni megfelelő hitelesítés után. A fotomultiplier fotonszámlálásra is alkalmas. Fotóellenállások: Kadmiumszulfid, ólomszulfid ellenállása megváltozik megvilágítás hatására. Az ellenállás-változás alkalmas a megvilágító fénysugárzás energiájának a meghatározására. Fényelemek : vannak olyan kristályos anyagok, amelyekben megvilágítás hatására töltésszétválás jön létre. Az így kialakult elektromos tér jellemzi a megvilágító fény energiáját. Összefüggés a fotometriai mennyiségek és az energiaáramot jellemző mennyiségek között Mind a fotometriai φ, I, B és E mennyiségek, mind a φ e, I e, E e és B e mennyiségek függnek a megvilágító fény hullámhosszától ( λ ), illetve attól, hogy milyen d λ hullámhossztartományban határozzák meg őket. Az energiamérő eszközöket egy spektrális érzékenység is jellemzi: i s( λ) =, φ ahol i a mért elektromos áram, φ e az energia áram, λ a hullámhossz. Egy fényforrás d λ hullámhossztartományban kibocsátott fényárama dφ = φ dλ fotometriai módszerekkel meghatározható, a kibocsátott energia áram dφ eλ = φ eλdλ a d λ hullámhossztartományban pedig energiaméréssel meghatározható. A dφ λ φ λdλ Kλ = K mvλ = = dφ eλ φ eλdλ hányados értékét úgy határozták meg, hogy sok száz egészséges szemű emberrel végzett összehasonlítás alapján megkapták a K m =683 lumen/w konstans értékét és a V λ láthatósági függvényt. A láthatósági függvény maximuma világosra adaptált szemnél 555 nm-nél van, sötétre adaptált szemnél a rövidebb hullámhosszak irányába tolódik el. 1W teljesítménynek 683 lumen felel meg. e λ λ λ
A fényforrás teljes energiaárama: φ = λ 1 φ λ e λ d eλ λ λ a teljes fényárama pedig: φ = φλdλ λφ λ λ λ = K V d 1 λ1 m e. Az energiamérő eszköz érzékenységét, s( λ )-t célszerű a V λ -hoz igazítani.
Fénytörés Ha a fény egyik közegből egy másik közegbe lép akkor a fényhullám terjedési sebessége megváltozik. Ha a fény terjedési iránya a két közeg határfelületére merőleges, akkor a fény terjedési iránya nem változik meg - amennyiben a közeg optikai szempontból izotróp. Ha azonban a fény terjedési iránya az 1 közegben α szöget zár be a két közeg határfelületére merőleges beesési merőlegessel, akkor a közegben olyan β szöget zár be a beesési merőlegessel, amelyre n 1 = sin α sinβ, ahol n 1 a közeg törésmutatója az 1 közegre nézve. Ez a Snellius-Descartes fénytörési törvény. A Huygens-Fresnel elv szerint - egy hullámfelület minden pontja elemi hullámok kiindulópontja és a megfigyelt hullámfelület az elemi hullámok szuperpozíciója - belátható, hogy az n 1 felírható a terjedési sebességek hányadosával is, meg a hullámhosszak hányadosával is: c1 fλ 1 λ1 n1 = = = c fλ λ, ahol c 1, és c, illetve λ 1 és λ a fényterjedési sebessége az 1 és közegben, illetve a fény hullámhossza az 1 és közegben, f pedig a fényhullám frekvenciája. Ha az α nagyobb, mint β, akkor az 1 közeg optikailag ritkább, a közeg pedig optikailag sűrűbb. Ha az α értékét növeljük 90 -ig, akkor a β értéke is nő egészen az sin90 1 n1 = = sinβ sinβ összefüggés által meghatározott β h értékig. Ez azt is jelenti, hogy a közegben nincs olyan fénysugár, amely a β h nagyobb szög alatt érkezne az 1 közegből. Ha a fény a közegből megy az 1 közegbe, akkor pedig, a β h -nál nagyobb beesési szögeknél teljes visszaverődés lép fel. h h
Optikai lencsék leképezési törvényei Gyűjtő lencsék (domború lencsék) és szóró lencsék (homorú lencsék) vázlatos jelölése: Nevezetes sugarak a gyűjtő lencsénél: A: az optikai tengellyel párhuzamos sugarak a lencsén áthaladva a fókuszpontban (F-ben) gyűlnek össze. B: a párhuzamos sugarak (de az optikai tengellyel nem párhuzamosak) a lencsén áthaladva a fókuszsíkban gyűlnek össze. C: az optikai középponton (O-on) áthaladó sugarak irányváltozás nélkül haladnak át a lencsén. D: a fókuszpontból kiinduló sugarak a lencsén áthaladva az optikai tengellyel párhuzamosan haladnak tovább. Nevezetes sugarak szórólencsénél: A: az optikai tengellyel párhuzamosan beérkező sugarak a lencsét elhagyva úgy haladnak tovább, mintha a fókuszpontból (F) indultak volna. B: a párhuzamos sugarak (de az optikai tengellyel nem párhuzamos sugarak) a lencsén átjutva úgy haladnak tovább, mintha a fókusz sík egy pontjából indultak volna. C: az optikai középponton (O) áthaladó sugarak irányváltozás nélkül haladnak át a lencsén.
Képalkotás a gyűjtőlencsénél: a. ha a tárgy a kétszeres és az egyszeres fókusztávolság között van a. A keletkezett kép valódi (egy tárgypontból kiinduló sugarak a lencsén való áthaladás után metszik egymást), fordított állású és nagyított. T: a tárgy, illetve a tárgy nagysága K: a kép, illetve a kép nagysága t: a tárgy távolság k: a képtávolság f: a fókusztávolság b. ha a tárgy a fókusztávolságon belül van A keletkezett kép egyenes állású, látszólagos (egy tárgypontból kiinduló sugarak a lencsén áthaladva nem metszik egymást, széttartóak) és nagyított. A képet a széttartó sugarak meghosszabbításakor létrejött metszéspontban látjuk. A leképezés törvénye szerint a tárgytávolság, a képtávolság és a fókusztávolság között az összefüggés: 1 1 1 = + f t k A nagyítás: N k K = = t T Ha a kép látszólagos, akkor a képtávolság, illetve a kép negatív és így a nagyítás is negatív.
Képalkotás a szórólencsénél: Szórólencsével a keletkezett kép mindig egyenes állású, látszólagos és kicsinyített. A lencse fókusztávolsága és a görbületi sugarai között a következő összefüggés áll fenn: 1 ( n 1) 1 1 = +, f r r 1 ahol n a lencse anyagának a törésmutatója. Ha a görbület domború, akkor r pozitív, ha a görbület homorú, akkor az r negatív, azaz a homorú lencse fókusztávolsága negatív. D = 1 mennyiséget - ha f méterben van mérve - dioptriának nevezzük. f Több lencséből álló lencserendszernél a dioptriák összeadódnak: D=D 1 +D +... A törésmutató mérése Oldatok, folyadékok törésmutatójának mérése Abbe-féle refraktométerrel A refraktométerben két prizma helyezkedik el. A két prizma között vékonyrétegben helyezkedik el a vizsgálandó oldat. Az felső a megvilágító prizma, amelynek a felülete matt. Ezt a prizmát megvilágítva a matt felületen keresztül minden irányba kerül fénysugár a vizsgálandó oldatba. Az oldat alatt helyezkedik el a mérő prizma, amelynek a törésmutatója nagy (1,5-1,7). Az oldatból a fény a mérőprizmába lép be, de a fénytörés miatt csak β h szögnél kisebb szög alatt. A mérő prizmából β h félnyílásszögű kúpban kilépő sugarakat egy gyűjtőlencse fókuszsíkjára képezzük le. A fókuszsíkban képződő világos és sötét terület határfelületét figyeljük meg egy távcsövön keresztül. A világos mező átmérője növekszik, ha a β h szög értéke nő. Ha a
távcsőben egy skálát is elhelyezünk, akkor a β h értéke, vagy közvetlenül a törésmutató értéke olvasható le. Általában a törésmutató skála mellett egy másik skála is látható, amelyik a törésmutatónak megfelelő szárazanyag-tartalmat mutatja %-ban. Törésmutató mérésének gyakorlati alkalmazása: megfelelő hitelesítés után - oldatok törésmutatójának mérése, a törésmutató értékéből az oldat koncentrációját lehet meghatározni - növényi zsírok, olajok törésmutatójának mérése, a törésmutató értékéből a tisztasági fokot lehet meghatározni - szuszpenziók törésmutatójának mérése, a törésmutató értékéből a szárazanyag tartalmat lehet meghatározni. Az anyagok törésmutatójának az értéke erősen függ a hőmérséklettől, ezért a refraktométerekben (törésmutató-mérőkben) a mérendő anyag hőmérsékletét termosztálással állandó értéken tartják. A leolvasott szárazanyag-tartalmat a hőmérséklet értékének megfelelően korrigálni kell korrekciós táblázatok segítségével. A moláris refrakció: R n 1 M =, ahol n a törésmutató, M a molekula tömeg, ρ a sűrűség. n + 1 ρ A törésmutató függ a megvilágító fény hullámhosszától. Általában a Na D vonalára adják meg az n értékét. A Na D vonala 598 nm hullámhosszú fény. Általában a törésmutató értéke csökken, ha nő a hullámhossz abban a spektrális tartományban, ahol az anyag nem nyel el fényt. Abban a spektrális tartományban, ahol az anyagnak az abszorpciója, ott a törésmutató értéke jelentékenyen nő a hullámhossz növelésével. Mivel a törésmutató értéke függ a fény frekvenciájától, illetve hullámhosszától, ezért a törési szög is függ a hullámhossztól. Ezt a jelenséget használják fel a spektroszkópiában, hogy az összetett fehér fény hullámhossz - szín - szerinti felbontását létre hozzák. Például a prizmáknál:
Száloptika Az üvegszál belsejében a fény mindig teljes visszaverődést szenved, ha a beesési szöge (α ) nagyobb, mint a határszög. Száloptika alkalmazása az élelmiszeriparban: Hőmérsékletmérés mikrohullámú térben. Mikrohullámú térbe fémtartalmú anyagot nem lehet tenni, mert a fémek elnyelik a mikrohullámot és a fém annyira felmelegszik, hogy elpárolog. Az üvegszál végére egy olyan kristályt helyeznek, melyiknek a színe hőmérsékletváltozás hatására megváltozik. Az üvegszálon keresztül ezt a kristályt megvilágítják egy vékony fénysugárral, majd a visszavert fénysugarat vizsgálva a kristály színe megállapítható. A kristály színének ismeretében a hőmérséklet megadható. Ez a hőmérséklet mérési módszer a mikrohullámú térben a melegítés során alkalmazható. A melegített anyagban az egyenlőtlen hőmérséklet-eloszlás meghatározható.
Fény és anyag kölcsönhatása A fény-anyag kölcsönhatásban általában a molekulák külső pályákon, azaz viszonylag kisebb energiájú pályákon levő elektronjai vesznek részt. Egy molekula általános elektron energia rendszere a következő: Mind az alapállapotban, mind a gerjesztett állapotban az elektron energia felhasad a molekula rezgéseinek következtébe ún. rezgési nívókra, illetve ezek tovább hasadnak forgási nívókra. Az alap és a gerjesztett állapot közötti energiakülönbség, ε e 1 3eV. (1 ev energia amikor egy elektron töltés, 1.6*10-19 C, gyorsul 1 V feszültség hatására, azaz 19 1eV = 1.6 *10 J ), a rezgési nívók közötti energia különbség, ε r 0.1 0. 01eV, a forgási nívók közötti energiakülönbség, ε f 0.01 0. 001eV. Az egyes energia állapotok közötti átmenetek valószínűségét, illetve megengedett vagy tiltott voltát a kvantummechanika törvényei adják meg. Az elektron energia átmenetek a látható fény tartományába esnek, a rezgési és forgási átmenetek az infravörös tartományba. A molekulák olyan látható, vagy infravörös fotont képesek elnyelni, vagy kibocsátani, amelyeknek az energiája a különböző energiaszintek közötti energiakülönbségeknek felelnek meg. Ha megmérjük az elnyelt, vagy
kibocsátott sugárzás spektrumát, azaz a hullámhossz, vagy frekvencia szerinti eloszlását, akkor az elnyelő vagy kibocsátó anyagot azonosítani lehet. A vizsgált anyag - levél, alma, répa, burgonya, stb. - felületére érkező fénysugár részben visszaverődik (A), részben behatol a szövetbe és onnan verődik vissza (B), részben elnyelődik a szöveten belül (C), részben szóródik (D) és részben törés után áthalad a szöveten keresztül (E): Fényvisszaverődés A szabályos visszaverődésnél (reflexió) (A) a beesési szög megegyezik a visszaverődési szöggel. A reflektált intenzitás függ a beesés szögétől. Merőleges beesésnél, és gyengén abszorbeáló közegnél a reflexiós koefficienst - a visszavert fényintenzitás a megvilágító teljes fényintenzitáshoz képest - Fresnel adta meg: ( n n ) R = 1 ( n + n1 ), ahol n a visszaverő közeg törésmutatója, n 1 a környezet törésmutatója. Merőleges beesésnél és erősen abszorbeáló közegnél a reflexiós koefficiens értéke: R = ( 1) ( ) n n + K n + n + K 1, ahol K = kλ és k a Lambert-féle abszorpciós törvényben szereplő abszorpciós tényező, λ a 4π megvilágító fény hullámhossza. A vizsgált objektum belsejéből történő visszaverődésnél (B) a visszavert fény diffúz, azaz mindenirányban megfigyelhető. Ez a visszavert fény elsősorban az objektumon belüli fényszórásról, illetve visszaverődésekről hordoz információt. A teljes visszaverődés vagy reflexió a szabályos és diffúz visszaverődés együttesen. Ezt a már említett Ulbricht-féle integráló gömbbel lehet megmérni. Ahogy nő az abszorpció úgy nő a Fresnel-féle reflexiós tényező. Az abszorpció növekedése viszont csökkenti a minta áteresztőképességét, amelyből a diffúz visszaverődés lesz. Különböző élelmiszerek reflexiós spektrumát vizsgálva látható, hogy például a zöld alma reflexiójában egy minimum figyelhető meg 675 nm-nél, ahol a klorofill abszorpciója nagy. A piros alma, a paradicsom, a zöld alma és a hús reflexiós színképében megfigyelhető minimumok 970, 1190 és 1450 nm-nél az élelmiszerekben jelenlevő víz abszorpciós
maximumának a helyei. Ezek a reflexiós spektrumok világosan mutatják, hogy a reflexió nem csak a felületi reflexió eredménye, hanem az objektumok belsejéből érkező diffúz visszaverődés is jelen van. Általában a reflexiós spektrumok a testek belsejében végbemenő abszorpcióról is hordoznak információt, az abszorbeáló anyagok minőségéről és koncentrációjáról.
Másrészt a teljes visszaverődés a felület sima, illetve érdes mivoltáról adhat felvilágosítást. Például a frissen szedett viaszos felületű almán a szabályos reflexió minden irányba történik, a test belsejéből származó reflexió gyenge. A szemünk a két reflexiót egyszerre figyeli meg, így az alma színét fakónak, telítetlen színűnek látjuk. Ha a felületről ledörzsöljük a viaszréteget, akkor a felületi szabályos visszaverődés lecsökken és az alma belsejéből származó diffúz visszaverődés válik uralkodóvá, amely tartalmazza az alma héjában végbemenő abszorpció eredményét is. Ezért az almát szép élénk, telített színűnek látjuk. Fényabszorpció A közeg abszorpcióját (C) a Lambert-féle törvénnyel lehet leírni. Ha egy dx vastagságú réteg I intenzitású fényből di intenzitást elnyel, akkor az elnyelt intenzitás: di = Ik( λ)dx, ahol k( λ ) az abszorpciós tényező. Ez az összefüggés egy differenciálegyenlet, amelyet átrendezve a baloldalon csak I függvényét, jobb oldalon csak az x függvényét kapjuk:
di = k( λ ) dx. I Ezt az összefüggést integrálva kapjuk, hogy: ln I = - k( λ) x + C. A C egy integrációs állandó. Ha l rétegvastagságú anyagot világítunk meg I o fényintenzitással és abból az anyagon történő áthaladás után I intenzitás marad, akkor a fenti általános határozatlan megoldást határozottá tehetjük azzal a feltételezéssel, hogy amikor x=0, akkor I=I o és amikor x=l, akkor az intenzitás I. C meghatározása : lni o = - k( λ )*0 +C összefüggésből C=lnI o. Ezt beírva az általános megoldásba kapjuk, hogy: lni o - ln I = k( λ )l, vagy ln (I o /I) = k( λ ) l, illetve 10-es alapú logaritmussal kifejezve: I lg 0 = k ( λ ) l = ε ( λ)cl. I ε λ a moláris dekadikus abszorpciós koefficiens, c a molban mért koncentráció, l a ( ) rétegvastagság és lg(i o /I) az abszorpció, vagy optikai denzitás, amit mérni tudunk. A ε λ c összefüggés a Beer-törvény és viszonylag kis koncentrációkra érvényes. A k'( λ )= ( ) viszonylag kis koncentráció azt jelenti, hogy a fényelnyelésben levő molekulák - ún. kromofor molekulák - között nincs aggregáció. Fényszórás Egy biológiai objektumon a szórás azt jelenti, hogy a fény az egyes alkotóelemeken irányt változtat. Ez függ az alkotóelemek koncentrációjától, törésmutatójától, a felületének egyenetlenségétől és abszorpciójától. Általában a homogén egyirányú megvilágító fénysugár a minták belsejében viszonylag rövid távolság megtétele után diffúzzá válik. Egy biológiai anyagnak azt a rétegvastagságát, amelyben az egyirányú fénysugár teljesen diffúzzá válik, az anyag diffúziós rétegvastagságának nevezzük. Ha egy biológiai minta egyszerre elnyeli és szórja a fényt, akkor: I ( k s) l = e +, ha k s I o ahol k az abszorpciós, s pedig a fényszórási együttható, l a minta rétegvastagsága I ( s k ) l illetve = +, ha k s. I o A fényszórás nagyobb alacsonyabb nedvességtartalmú és kis abszorpciójú anyagokban, és kisebb a fényszórás olyan anyagokban, amelyeknek magas a nedvességtartalma és nagy az abszorpciója. A Kubelka-Munk elmélet vizsgálja az abszorpció és fényszórás arányát, valamint a reflexió és áteresztőképesség fokát a színes anyagoknál. k s = ( 1 R ) R,
ahol R a végtelen vékony minta reflexiós tényezője. A k abszorpciós tényező elsősorban az összetételtől, a fényelnyelő molekulák jelenlététől függ, az s fényszórási tényező pedig a minta mikroszkopikus szerkezetétől függ. Fényszórásnál megkülönböztetünk kétféle jelenséget: Koherens fényszórásról akkor beszélünk, ha a szórt fény hullámhossza megegyezik a megvilágító fény hullámhosszával. Kicsi részecskéken a szórt fény intenzitása arányos a részecskék átmérőjének hatodik hatványával, és fordítva arányos a megvilágító fény hullámhosszának a negyedik hatványával. Inkoherens vagy Raman-szórásról akkor beszélünk, ha a szórt fényben a megvilágító fény hullámhossza mellett megjelennek a megvilágító hullámhossznál kicsit nagyobb és kicsit kisebb hullámhosszak is. A jelenség magyarázata az, hogy amikor a fény foton kölcsönhatásba lép azzal a molekulával, melyiken a foton szóródik, akkor a foton energiája megnőhet, vagy csökkenhet a molekula rezgési és forgási energia értékeivel. A szabatos magyarázatot a kvantummechanika adja meg. Ilyen szórás csak nagyintenzitású megvilágítás esetén jön létre. Gyakorlati jelentősége az, hogy így a látható spektrum tartományban vizsgálhatók a molekulák rezgési és forgási energiái, amelyek a kis értékükre való tekintettel csak az infravörös spektroszkópiában mérhetőek közvetlenül. A Raman spektroszkópiában nagyintenzitású fényforrásként lézereket használnak. Abszorpciós spektrofotometria Cél a vizsgált anyag által elnyelt spektrum meghatározása akár látható, akár ultraibolya vagy infravörös tartományban. Fotométer vázlatos felépítése: A fényforrás folytonos és kellően intenzív, hogy a monokromátor felbontása után is elegendő intenzitás maradjon a méréshez. Ha látható fénnyel mérünk, akkor üvegből készült lencsékkel dolgozunk, ha ultraibolya fénnyel, akkor kvarcüvegből készült leképező rendszert kell használni. Ha a fenti ábrán látható egyutas mérőrendszerrel mérünk, akkor először a minta helyére az összehasonlító kerül, oldatok esetében az oldószer. Az oldószerrel meghatározzuk
az Io intenzitást, majd a mintán mérve az I intenzitást. Ezután számolható a lg(io/i) abszorpció. A kétutas készüléknél egy fényszaggató és tükrök segítségével hol az oldószeren, hol az oldaton megy át a fény. A monokromátor lehet prizma, vagy optikai rács. A detektor általában fotoelektronsokszorozó, amely viszonylag kevés foton esetén is jól értékelhető jelet ad. Izzó gőzök és gázok vonalas színképet adnak, sávos színképet kapunk különböző oldatban, membránban levő festék molekulák esetén (klorofill, karotinok). k( λ) -t, vagy ε ( λ) -t ábrázolva a hullámhossz függvényében kapjuk az abszorpciós spektrumot: Ha több elnyelő anyag van a mintában, akkor a spektrumban is több csúcs jelenik meg:
Matematikai módszerekkel fel lehet a spektrumot bontani sávokra, amik az egyes elnyelő komponenseknek felelnek meg. Az abszorpció értéke, a sáv maximumának helye függ a hőmérséklettől, ionkörnyezettől, ph-tól, a megvilágítástól, a mintán levő külső elektromos, illetve mágneses tértől. Például a hőkezelés során változik a zöldségek, gyümölcsök színe, a fehérje molekulák denaturációját is követhetjük abszorpció méréssel. A tirozin, triptofán és fenilalanin aminosavaknak van abszorpciós sávja az ultraibolya tartományban. Ezeknek a sávoknak az értéke mutatja az elnyelő aminosavak környezetét a fehérje molekulán belül. Az abszorpció értékét vizsgálhatjuk az idő folyamán is. Különböző fotófizikai, fotokémiai és fotóbiológiai folyamatok időbeli lefolyását követhetjük az abszorpció időbeli változásának a mérésével, egész ps (pikoszekundum 1ps=10-1 s) időtartománytól percekig, órákig. Fotoakusztikus spektroszkópia Átlátszatlan oldatoknál, poroknál, pépeknél is meg lehet határozni a fényelnyelési spektrumot. Megvilágítás hatására a zárt rendszerben fényabszorpció lép fel. Az abszorpció helyén lokális felmelegedés jön létre. Ez sűrűségváltozást okoz. A sűrűségváltozás nyomásváltozást hoz létre, ami mechanikai hullámokat (hanghullámokat) kelt. A hanghullámok mikrofonnal érzékelhetőek. Csak olyan hullámhosszú megvilágításnál figyelhetőek meg a hanghullámok, amelyeket a vizsgált anyag képes elnyelni. Infravörös spektroszkópia Lehet reflexiós (a visszavert infravörös fényt méri) és áteresztő (az elnyelt infravörös fényt méri) üzemmódban használni. Az infravörös tartományban a molekulák különböző rezgési átmenetei tanulmányozhatóak. Főleg fehérje, zsír, szénhidrát és víztartalom határozható meg így, akár feldolgozás során, folyamatos méréssel is. Három spektrális tartományt különböztetünk meg: közeli infravörös 800-500 nm; közép infravörös: 500-50000 nm; és távoli infravörös: 50-1000 µ m (vagy mikron). Például egy kétatomos molekula CO rezgése a két atom kovalens kötése mentén jöhet létre. A két atom közötti kölcsönhatási energiát egy parabola szemlélteti az egyensúlyi magtávolság körüli kis tartományban. Amíg ez érvényes, addig a kötési energiát egy rugó energiájával lehet közelíteni. A rendszer a tömegközéppontja körül fog rezegni. A rezgés frekvenciája:
1 f = π m1 + m D m m A szénmonoxidra: m C =*10-6 kg, m O =,7*10-6 kg és D 10 3 N/m értékekkel f=4,7*10 13 Hz, ami 6,4 µ m hullámhossznak felel meg. Több atomos molekulák esetén többféle rezgés jöhet létre. Azonban, hogy valójában milyen rezgések jönnek létre a lehetséges rezgések közül, azt a kvantummechanika törvényei szabják meg. Az egymástól független rezgéseket nevezik normálrezgéseknek. Például a víz normálrezgései: 1 Az infravörös spektroszkópiában gyakran nem a hullámhosszat, vagy a frekvenciát adják meg, hanem a centiméterben mért hullámhossz reciprok értékét. Az egyes rezgési frekvenciákat a kvantummechanika törvényei alapján ki is lehet pontosan számolni, de ez a számítás még viszonylag kevés atomból felépülő molekulánál is hosszadalmas. A kovalens kötések rugóállandója 1000 N/m körüli érték. A biológiai molekulák rezgési frekvenciái 50-100 THz (T terra 10 1 ) nagyságrendűek. Makromolekuláknál általában csak egyes atomcsoportok rezgéseit vizsgálják, amelyeket a messzebb levő atomok nem befolyásolnak. Az infravörös spektroszkópiát fel lehet használni ismeretlen anyagok meghatározására. Az egyes kötések, csoportok adott hullámhosszaknál mutatnak elnyelődést (érvényes ebben a hullámhossz tartományban is a Lambert-Beertörvény). A mért spektrumok alakjából a maximumokra jellemző hullámhosszak és
intenzitások értékéből az elnyelő anyagra lehet következtetni. Az infravörös spektrumokat ujjlenyomatoknak is nevezik. A 1100-1700 cm -1 frekvenciatartomány neve a fingerprint region. Modern készülékekhez már spektrumkönyvtárakat adnak, amelyek több száz, ezer jellegzetes spektrumot tartalmaznak. A mért spektrumot a szoftver összehasonlítja a könyvtár spektrumokkal és a legjobban hasonló, vagy éppen egyező spektrum alapján azonosítja a mérendő anyagot. Régebben az infravörös spektroszkópok felépítése hasonló volt az abszorpció mérésére alkalmas készülékekhez. Egy intenzív fényforrás fényét felbontották egy monokromátor segítségével, a monokromatikus fény a mintán áthaladt. A megvilágító és a mintán áthaladt fény intenzitásokból határozták meg az abszorpciós tényezőt. A korszerű infravörös spektroszkópok Fourier transzformáció elvén működnek. Ezeket a készülékeket FTIR (Fourier Transzformált Infra Red) spektroszkópoknak nevezik. A fényforrás - egy lézer - fényét egy Michelson-féle interferométerre vetítik. Kezdetben, amikor az A és a B fényút megegyezik a féligáteresztő tükörnél minden hullámhosszra erősítés következik be, mert nincs útkülönbség. Ha a mozgó tükröt elmozdítjuk egy x távolsággal, akkor csak azoknál a hullámoknál lesz erősítés, amelyekre az útkülönbség a hullámhossz egészszámú többszöröse: x = kλ. Ha egy λ 1 hullámhosszra erősítés van, λ1 λ1 akkor λ =, λ3 =... hullámhosszakon is erősítés lesz. Az interferencia szabályai szerint, 3
ha a fél hullámhossz páratlanszor fér rá az útkülönbségre, akkor kioltás következik be. Egy elmozdulásnál lesznek olyan hullámhosszak, amelyekre részleges kioltás jön létre. Nagyon leegyszerűsítve a készülék működését, azt mondhatjuk, hogy az interferométer segítségével nem egy hullámhosszra nézzük az abszorpciót, hanem egy egész sor hullámhosszra. A mozgatható tükör segítségével többféle hullámhossz kombináció választható ki. Az egyes hullámhossz kombinációknál mért abszorpciókból a Fourier transzformáció segítségével lehet a minta abszorpciós spektrumát meghatározni. A Fourier transzformáció eredetileg egy függvény előállítása szinuszos függvények kombinációjából. Egy spektrum felvételekor több ezer hullámhosszra határozzák meg az abszorpciót, ehhez megfelelő programokra van szükség. A FTIR spektroszkópok előnye, hogy sokkal pontosabb a hullámhossz beállítás, nagyobb az intenzitás, mert több hullámhossz van jelen, jobb a jel/zaj viszony. Fénykibocsátás A fényelnyelést és a fénykibocsátást a Jablonski-sémával lehet magyarázni. Fényabszorpciónál az elektron spin állapota nem változik meg. Egy fény foton elnyelődésekor az elektron gerjesztett állapotba jut. Az abszorpció 10-15 s (femto szekundum) alatt játszódik le. Ekkor általában az elektron energiája még nagy, nincs a környezettel termikus egyensúlyban. Ezután a környezettel termikus egyensúlyba jut 10-1 s alatt, ezt nevezzük vibrációs relaxációnak. Ekkor az elektron gyakorlatilag az S1 szint legalsó vibrációs szintje. Erről a szintről kerül aztán vissza az alap állapotba különböző úton. Fénykibocsátás vagy emisszió, illetve lumineszcencia akkor lép fel, ha a molekulában levő elektron gerjesztett állapotból alap állapotba fény kibocsátásával tér vissza. Hideg sugárzás. A gerjesztés létrejöhet fénnyel történő megvilágítással, ilyenkor fotólumineszcenciáról beszélünk. A gerjesztés történhet még kémiai, biológiai folyamatokkal is. Ekkor kemi-, illetve biolumineszcenciáról van szó. Radioaktív sugárzás is hozhat létre fénykibocsátást, ez a
radiolumineszcencia. Ha fénnyel történik a gerjesztés, akkor a gerjesztő foton energiája nagyobb, mint a kibocsátott foton energiája. A fotógerjesztés során létrehozott állapot élettartama meglehetősen kicsi 10-15 s. Ha a gerjesztés polarizált fénnyel történik, akkor a lumineszcencia fény polarizáltságát (a polarizációs fokot) vizsgálva megállapítható a molekulák elfordulása a gerjesztett állapot élettartama alatt. A lumineszcencia spektrumok mérésénél fontos figyelembe venni a reabszorpciót, azaz azt a fényabszorpciót, ami a kibocsátott lumineszcencia fényből nyelődik el. Fluoreszcencia, foszforeszcencia A gerjesztésre fényt használnak. A fluoreszcencia spektrum mindig hosszabb hullámhosszaknál, azaz kisebb frekvenciáknál, ill. kisebb energiáknál figyelhető meg, mint az abszorpciós spektrum. Ennek oka a foton elnyelést követő belső konverzió, amely során az elektron energiájának egy része hővé alakul. A fluoreszcencia spektrum mindig ugyanolyan spektrális eloszlást ad. Ez szintén alátámasztja azt a megállapítást, hogy a fény abszorpció után belső és vibrációs konverzió után az elektron az első gerjesztett állapot alap rezgési nívóján van. A fluoreszcencia az S1 állapot alap vibrációs szintjéről jön létre egy foton kibocsátásával. A fluoreszcenciát jellemzi a gerjesztett állapot élettartama, a kvantumhatásfoka és a polarizációs foka. Ha a fluoreszcencia spektrum több komponensből áll, akkor a gerjesztési spektrum felvételével lehet az egyes komponenseket elkülöníteni. A gerjesztési spektrumot úgy határozzuk meg, hogy a fluoreszcencia spektrumban egy hullámhosszat beállítunk, ezen a hullámhosszon mérjük a fluoreszcencia intenzitást miközben a gerjesztő fény hullámhosszát változtatjuk. Fluoreszcencia kvantumhatásfoknak nevezzük a kibocsátott és az elnyelt fotonok számának hányadosát. A polarizációs fokot úgy kapjuk meg, hogy a gerjesztést síkban poláros fénnyel végezzük, és azt vizsgáljuk, hogy a fluoreszcencia fény mennyire tér el a síkban poláros fénytől. A foszforeszcencia a T1 triplett szintről történő fény kibocsátás. Mivel a triplett állapotban az elektron spinje megváltozik ez viszonylag hosszú időt igényel ezért a foszforeszcencia az abszorpciót követően hosszú idő múlva figyelhető meg. A foszforeszcencia élettartama 10-9 s- tól egészen néhány szekundumig terjedhet.
A fluoreszcencia, vagy foszforeszcencia mérésére alkalmas berendezés blokk vázlata. A gerjesztő fényt előállító monokromátor lehet prizma, vagy rács. Általában a gerjesztő fényt merőlegesen irányítják a fluoreszcencia megfigyelési irányára, hogy ne kerüljön be a fluoreszcenciába a közvetlen gerjesztő fény. Termolumineszcencia Ha a gerjesztés hő hatására jön létre, akkor termolumineszcenciáról beszélünk. A termolumineszcencia kialakulásában egy ún. hosszú élettartamú (lényegében tiltott, vagy nagyon kis valószínűségű átmenet) állapot is szerepet játszik. Az alapállapotból a gerjesztett állapotba az elektron például radioaktív sugárzással (esetleg egyéb módon) kerülhet. Innen nem az alapállapotba megy vissza fénykibocsátással, hanem egy hosszú élettartamú (akár több év is lehet) állapotba. Itt az elektron csapdába kerül. Innen például melegítéssel kerülhet vissza a gerjesztett állapotba, ahonnan már egy foton kibocsátásával az alapállapotba tér majd vissza. Így kapjuk a termolumineszcencia görbét. Itt a vízszintes tengelyen a hőmérséklet van felmérve. Ez a módszer alkalmas arra, hogy kimutassa, érte-e a mintát korábban radioaktív sugárzás: például a burgonya, fűszerpaprika sterilizálása radioaktív sugárzással történt-e.
Lézerfény A rubin kristályban külső foto - vagy egyéb gerjesztéssel a lézerfényt adó molekulák többségét gerjesztett állapotba visszük, azaz populáció inverziót hozunk létre. (Normál körülmények között a molekulák többsége alapállapotban van, és csak néhány van gerjesztett állapotban). A molekulák többsége nem a gerjesztett állapotban marad, hanem sugárzás nélküli átmenettel egy hosszú élettartamú szintre, egy ún. metastabil szintre kerül. Ebből az állapotból elegendő egyetlen foton emissziója, hogy indukálja a többi elektront arra, hogy szinte egy időben térjen vissza a metastabil állapotból az alapállapotba. Így egy nagy intenzitású, nagy fénysűrűségű fénysugárzás jön létre, ami monokromatikus és nagy a koherencia hossza, azaz viszonylag nagy útkülönbség esetén is képes interferenciára. Lézerfénnyel hologramot lehet készíteni a tárgyakról, ami a rögzített tárgy térbeli jellemzőit is tartalmazza. Ugyanis az interferenciával készült képen a tárgyról visszaverődő fénysugaraknak nem csak az intenzitás viszonyait, hanem a fázis viszonyait is rögzíteni lehet. Lézerfény előállítása
Polarimetria Poláros fény előállítása Ha levegőből megy a fény üvegbe, és a visszavert és megtört sugár egymásra merőleges, akkor a megtört és visszavert sugár is síkban poláros lesz és a polarizációs síkjuk egymásra merőleges. Vannak kettősen törő kristályok. Ezekben a két egymásra merőlegesen poláros fény terjedési sebessége különböző. Megfelelő irányban kimetszve kristálylapokat előállítható síkban poláros fény. A fény transzverzális elektromágneses hullám, ezért polarizálható síkban és cirkulárisan is. Ha síkban poláros fénnyel világítunk meg bizonyos aszimmetrikus felépítésű anyagokat, akkor azok a fény polarizációs síkját elforgatják. A polariméter felépítése: A küvettába először oldószer van. A P polarizátor síkban poláros fényt állít elő. Ehhez a síkhoz képest kis szöggel elforgatjuk a kvarclemezt. Ekkor szemből nézve, a látómező két féltere különbözően van megvilágítva. Ezután az analizátort úgy forgatjuk, hogy a látómező kivilágítása egyenletes legyen. A küvettába ezután az aktív molekulák oldatát téve a poláros fény síkja elfordul. A látómező kivilágítása a két féltéren megint különböző. Az analizátort elforgatva ugyanakkora szöggel, mint amekkorával az oldat forgatta el a polarizáció síkját, a látómező megint egyenletesen lesz megvilágítva. Ez a félárnyék módszer. Azért célszerű használni, mert az emberi szem a megvilágítás különbségek észlelésében sokkal érzékenyebb, mint az abszolút megvilágítás megítélésében. Az aktív oldat α forgatóképessége függ az oldat c koncentrációjától, az optikai úthossztól, l- α -tól: től és a fajlagos optikai forgatóképességtől, [ ] α = cl Főleg különböző cukrok koncentrációjának a meghatározására alkalmas a forgatóképesség mérése. Fehérjék oldata is forgatja a fény polarizációs síkját. [ α]
Látószög Szerkezetvizsgálati módszerek Két pontot akkor látunk különbözőnek, ha 5 cm-re a szemünktől a tisztánlátás távolságában 1 ívperc szög alatt látjuk. Ha ennél kisebb a látószög, akkor nagyítóra van szükségünk. Az egyszerű nagyító A tárgy látószögét növeli meg, egyenes állású látszólagos képet hoz létre a tárgyról, a szögnagyítása: K tgβ = = k Ta 1 1 N szög = = a tgα T tt f k a Mikroszkópok A fénymikroszkóp felépítése. A mikroszkóp képalkotása:
A tárgylencse valódi, nagyított képet állít elő, erről a képről a szemlencse látszólagos nagyított képet készít, amit a széttartó sugarak meghosszabbításának az irányában láthatunk a tisztán látás a távolságában. Mivel t f és t f, valamint k d, ahol d a mikroszkóp optikai 1 1 tubushossza, a k a, ezért a mikroszkóp nagyítása: k1 k d a da N = N1N = = t1 t f1 f f1f Elméleti meggondolások szerint a mikroszkóp segítségével az a legkisebb távolság, amely még két pontként megkülönböztethető: λ δ = 0. 61, nsinω ahol λ a megvilágító fény hullámhossza, n a tárgy és a tárgylencse közötti közeg törésmutatója és ω a tárgylencse félnyílásszöge. δ 1 a mikroszkóp feloldóképessége. A cél a δ távolság növelése. Ernst Abbe vizsgálta mikroszkóp felbontási határának növelését. Tárgyként optikai rácsot használt. Akkor kapott képet, ha a nulladrendű sugarakon kívül az elsőrendű sugarak is bejutottak a tárgylencsében és részt vettek a képalkotásban. 1 A különböző k-ad rendű elhajlási irányok d sin α = kλ d a rácsállandó, k=0, 1,, és λ a megvilágító fény hullámhossza. Ha k=1, akkor már létrejön éles kép, annál részletgazdagabb a kép, minél több elhajlási rend bekerül a képalkotásba. λ Ha sin ω sinα =, akkor bejut az elsőrendű elhajlást adó fénynyaláb a leképezésbe. d λ Pontosabb számítások alapján δ = 0,61, ahol n annak az anyagnak a törésmutatója, nsinω amely a tárgy és a tárgylencse között van. Általában nagy törésmutatójú immerziós olajokat használnak, hogy a δ értéke növekedjen.
Ha nem rács a tárgy, akkor még nem megkülönböztethető két pont és két, már éppen megkülönböztethető pont elhajlási képe. A tárgylencse feloldóképessége határozza meg a mikroszkóp feloldóképességét. A szemlencse további részleteket mát nem tesz láthatóvá, csak a tárgylencse által alkotott képet nagyítja tovább. A különböző speciális mikroszkópok lehetővé teszik a még megkülönböztethető pontok távolságának csökkentését. Speciális mikroszkópok Ultraibolya mikroszkóp A megvilágító fény hullámhosszát csökkentik, ezáltal növelik a mikroszkóp feloldóképességét. Ultraibolya fényt használnak megvilágításra. A leképezés eredményét egy speciális fluoreszkáló ernyőn teszik láthatóvá. Ha maga a minta ultraibolya megvilágításra látható fényű fluoreszcenciát ad, akkor nem kell átalakító ernyő. Fehérjéket tartalmazó mintákat lehet így vizsgálni. A triptofán, a tirozin és a fenilalanin aminosavak tartalmaznak gyűrűt, ultraibolya fénnyel történő megvilágításra fluoreszcenciát adnak. Sztereomikroszkóp Két összeépített mikroszkóp, amelyek tubusai két különböző irányból képezik le a tárgyat és ezeket két szemmel megfigyelve valóban térbeli képet látunk. Tartalmaz még képfordító prizmákat, így oldal és irányhelyesen lehet a képet látni.
Ultramikroszkóp Redőny rései között a szobába beszűrődő fénysugárban láthatóvá válnak a porszemek, mivel a rájuk eső fény szóródik minden irányba. Ezen az elven működik az ultramikroszkóp, oldal irányban világítják meg a mintát és a mintában levő részecskéken szóródó sugarak kerülnek be a leképező rendszerbe. A részecskék nagyságát nem lehet megállapítani, de mozgásuk megfigyelhető, és valódi színük is látható. Fluoreszcencia mikroszkóp A mintát megvilágítják és a minta a különböző alkotórészei különböző fluoreszcencia fényt bocsátanak ki. A fluoreszcencia fényt képezik le a tárgy lencsével. A gerjesztő fényt egy dikroikus tükörrel távolítják el. A dikroikus tükör egy bizonyos hullámhosszú fényt visszaver, a többi fényt átengedi. A gerjesztő fényt visszaveri és a fluoreszcencia fényt átengedi. Ha a minta alkotórészei önmaguk nem adnak fluoreszcencia fényt, akkor speciális festékekkel, amelyek más-más alkotórészhez kötődnek láthatóvá tehetők a részletek. A gerjesztéshez lézereket is használnak. Polarizációs mikroszkóp Kettősen törő anyagok vizsgálatára használják. Kettőstörés akkor jön létre, ha az egymásra merőlegesen polarizált fénysugarakra az anyagban a terjedési sebesség, ill. a törésmutató függ az iránytól. Az ilyen anyagokat optikailag anizotrópoknak nevezik. Ilyen tulajdonságúak pl. a membránok, vagy makromolekulák áramló rendszere. A megvilágító fényt egy polarizátorral síkban polarizálják. A poláros fénnyel világítják meg a mintát. Ha a mintában a síkban poláros fényből elliptikusan poláros fény lesz, akkor a minta után elhelyezett analizátort merőlegesen
állítva a polarizátorra a nem kettősen törő részeket nem látjuk, mert ott a polarizáció síkja nem változott, az analizátor nem engedi át. A kettősen törő részek viszont láthatóvá válnak. Fáziskontraszt mikroszkóp Olyan részeket tesz láthatóvá, amelyek szemünk számára átlátszóak, de törésmutatójuk különböző. Az ilyen részeken áthaladó fénysugárban fázisváltozás jön létre. Szemünk a fény fázis viszonyaira nem érzékeny. Ez a mikroszkóp a fáziskülönbségeket intenzitás különbséggé alakítja, és így láthatóvá válnak számunkra is a különböző törésmutatójú részletek is. Nincs szükség fixálásra, folyamatok is megfigyelhetőek. Pásztázó mikroszkópos módszerek A pásztázás pontossága elérheti a hidrogénatom átmérőjének (0,5 Å) kevesebb, mint tizedét. Meg kellett oldani ehhez a mérőrendszer környezettől való függetlenítését. Általában a mérőrendszert felfüggesztik, vagy alátámasztják.
A pásztázáshoz a piezo hatást alkalmazzák, azaz a kvarckristály nagyon gyors és nagyon pontos megnyúlását használják fel. A piezoelektromos hatás lényege, hogy ha egy megfelelően kivágott kvarckristályt elektromos térbe tesznek, az megváltoztatja a hosszát, ill. mechanikai erő hatására a kvarckristály felületén elektromos töltések jelennek meg. A szokásos letapogatott felületek 0 x 0, 40 x 40, 18 x 18 µ m. A pásztázás három piezoelektromos transzducer kell az x, y és z irányban. A háromdimenziós képet a számítógép teszi össze a három irány adataiból. Atomerő-mikroszkóp Nem kimondottan optikai módszer, de mikrostruktúrák pl. sejtek felszínét lehet letapogatni ezzel a módszerrel. Alapelve a következő. Közel atomi méretre kihegyezett tűt mozgatnak a pásztázó berendezéssel atomok, molekulák, membránok, sejtek felett igen kis távolságra, és a tű felfüggesztése olyan, hogy az atomokat nem tudja egymástól elszakítani, mert ehhez gyenge a felfüggesztés rugóállandója. A tű ilyen mozgása hűen tükrözi a letapogatott felület felszíni alakját. A tű sztaniollemezre ragasztott kristály. A tű, illetve a sztaniollemez mozgását a lemezre vetített és onnan visszaverődő lézersugár képezi le. A vizsgálat fizikai elve, hogy a tű és a vizsgált anyag elektronfelhői között a taszító erő akkora, hogy nem engedi a tűbehatolását az anyagba, mivel a sztaniollemez rugóállandója nagyon gyenge. Ugyanakkor a rugóállandó elég nagy ahhoz, hogy a tűt a felszínhez nyomja. Nem csak a felszíni struktúrák képezhetőek le, hanem membránok alatti képződmények is. Lehet a sejtmag szerkezetét vizsgálni, mérhetők a sejtek mikro rugalmassági, mikro viszkozitási jellemzői is. Ha speciális molekulákat rögzítenek a tűn, különböző molekuláris kölcsönhatásokhoz szükséges erőt is lehet mérni. Élő struktúrák vizsgálhatóak, nem kell minta előkészítés.
Konfokális lézer pásztázó mikroszkóp (CLSM Confocal Laser Scanning Microscope) Tulajdonképpen hagyományos optikai spektroszkópia, mégis modern módszer, beállítható mélységben kiválasztott rétegről a képet pontonként pásztázással állítja elő. Így be lehet tekinteni egy sejt belsejébe háromdimenziós képet lehet kapni -, annak elmetszése nélkül. A mintáról érkező fotonok az optikai rendszer hátsó fókuszsíkjában elhelyezett szűk apertúrán keresztül jutnak a detektorra. A hátsó fókuszsík az objektív fókuszsíkjával konjugált viszonyban van, ami azt eredményezi, hogy az elülső fókuszsíkból érkező fotonok az objektívet párhuzamos nyalábként hagyják el, és a tubuslencse által az apertúra nyílására fókuszálódnak, s azon veszteség k áthaladnak a detektorhoz. Az elülső fókuszsík alatti és feletti síkokból érkező fotonok az objektívet össze-, ill. széttartó nyalábként hagyják el, a tubuslencsére is így érkeznek, s emiatt a hátsó fókuszsík (és az apertúra) elé, ill. mögé fókuszálódnak. Mindkét esetben a hátsó fókuszsíkban ezek a nyalábok nagyobb átmérőjűek, mint az apertúra, és így fotonjaik egy része nem jut át a nyíláson. Minél távolabb van a fotonforrás az elülső fókuszsíktól, annál kevesebb foton jut át az apertúrán. A fókuszsíkon kívüli fotonok kirekesztése azt jelenti, hogy ezzel a módszerrel a hagyományos mikroszkópos képhez képest keskeny jól definiált rétegből lehet éles képet kapni. A z tengely menti feloldóképesség azzal fokozható, hogy az apertúra méretét csökkentjük. A gyakorlatban a szeletvastagság néhány mikron, tehát a z-irányú feloldás az x-y irányú feloldásnál lényegesen rosszabb. Azért van szükség lézerfényre a megvilágításnál, mert az apertúra nagyon kicsiny nyílás (1 mm-nél kisebb átmérőjű), és a rajta áthaladó fényintenzitásnak (ami a teljes megvilágító intenzitásnak csak kicsi része) elegendőnek kell lenni ahhoz, hogy a detektor észlelni tudja. A kétdimenziós képet pásztázással állítják elő. Újabb rendszerekben a megvilágító fénynyalábot egy optikai rendszer, pl. egy mozgó tükör, a minta vizsgált pontjaira vetíti. Vannak olyan rendszerek is, amelyekben a mintát mozgatja egy motor kicsiny lépésekben. A megvilágított pontokból az emittált vagy visszavert fotonok a detektorba kerülnek, amely rendszerint fotoelektronsokszorozó. Annál élesebb képet lehet kapni, minél kisebb a megvilágított térfogatelem.