Hagyományos HPLC Page 1
Elválasztás sík és térbeli ábrázolása Page 2
Elválasztás elvi megoldásai 3 kromatográfiás technika: frontális kiszorításos elúciós Page 3
Kiszorításos technika minta diszkrét mennyisége jut a kolonnára beáll az egyensúlyi állapot komponensek fajlagos szorpciójuk szerint kötődnek meg ezután mindennél nagyobb fajlagos szorpciójú kiszorító anyaggal leszorítjuk a komponenseket (növekvő fajl. szorpciójuk szerint) Page 4
Elúciós technika Mozgófázis pulzálásmentes áramoltatása Minta felvitele (injektálás) impulzusszerűen Lamináris eluensáram a mintát dugószerűen felviszi az kolonnára Szorpciós-deszorpciós folyamatok Page 5
Szorpció-deszorpció Page 6
Állófázissal szemben támasztott követelmények Mechanikai stabilitás Kis szemcseméret Kis szemcseméret-eloszlás Energetikailag homogén felület Page 7
Mozgófázissal szemben támasztott követelmények D Arcy egyenlet: Lu p 2 d p Kis viszkozitás Jó UV áteresztő képesség Szilárd szennyező-mentes oldószerek Nem túl illékony Nem toxikus Olcsó Polaritás, módszer specifikus Page 8
Csoportosítás Normál fázisú (NP-HPLC) Fordított fázisú (RP-HPLC) Fordított fázisú ionpár (RP-IP-HPLC) Ion kromatográfia (IC) Ion kizárásos kromatográfia (IEC) Méret kizárásos kromatográfia (SEC) Page 9
NP-HPLC: állófázisok Szilikagél alapú OH Si O OH Si O Si H O O Si H H O OH Si Alumínium-oxid alapú Módosított szilikagél alapú Szilárd váz árnyékoló kölcsönható Powerpoint távtartó Templates Page 10
NP-HPLC: mozgófázisok Oldószerelegyek: apoláris, poláris Snyder-féle eluenserősség R e t e n c i ó, s z e l e k ti v it á s Alkánok Klórozott szénhidrogének Éterek Észterek Alkoholok Nitrilek Aminok Savak Víz E lu e n se rő ss é g, p ol ar it ás Hexán, Heptán, Izooktán Dikórmetán, Diklóretán, Kloroform Diizopropil-éter, Diizobutiléter, MTBE, THF, Dioxán Metil-acetát, Etil-acetát Etanol, Izopropanol Acetonitril Trietil-amin, Butil-amin Ecetsav Víz Page 11
NP-HPLC: mozgófázisok Alap oldószerek: alkánok: hexán, heptán, izooktán Oldhatóságot növelő oldószerek: Diklórmetán, diklóretán, kloroform Módosítószerek (modifikátorok) Lokalizáltan (erős H-hidas) Nem lokalizáltan adszorbeálódó (gyenge H-híd kölcsönhatás, mintakomponens kiszoríthatja őket a felületről) Page 12
RP-HPLC: állófázisok Monomer módosítás: O Si O Si O Si OH OH OH + Cl O CH 3 Si OH CH 3 -HCl O Si C 18 H 37 Si O Si C 18 H 37 O CH 3 Si OH CH 3 Átmeneti módosítás Polimer módosítás Page 13
RP-HPLC: állófázisok ph tűrés hidrolízis sebesség H + szilárd CH 2 Si O Si R CH oldhatóság alsó ph határ 1 2... 7 8 9... 14 felsõ ph határ Page 14
RP-HPLC: állófázisok Egyéb töltetek: Szén alapú Szerves polimer alapú Alumínium-oxid alapú Kapszulázott töltetek Titán-oxid alapú Cirkónium-oxid alapú Page 15
RP-HPLC: mozgófázisok víz<metanol<acetonitril<etanol<2- propanol<tetrahidrofurán Etanol, 2-propanol viszkozitása nagy Dioxin poláris oldószer, de reaktív és mérgező Tetrahidrofurán esetében stabilitási problémák (levegő oxigénjével peroxidosodik, ezért stabilizálni kell, pl. 3,5- diizobutil-4-hidroxi-toluolt) Page 16
RP-HPLC: mozgófázisok Pufferek használata: Ionos vagy könnyen ionizálható vegyületek vizsgálata esetén az előnytelen erős kölcsönhatások kiküszöbölésére Pufferelt mozgófázisok alkalmazásának speciális területe az RP-IP-HPLC Követelmények: Detektálásnál ne legyen probléma, (kis UV cut-off) Adott mérési körülmények között nagy pufferkapacitás Szilárdanyag mentesség (szűrés) Lehető legtisztább puffer Pufferkompatibilitás: nagy szervesanyag-tartalomnál ne váljon ki Page 17
Műszerezettség 1. Nagynyomású szivattyú 4. Detektor 2. Mintaadagoló 5. Vezérlőegység 3. Kolonna 6. Adatfeldolgozó Page 18
Műszerezettség: Mozgófázis Kis viszkozitás Jó UV áteresztő képesség Szilárd szennyező-mentes oldószerek Nem túl illékony Nem toxikus Olcsó Oxigén mentes Polaritás, módszer specifikus Page 19
Műszerezettség: Nagynyomású szivattyú Kb. 400 bar nyomásesés ellenében 0,01-10ml/min pulzálásmentes áramlás biztosítása Korrózió állóság Működtetés és szabályozás számítógép által Page 20
Műszerezettség: 3. mintaadagoló és kolonna Mintaadagolás: 6 ágú csappal Kolonna: Analitikai Preparatív Sub-2µm Page 21
Műszerezettség: 4. detektor UV, UV-VIS, DAD Fluoreszcens Elektrokémiai (amperometriás, kulometriás) Vezetőképességi detektorok Törésmutató különbség mérésén (RI) Kapcsolt technikák (MS, ELSD) Page 22
Műszerezettség: 4. detektor UV/VIS Page 23
Műszerezettség: 4. detektor DAD Page 24
Műszerezettség: 4. detektor DAD 0.050 0.040 0.030 0.020 0.010 0.000-0.010-0.020 AU -0.030-0.040-0.050-0.060-0.070 250.00 300.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 Minutes Page 25
Műszerezettség: 4. detektor DAD 280.00 AU AU 260.00 240.00 220.00 0.04 0.02 0.00 2.94 2.96 2.98 3.00 3.02 3.04 3.06 Minutes triamcinolone - 2.996 AU 0.050 0.040 0.030 0.020 0.010 0.000 239.7 244.4 239.7 244.4 334.8 310.9 320.4 339.5 325.2 220.00 240.00 260.00 280.00 300.00 320.00 340.00 nm 2.94 2.96 2.98 3.00 3.02 3.04 3.06 Minutes Page 26
Műszerezettség: 4. detektor Fluoreszcens Page 27