Tartalom. 2013. XIII. évfolyam 3. szám. GEN-LAB Kft.

2013. XIII. évfolyam 3. szám GEN-LAB Kft. Tartalom Módszerfejlesztés alapjai I. 2-4. oldal Új taggal bővült a Phenomenex Zebron GC kolonnacsalád -6. oldal Hogyan válasszunk fecskendőszűrőt módszerünkhöz 7-8. oldal Phree Foszfolipid eltávolítás és fehérjekicsapás egyszerűen 9-10. oldal, technikai sarok 11. Gen-Lab Kft. H-1119 Budapest, Hadak útja 41. Telefon: (36-1)206-24 Fax: (36-1)206-241 Email: info@gen-lab.hu Web: oldal

Gradiens módszer előnyei az izokratikus módszerrel szemben (I.) (RP-HPLC) Izokratikus módszer A mobil fázis magában foglalja a vizes (puffer, víz) és a szerves (ACN, MeOH) részt A vizes fázis a gyenge (A), a szerves fázis az erős (B) eluens A vizes és a szerves fázisok aránya nem változik a futások során Csökkentve a B (%) összetételt a retenciós idők növekednek, a csúcsok szélesebbek, javul az elválasztás hatékonysága Az áramlási sebesség növelése rövidebb, míg csökkentése hosszabb futási időt eredményez, de nem változik a komponensek elúciós sorrendje A kolonna hőmérséklet növekedése szélesebb csúcsokat eredményez, a hőmérséklet változtatás okozhat szelektivitásbeli eltéréseket A kolonna hossz növelése és az átmérő csökkentése növeli a nyomást, a futási időt, viszont nem változik a komponensek szelektivitása A részecskeméret csökkentése növeli a nyomást, szélesebb csúcsokat ad, viszont nem változik a csúcsok retenciós ideje A csúcsszélességet a retenciós idő befolyásolja, a B (%) összetétel nem (a kromatogram elején keskenyebbek, a kromatogram végén szélesebbek a csúcsok) Az eluens ph-jának beállítása megfelelő, az adott ph tartományban használható pufferrel történjen Gradiens módszer A mozgó fázis összetétele változik a gradiens áramlás során A gradiens áramlás lehet csökkenő vagy növekvő Hosszabb gradiens idő növeli a komponensek retenciós idejét, szélesebbek a csúcsalakok, javul az elválasztás A gradiens idők változtatásával megváltozhat a csúcsok relatív helyzete Ha megváltozik a gradiens meredeksége, ugyanolyan eredményt ad, mint izokratikus módszernél a B (%) összetétel változása A kolonna hőmérséklet növekedése csökkenti a futási időket, a nyomást, élesebbek és keskenyebbek a csúcsok, megváltozik a szelektivitásuk (ugyanaz, mint izokratikus módszernél) A részecskeméret csökkentése növeli a nyomást, szélesebb csúcsokat ad, viszont nem változnak a retenciós idők (ugyanaz, mint izokratikus módszernél) A kolonna hossz, átmérő és az áramlási sebesség változásának hatására megváltozik a komponensek szelektivitása (nem ugyanaz, mint izokratikus módszernél) A csúcsszélességet a gradiens idő befolyásolja (növelve a gradiens időt, nő a csúcsszélesség) Az eluens ph-jának beállítása megfelelő, az adott ph tartományban használható pufferrel történjen Konklúzió A gradiens módszer meredekségének (gradiens idő) megváltozása ugyanazt eredményezi, mint a B (%) összetételének megváltozása izokratikus módszerben A hosszabb futási idő, a kevésbé meredek gradiens ugyanazt eredményezi, mint a B (%) csökkentése izokratikus módszernél: hosszabb a retenciós idő, hatékonyabb az elválasztás, szélesebbek a csúcsok Izokratikus módszerben ha változtatjuk a mérési körülményeket (hossz, átmérő, részecskeméret vagy áramlási sebesség), akkor a változtatásoknak megfelelően alakul a kromatogram: k értéke nem befolyásolja a mérési paramétereket 2. oldal

Gradiens módszer előnyei az izokratikus módszerrel szemben (II.) (RP-HPLC) A gradiens módszer előnyei az izokratikus módszerrel szemben Élesebbek, nagyobb intenzitásúak a csúcsok, mint izokratikus rendszerben, így könnyebb a mennyiségi meghatározás, így szélesebb körben használják a gradiens módszereket Javul az izokratikus rendszerben későn eluálódó, szélesebb csúcsot adó komponensek detektálása: gradiens rendszerben nagyobb intenzitású, jobban integrálható csúcsokat kapunk, rövidebb elúcióval Gradiens módszert akkor használunk, ha több komponensű elegyet akarunk meghatározni, a komponensek polaritása különböző, amelyeket izokratikus módszerrel nem lehet elválasztani Tisztaság és szennyezésprofil vizsgálatoknál általában gradiens, míg hatóanyag, illetve kioldódás vizsgálatoknál izokratikus módszereket használunk Eluens oldószer erősségének hatása Izokratikus Gradiens Oldószererősség növelésével csökken az analízisidő és a felbontás Gradiens meredekségének növelésével csökken az analízisidő és a felbontás Oldószererősség csökkentésével nő az analízisidő és a felbontás Gradiens meredekségének csökkentésével nő az analízisidő és a felbontás Oldószererősség befolyásolja a szelektivitást Gradiens meredekség változása befolyásolja szelektivitást Oldószererősség növelésével koeluálódnak a csúcsok, csökkentve az erősséget javul a felbontás Oldószererősség növelésével koeluálódnak a csúcsok, csökkentve az erősséget javul a felbontás Oldószererősség RP HPLC-nél: Gyenge oldószer: víz/ puffer Erős oldószer:1.acn, 2.MeOH, 3.THF (1-3: erősebbtől haladva a gyengébb felé) Ha az izokratikus módszer nem működik: A kromatogram elején keskeny csúcsok, rossz felbontással, a kromatogram végén széles csúcsok, jó felbontással Megoldás: kromatogram elején csökkenteni, a végén növelni a B (%)-ot, gradiens módszer kidolgozása A kromatogram elején lévő komponensek összecsúsznak, pl: 20 % ACN-t alkalmazva eluensként, 220 nm-en történő detektálással Megoldás: 3 % metanol használata az eluensben ACN helyett Ha a k (visszatartás) értéke túl kicsi Megoldás: csökkentve a B (%)-ot, nő a felbontás és a retenciós idő, így a k értéke is Ha a gradiens módszer nem működik: Holttérfogat kialakulása: Módszer transzfereknél okozhat problémát (eltérő típusú és holttérfogatú HPLC készülékek esetén) Megoldás: megadni a módszerekben, hogy milyen holttérfogatú HPLC készüléken történt a a fejlesztés, illetve milyen gradiens változtatás szükséges a módszer eltérő holttérfogatú készülékre történő átviteléhez Alapvonal eltolódás: függ az alkalmazott hullámhossztól: ha ez nagyobb, mint 20 nm, akkor a komponensek UV abszorbanciája minimális, így alapvonal eltolódás ritkán lép fel. Ha ez kisebb, mint 220 nm, akkor az UV abszorbancia jelentős Megoldás: UV elnyelő anyaggal (pl: foszfát puffer, 21 nm-en) csökkentik az UV abszorbanciákban tapasztalt különbségeket. Az eluens komponensek és a detektálási hullámhossz megfelelő megválasztásával lehet olyan gradiens körülményt találni,amely nem veszélyezteti az analízist. Korán eluálódó komponensek közötti felbontás nem megfelelő Megoldás: izokratikus szakasz beépítése a gradiens első szakaszába 3. oldal

Gradiens módszer előnyei az izokratikus módszerrel szemben (III.) (RP-HPLC) Izokratikus módszer: áramlási sebesség és kolonna hossz változtatása Kinetex C18 oszlopon Kolonna Kinetex C18 2,6 um Dimenzió 10*4,6 mm Part.No. 00F-4462-E0 Áramlási sebesség 0,6 ml/perc Eluens 12,mM foszforsavas víz/meoh/thf=80/18/2 Oszlop hőmérséklet 22 C 30 %-kal gyorsabb analízis Kinetex C18 2,6 um Kolonna Dimenzió 10*4,6 mm Part.No. 00F-4462-E0 Áramlási sebesség 0,8 ml/perc Eluens 12,mM foszforsavas víz/meoh/thf=80/18/2 Oszlop hőmérséklet 22 C 66 %-kal nagyobb teljesítmény Kinetex C18 2,6 um Kolonna Dimenzió 100*4,6 mm Part.No. 00D-4462-E0 Áramlási sebesség 1 ml/perc Eluens 12,mM foszforsavas víz/meoh/thf=80/18/2 Oszlop hőmérséklet 22 C Gradiens módszer: nagyobb hatékonyság elérése Kinetex C18 oszlopon Kolonna Teljesen porózus töltetű C18 um Kolonna Kinetex C18 2,6 um Kolonna dimenzió 20*4,6 mm Kolonna dimenzió 100*4,6 mm Eluens A:víz, B:ACN Eluens A:víz, B:ACN Áramlási sebesség 0,7 ml/perc Áramlási sebesség 2,1 ml/perc Gradiens Idő (min) B (%) Idő (min) B (%) 0 8,2 9 0,6 8,21 7,01 9 10,97 Idő (min) B (%) Idő (min) B (%) 0 66 9 4,78 66,01 1,2 9 86,38 Gradiens Oszlop hőmérséklet 4 C Oszlop hőmérséklet 4 C Detektálási hullámhossz 28 nm Detektálási hullámhossz 28 nm 4. oldal

ZB-SemiVolatiles Új! Új, Enviro-InertTM Technológiával GC kolonna Miért fontos a csökkentett aktivitás? Az oszlop magas aktivitása okán kialakult csekély mértékű inertség könnyen alacsony sav/bázis érzékenységhez vezethet. Ennek köszönhetően a valóságtól eltérő adatokat is kaphatunk. A megoldás az új technológiával készült ZB-SemiVolatiles oszlop. Inert, robosztus teljesítmény Nagyobb felbontást nyújt a kulcsfontosságú elválasztásokhoz Szebb csúcsalak, illetve visszatartás savakra, aminokra és PAH-okra Enviro-Inert Technológia Keresztkötéses ESC Technológia Módszer Az Arilén Mátrix Technológiának köszönhetően egy nagyon robosztus és alacsony vérzéssel rendelkező GC oszlop. Kiemelkedő elválasztást biztosít poliaromás szénhidrogénekre. Kimondottan alkalmas GC/MS mérésekhez. Az alkalmazható hőmérséklet-tartomány -60 C-tól 32/30 C-fokig terjed. Integrált előtétkolonnával is rendelhető. Alkalmazások: További információk és technikai anyagok: Szemi-illékonyak Savak Aminok PAH-ok EPA módszer 2, 610, 62, 8100 és 8270 Oszlop garancia Tudjon meg többet Nincs retenciós idő eltolódás más % fenil-arilén állófázisokhoz képest. oldal

Miért fontos a piridin jel? Relatív válaszjel faktor A piridin egy nagyon aktív amin, így jelzésértékű az oszlop élettartamára és érzékenységére vonatkozólag. Várható ugyanis, hogy azok a kolonnák, melyek kezdetben is magas csúcsokat adnak, tovább is tudják megőrizni minőségüket. Továbbá a magasabb válaszjel alacsonyabb detektálható mennyiséget is eredményez, így növelve az analízisünk érzékenységét. Detektor Poliaromás szénhidrogének (PAH) elválasztása ZB-SemiVolatiles oszlopon Peszticid osztály 14 perc alatt: Oszlop: Zebron ZB-SemiVolatiles GC Kapilláris oszlop Fázis: % fenil 9% dimetil-polisziloxán (Arilén Mátrix Technológia) Dimenzió: 30 m x 0,2 mm x 0,2 μm Rendelési szám: 7HG-G027-11 Hőmérséklet program:100 C 0, percig; 260 C-ra 30 C/perc-cel; 29 C-ra 6 C/perccel, majd 2 C/perc-cel 32 C-ra; 2 percig 32 C Vivőgáz: Hélium, 1,4 ml/perc Injektálás: split 10:1; 1 μl (280 C) Detektálás: MS (340 C); 4-40 amu Komponensek: 1 Naphthalene 2. 2-Methylnaphthalene 3. 1-Methylnaphthalene 4 Acenaphthylene Acenaphthene 6 Fluorene 7 Phenanthrene 8 Anthracene 9 Fluoranthene 10 Pyrene 11 Benzo[a]anthracene 12 Chrysene 13 Benzo[b]fluoranthene 14 Benzo[k]fluoranthene 1 Benzo[a]pyrene 16. 3-Methylcholanthrene 16 Indeno[1,2,3-cd]pyrene 17 Dibenz[a,h]anthracene 18 Benzo[g,h,i]perylene Tudjon meg többet 6. oldal

Szűrés és kromatográfia, avagy hogyan válasszak fecskendő- és eluens szűrőt? Miért fontos ez? A kromatográfiás minták előszűrése nem csak azért fontos, hogy a kolonnánk élettartamát növeljük, hanem ez adott esetben a készülékünket, és annak alkatrészeit is védi, így a karbantartási költségek is csökkenthetőek... Másrészről, különösen a mai helyzetben, amikor az UHPLC technológia egyre inkább teret hódít, a szemcseméretek egyre kisebbek, a készülék átfolyó térfogatai szintén csökkennek, fontos tudni, hogy az in-line eluens szűrő már nem jelent védelmet. Gondoljunk bele, hogy egy ilyen szűrő a 10mm nagyságú alakos szennyezők mindössze 90%-át távolítja el. A fennmaradó alakos szennyezők pedig eltömíthetik a pumpát, a kapillárisokat, vagy a kolonna frittjén rakódhatnak le. Mindezek kiküszöbölésére egy nagyszerű és költséghatékony megoldás a minták és az elkészített eluens előszűrése. De mi alapján válasszunk szűrőt? Egyre több gyártó, egyre több membrán típusa közül melyik lesz a legmegfelelőbb? Rövid írásunkkal arra teszünk kísérletet, hogy ebben az útvesztőben kivezetőt, vagy legalábbis egy utat mutassunk. Kromatográfiás feladat Munkánk során az alábbi feladattal találjuk szembe magunkat. Különböző fájdalomcsillapítók vizsgálata a cél, melyre egy izokratikus módszer áll rendelkezésre, acetonitril/víz+foszfát puffer (ph=2,) az eluens, egy 10X4,6mm, 3µm Gemini kolonnát használunk az elválasztáshoz, egy hagyományos HPLC készüléken. Ezen a példán keresztül szeretnénk végigmenni, hogyan válasszuk ki a membránszűrőket az eluens és a minta szűréséhez. A megfelelő pórusátmérő kiválasztása Az első dolog, amit itt meg kell gondolnunk, hogy a kolonnában a fázist mindkét oldalon egy-egy fritt tarja, amit úgy kell elképzelni, mint egy szitát. Természetesen a fritten levő hézagok nem lehetnek nagyobbak, mint a szemcseméret. Ha a szilárd szennyezőink pont akkora méretűek, vagy valamivel kisebbek, mint a fritten található hézagok, azt könnyen eltömíthetik. Másrészt a kolonnában gömb alakú szemcsék vannak, és a szemcsék közötti térben az alakos Szemcseméret szemcsék közötti szennyezők bejutva a kolonna eltömődését okozhatják. (µm) tér (µm) A jobb oldali táblázatban összefoglaltuk, hogy mely szemcsemérethez jellemzően mekkora a szemcsék közötti tér. Ez 0,72 alapján érdemes kiválasztanunk a szűrőnk pórusméretét is. Mivel 3 0,43 membránszűrőt használunk, ez definíció szerint a pórusméret alatti 2,6 0,38 részecskéket visszatartja, a 3µm-es kolonnához a 0,4µm-es 1,7 0,2 membrán nem lesz elegendő, így a 0,2µm-es pórusméretet választjuk. De miért is kell szűrni az eluenst, ha HPLC minőségű oldószereket használunk? Mivel jelen esetben puffert készítünk az elúcióhoz, nem lehetünk biztosak benne, hogy az oldatkészítés tökéletes volt, szabad szemmel ugyanis nem láthatóak az ilyen kis részecskék. A minta szűréséhez szintén ezt a pórusméretet javasoljuk. 7. oldal

A megfelelő membrántípus kiválasztása A membránválasztásnál arra kell törekednünk, hogy az adott feladatra egy jó áteresztőképességgel, alacsony, nemspecifikus adszorpciós jellemzőkkel, kiváló kémiai kompatibilitással bíró membránt válasszunk. Erre a legmegfelelőbb a regenerált cellulóz membrán, melyet kifejezetten kromatográfiás célra fejlesztettek. Az alábbi táblázatban adunk egy rövid összefoglalót, hogy milyen további lehetőségeink vannak, ha speciális feladatra szeretnénk szűrőt választani. Egyéb membrán / szűrő típusok a teljesség igénye nélkül Hirdofób PTFE Hirdofil PTFE Hirdofób PVDF Hirdofil PVDF PES CA NY GF kiváló kémiai tulajdonsággal bíró membrántípus szervetlen savak és lúgok, illetve 100% szerves oldószerek szűréséhez ajánlott. A hidrofób teflon minden előnyös tulajdonságával rendelkezik, de vizes minták szűrésére ajánlott Remek kémiai kompatibilitás jellemzi, szerves oldószerek szűrésére javasolt, a hidrofób teflon alternatívájaként Vizes minták szűrésére javasolt ez a membrántípus, jó tulajdonságai miatt ez is kedvelt típus Extrém alacsony adszorpciós képességei miatt elsősorban biológiai minták szűréséhez használt membrán Vizes minták szűrésére kiváló membrán a jó áteresztőképessége miatt, viszont mérsékelt kémiai kompatibilitása miatt kromatográfiás célra nem javasolt A magas megkötő képesség és alacsony kémiai kompatibilitás jellemzi ezt a membrántípust Magas lebegőanyag tartalom esetén (pl. zagyos, fermentációs minta) javasolt a minta üveg gyapoton való előszűrése, némely esetben ez a membránnal egybeépítve megtalálható A fecskendőszűrők kiválasztásánál ugyanakkor nem elegendő, ha a membrán kémiai kompatibilitása lehetővé teszi a vele való munkát, figyelni kell a szűrőház megfelelőségére is. A PP házban levő membránok elég inertek a kromatográfiás feladatok legtöbbjéhez, viszont egyes membránokat, pl. CA kevésbé ellenálló házba forgalmaznak. Előfordulhat továbbá, hogy a mintánk, természeténél fogva több alakos szennyezőt tartalmaz, pl. zagyos, vagy fermentációs minták, ebben az esetben az üveggyapot előszűrő használata javasolt. Egyes membrántípusok megtalálhatóak egybeépített előszűrővel is, de lehetőség van két szűrő egymás utáni használatára is. Elképzelhető, hogy az adott feladatra elegendő lenne egy nylon membrán használata is, viszont érdemes utána gondolni annak, hogy kell-e több fajta membránt tartani a laborban? A legtöbb gyártó színkóddal látja el a különböző membrántípusokkal rendelkező fecskendőszűrőket, de kérdés, hogy a többfajta típus okozhat-e tévesztést? A fecskendőszűrők és szűrőházak kémiai kompatibilitását megtalálja a /mintaelokeszites honlapon, sok egyéb hasznos információval együtt! 8. oldal

A megfelelő membrán átmérő kiválasztása 2ml minta térfogat 4mm átmérő 2-10ml minta térfogat 10-100ml minta térfogat 1mm átmérő 2-28mm átmérő A fecskendőszűrő méretének kiválasztásánál arra kell figyelni, hogy ha túl kis felületű membránt választunk, túl hamar eltömődhet a szűrőnk, és nem tudjuk a megfelelő anyagmennyiséget átszűrni, csak két, vagy több szűrő elhasználásával. Ha a membránfelület túl nagy, számolnunk kell a szűrő holttérfogatával is! Ez a 4mm átmérőnél nem számottevő, a 1mm átmérő esetén 100µl, míg a 2-28mm átmérőnél már 200-300µl is lehet! Esetünkben tehát a 1mm-es átmérőjű fecskendőszűrőt javasoljuk. Az eluens szűrő membrán méretének kiválasztásánál viszonylag egyszerű a dolgunk, mert itt a 47mm-es membrán átmérő a szabvány méret, a legtöbb szűrőkészülékhez ekkora membrán szükséges. Ekkora membránnal akár 4l eluenst is le tudunk szűrni. Persze előfordul más méret is, arra kell egyedül figyelni, hogy a megfelelő méretet használjuk. Összefoglalás és a szűrő megfelelő használata Az adott kromatográfiás feladathoz a kolonna kisebb szemcsemérete, illetve az eluens és mintaoldó összetétele alapján tehát egy 1mm átmérőjű, 0,2µm-es regenerált cellulóz fecskendőszűrőt választottunk. Eluens szűréshez ugyanezt a membrántípust javasoljuk, 47mm-es átmérőben. Az alsó ábrán egyszerű lépésben ábrázoljuk a fecskendőszűrő helyes használatát. 1. szívjuk fel a fecskendőbe a szűrendő mintát, majd szívjunk a fecskendőbe egy kevés levegőt. 2. válasszuk ki a megfelelő fecskendőszűrőt, figyelve a megfelelő pórusméretre, membrántípusra és átmérőre 3. csatlakoztassuk a szűrőt a luer-lock csatlakozóval. Lehetőleg kerüljük a nem bajonett záras fecskendő használatát, mert a szűrés során fellépő nyomás lelökheti a szűrőt 4. enyhén megnyomva a fecskendőt, kezdjük el a szűrést a mintatartó üvegbe. a minta után engedjük át a levegőt is a szűrőn, ezáltal a felületen maradt anyagmennyiséget csökkenthetjük Tudjon meg többet 9. oldal

Fehérje kicsapás és foszfolipid eltávolítás egyszerűen! A zavaró fehérjék és foszfolipidek eltávolítására kínálnak egyszerű, robosztus megoldást a Phenomenex Phree termékei. A hagyományos fehérjekicsapás hosszadalmas, körülményes eljárás mely ráadásul az MS detektálásnál zavaró foszfolipideket sem távolítják el, csökkentve ezáltal az érzékenységet és a használt oszlop élettartamát. Nézzük meg az alábbi 4 egyszerű lépésben a használatát: Kicsapószer bemérése: A kicsapáshoz használt szerves oldószer (pl: ACN, MeOH) bemérése. Használjunk 3-4x-es mennyiséget a minta térfogatához képest (maximum 1,2ml). Minta bemérése: 2μl-400μl plazma minta bemérése közvetlenül a szerves fázisba. Kicsapás: Detektor 1 percen keresztül hagyjuk állni a mintánkat, míg megtörténik a fehérjék kicsapódása. A hatékonyság növelés érdekében rázathatjuk a mintát (Vortex) de erre nincs feltétlen szükség. Szűrés: Vákuum segítségével szűrjük le a mintát a kicsapó plate-ről, csőről. Ennél a lépésnél a szorbens felületén megtörténik a foszfolipidek kikötődése és a szűrő felületén fennmaradnak a kicsapott fehérjék ezután a minta már közvetlenül injektálható. Fehérje eltávolítása Foszfolipid megkötése ÚJ Nincs sok minta egyszerre? Már nem csak 96-os wellplate formátumban hanem 1ml-es SPE csőben is elérhetők a Phree fehérjekicsapó/foszfolipid eltávolító szorbensek. Kevesebb mintaszám esetén is költséghatékonyan használható ezentúl. Fehérje Foszfolipid Célvegyület Próbálja ki a gyakorlatban! Kérje ingyenes mintacsomagunkat és tesztelje saját mintáin! info@gen-lab.hu 10. oldal

TECHNIKAI SAROK MINDEN EGY HELYEN Ha nincs ideje az interneten böngészni, itt megtalálhatja, amire szüksége van! Ebbe a gyűjteménybe igyekeztünk összeszedni azokat a segédleteket, amelyeket egy kromatográfus munkája során leggyakrabban használ. Csak hogy néhányat említsünk: Puffer kalkulátor (letölthető recepttel) Oldószerek tulajdonságai, kompatibilitások Oszlopmosási segédlet USP és Ph EUR fázis besorolások Stb... Ezeken kívül még sok más kalkulátor illetve hasznos útmutató elérhető honlapunkról, csak egy kattintás! Kihagytunk valamit? Írják meg nekünk, hogy mit szeretnének még a technikai sarokban látni! Kinetex oszlopok bekötése PEEK illetve SS (stainless steel) kapillárissal Kinetex oszlopok csatlakoztatása különböző típusú készülékekbe Előtétkolonna csatlakoztatása, cseréje HPLC készülék optimalizálása Ezen kívül még 1-2 szórakoztató kisfilmet is feltöltöttünk, ha egy kis kikapcsolódásra vágyna:) 11. oldal

Hírek röviden... III. Kromatográfiás Horgászverseny 2013. szeptember 21-én Kiskunlacháza, Préri-tó Jelentkezés, bővebb információ: Tudjon meg többet Gen-Lab Kft. H-1119 Budapest, Hadak útja 41. Telefon: (36-1)206-24 Fax: (36-1)206-241 Email: info@gen-lab.hu Web: