2.6.16. Vizsgálatok idegen kórokozókra Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.7.0 1 2.6.16. VIZSGÁLATOK IDEGEN KÓROKOZÓKRA HUMÁN ÉLŐVÍRUS-VAKCINÁKBAN 01/2011:20616 Azokhoz a vizsgálatokhoz, amelyekhez a vírust előzőleg semlegesíteni kell, olyan specifikus ellenanyagot használunk, amelyek nem emberből vagy majomból származnak. Amennyiben a vírust madárszövetekben tenyésztették, az ellenanyag madár eredetű sem lehet. Az ellenanyag előállításához olyan immunizáló antigént használunk, amelyet más fajból származó sejttenyészetben állítottak elő, mint amelyet a vakcina esetében alkalmaztak, és amely nem tartalmaz idegen kórokozókat. Ha SPF tojások használatát írják elő, a tojásokat olyan állományból nyerjük, amely meghatározott kórokozóktól mentes (5.2.2). VÍRUS-OLTÓCSÍRATÉTEL A vírusaratás időpontjában a vírus-oltócsíratételből mintákat veszünk. Ha a mintákat nem azonnal vizsgáljuk, a felhasználásig 40 C alatti hőmérsékleten tartjuk őket. Felnőtt egerek. Legalább tíz, 15 20 g testtömegű felnőtt egérbe a vírusoltócsíratételből egyenként 0,03 ml-t injektálunk intracerebrálisan, 0,5 ml-t pedig intraperitoneálisan. Az állatokat legalább 21 napon át megfigyelés alatt tartjuk. A vizsgálat 24. órája után elhulló állatokat, valamint azokat, amelyeken betegség tünetei mutatkoznak, felboncoljuk és megvizsgáljuk a vírusfertőzés tüneteire. A vizsgálatokat egyrészt közvetlen makroszkópos megfigyeléssel végezzük, másrészt úgy, hogy a megfelelő szövetszuszpenziókat még legalább öt egérbe intracerebrálisan és intraperitoneálisan átoltjuk, s az egereket 21 napon át megfigyeljük. A vírusoltócsíratétel megfelel a vizsgálatnak, ha egy egéren sem mutatkoznak a vírusoltócsírának tulajdonítható fertőzés tünetei. A vizsgálat csak akkor értékelhető, ha az először beoltott egereknek legalább 80%-a túléli a megfigyelési időtartamot. Szopós egerek. Legalább húsz egérbe, amelyek legfeljebb 24 órája születtek, intracerebrálisan 0,01 ml-t, intraperitoneálisan pedig legalább 0,1 ml-t injektálunk a vírus-oltócsíratételből Az állatokat legalább 14 napon át, napi rendszerességgel megfigyelés alatt tartjuk. A vizsgálat 24. órája után elhulló állatokat, valamint azokat, amelyeken betegség tünetei lépnek fel, felboncoljuk és a vírusfertőzés bizonyítása céljából megvizsgáljuk. A vizsgálatot egyrészt közvetlen makroszkópos megfigyeléssel, másrészt a megfelelő szövetszuszpenziónak még legalább öt szopós
2.6.16. Vizsgálatok idegen kórokozókra Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.7.0 2 egérbe történő intracerebrális és intraperitoneális átoltásával végezzük. Ezeket az egereket 14 napon át, napi rendszerességgel megfigyelés alatt tartjuk. A vírusoltócsíratétel megfelel a vizsgálatnak, ha egy egéren sem mutatkoznak a vírusoltócsírának tulajdonítható fertőzés tünetei. A vizsgálat csak akkor értékelhető, ha az először beoltott egereknek legalább 80%-a túléli a megfigyelés időtartamát. Tengerimalacok. Legalább öt, 350 450 g testtömegű tengerimalacba intraperitoneálisan injektáljuk a vírus-oltócsíratétel 5,0-5,0 ml-ét. Az állatokat legalább 42 napon át megfigyeljük, tapasztalhatók-e rajtuk betegség tünetei. A vizsgálat 24. órája után elhulló állatokat, valamint azokat, amelyeken betegség tünetei lépnek fel, felboncoljuk és makroszkóposan vizsgáljuk; a szöveteket a vírusfertőzés bizonyítása céljából mind mikroszkóposan, mind tenyésztéssel megvizsgáljuk. A megfigyelési időtartamot túlélő állatokat leöljük és azonos módon vizsgáljuk. A vírus-oltócsíratétel megfelel a vizsgálatnak, ha egy tengerimalacon sem mutatkoznak a vírus-oltócsírának tulajdonítható fertőzés tünetei. A vizsgálat csak akkor értékelhető, ha a tengerimalacoknak legalább 80%-a túléli a megfigyelési időtartamot. VÍRUS-OLTÓCSÍRATÉTEL ÉS VÍRUSARATÁSOK A vírusaratás időpontjában mintákat veszünk. Ha a mintákat nem azonnal vizsgáljuk, a felhasználásig 40 C alatti hőmérsékleten tartjuk őket. Baktériumokra és gombákra vonatkozó sterilitási vizsgálat. 10 ml minta feleljen meg a Sterilitási vizsgálat (2.6.1) fejezet követelményeinek. Mikoplazmák. 10 ml minta feleljen meg a Mikoplazmák (2.6.7) fejezet követelményeinek. Mikobaktériumok (2.6.2). 5 ml mintát Mycobacterium fajokra vizsgálunk, olyan tenyésztési eljárásokat alkalmazva, amelyekről ismeretes, hogy ezen mikroorganizmusok kimutatására érzékenyek. Vizsgálat egyéb idegen kórokozókra sejttenyészetek alkalmazásával. Ha nincs más előírás, 500 humán adagnak megfelelő vagy 50 ml semlegesített vakcinamintát a kettő közül a nagyobb mennyiségűt majomvese-, valamint humán eredetű, folyamatos sejtkultúrákba oltva vizsgálunk. Ha a vírust majom- vagy humán sejtekben tenyésztették, a semlegesített vírusaratást ezen sejteknek egy másik tenyészetében is vizsgáljuk. Amennyiben az oltóanyag vírusát emlős vagy madár eredetű nem emberből vagy majomból származó sejtkultúrában tenyésztették, az
2.6.16. Vizsgálatok idegen kórokozókra Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.7.0 3 illető fajnak egy másik tenyészetből származó sejtjeit szintén beoltjuk. A sejteket 36±1 C-on inkubáljuk, és 14 napon át megfigyeljük. A vírus-oltócsíratétel vagy az aratás megfelel a követelményeknek, ha a sejttenyészetek egyike sem utal idegen kórokozók jelenlétére. A vizsgálat csak akkor értékelhető, ha a sejttenyészeteknek legalább 80%-a életképes marad. Madár vírusok (a vizsgálat elvégzése csak madárszövetekben tenyésztett vírusoltócsíratételekre és elsődleges madárszövetekben tenyésztett vírusaratásokra kötelező). 100 humán adagnak megfelelő vagy 10 ml vakcinamintát a kettő közül a nagyobb mennyiséget semlegesítünk. A készítményből 0,5 0,5 ml-t oltunk be 9 11 napos előkeltetett SPF tojások allantois-üregeibe és 5 7 napos előkeltetett SPF tojások tojássárgáiba. A tojásokat 7 napon át inkubáljuk. A vírus-oltócsíratétel vagy a vírusaratás megfelel a vizsgálat követelményeinek, ha sem az allantois- sem a tojássárgája-folyadékokban nem mutatható ki hemagglutináló ágens, és ha a makroszkópos patológiai vizsgálatban minden embrió és mindegyik korioallantoismembrán normális állapotúnak bizonyul. A vizsgálat csak akkor értékelhető, ha a beoltott tojásoknak legalább 80%-a 7 nap után is életképes marad. Rovar vírusok (csak rovarsejtekben tenyésztett vírusokra kötelező). Ha nincs más előírás, 500 humán adagnak megfelelő vagy 50 ml semlegesített vakcinamintát a kettő közül a nagyobb mennyiségűt idegen kórokozók jelenlétére legalább egy sejtkultúrába oltva vizsgálunk. A sejttenyészetnek különböznie kell a gyártás során használttól, valamint alkalmasnak kell lennie rovar vírusok tenyésztésére és humán arbovírusok kimutatására. A kiválasztott sejteket az illetékes hatóságnak kell jóváhagynia. A kiválasztásnál figyelembe kell venni a gyártásnál használt sejtek eredetét, továbbá azokat a szennyezőket is, amelyek kimutatására a kiválasztott sejtvonal alkalmas lehet. A sejteket 27±1 C-on inkubáljuk és 14 napon át megfigyelés alatt tartjuk. A vírus-oltócsíratétel vagy -aratás megfelel a vizsgálat követelményének, ha egyetlen sejttenyészetben sem mutatkoznak idegen kórokozó jelenlétének jelei. A vizsgálat csak akkor értékelhető, ha a sejttenyészetek legalább 80%-a életképes marad. TERMELŐ SEJTTENYÉSZET: KONTROLLSEJTEK A kontrollsejteket a beoltott termelő sejttenyészetek teljes inkubációs ideje folyamán vagy az előállító tartály beoltását követő legalább 14 napon át a kettő közül a hosszabb ideig mikroszkóposan vizsgáljuk, hogy megállapítsuk, mentesek-e citopatológiás elváltozást okozó vírusoktól. A vizsgálat csak akkor értékelhető, ha a
2.6.16. Vizsgálatok idegen kórokozókra Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.7.0 4 kontroll sejttenyészeteknek legalább 80%-a a megfigyelési időtartam végéig életképes marad. 14 nap elteltével vagy az utolsó vírusaratás időpontjában a kettő közül a hosszabb időtartamot választva elvégezzük az alábbi vizsgálatokat. Hemadszorbeáló vírusok. A kontroll sejttenyészetek legalább 25%-át vizsgáljuk hemadszorbeáló vírusok jelenlétére, tengerimalacból származó vörösvértestek hozzáadásával. Ha a hemadszorbeáló vírusok jelenlétére végzett vizsgálat nem kivitelezhető, hemagglutináló vírusok jelenlétére végzünk vizsgálatot. Felhasználás előtt a vörösvértestek 5±3 C-on legfeljebb 7 napig tárolhatók. A tenyészetek felét 30 percen át 5±3 C-on, a másik felét pedig 30 percen át 20 25 C-on történő inkubálás után értékeljük. Hemadszorbeáló ágensek ne legyenek kimutathatók. Vizsgálatok egyéb idegen kórokozókra, sejttenyészetek felhasználásával. A kontrollsejtek felülúszó folyadékait egyesítjük, és majomvese-, valamint humán eredetű sejttenyészetekbe történő beoltással vizsgáljuk. Ha az oltóanyag vírusát más nem emberből vagy majomból származó emlős sejtrendszerben tenyésztették, az illető fajnak egy másik sejttenyészetéből származó sejtjeit szintén beoltjuk. Mindegyik sejtrendszerben legalább 5 ml-t vizsgálunk. A beoltott tenyészeteket 36±1 C-on inkubáljuk, és 14 napon át megfigyeljük. Idegen ágensek nem lehetnek jelen. Ha a termelő sejttenyészetet 36±1 C-tól eltérő hőmérsékleten inkubáljuk, az idegen ágensekre történő vizsgálatot az előállítás hőmérsékletén is elvégezzük. A vizsgálathoz ugyanolyan sejttípust használunk, mint amelyet a vírus tenyésztéséhez alkalmaztak. Ha a vírust rovarsejtekben tenyésztették, az egyesített felülúszót is tovább oltjuk legalább egy olyan további sejtkultúrába, amely különbözik a gyártás során használttól, valamint rovar vírusok tenyésztésére és humán arbovírusok kimutatására is alkalmas. Madár leukózisvírusok (a vizsgálat elvégzése csak az elsődleges madárszövetekben tenyésztett vírusokra kötelező). A vizsgálatot a kontrollsejtek felülúszó folyadékának 5 ml-ével végezzük. KONTROLLTOJÁSOK
2.6.16. Vizsgálatok idegen kórokozókra Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.7.0 5 Hemagglutináló ágensek. Mindegyik tojásból 0,25 ml allantois-folyadékot vizsgálunk oly módon, hogy csirke-vörösvértestekkel közvetlenül összekeverjük. A hemagglutináló ágensek vizsgálatát SPF tojásokba történő átoltás után is elvégezzük, a következőképpen: a kontrolltojások egyesített amnion-folyadékának 5 ml-ét 0,5 ml-es részletekben SPF tojások allantois- és amnion-üregébe oltjuk. A kontrolltojások megfelelnek a vizsgálat követelményének, ha a két vizsgálat egyikében sem mutathatók ki hemagglutináló ágensek. Madár leukózisvírusok. A kontrolltojások egyesített amnion-folyadékának 10 ml-ét vizsgáljuk. Ötszörös átoltással dúsítást végzünk leukózis-mentes csirkeembriósejtkultúrákban; madár leukózisvírusok vizsgálatához az ötödik átoltásból származó sejteket használjuk. A kontrolltojások megfelelnek a vizsgálatnak, ha madár leukózisvírus nem mutatható ki. Egyéb idegen kórokozók. A kontrolltojások egyesített amnion-folyadékának 5 mles részleteit humán és majom eredetű sejttenyészetekbe oltjuk. A sejttenyészeteket 14 napon át megfigyeljük. A kontrolltojások megfelelnek a vizsgálat követelményének, ha idegen kórokozók nem mutathatók ki. A vizsgálat csak akkor értékelheő, ha a beoltott tenyészeteknek legalább 80%-a a megfigyelési időtartam végéig életképes marad.