A folyadékkromatográfiás laboratóriumi gyakorlatokhoz szükséges elméleti alapok Tartalomjegyzék 1. BEVEZETÉS... 2 2. A FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA ÁLLÓFÁZISAI... 2 2.1 SZILIKAGÉL ALAPÚ ÁLLÓFÁZISOK ÉS JELLEMZÉSÜK... 3 2.1 NORMÁL FÁZISÚ ÁLLÓFÁZISOK... 5 2.1.1 Szilikagél fázisok... 5 2.1.2 Alumínium-oxid fázisok... 5 2.1.3 Kémiailag módosított poláris fázisok... 6 2.2 SZILIKAGÉL ALAPÚ ÁLLÓFÁZISOK A FORDÍTOTT FÁZISÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁBAN... 6 2.3.1 Monomer fázisok... 7 2.3.2 Átmeneti módosítású fázisok... 8 2.3.3 Polimer módosítású fázisok... 8 2.3.4 Utószilanizálási reakciók... 9 3. MOZGÓFÁZISOK AZ RP-HPLC-BAN... 9 3.1. ELUENSERŐSSÉG...10 3.2. SZELEKTIVITÁS...10 3.3. PUFFEREK HASZNÁLATA...11 Savas jellegű funkciós csoportot tartalmazó vegyületek...11 Bázikus jellegű funkciós csoportot tartalmazó vegyületek...12 4. A FOLYADÉKKROMATOGRÁF FELÉPÍTÉSE...12 5. DETEKTOROK ALAPVETŐ JELLEMZŐI...14
1. Bevezetés A kromatográfiás technikák alkalmazásával hasonló fizikai-kémiai tulajdonságú vegyületek elválasztását tudjuk megoldani. A nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiában az álló fázis feletti nyomáskülönbség hatására kényszeráramot hozunk létre. Minden egyes komponens a mozgó fázisban azonos sebességgel halad. Az észlelt eltérő sebességkülönbség, abból ered, hogy az egyes komponensek mennyi időt töltenek az állófázison. Összefoglalva: a folyadékkromatográfiás elválasztás alapja, hogy a különböző fizikai-kémiai tulajdonságú komponensek megoszlása a mozgó- és az állófázis között eltérő. A folyamatnak reverzibilisnek kell lennie, ebből következik, hogy a folyamatot a fizikai szorpció kategóriájába soroljuk. A nagyhatékonyságú elválasztási módszereknél elúciós technikát alkalmazunk, melynek a három fő kritériuma: 1. minta bevitele dugószerűen történik; 2. mozgófázis a kromatogram kifejlesztése alatt állandóan áramlik az állófázis felett; 3. mozgófázis átlagos szorpciója kisebb mértékű, mint a legkevésbé kötődő komponensé. A harmadik kritériumra azért van szükség, mert az egyes folyadékkromatográfiás módszereknél a mozgófázis egyes komponensei önmagukban jobban szorbeálódnak az állófázison. Így a mozgófázis a vizsgálandó komponenst vagy kiszorítja az állófázis felületéről, vagy az a már adszorbeált rétegen kötődik meg. A gázkromatográfia matematikai leírásánál megismert fogalmak (retenciós idő, holtidő, korrigált retenciós idő, retenciós tényező, fázis arány, szelektivitási tényező, felbontás tányérszám, HEPT) a folyadékkromatográfia esetén is jól alkalmazhatók a kromatográfiás folyamat leírására. Ezen fogalmak ismerete a folyadékkromatográfiás gyakorlatokon is elvárt. 2. A folyadékkromatográfia állófázisai Az elmúlt évtizedek fejlesztéseinek eredményeként a folyadékkromatográfiás állófázisok (töltetek) választéka ma már rendkívül nagy. Fajtáikat, minőségüket és alkalmazhatóságukat elsősorban az egyes folyadékkromatográfiás módszereknél részletezett különböző elválasztási mechanizmusok határozzák meg. A fentieken túlmenően a folyadékkromatográfiás töltetek néhány fontosabb műszaki, egyben az elválasztás hatékonyságát (felbontóképességét) meghatározó paraméterei: a szemcseméret és alak, a szemcseméret eloszlás, a töltet szerkezete, pórusmérete, stabilitása. 2
A folyadékkromatográfiás töltetek szemcsemérete alapvetően meghatározza az oszlopban kialakítható nyomásesést és áramlási sebességet, illetőleg az elválasztás felbontóképességét. Általános szabályként megállapítható, hogy a szemcseméret csökkentésével csökken az elméleti tányérmagasság, tehát nő az oszlop felbontóképessége. Kisebb felbontóképességű preparatív oszlopokban általában 40-400µm, kisebb, félpreparatív oszlopokban 10-40µm méretű szemcséket alkalmaznak. Az analitikai nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás (HPLC) oszlopok tölteteinek szemcsemérete rendszerint 1.8, 3 vagy 5µm. A folyadékkromatográfiás töltetek szemcséinek optimális formája a gömbszimmetrikus (szferoid) alak, amely az oszlopban a szemcsék között viszonylag egységes tereket hoz létre és hidrodinamikailag a legkedvezőbb áramlási viszonyokat és a legkisebb nyomásesést biztosítja. A fentiekkel összhangban az a törekvés, hogy a szemcsék méretének eloszlása ideálisan homodiszperz, vagy lehetőség szerint a legszűkebb eloszlású legyen. A szemcsék belső szerkezete a felszínen kialakított aktív helyek, funkcionális csoportok tekintetében jelentős fejlődésen ment keresztül. A kezdetben irreguláris, majd homogén, ún. monodiszperz részecskéket felváltották a felületükön módosított réteges szerkezetű, ún. pellikuláris töltetek, továbbá a folyadékáramlás szempontjából átjárható tulajdonságokkal és lényegesen nagyobb fajlagos felülettel rendelkező, erősen porózus és permeábilis ún. perfúziós és makropórusos (wide-pore, 100-300µm) szemcsék. A nagytisztaságú alkoxi szilánból tömbpolimerizációval előállított, makropórusokból (2 m) és mezopórusokból (13 nm) felépített bimodális szerkezetű ún. monolitikus (szilika) oszlopok kifejlesztése az utóbbi évek egyik jelentős újítása volt. Ez a tömör oszlop (újabban C18 fordított fázisú formában is) nagy áramlási sebességekkel és kis nyomáseséssel gyors elemzésekhez kiválóan használható. A folyadékkromatográfiás töltetek stabilitására vonatkozóan általános igény, hogy a kémiai (ph), mechanikai, hő, bakteriális, stb. hatásokkal szemben ellenállóképesek legyenek. 2.1 Szilikagél alapú állófázisok és jellemzésük A nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiában a kis molekulatömegű anyagok elválasztásakor (M w < 10000) a szilikagél alapú állófázisok használata közelítőleg 90%-os. Ahhoz, hogy a különböző folyadékkromatográfiás módszereket megértsük, szükséges a folyadékkromatográfiás célra használt szilikagél szerkezetének és tulajdonságainak közelebbi ismerete. A kromatográfiás célra használt szilikagél porózus szerkezetű, így a szerkezetéről kevés a megbízható információ, továbbá a porózus szilikagél termodinamikailag és kinetikailag nem stabil forma. Ebből következik a termodinamikában jól ismert tétel, hogy a nem egyensúlyi állapotban lévő rendszerek az egyensúly elérésére törekszenek. Szilikagél esetén ez a stabil forma a nem porózus, kristályos szerkezet, például a kvarc. Minél jobban eltér egy rendszer az egyensúlytól, annál nagyobb a hajtóerő az egyensúly elérésére. A szilikagél előállítási körülményeitől függ, hogy a nem kristályos szerkezetű, amorf, porózus szilikagél milyen távol van az egyensúlyi állapottól. Kromatográfiás szempontból ez egyben annyit is jelent, hogy az eltérő módon 3
előállított és utókezelt szilikagélek kromatográfiás tulajdonságai eltérőek. Ahhoz, hogy a szilikagélek kromatográfiás viselkedését megértsük, szükséges annak ismerete, hogy a felületen milyen, adszorpciós szempontból eltérő tulajdonságú csoportok vannak. A szilikon kémiából köztudott, hogy két szilícium atom közvetlenül, csak kivételes esetben kapcsolódik. Két szilícium atom egy oxigénatomon keresztül kapcsolódik: Az - Si - O - Si - kötés kevésbé polarizált, s így végső soron apolárisnak tekinthető. A mozgó fázis felé irányuló hidroxil csoportokat szilanol csoportoknak nevezzük. Szabad szilanol Geminális szilanol Asszociált szilanol 1. ábra: A szilanol csoportok fajtái A szilikagél felületén egy ill. két (geminális) szilanolcsoportot tartalmzó szilícium atom is előfordulhat. A két hidroxilcsoportot tartalmazó szilícium atom létezését azonban még napjainkban sem sikerült egyértelműen bizonyítani. Az egy szilanolcsoportot tartalmazó szilícium atomok távolságától függően eltérő lehet a csoportok aktivitása. Ha a szilanolcsoportok olyan geometriai helyzetben vannak, hogy nem lehetséges a két csoport között H-hidas kölcsönhatás, akkor beszélünk izolált, vagy szabad szilanol-csoportokról. Ha pedig a két szilanolcsoport H-hidas kötést tud biztosítani, akkor H-hidas kötésben lévő, vagy vicinális szilanol-csoportokról beszélünk. Mikor a szilanolcsoportok H-hidas kötést hoznak létre a vízzel, akkor dezaktivált szilanolcsoportokról beszélünk. H H O H H O O Si Si O O O O O 2. ábra: Dezaktivált szilanol csoportok Kromatográfiás elválasztásnál az eltérő aktivitású szilanolcsoport eltérő retenciót és szelektivitást eredményez. 4
2.1 Normál fázisú állófázisok A normál fázisú kromatográfia (NP Normal Phase) során a poláris(abb) állófázison apoláris(abb) mozgófázissal (legtöbbször közepesen) poláris tulajdonságú vegyületeket, molekulákat akarunk elválasztani. A kezdeti kromatográfiás kísérletek normál fázisú elválasztások voltak, elsőként Zwett klorofillokat választott el krétaporon petroléter segítségével. Napjainkban a normál fázisú kromatográfia elterjedt állófázisai az alábbiak: szilikagél; alumínium-oxid; szilikagélhez kémiailag kötött poláris csoportot tartalmazó fázisok pl.: ciano, amino, diol, nitro stb.. 2.1.1 Szilikagél fázisok A szilikagél alapváz SiO 4 tetraéderekből áll, valamint a szilikagél felszíne szilanol-csoportokkal (-OH) borított. Nagy mechanikai stabilitása miatt az elsőszámú állófázis a normál fázisú folyadékkromatográfiában. Az oszlop töltése során alkalmazott nyomás meghaladhatja az 1000 bar körüli értéket is. A szűk szemcseméret eloszlás fontos, mert a kisebb szemcsék az oszlopot érő nyomásterhelés hatására beékelődnek a nagyobb szemcsék közötti járatokba, jelentősen megnövelve a nyomásesést. A szilikagél, a szilanol-csoportokból kifolyólag, minden olyan anyaggal kölcsönhatásba lép, amellyel hidrogén hidas kölcsönhatást tud kialakítani. Mint ahogy már korábban megismertük a szilikagél felületen eltérő tulajdonságú szilanolcsoportokat találunk. A szabad szilanol-csoportok egymástól 0,5 nm-nél nagyobb távolságra vannak. Ha ennél kisebb a távolság, akkor hidrogén hidak alakulnak ki az egyes szilanol-csoportok között, melyek nagyban csökkentik az állófázis aktivitását. Összegezve a szilikagél felülete energetikailag heterogén, nem mutat egységes adszorpciós tulajdonságokat kromatográfiás szempontból. A normál fázisú szilikagél állófázisok egyik fő hátránya a vízérzékenységük. A mindennapos gyakorlatban jól ismert, hogy a szilikagélek jó vízmegkötő anyagok. Kromatográfiás szemszögből ez annyit jelent, hogy a felületen adszorbeálódott víz erősen kötődik a szilanol-csoportokhoz, kizárva a vizsgálandó komponens állófázishoz való hozzáférhetőségét, azaz dezaktiválja. 2.1.2 Alumínium-oxid fázisok Igen sokféle alumínium-oxid állófázis létezik a változatos technológiai folyamatok miatt, ezért jelentős különbségek vannak az egyes fázisok között. Fajlagos felülete kisebb, mint a szilikagélé, valamint a pórusszerkezete sem annyira ismert. A pórusalak és átjárhatósági problémák miatt a zónaszélesedés általában nagyobb, mint a szilikagélt tartalmazó kolonnák esetében. Vízre hasonlóan érzékeny, mert a felületén ugyanúgy OH csoportok találhatók. Általában lúgosan kezelt ill. közel semleges töltettel rendelkező kolonnákat hoznak 5
forgalomba, ezért az alumínium-oxid használható olyan vegyületek vizsgálatára, melyek savkatalízisre bomlanak, így a szilikagélen nem mérhetők. 2.1.3 Kémiailag módosított poláris fázisok A kémiailag módosított töltetek kifejlesztésnek több oka volt: víz dezaktiváló hatásának csökkentése szilikagélen; szelektivitás növelése. A szilikagél felületén található szilanol-csoportokat poláris funkciós csoportot tartalmazó vegyülettel szilanizálva energetikailag homogénebb felületet kapunk, melynek a kromatográfiás viselkedése kedvezőbb. A töltet kevesebb aktív helyet tartalmaz, mivel a szilanizálási reakció során a szilanol-csoportok legfeljebb 60%-a vihető csak reakcióba. A szabadon maradt szilanol-csoportok nagy részét a szilanizálószer metil-csoportjai leárnyékolják, így a vizsgált minta komponensei számára nem hozzáférhetők. A módosításra használt kémiai reakció lehet Grignard-reakcióval létrehozott -Si- C- kötés, de ez nehezen kivitelezhető. Napjainkban legelterjedtebb a -Si-O-Si- kötésű módosított fázisok előállítása. Az alábbi ábrán egy propil-amino csoport figyelhető meg. A bevitt csoport Si atomján két darab árnyékoló metil-csoport és egy a távtartó propilén csoporthoz kapcsolódó amino-csoport található. Az amino-csoport természetesen más csoportokkal is helyettesíthető: ciano, nitro CH 3 Si O CH 3 H 3 C Si NH 2 CH 3 3. ábra Ezek az állófázisok a mozgófázis polaritásától függően használhatók normál és fordított fázisként. 2.2 Szilikagél alapú állófázisok a fordított fázisú folyadékkromatográfiában A fordított fázisú (RP Reverse Phase) HPLC-ben a mozgófázis polárisabb az állófázisnál, míg a hamarabb kialakult, és így vonatkoztatási alapul szolgáló normál" fázisú folyadékkromatográfiánál az állófázis a polárisabb. Innen ered a fordított jelző. A gyakorlatban alkalmazott állófázisok nagy része, nagy mechanikai stabilitással bíró, módosított szilikagél. Maga a szilikagél gyakorlatilag polikovasavnak tekinthető, mivel savas karakterű hidroxil-csoportok borítják felületét. A felületet leggyakrabban 6
valamilyen szilanizálási reakcióval módosítják. Az alkalmazható ph tartományt a szilikagél oldhatósága szabja meg, amely 8-9-es ph-nál van. A kétszeres utószilanizálással (lásd: később) kezelt fázisok esetében a felső ph-határ 10-ig is kitolható. Alacsonyabb, savasabb ph-n viszont a szilanizálással a felületre felvitt csoportok hidrolízisének sebessége jelentősen megnő, így az alkalmazhatóság alsó korlátja 1 2 ph között van. A szilikagél felületén lévő fémionok gyengítik a közelükben lévő szilanol-csoportoknál a ligandum és az oxigénatom közötti kötést, ami a hidrolízis sebességét, azaz az alkalmazhatóság alsó ph-korlátját emeli meg. A fordított fázisú HPLC-ben használatos szilikagél alapú fázisokat a módosítás szempontjából három csoportra oszthatjuk: Monomer módosítású fázis; Átmeneti módosítású fázis; Polimer módosítású fázis. 2.3.1 Monomer fázisok Monofunkciós klór-szilánok alkalmazásával a szilanizálási reakció során sósav kilépés mellett a szilanol-csoportra köthető a felületmódosításra kiválasztott alkilcsoport. A reakció során a szilanol-csoportok kb. 50-60%-a vihető reakcióba, mivel a már a felületre bevitt ligandumok metil-csoportjai leárnyékolják a felület egy bizonyos részét. A fellépő sztérikus gátlás miatt reagálatlan, szabad" szilanol-csoportok maradnak a szilikagél felületén. Ebből következik, hogy teljesen borított fordított fázisú felület nincsen. A reakció nyomonkövetéséből megállapítható, hogy mennyi szilanol-csoport reagált, de azt nem tudjuk megállapítani, hogy adott mérési körülmények között mennyi szilanolcsoport lesz hozzáférhető a mintakomponensek számára. Hozzáférhető szilanol-csoportok Leárnyékolt szilanol-csoportok 3 ábra: A szilanol csoportok fajtái A létrehozott fordított fázisú töltet jellemezhető a hidrofób és a hidrofil felület arányával. A hidrofób felületet alkotó pl. C 18 -as alkil-láncok gyenge diszperziós kölcsönhatásra képesek (kb. 4-20 kj/mól), míg a szilanol-csoportok erősebb H-hidas kölcsönhatást tudnak kialakítani a mintakomponensekkel (kb. 50-80 kj/mól). Mivel a H-hidas kölcsönhatás lényegesebben erősebb, ezért a szabad szilanol-csoportok 7
mennyiségében történő kis változás a felület energetikai viszonyaira nézve nagy változáshoz vezethet. Az eltérő energetikai viszonyok miatt más lesz a töltet minősége, a mintakomponensek másképp fognak viselkedni. A hidrofób és a hidrofil felület arányát ezért mindenképpen kontrollálni kell. 2.3.2 Átmeneti módosítású fázisok A szilikagél módosításának második formája, amikor bifunkciós klór-szilánokat alkalmaznak a szilanizálási reakcióban arra törekedve, hogy egy reakciólépésben két szilanol-csoportot vigyenek reakcióba. A valóságban a reakciónak egy másik útja is lejátszódik, melynél csak egy szilanol-csoport reagál. Víz jelenlétében a klór-szilán reagálatlan klóratomja hidroxil-csoportra cserélődik, ami pedig jól hozzáférhető a szililezőszer számára. A reakcióközeg természetesen mindig tartalmazhat vizet, mivel a szilikagél módosításának első lépése a sziloxán-csoportok vizes mosással történő hidrolízise. A szilanizálási reakcióval új, hozzáférhető szilanol-csoportok jelentek meg a felületen, ami megváltoztatta a hidrofób/hidrofil felületarányt. Így egy eltérő tulajdonságú állófázist kapunk a monomer módosításhoz képest, sarzsról-sarzsra (batch-to-batch) változhat a gyártott töltetek minősége. 2.3.3 Polimer módosítású fázisok A szilikagél módosítása trifunkciós klór-szilánokkal is megvalósítható. Matematikailag legfeljebb csak két sziloxán-kötéssel tud a felülethez kapcsolódni a reakciópartner, így a szililezőszeren biztosan marad etoxi-csoport vagy klór atom. Hidrolízist követően a szilanizálási reakció folytatódik. Ebben az esetben a felületen térhálós polimer jön létre. A gyakorlatban így állítják elő a polimer módosítású 3 ábra: Polimer fázis szerkezete szilikagél állófázisokat. A polimer módosítású állófázisok felületén vannak hozzáférhető és leárnyékolt szilanol-csoportok. A hozzáfetöség függ a polimer szerkezetétől, azaz hogy az adott komponens mennyire tud behatolni ebbe a térhálós rendszerbe. Az előállítási reakciókban triklór-szilánt vagy trietoxi-klórszilánt használnak. A három reakcióképes csoport közül vagy egy, vagy kettő reagál a szilikagél határfelületén található szilanol-csoportokkal. A reakció elegyben víz is 8
található ez hidrolizálja a nem reagált csoportokat, reakcióképes szilanol-csoportokat eredményezve. Az elindított láncreakció eredményeképp, mivel a folyamat két helyen is mehet tovább, valamint a folyadékfázisban keletkező előpolimerek is reagálhatnak az új, reakcióban keletkező szilanol-csoportokkal, az eredmény térhálós szilikon-polimer. Innen az elnevezés: polimer módosítású szilikagél. 2.3.4 Utószilanizálási reakciók Abban az esetben, ha az adott elválasztási feladatban ki akarjuk használni a szilanol-csoportok által nyújtott poláris szelektivitást, akkor az átmeneti vagy polimer módosítású állófázist célszerű választani. Ha azonban a szabad szilanol-csoportok hatására zónaszélesedést kapunk, akkor olyan töltetet kell alkalmazni, melynél a hozzáférhető szilanol-csoportokat ún. utószilanizálási (endcapping) reakcióval átalakították. Az utószilanizálást általában olyan vegyületekkel végzik, amelyek kellően kisméretűek ahhoz, hogy a zegzugos térhálós szerkezetbe beférjenek. Jól alkalmazható erre a célra a trimetil-klór-szilán, melynél a CH 3 -Si-CH 3 ligandumok térigénye szabja meg, hogy mennyire férnek hozzá a szilanol-csoportokhoz. 3. Mozgófázisok az RP-HPLC-ban A fordított fázisú folyadékkromatográfiában az alkalmazott mozgófázisokkal szemben támasztott általános követelmények a következők: tisztasági követelmény: a lehető legtisztább oldószert kell használni kompatibilitás a detektorral (pl. jó UV-fény áteresztőképesség (UV cut-off)) kis viszkozitás a mintakomponenseknek jól kell oldódniuk a mozgófázisban nem tartalmazhat szilárd anyagot alacsony toxicitás módszer-specifikus követelmény, hogy a mozgófázisnak polárisabbnak kell lennie, mint az állófázisnak Ezeknek a kritériumoknak a víz általában megfelel, hiszen kellő tisztaságban 190 nm-ig nem nyel el UV-fényt és kis viszkozitású (% = 1 cp). A szerves molekulák tekintélyes része azonban nem oldódik vízben, ezért növelni kell a mozgófázis oldóképességét, ami a vízzel elegyedő szerves oldószerek vízhez keverésével történik. Az etanol és a 2-propanol nagy viszkozitással rendelkező oldószerek, ezért csak ritkán alkalmazhatók. A kellő tisztaság biztosítása az acetonitril esetében a legnehezebb probléma. Az acetonitril szennyezői az aceton és a benzoenitril. A kereskedelmi forgalomban általában négy fajta minőségben kapható acatonitril:a legtisztább a hypergrade, ezt követi az ugyancsak nagytisztaságú (gradientgrade), az izokratikus mérésekhez használatos normál HPLC-s minőség, és a 230 nm isocratic jelzésű. A metanol, etanol, 2-propanol vízzel hidrogénhidas kölcsönhatásba lép, ezért a biner elegyek viszkozitása az összetételtől függően, jellemzően maximumos görbe szerint változik. Az acetonitril a vízzel dipól-dipól kölcsönhatásra képes, melynek 9
erőssége kisebb a hidrogén-hidas kölcsönhatásénál. A biner elegy viszkozitása az összetétel függvényében egy lapos görbe mentén alakul. Tekintettel arra, hogy a nagyobb hatékonyság elérése érdekében egyre kisebb átlagos szemcseátmérőjű kolonnák kerülnek forgalomba fontos szempont, hogy a viszkozitás értéke kicsi legyen, mert a kolonnán eső nyomás értéke egyenes arányban változik a viszkozitással. Ebből a szempontból jól láthatóan az acetonitril sokkal kedvezőbb, mint a metanol. Viszont azt sem szabad elfelejteni, hogy a viszkozitás a hőmérséklet emelésével csökken, így a kolonnán létrejövő nyomásesés is. 3.1. Eluenserősség A fordított fázisú folyadékkromatográfiás körülmények között az állófázis változó felületének jelentős szerepe van a visszatartás kialakításában, ezért nincs egzakt megközelítés az eluotróp (eluenserősségi) sorrend felállításában. Tekintsünk egy tökéletesen borított felületű, nagy ligandsűrűségű C 18 -as állófázist. Ilyen körülmények között csak diszperziós kölcsönhatás léphet fel az állófázis és a vizsgált molekula között, ami a kölcsönhatási felületek nagyságával arányos. Ilyenkor: elúciós erő víz < metanol < acetonitril < etanol < 2-propanol < tetrahidrofurán A biner elegyek viszkozitási sorrendje adott összetételnél az alábbiak szerint alakul: víz - 2-propanol > víz-etanol > víz-metanol > víz - acetonitril 3.2. Szelektivitás A gyakorlatban sokkomponensű minták elválasztásánál a legnehezebb feladatot a közel azonos tulajdonságú anyagok elválasztása jelenti. Ha jól borított állófázison dolgozunk és a mintakomponensek nem férnek hozzá a hidrofil felülethez (szilanolcsoportok), akkor az elúciós erősség növelésével a szelektivitás csökken (az állófázis tökéletes borítása természetesen nem valósítható meg, de engedjük meg ezt a közelítést). Tekintsük metanol, acetonitril és tetrahidrofurán biner elegyét vízzel és vizsgáljuk meg a felületi jelenségeket. A felületen immobilizált hidrofób alkilláncok taszítják a vizet, a szerves oldószerből azonban az oldószer polaritásától függő vastagságú adszorpciós réteg alakul ki az állófázis felületén. Ez az oldószerréteg a tetrahidrofurán esetében a legvastagabb, mivel az alkilláncok ebben oldódnak legjobban a három oldószer közül. Legkevésbé metanolban szolvatálódnak, így a felületen adszorbeálódott oldószerréteg metanol esetében a legvékonyabb, míg az acetonitril e tekintetben a két végső állapot közötti. Metanol alkalmazása esetén az alkilláncok a felület közelében helyezkednek el, mivel nem szolvatálódnak jól a viszonylag poláris oldószer alkotta felületi rétegben. Az alkilláncok a felületre borulnak, ezáltal a szabad szilanol-csoportok nagyrészét elfedik a mintakomponensek elöl ( hidrofób zár" alakul ki). Acetonitrilben valamivel jobban 10
szolvatálódnak a felületre kötött alkilláncok, az előbb említett hidrofób zár nem borítja olyan mértékben a felületet, mint a metanol esetében, ezáltal megnő a hozzáférhető szilanol-csoportok száma. Tetrahidrofuránban az alkilláncok nagyon jól szolvatálódnak, a felületi vastag oldószerrétegben kinyílnak, szabadon lobognak", ami még több szilanol-csoportot tesz hozzáférhetővé a mintakomponensek számára. Jól látható, hogyha a szilanol-csoportok H-hidas poláris szelektivitását szeretnénk kihasználni, akkor tetrahidrofuránt kell alkalmaznunk az eluens szerves komponenseként. Ez esetben azonban elvesztettük a mozgó fázis szelektivitását, amely könnyen növelhető víz- tetrahidrofurán - metanol terner elegy alkalmazásával. Ennek akkor van jelentősége, ha az elválasztandó komponensek között erős H-hidas kölcsönhatásra alkalmas vegyület is van, megfelelő funkciós csoporttal. Jól látható, hogy mind a mozgó fázis, mind az állófázis oldalát tekintve számolnunk kell a szelektivitás hangolásával. 3.3. Pufferek használata Ionos és könnyen ionizálható anyagok vizsgálata esetén az előnytelen erős kölcsönhatások kiküszöbölése végett elengedhetetlen a mozgó fázis ph-kontrollja, illetve ezt biztosítandó az eluens pufferelése. A megfelelő ph beállításához ismernünk kell az elválasztandó komponensek pk a -értékét, illetve az alkalmazni kívánt anyag pufferkapacitását a ph függvényében. Savas jellegű funkciós csoportot tartalmazó vegyületek A savas funkciós csoportot tartalmazó vegyületek a ph-tól függően két molekuláris állapotban lehetnek jelen, melyek az eluensben való oldhatósága eltérő. Ebből következik, hogy ha ph-kontroll nélkül próbálnánk mérni és a körülmények megváltoznak, a molekuláris formák aránya is változni fog, ami pedig a retenció megváltozását eredményezi. A fentiekből egyértelműen kitűnik, hogy a ph-kontroll célja: biztosítani a mozgó fázisban a molekuláris formák arányának állandóságát, illetve hogy kizárólag az egyik vagy másik forma legyen jelen. Tekintsük például a benzoesav viselkedését különböző ph tartományok esetén: A ph=pk a -2 értéknél savasabb tartományban a vegyület ionos formája alig van jelen. A kölcsönhatási formák száma kicsi, keskeny a csúcs, nagy a visszatartás, robosztus a módszer; A ph=pk a +2 értéknél lúgosabb tartományban a molekula ionos formában van, a kölcsönhatási formák száma kicsi, csúnya csúcsalak, kicsi a visszatartás; A ph=pk a ±2 tartományban a molekula mindkét formája jelen van, a visszatartás (retenció) attól függ, hogy milyen a két forma aránya. Több kölcsönhatás típus játszik szerepet az elválasztásban, s mivel ez zónaszélesedéshez vezet, a csúcs általában széles. A módszer nem robosztus, mivel már kis ph változás esetén a két molekulaforma arányának megváltozása miatt jelentős retencióváltozás következhet be. 11
Bázikus jellegű funkciós csoportot tartalmazó vegyületek A bázikus funkciós csoportot tartalmazó vegyületek, hasonlóan a savas funkciós csoportot tartalmazó molekulákhoz, szintén két molekuláris állapotban lehetnek jelen a ph-tól függően. Tekintsük a fenil-amin viselkedését különböző ph tartományok esetén: A ph=pk a -2 értéknél savasabb tartományban a molekula ionos formában van jelen; A ph=pk a +2 értéknél lúgosabb tartományban ionos formában alig van jelen A ph=pk a ±2 tartományban a molekula mindkét formája jelen van, a savas funkciós csoporttal rendelkező molekulák esetében tapasztaltak érvényesek. 4. A folyadékkromatográf felépítése Technikailag a folyadékkromatográfia zárt térben (oszlop, cső, túlnyomásos réteg), vagy nyitott, sík (planáris) rendszerben (rétegkromatográfia) valósítható meg. A folyadékfázisú oszlopkromatográfia legegyszerűbb formája az egyik végén szűrőbetéttel ellátott és az állófázissal megtöltött cső (üveg, műanyag, fém), amelyen keresztül az mozgófázis (eluens) valamely kényszer hatására (gravitációshidrodinamikus nyomás, ejtőedény, pumpa) áthalad. A mozgófázissal az oszlopba bemosott anyagkeverék (minta) összetevői az állófázison optimális esetben szétválnak és az oszlop végén alkalmas berendezéssel detektálhatók, illetőleg frakcionáltan összegyűjthetők. Zárt térben a folyadékáramlás a berendezés szerkezetétől és dimenzióitól függően: - kis (gravitációs-hidrosztatikus, ún. nyitott oszlop), - közepes (perisztaltikus, dugattyús pumpák, 1-5 MPa), vagy - nagy nyomásokkal (5-40 MPa) biztosítható. A fel-, vagy leszálló módban alkalmazott papír-, vagy rétegkromatográfia esetében a folyadékáramlást a kapilláris erőhatás hozza létre. Magyar kutatók megvalósították a zárt térben nyomás alatt végrehajtható, ún. túlnyomásos rétegkromatográfiát (OPTLC), amely számos technikai megoldással kiszélesíti és meggyorsítja a módszer alkalmazhatóságát. Az összetettebb felépítésű, nagyhatékonyságú folyadékkromatográfok (HPLC) általános működési elvét a 6. ábra szemlélteti. A kromatográfia során a különböző oldószerek (eluensek, oldószerelegyek) 2-3 (vagy több) tároló edényből változatlan összetételben (izokratikus elúció), vagy meghatározott program szerint összekeverve kerülnek felhasználásra (gradiens elúció). Ennek megvalósítása alapvetően kétféle módon történhet. A 6. ábrán látható módszer szerint az eluenseket egy program által vezérelt szeleprendszer kis nyomáson keveri össze és az oldószerelegyet egy nagynyomású folyadékpumpa juttatja a mintaadagoló egységbe, illetőleg a kromatográfiás oszlopba. A másik műszaki megoldásnál minden egyes eluens külön 12
5. ábra: A folyadékkromatográf felépítése nagynyomású pumpával rendelkezik és a folyadékelegyek arányának változtatása általában a pumpák áramlási sebességének vezérlésével, összehangolásával történik. A kromatográfiás oszlop előtti holtterek térfogatának zavaró hatását figyelembe véve a kapillláris, illetőleg szűk keresztmetszetű oszlopok esetén csak a 6. ábrán bemutatott megoldás alkalmazható. Az eluens (oldószerelegy) ezután a manuálisan kezelhető (mintahurok, adagoló fecskendő, váltószelep), vagy programozott-automatizált mintaadagoló egységbe kerül, amely termosztált (hűtött) körülmények között néhány száz minta tárolására és folyamatos (változtatható térfogatú) beadagolására is alkalmas lehet. A folyadékkromatográfok alapvető része a kis (3-5 cm) előtét oszloppal (cartridge) védett, gyakran termosztálható kromatográfiás oszlop, amelyben az elválasztás történik. A folyadékkromatográfiás oszlopok rozsdamentes acélból 13
készülnek. Az elválasztás igényeitől függően 3-30 cm hosszú, belső átmérőjüket (Ø, ID cm) tekintve: - kapilláris (Ø 25-100 µm), - szűk keresztmetszetű (microbore, narrowbore, Ø 0,1, 0,21, 0,3, 0,32 cm), - analitikai (leggyakrabban alkalmazott, reguláris: Ø 0,46 cm) - félpreparatív (Ø 1 2 cm), illetőleg - preparatív (Ø 2,5 cm vagy nagyobb) oszlopokat alkalmaznak. Az oszlop hossza és átmérője, az elválasztás hatékonyságán túlmenően az elválasztás oldószer igényét, az analízis időtartamát, és az alkalmazható minta mennyiségét is meghatározza. 5. Detektorok alapvető jellemzői Az egyes detektorok működési elvben különböznek, így más és más fizikai vagy kémiai paraméter változására adnak jelet. A folyadékkromatográfiában alkalmazható detektorok az áramló fázis halmazállapotát figyelembe véve rendszerint olyan átfolyó cellával (üveg, kvarc, műanyag) rendelkeznek, amelyek az átáramló eluens optikai, elektromos, stb. tulajdonságainak változását érzékelni és mérni képesek. A detektorok érzékenységét a jel erősítésén és egyéb konstrukciós tényezőkön túlmenően elsősorban az optikai fényút hossza és a detektorcella belső térfogata (analitikai készülékeknél 1-50 L) határozza meg. A folyadékkromatográfia céljára a következő detektortípusokat alkalmazzák: Ultraibolya-látható (UV-VIS) hullámhossz tartományban mért fényelnyelés (színszűrő, prizma, vagy Fresnel-rács, Hg-xenon, lézer gerjesztett, diódasoros felbontás) alapján működő fotométerek, spektrofotométerek. Kimutatási határ: fotometria: 10-3 10-6 M, LC-UV : 10-4 10-8 M. Fluorescencia mérésén alapuló detektorok. Kimutatási határ: 10-5 10-9 M. Törésmutató változás mérésén (refraktív index, RI) alapuló detektorok. Magasabb kimutatási határ : 10-3 10-5 M. Fényszórás elvén (beszárításos technikán, Evaporation Light Scattering Detection, ELSD) működő detektorok. Kimutatási határ: ng határon. Elektrokémiai (vezetőképességi, potenciometriás, amperometriás, polarográfiás) detektorok. Kimutatási határ (konstrukciótól függően): 10-3 10-7 M. Dielektromos állandó mérésén alapuló detektorok. Magmágneses rezonancia (NMR) elvén működő detektorok. Rádióaktivitás mérésén (RIA) alapuló detektorok. Kimutatási határ: 10-7 10-10 M. Tömegspektrometriás (ESI, APCI, MALDI-TOF) detektorok közvetlen (on-line), vagy közvetett (off-line) módszerrel. Felhasznált irodalom: Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia elmélete és gyakorlata (Edison House) Kremmer Tíbor, Torkos Kornél, Elválasztástechnikai módszerek elmélete és gyakorlata (Akadémiai Kiadó 2010) 14