CB1 cannabinoid receptorok megoszlásának vizsgálata a gerincvelő felületes hátsó szarvában. Készítette: Pálóczi János



Hasonló dokumentumok
Jegyzőkönyv. dr. Kozsurek Márk. A CART peptid a gerincvelői szintű nociceptív információfeldolgozásban szerepet játszó neuronális hálózatokban

AZ ENDOKANNABINOID RENDSZER MOLEKULÁRIS SZERVEZŐDÉSE RÁGCSÁLÓK GERINCVELŐJÉNEK FELÜLETES HÁTSÓ SZARVÁBAN. Hegyi Zoltán

A pályázat célul tűzte ki a gerincvelői nociceptív ingerületfeldolgozást végző érző és a gerincvelői szintű motoros működéseket irányító mozgató

Gyógyszerészeti neurobiológia. Idegélettan

Az inzulin receptort kifejező elsődleges érző idegsejtek morfometriai és neurokémiai jellemzése patkányban

1./ Hím patkányok négy hetes részleges éheztetésének napi átlagfogyasztás 60 %-a) hatása a lateralis septum három neuropeptidjének mennyiségére:

EGYETEMI DOKTORI (Ph.D.) ÉRTEKEZÉS TÉZISEI

KÉSZÍTETTE: BALOGH VERONIKA ELTE IDEGTUDOMÁNY ÉS HUMÁNBIOLÓGIA SZAKIRÁNY MSC 2015/16 II. FÉLÉV

Nemszinaptikus receptorok és szubmikronos Ca2+ válaszok: A két-foton lézermikroszkópia felhasználása a farmakológiai vizsgálatokra.

A gerincvelő caudalis végének szerkezete (conus medullaris, filum terminale)

A sejtmembrán szabályozó szerepe fiziológiás körülmények között és kóros állapotokban

Az idegsejtek kommunikációja. a. Szinaptikus jelátvitel b. Receptorok c. Szignál transzdukció neuronokban d. Neuromoduláció

Ca 2+ Transients in Astrocyte Fine Processes Occur Via Ca 2+ Influx in the Adult Mouse Hippocampus

AZ ÖSZTROGÉN ÉS A DEHIDROEPIANDROSZTERON SZEREPE A SZINAPTIKUS ÁTRENDEZŐDÉSBEN

4.1. A bélidegrendszer nitrerg neuronjainak vizsgálata fejlődő csirkeembrióban

A tanulási és emlékezési zavarok pathofiziológiája. Szeged,

Dr. Cserépné Dr. Szabadits Eszter

Doktori tézisek. Dr. Turu Gábor Semmelweis Egyetem Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskola

a. Szinaptikus jelátvitel b. Receptorok c. Szignál transzdukció neuronokban d. Neuromoduláció. Szinaptikus jelátvitel.

Egy idegsejt működése. a. Nyugalmi potenciál b. Transzport proteinek c. Akciós potenciál

a. Nyugalmi potenciál b. Transzport proteinek c. Akciós potenciál. Nyugalmi potenciál. 3 tényező határozza meg:

Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen

1. Propriospinalis axon - gerincvelői motoneuron párok korrelatív fiziológiai, morfológiai vizsgálata és számítógépes modellezése

Ph.D. értekezés tézisei. Báldi Rita. Témavezető: Tamás Gábor, Ph.D., D.Sc. Biológia Doktori Iskola

Centrális mechanizmusok a neuropathiás fájdalom kialakulásában. Nagy Gergely György, Andrew Todd

Asztrociták: a központi idegrendszer sokoldalú sejtjei Dr Környei Zsuzsanna

Kolin-acetiltranszferáz

A sejtek közöti kommunikáció formái. BsC II. Sejtélettani alapok Dr. Fodor János

megerősítik azt a hipotézist, miszerint az NPY szerepet játszik az evés, az anyagcsere, és az alvás integrálásában.

GLUTAMINSAV-GABA CSEREFOLYAMAT A KÖZPONTI IDEGRENDSZERBEN

-Két fő korlát: - asztrogliák rendkívüli morfológiája -Ca szignálok értelmezési nehézségei

Jellegzetességek, specialitások

Sejt - kölcsönhatások az idegrendszerben

Az endokannabinoid rendszer molekuláris neurobiológiai jellemzése posztmortem és epilepsziás emberi hippokampuszban. Ludányi Anikó

A striatalis kapcsolatrendszerek vizsgálata a tanulással és motivációval összefüggésben

Az idegsejtek diverzitása

I. Spinális mechanizmusok vizsgálata

Egy idegsejt működése

A humán tripszinogén 4 expressziója és eloszlási mintázata az emberi agyban

Neuronok előkészítése funkcionális vizsgálatokra. Az alkalmazható technikák előnyei és hátrányai. Neuronok izolálása I

A monoacilglicerol lipáz neuronális és gliális expressziója rágcsáló gerincvelő felületes hátsó szarvában

Mozgás, mozgásszabályozás

Alapfogalmak I. Elsősorban fehérjék és ezek szénhidrátokkal és lipidekkel alkotott molekulái lokalizációjának meghatározásának eszköze.

Receptorok, szignáltranszdukció jelátviteli mechanizmusok

CB2 receptorok megoszlása gerincvelő hátsó szarvában

II. félév, 8. ANATÓMIA elıadás JGYTFK, Testnevelési és Sporttudományi Intézet. Idegrendszer SYSTEMA NERVOSUM

A zsírszövet mellett az agyvelő lipidekben leggazdagabb szervünk. Pontosabban az agy igen gazdag hosszú szénláncú politelítetlen zsírsavakban

III./2.2.: Pathologiai jellemzők, etiológia. III./2.2.1.: Anatómiai alapok

Szignalizáció - jelátvitel

A neurogliaform sejtek szerepe az agykéregben

Interneurális kommunikáció

Immunhisztokémiai módszerek

Az Oxidatív stressz hatása a PIBF receptor alegységek összeszerelődésére.

Sejt - kölcsönhatások. az idegrendszerben és az immunrendszerben

Az endokannabinoid jelpálya molekuláris szerveződése és szerepe a szinapszisokban

TRIPSZIN TISZTÍTÁSA AFFINITÁS KROMATOGRÁFIA SEGÍTSÉGÉVEL

Az áramlási citométer és sejtszorter felépítése és működése, diagnosztikai alkalmazásai

A nemi különbségek vizsgálatáról lévén szó, elsődleges volt a nemi hormonok, mint belső környezetbeli különbségeket létrehozó tényezők szerepének

A somatomotoros rendszer

Degeneráció és regeneráció az idegrendszerben

AZ IDEGSZÖVET Halasy Katalin

Az elért eredmények ismertetése 1. Csirkeembriók gerincvelő telepeiben kimutattuk, hogy az extracellularis matrix (ECM) egyik organizátor molekulája,

A diabetes hatása a terhes patkány uterus működésére és farmakológiai reaktivitására

Immunológia alapjai. Az immunválasz szupressziója Előadás. A szupresszióban részt vevő sejtes és molekuláris elemek

A juxtaglomeruláris apparátus jelátviteli mechanizmusai a macula densán keresztül és azon túl

Membránszerkezet Nyugalmi membránpotenciál

IONCSATORNÁK. I. Szelektivitás és kapuzás. III. Szabályozás enzimek és alegységek által. IV. Akciós potenciál és szinaptikus átvitel

Debreceni Egyetem Orvos- és Egészségtudományi Centrum Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

A kémiai szinapszis (alapok)

Két kevéssé ismert humán ABCG fehérje expressziója és funkcionális vizsgálata: ABCG1 és ABCG4 jellemzése

Az idegi működés strukturális és sejtes alapjai

Az érzőrendszer. Az érzőrendszerek

Immunológiai módszerek a klinikai kutatásban

Humán asztrociták. Nagyobb és komplexebb. idegrendszeri fejlődésben jelentős szerepű

Válasz Dr. Gereben Balázs bírálatára

ANATÓMIA FITNESS AKADÉMIA

Doktori (Ph.D.) értekezés tézisei. Dobszay Márton

Dózis-válasz görbe A dózis válasz kapcsolat ábrázolása a legáltalánosabb módja annak, hogy bemutassunk eredményeket a tudományban vagy a klinikai

Idegrendszer egyedfejlődése. Az idegszövet jellemzése

Ph.D. tézis összefoglaló. CB 2 CANNABINOID ÉS µ-opioid RECEPTOROK KÖLCSÖNHATÁSA KÜLÖNBÖZİ AGYI RÉGIÓKBAN PÁLDY ESZTER

Az endokannabinoid és kolinerg neuromodulációs mechanizmusok vizsgálata az egér nucleus pedunculopontinus neuronjain és asztrocitáin

2) Megfigyelések éheztetés és újraetetés (jóllakottság) hatására bekövetkezett változásokról a hypothalamus neuronjaiban

FUSARIUM TOXINOK IDEGRENDSZERI HATÁSÁNAK ELEMZÉSE

Az extracelluláris mátrix morfológiai analízise az ember központi idegrendszerében. Doktori tézisek. dr. Lendvai Dávid

VACCINUM FEBRIS FLAVAE VIVUM. Sárgaláz vakcina (élő)

Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen

SZAGLÁS 2

Szőlőmag extraktum hatása makrofág immunsejtek által indukált gyulladásos folyamatokra Radnai Balázs, Antus Csenge, Sümegi Balázs

Kutatási beszámoló ( )

Nagyon köszönöm a disszertáció alapvetően pozitív megítélését és a gondos bírálatot. A következőkben válaszolok a feltett kérdésekre.

Prof. Dr. Kéri Szabolcs SZTE ÁOK, Élettani Intézet, 2018

Drogok és addikciók különböző kultúrákban

Rövid ismertető. Modern mikroszkópiai módszerek. A mikroszkóp. A mikroszkóp. Az optikai mikroszkópia áttekintése

Transzportfolyamatok a biológiai rendszerekben

Immunológia alapjai. 10. előadás. Komplement rendszer

IN SITU HIBRIDIZÁCIÓS HISZTOKÉMIA (ISHH)

Érzékelési folyamat szereplői. Az érzékelés biofizikájának alapjai. Inger Modalitás Receptortípus. Az inger jellemzői MILYEN? HOL? MENNYI? MEDDIG?

Szinaptikus folyamatok

A látás alapjai. Látás Nyelv Emlékezet. Általános elv. Neuron idegsejt Neuronális hálózatok. Cajal és Golgi 1906 Nobel Díj A neuron

Endogén és exogén ligandok, valamint a szociális izoláció hatásai a fájdalomérzékenységre Ph.D. értekezés tézisei

Átírás:

CB1 cannabinoid receptorok megoszlásának vizsgálata a gerincvelő felületes hátsó szarvában Készítette: Pálóczi János Debrecen 2013

Tartalom 1. ÁTTEKINTÉS... 3 1.1. A CB1 RECEPTOR TULAJDONSÁGAI... 4 1.2. A CB1 RECEPTOR LOKALIZÁCIÓJA A KÖZPONTI IDEGRENDSZERBEN... 6 2. ANYAG ÉS MÓDSZER... 8 2.1. ÁLLATOK... 8 2.2. RHIZOTOMIA... 8 2.3. FIXÁLÁS, METSZÉS... 8 2.4. IMMUNHISZTOKÉMIA... 9 2.4.1. DAB kromogén reakció (fénymikroszkópos vizsgálatokra)... 9 2.4.2. Immunfluoreszcens jelölés (konfokális mikroszkópos vizsgálatokhoz)...10 2.4.3. Nanogold jelölés (elektronmikroszkópos vizsgálatokra)...11 2.5. ELEKTRONMIKROSZKÓPIA... 11 2.6. KONFOKÁLIS MIKROSZKÓPIA... 12 2.7. KVANTITATÍV ANALÍZIS... 13 3. EREDMÉNYEK... 14 3.1. A CB1 RECEPTOR MEGOSZLÁSA PATKÁNY GERINCVELŐ FELÜLETES HÁTSÓ SZARVÁBAN DAB KROMOGÉN REAKCIÓT KÖVETŐEN... 14 3.2 A CB1 RECEPTOR ÉS AZ AXONÁLIS MARKEREK KOLOKALIZÁCIÓJA... 15 3.3. A CB1 RECEPTOR SUBCELLULÁRIS LOKALIZÁCIÓJA... 21 4. DISZKUSSZIÓ... 23 5. FÜGGELÉK... HIBA! A KÖNYVJELZŐ NEM LÉTEZIK. 5.1. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE... 25 5.2. FELHASZNÁLT OLDATOK RECEPTÚRÁI... HIBA! A KÖNYVJELZŐ NEM LÉTEZIK. 6. IRODALOMJEGYZÉK... 26 2

CB1 cannabinoid receptorok megoszlásának vizsgálata a gerincvelőfelületes hátsó szarvában 1. Áttekintés A vadkendert (Cannabis sativa), mint ismert kultúrnövénytaz antik Európábanigen széleskörűen használták fel, úgymint kötelek, erős vásznak, ruhadarabok készítéséhez alapanyagként. ACommentary of thebritish Pharmacopedia egyik 1848-ban kiadott áttekintésében az indiai kenderről, mint a keleti orvoslásban széleskörűen használt analgetikushatású, pszichotróp gyógyszerről ír. Ezt követően a kenderkivonatok kiterjedt vizsgálata indult meg Európában. Időközben a kender pszichoaktív komponensét sikerült azonosítani, amely egy terpenoid-származék: Δ 9 -tetrahidro-kannabiol (THC). (1. ábra) 1. ábra:aδ 9 -tetrahidro-kannabinol szerkezete. A THC pszichoaktív tulajdonságait igen hamar felismerték ugyan, de egyedi kémiai struktúrájából adódóan a hatásmechanizmusa nehezen követhető nyomon. Ezt a kérdést az 1950-es évek radioligand-jelöléses vizsgálatai tisztázták [21], amelyek acannabinoid-érzékeny kötőhelyek azonosításátlehetővé tették, eleinte csak a központi idegrendszerben (cannabinoid receptor1-cb1-r), későbbaz immunrendszer sejtes elemein [24], endothel sejteken, sőt a tüdőben, a herében és a placentában is [7,10] (CB2 receptor). 3

A CB1 recetor endogén agonistáinak keresése már az 1960-as évek elején megkezdődött,viszont az intenzív hatásmechanizmus-, és receptor-vizsgálatok ellenére csak a 90-es évek elejére sikerült azonosítani az első endogén ligandot, az anandamidot [2,3]. A CB1 receptor endogén agonistáit az endorfinok analógiájára endocannabinoidoknak nevezték el. A CB1 receptor (CB1-R) elsőként izolált endogén ligandja az anandamid (arachidonoil-etanolamin)[2,3,7,10].szerkezetét tekintve az eikozanoidok családjába tartozik (2. ábra bal oldala). Ez a vegyületcsalád mediátoraként ismert a gyulladásos folyamatokban, ill. szerepük van a nociceptív folyamatokban a neuronok közti kommunikációban [7]. 2. ábra: Az ábra bal oldalán az anandamid, jobb oldalán a 2-arachidonilglicerol szerkezete látható. Egy másik, jelentős endogén cannabinoid agonista a 2-arachidonilglicerol (2-AG). Jelenlétét 1995-ban mutatták ki [4,7,8,10].Szerkezetét tekintve egy monoacil-glicerol (2. ábra jobb oldala), amely bonyolult metabolizmus révén igen nagy mennyiségben termelődik a központi idegrendszerben (200-szorosa az anandamid koncentrációnak). Ismeretes további három endocannabinoid: virodhamin, noladin-éter és N- arachidonoil-dopamin(nada).jelentőségük még nem igazán nyert bizonyítást [7], mert az idegszövetben fiziológiás körülmények között igen kis mennyiségben vannak jelen és általában eléggé bomlékony vegyületek. Így nehezen vizsgálhatók, szerepük a retrográd jelátvitelben kérdéses. 1.1. A CB1 receptor tulajdonságai A CB1 receptor egy 7 transzmembrán-doménnel rendelkező, a sejtmembránba integrálódott fehérje (4. ábra) [1,7,10]. Immunhisztokémiai vizsgálataink szempontjából 4

fontos megjegyezni, hogy a receptor N-terminálisa extracelluláris, C-terminálisa pedig intracelluláris helyzetű. A receptor szignáltranszdukcióját illetően Gi-fehérje kapcsolt, tehát intracellulárisan gátolja az adenilát-cikláz enzimet, így a sejtben csökken a camp szint, csökken a PKA aktivitása, ill. mindezeken keresztül mérséklődnek a foszforilációs folyamatok a sejtben. Ezáltal a CB1 mediált jelátvitel általános anyagcsere-depressziót indít el a sejtben. Ezen túlmenően az endocannabinoidok kötődése a CB1 receptorhoz az N-, illetőleg P/Q-típusú feszültségfüggő Ca 2+ -csatornák záródását idézi elő, ami jelentősen csökkenti a szóban forgó idegsejt EPSP-jét, így gátolja a neurotranszmitterek felszabadulását [16]. 4. ábra: A CB1 receptor szerkezete. A közlemények többsége arról számol be, hogy a CB1 receptor preszinaptikus elhelyezkedésű [1,2,11,12,13]. Ez a helyzet egyedivé teszi az endocannabinoidok jelátvitelét és felveti a retrográd transzmisszió lehetőségét [11,12,13,16,18,19]. Hippocampus-beli piramissejteken tapasztalták először,hogy a depolarizált piramissejtek preszinaptikus, gátló GABAerg interneuronjainak neurotranszmitterfelszabadulása tranziensen csökkena posztszinaptikus sejt depolarizációja után [16].A jelenség a depolarization-induced suppressionof inhibition(dsi)[7,10,11,12,13]. Hátterében a posztszinaptikus sejtben a membránpotenciál változás hatására bekövetkező endocannabinoidtermelése játszik szerepet. A szintézisben számottevő szerep jut a Ca 2+ -ionoknak (5. ábra): a membrán-depolarizáció hatására ugrásszerűen megnő a posztszinaptikus sejtben a kalcium koncentráció, ami az endocannabinoidok szintézisében részt vevő enzimrendszer aktiválódását indítja el. 5

5. ábra.endocannabinoidok által mediált neurotranszmitter felszabadulás-gátlás. Erős depolarizáció hatására endocannabinoidok gyors és azonnali szintézise történik a posztszinaptikus sejtben, amely anyagok kidiffundálva a szinaptikus résbe retrográd módon kötődve preszinaptikus helyzetű receptorukon olyan intracelluláris szignáltranszdukciót indítanak el, ami gátolja a további neurotranszmitterek felszabadulását. (Kano M. et al, 2005) Hasonló hatás mutatható ki serkentő neuronokon. A megfigyelt jelenség a DSE (deporizationinduced supression of excitation). A posztszinaptikus sejtben megnövekvő intracelluláris Ca 2+ koncentráció hatására felszabadult endocannabinoid mediátor hatékonyan gátolja a serkentő neurotranszmitter felszabadulását, így az EPSP mértékét a posztszinaptikus membránon [10,13]. 1.2. A CB1 receptor lokalizációja a központi idegrendszerben A CB1 receptor széleskörűenexpresszálódik a központi idegrendszerben (6. ábra). 6. ábra. A CB1 előfordulása patkány agyában. Tríciummal jelzett CB1-R autoradiográfiás képe patkány agyának sagittalis metszetén. A szürkeskála reprezentatív a CB1-R különböző agyi területeken való relatív előfordulására nézve.(herkenham M. et al,1990.) 6

A CB1 receptor nagymértékben expresszálódik a nagyagykéregben, a substantia nigra területén, a hippocampusban,a globus pallidus területén,illetőleg jelentős mértékben jelenik meg továbbá a kisagyban is. Ezeken kívül az agytörzs kivételével szinte mindenhol megjelenik a CB1 receptor az agyban, még ha eltérő mértékben is[16,18,20,21,22]. Igen jelentős a CB1 gerincvelői, ill. hátsó gyöki ganglionáris előfordulása.összességében a hátsó gyöki ganglionsejtek közel fele CB1-receptort expresszál, ebből mindössze 1/4-ük nem nociceptív neuron [10,12,14]. A nociceptív primer afferens neuronokat két nagyobb szubpopulációra lehet bontani: ennek alapja, hogy milyen növekedési faktorra érzékenyek. Ilyenformán megkülönböztetünk neuronális növekedési faktorra (NGF), ill. gliális neutrofikus faktorra (GDNF) érzékeny nociceptív neuronokat. Előbbi neuron populációkülönböző neuropeptideket expresszál, mint például CGRP-t (calcitonin gene-related peptide), Substance-P-t, szomatosztatint, utóbbi pedig a nem peptiderg axonterminálisaok szubpopulációjaként a Bandeirea simplicifoliából izolált IB4-et (isolectin B4) köt. Korábbi tanulmányok alapján a II belső laminában GABAerg interneuronok szubpopulációjakifejezett CB1 immunreaktivitást mutat, amely nitrogén-monoxid szintáz (NOS) jelöléssel kolokalizál.egyes szerzők megfigyelték a CB1 X-es lamina-beli feltűnését is [14] (a gerincvelő canalis centralis környéki régiója). A legélénkebb immunhisztokémiai jelölés viszont a gerincvelő dorsolaterális funiculus területéntapasztalható [14]. Több szerző beszámolt arról, hogy patkányokon végzett dorzális rhizotomia, ill. hemisectio után végzett a gerincvelő hátsó szarvi CB1 jelölése alig vesztett intenzitásából[12]. Így arra a következtetésre jutottak, hogy a hátsó gyöki ganglionok centrális nyúlványai csakkis mértékben expresszálják a receptor típust [12] (azt inkább a gerincvelő felületes hátsó szarvában található interneuronok termelik). Mások viszont ennek az ellenkezőjéről is beszámoltak, tehát a primer afferensek CB1 expressziója kifejezett, a dorzálisrhizotomiaszámukat szignifikánsan csökkenti[15, 21]. Vizsgálataim központjában az endocannabinoid CB1 receptor lokalizációja állt patkány gerincvelőjének hátsó szarvában. Munkám során célul tűztem ki a CB1 receptorok megoszlásának vizsgálatát fény- és elektronmikroszkópos szinten egyaránt a gerincvelő felületes hátsó szarvában Tekintettel arra, hogy a primer afferensek centrális nyúlványainak szerepe a gerincvelő I-II. lamináinak CB1 expressziójában ellentmondásos, vizsgálataink egyik fő elemeként vizsgálni kívántuk a primer afferensek axonterminálisainak CB1 receptor expresszióját. 7

2. Anyag és módszer 2.1. Állatok A kísérletet felnőtt, nőstény Wistar-Kyoto patkányokon végeztük, 200-320g közti mérettartományban. Az állatokat a számukra megfelelő körülmények között tartottuk, 12 órás fény/sötét ciklusban. Az általunk felhasznált CB1 receptor elleni antitest specificitásának tesztelésére a CB1 receptor elleni immunreakciót vad típusú és CB1 receptor knock out egereken [23] egyaránt elvégeztük.míg a vad típusú egér felületes hátsó szarvában a patkányokéval mindenben megegyező immunfestődés volt megfigyelhető, addig a knock out egerek gerincvelőjéből készített metszetek semmiféle immunreakciót nem mutattak (9. ábra C és D részei) 2.2. Rhizotomia A CB1 receptor expressziójának vizsgálatára rhizotómiát is alkalmaztunk egyes állatokon. Az intraperitoneálisan adott Na-pentobarbitallal altatott állat lumbális gerincvelői szakaszán, a hátsó gyökereket metszettük el. A beavatkozás a lumbális gerincvelő L4-es szegmentumát, illetőleg ettől cranialisan és caudalisan 2-2 szegmentumnyi távolságban belépő gyökereket érintette. A rhizotómián átesett állatok gerincvelői a két hetes túlélés után lettek eltávolítva a perfúziót követően. A cél a rhizotómiával az volt, hogy ezen beavatkozást követő immunhisztokémiai vizsgálatokkal kiderítsük, vajon számottevő mértékben expresszálódik-e a CB1 receptor a primer afferensek centrális nyúlványain. 2.3. Fixálás, metszés A perfundálni kívánt állatot60mg/testsúlykg intraperitonálisan adott nátriumpentobarbitallalaltattuk. A transzkardiális perfúziót először frissen oxigenizált, előzetesen jégen tartott Tyrodeoldattal, majd a fixáló oldattalvégeztük. A fiziológiás oldattal történő átmosással megakadályoztuk a kapillárisok sejtes elemekkel történő elzáródását, továbbá a lehűtött, magas oxigén tartalmú oldat késleltette a sejtek autolízisét. Konfokális mikroszkóppal végzendő kolokalizációs vizsgálatokhoz fixáló oldatként 0.1M-os foszfát pufferben(pb) oldott (ph: 7,4), 4%-os paraformaldehidet (PFA, Sigma- Aldrich) használtunk. Az elektronmikroszkópos vizsgálatainkhoz feldolgozott minták 8

fixálásához a fixáló oldat 0.1M-os PB-ben oldott 2.5% PFA-n kívül tartalmazott 0.5% glutáraldehidet(ga, Sigma-Aldrich), illetőlegmég 0.2%pikrinsavat(Fluka) is (a fixáló oldatok, illetőleg a pufferek receptúrája a mellékletben található). A perfúzió után közvetlenül eltávolítottuk a gerincvelő lumbális szakaszát. A 24 órás utófixálást követően az eltávolított lumbális gerincvelőt először0.1m-os PB-ben oldott 10%- os majd 20%-os szacharóz-oldatba tettük, amíg le nem süllyedtek.ennek célja a folyékony N 2 -ben történő feltárást megelőzőcryoprotekcio. A feltárás (freeze-thawing) után a lumbális gerincvelőt 8%-os agarba öntöttük, és vibrotómmal (Leica VT 1000 S) 50μm-es metszeteket készítettünk. A metszeteket 0.1 M-os PB-vel 3 15 percigmostuk. Ezek utána metszetek 0.01%-os H 2 O 2 oldatba kerültek az endogén peroxidázok aktivitásának kioltása céljából. Az újbóli mosás után a glutáraldehiddel fixált (elektronmikroszkópos feldolgozásra szánt) metszetek 1%-os NaBH(Sigma- Aldrich)oldatba kerültek az aldehid behatás után kialakult fehérje-keresztkötések felszakítása miatt.ezután ismét többszöri PB-s mosás következett, amit a konfokális mikroszkópos vizsgálatokra szánt, ill. a nanogold jelölést kapó metszetek esetében háromszori PBS-es, a diamino-benidinnel (DAB) jelölt metszetek esetében háromszori TPBS-es mosásváltott fel. 2.4. Immunhisztokémia 2.4.1. DAB kromogén reakció (fénymikroszkópos vizsgálatokra) Az alaposan átmosott metszeteket 50 percre TPBS-ben oldott 10%-os normál szérumban (normal goat serum-ngs) inkubáltuk. Az NGS(Vector Laboratories Inc. Burlingame, CA)csökkenti a metszetek nem specifikus kötőhelyeit. A blokkolás után mosás következett TPBS-ben oldott1%-os NGS-sel. Mindezek után került a metszetekre a CB1 receptor ellen termeltetett primer antitest megfelelően hígított oldata. Az általunk használt antitest (a Cayman cég által előállított, nyúlba termeltetett CB1 poliklonális antitest) a CB1 receptorintracellulárisc-terminálisának részletét felismerve kötődik a receptorhoz. Az anti-cb1-r 1%-os NGS-t tartalmazó TPBSben oldottuk fel 2000-szeres hígításban. A primer antitest minden esetben két éjszakán át, 4 C-on volt a metszeteken. Ezt követően háromszori, 1%-os normál szérum oldattal történő mosás, majd a szekunder antitest következett. A DAB alapú immunhisztokémia esetében ez biotinnal konjugált goat anti-rabbit immunglobulin G-t (Sigma) jelent, amely 12 órán át volt a metszeteken, 4 C-on. A későbbiekbenhozzáadott avidinnel a primer antitest kötődésének 9

megjelenítésére alkalmasreakció játszódik le.az avidin-biotin komplexben (ABC- Vector Laboratories Inc. Burlingame, CA) ugyanis térhálós szerkezetű keresztkötések alakulnak ki, amelyek között az avidinhez konjugált tormaperoxidáz enzim segítségével, H 2 O 2 jelenlétében a diamino-benzidin könnyen precipitálódik, és barna csapadékként jelenik meg a metszeteken. A biotinilált szekunder után 1%-os NGS oldatban történő háromszorimosás, majd a fent említett ABC komplex applikálása következett egy éjszakán át. Ezt követően TPBS-es, majd 0.05M-os TRIS-esmosás követezett. A metszetekre ezek után került rá a diaminobenzidin (DAB) oldat, majd 20 perc eltelte után ennek előhívása következett 0.01%-os H 2 O 2 oldat segítségével a barna csapadék megjelenéséig. A vizualizáció után háromszori TRIS-es, majd 0.1 M-os PB-s mosás következett. A tárgylemezre történő felszedés után a metszeteket felszálló etanol-soron 10-10 percig, majd xilolban 15-15 percigvíztelenítettük. A metszeteket DPX fedőanyaggal (Fluka) fedtük le. 2.4.2. Immunfluoreszcens jelölés (konfokális mikroszkópos vizsgálatokhoz) Az Immunfluoreszcens vizsgálatokra szánt metszeteket a primer antitest előtt 10%-os, illetőleg 1%-os NGS-t tartalmazó PBS oldattal kezeltük. Előbbi esetben a nem specifikus kötőhelyek számának csökkentése történt50 percen át,utóbbi esetben pedig a blokkoló oldat kimosása volt a cél. Az 1% NGS-t tartalmazó PBS oldatban történt az anti-cb1- Rhígítása.Ugyanebben az oldatban történt kolokalizációs vizsgálatokban felhasználni kívánt markerekellen termeltetett primer ellenanyagok hígítása is.az alkalmazott markerekközül a peptiderg primer afferensek centrális nyúlványainak jelölésérekalcitonin gén relációs peptid (CGRP) ellen termeltetett antitestet alkalmaztunk, míg a nem peptidergek kimutatásáraegy lektinkötési reakciót, a Bandeirea simplicifoliából izoláltisolectinb4 (IB4) kötődését használtuk fel. A gátló intrinsic neuronok axonterminálisainak jelölését a γ-amino-vajsavat (GABA) szintetizáló enzim (GAD 65/67) elleni antitesttel (anti-gad65/67) végeztük, a serkentő interneuronok feltüntetésére pedig glutamaterg terminálisokbankimutatható vezikuláris glutamát transzporter (VGLUT2) ellen termeltetett antitestet alkalmaztunk.a kettős jelölés alapjául szolgáló primer antitestek 2 éjszakán át voltak a metszeteken. Ezután PBS-ben oldott 1%-os normál szérumos mosás következett háromszori ismétlésben. A szekunder antitesteket tartalmazó oldat ezek után került a metszetekre, 1000-szeres hígításban. A CB1 ellen termeltetett antitest megjelölésére goat anti-rabbit immunglobulin G (GAR-IgG) szekunder antitestet használtunk, amely Alexa-555 fluorokrómmal volt konjugálva(sigma-aldrich).az IB4-jelölt metszetekre streptavidin-alexa-647, a CGRP-ellen 10

termeltetett antitest megjelölésére goat anti-guinea pig-alexa-488, a VGLUT2-jelölt metszetekre goat anti-guinea pig-alexa-488, a GAD 65/67 jelölt metszetekre pedig goat antimouse-alexa-488 jelzésű fluorokrómot tartalmazó szekunder antitest került (Sigma-Aldrich), amely 5 órán át volt a metszeteken.a fluoreszcens csoportot hordozó szekunder antitesttel kezelt metszetekre az immunreakciót követően előbb 1%-os NGS oldat, majd PBS, és végül 0.1 M-os PB oldat került háromszori cserével. Mindezek után a metszeteket speciális fedőanyaggal(vectashield-vector Laboratories Inc. Burlingame, CA)fedtük le. 2.4.3. Nanogold jelölés (elektronmikroszkópos vizsgálatokra) Nanogold jelölés esetében a primer antitest alkalmazása előtt 0.1 M-os PBS-t, illetőleg speciális blokkoló,majd inkubáló oldatot használtunk.mindezek után a metszetekre anti-cb1- R került inkubáló oldatban hígítva2 éjszakán át.a feleslegben levő, nem kötődött primer antitest eltávolítása inkubáló oldat segítségével történt háromszori 30 perc mosással. A szekunder antitestgoat anti-rabbit IgG kolloidális(~1nm-es)méretű aranyszemcsével volt konjugálva. A szekunder antitesteket tartalmazó oldat nanogoldos eljárás során egy éjszakán át voltak a metszeteken, 4 C-on. Ezután mosás következett: háromszori inkubáló oldat, majd háromszori PBS alkalmazása után még utófixálás következett 1%-os glutáraldehid oldat segítségével, amelyet újabb PBS-es, majd desztillált vizes mosás követett. Ezek után az ún. ezüst-intenzifikálás következett, amely során a szekunderhez kötött arany részecske felületére ezüst redukálódik(aurion R-GENT, EMS Washington, PA). Végeredményben a szemcse mérete az aranyfelületre kivált ezüst miatt nagyobb lesz, így elektronmikroszkóppal vizsgálható a CB1 pontos szubcelluláris lokalizációja. Az intenzifikálást a metszeteken, az ezüstre jellemző sárgás-barna színmegjelenéséig végeztük, ami után a rajtuk lévő oldatot desztillált vízre, majd pedig 0.1 M-os PB-recseréltük.A metszeteket végülfelszálló etanol-sorban, majd propilénoxidbanvíztelenítettük. 2.5. Elektronmikroszkópia A kolloid méretű aranyszemcsével, illetőleg az intenzifikálás során erre a szemcsére rárakódó ezüstteljelölt metszetekettranszmissziós elektronmikroszkóppalvizsgáltuk a CB1 szubcelluláris lokalizációjának vizsgálatára. A metszeteket 0.1 M-os PB-ben oldott, 0.5%-os ozmium-tetroxid oldatba helyeztük 30-45 percre. Az ozmium nehézfémként a sejtek membránkomponenseihez, ezen belül is a foszfolipid összetevőkhöz igen nagy affinitással 11

kötődik. Így az ozmium fokozza a membránok denzitását, az intracelluláris képletek kontrasztját. A következő lépésbenhidrofób, epoxi alapú, négykomponensű gyantával (ARALDIT-gyanta; Durcupan ACM gyanta, Fluka) infiltráltuk a preparátumokat.ezt követően a gerincvelői metszeteket ebben a vékony gyantarétegben szedtük fel tárgylemezre ésfedtük le.ezt a polimerizáció követte, 56 C-on.Az ultrastukturális vizsgálatokhoz már csak a kimetszett felületes hátsó szarvi részt használtuk fel. Miután a megfelelő blokkba öntöttük a preparátumokat, ultramikrotómmal (Leica Ultracut UCT) 40-60 nm-es vastagságú metszeteket készítettünk belőlük. A megfelelőnek ítélt metszeteket ún. gridekre, elektronmikroszkóphoz használt tárgytartókra helyeztük. A preparátumok kontrasztosabb megjelenítéseérdekében a grideken levő metszeteket előbb uranil-acetátot, majd ólom-nitrátot, illetőleg nátrium-citrátot (Reynolds oldat) tartalmazó oldatba merítettük. A két kontrasztozás között pedig 50%-os etanolos, majd desztillált vizes mosást alkalmaztunk. Mivel az elektronnyaláb hullámhossza jóval kisebb, mint a láthatófényé, így lényegesen nagyobb felbontásban vizsgálhatóak a biológiai minták elektronmikroszkóppal. Így tehát a patkányból származó gerincvelői metszetek dorzális szarvának ultrastruktúrális és a CB1 receptor subcelluláris lokalizációjánakvizsgálata ezzel az eszközzel folytatódott tovább(jeol 1010, 80kV, Japan). 2.6. Konfokális mikroszkópia A pásztázó lézersugaras konfokális mikroszkópia lényege, hogy egy koherens lézernyaláb végigpásztázza a minta meghatározott részletét egy dichroikus tükörrendszer segítségével. A mintát pásztázó, fókuszált lézernyaláb gerjeszti az immunhisztokémiai eljárások során jelölt target molekulához kapcsoltfluorokróm molekularészt. A gerjesztett molekulacsoportok által emittált fény optikai tulajdonságait egy számítógéppel összekötött nagy felbontású digitális kamera rögzíti. A számítógép az időben elkülönülő fluoreszcens felvillanásokat feldolgozva alkot képet. Az optikai rendszerbe két apertúra-rekesz (pin hole) van beépítve, amelynek átmérője, ily módon a beérkező fény mennyisége szabályozható.nagy előnye a rendszernek, hogy a mintáról egy kb. 1µm-es optikai metszetről készít felvételt a koherens lézernyaláb pontos fókuszálása, illetőleg az apertúra-rekesz átmérőjének beállítása révén. 12

A konfokális mikroszkópra feldolgozott metszeteket két szekunder antitesttel jelöltük, melyekhez 1-1különböző színű fluorokróm volt kapcsolva. Ezen színes csoportok más-más hullámhosszúságú fénnyel gerjeszthetők, és eltérő hullámhosszúságú fényt emittálnak.a külön-külön készített felvételek egymásra vetíthetőek, az emittált fénypontok együttes megjelenése keveredésük révén,egy harmadik, kevert szín megjelenését teszi lehetővé. Ez a jelenség az alapja a kolokalizációs vizsgálatoknak. 2.7. Kvantitatív analízis A konfokális mikroszkóppal készített képeken a fluoreszcens jeleket Adobe Photoshop CS3 szoftver segítségével számoltuk. Minden 1µm vastag optikai szeleten egy 10 10-es, egyenként 4 µm-es élhosszúságú négyzetet vettünk fel a felületes hátsó szarv CB1 receptorra és a vizsgált marker előfordulására nézve releváns területén. Csak azokat az immunreaktív profilokat vettük figyelembe, amelyek a 4µm-es élhosszúságú négyzet vonalaira estek. A módszer jellegéből fakadóan statisztikailag reprezentatív és objektív adatok álltak rendelkezésünkre. 13

3. Eredmények 3.1. A CB1 receptor megoszlása patkány gerincvelő DAB kromogén reakciót követően felületes hátsó szarvában A CB1 receptor elleni immunreakció szembetűnő en jellegzetes eloszlást mutat a gerincvelő hátsó szarvában (9. ábra). A lumbális gerincvelő teljes rostrocaudaliss kiterjedésében két igen intenzíven immunfestett sáv figyelhető meg. A külső, CB1 receptorra erőteljesen immunpozitív sáv a gerincvelő I. laminájának felel meg, míg a belső a II. laminaa belsőő részével (IIi) esik egybe. Ezeket a területeket egy gyengébb immunreakciót mutató vékony sávszerűű zóna, a II. lamina külső része (IIo)választja el egymástól. 9. ábra. CB1 receptor elleni immunreakció megoszlása a gerincvelő felületes hátsó szarvában. a-b, CB1 immunfestődés vad típusú és CB1 knock out egérben. A CB1 immunfestődés megfigyelhető a vad típusú egér gerincvelőjének hátsó szarvában (a), míg a CB1 knock out egérből származó metszeten immunreakció nem látható (b) mutatva, hogy az kísérleteinkhez használt antitest specifikus. c-d, CB1 immunfestődés patkány gerincvelőjének hátsó szarvában az L2 (c) és L4 (d) szegmentum magasságában. Erőteljes CB1 immunreakció látható a gerincvelő I és IIi lamináiban, míg a IIo lamina gyenge immunfestődéstt mutat. Az L4 szegmentumban a IIi lamina mediális felének jelölődése sokkal gyengébb, mint az L2 szegmentum megfelelő területének immunfestődése. Lépték: 100 µm A vizsgálataink középpontjában álló negyedik lumbális szegmentumból készült metszeteken megfigyelhető, hogy a II. lamina belső részének immunreaktivitása csak a hátsó szarv laterális felén jelenik meg, míg mediálisan az immunfestődés kevésbé erőteljes (9. ábra 14

d része). Ez a jellegzetes eloszlás a lumbális gerincvelő további szegmentumaiban nem figyelhető meg, ott az immunreakció mind az I, mind a II. lamina belső részében a hátsó szarv teljes mediolaterális kiterjedésében közel azonos erősségű (9. ábra c része). Az általunk vizsgált metszetek egyikében sem sikerült immunfestett sejttestet vagy dendritet azonosítani, a jelölés mindig axonálisan, finom pettyek formájában jelentkezett. A CB1 receptor immunfestődését mindcb1 knockout egér gerincvelőjén,vad típusú egér [23] gerincvelőjénmegvizsgáltuk.a CB1 receptor knock out egér gerincvelőjében nem sikerült CB1 receptort kimutatni (9. ábra b része), míg a vad típusú egérben erőteljes immunfestődést tapasztaltunk (9. ábra a része), így az általunk alkalmazott antitest CB1 receptorra specifikusnak tekinthető. A vad típusú egerek lumbális gerincvelőjének felületes hátsó szarvában a CB1 immunfestődés megoszlása mintázata teljesen megegyezik a patkány gerincvelőjében tapasztalt eloszlással. 3.2. A CB1 receptor és az axonális markerek kolokalizációja CB1 receptor és nociceptív primer afferens markerek kolokalizációja. Általánosan elfogadott, hogy a nociceptív primer afferensek egy része a gerincvelő hátsó szarvában kizárólag glutamáttal valósítja meg az ingerületátvitelt, míg mások a glutamát mellett neuropeptideket is felszabadítanak. A peptiderg nociceptív primer afferensek döntő többsége calcitonin gén-relációs peptidet (CGRP) expresszál, a nem peptiderg primer afferensek sejtmembránja pedig egy speciális poliszacharidot tartalmaz, ami szelektíven képes kötni egy, a Bandeiraea simplicifoliából izolált lektint, az isolectin-b4-et. (IB4) Ezért a nociceptív primer afferensek axonterminálisainak CB1 receptor expresszióját a CB1 receptor immunfestődésének, illetve a CGRP ellenes immunreakciónak (10. ábra a-b-c része) vagy az IB4 kötésnek a kolokalizációja alapján vizsgáltuk (10. ábra d-e-f része). Korábbi vizsgálatokkal összhangban a CGRP ellenes immunreakció a hátsó szarv I. és és IIo laminájára korlátozódott. A CB1 receptor, illetve a CGRP immunfestődésének kolokalizációját vizsgálva, a CB1 immunpozitív profiloknak 22,8± SEM%-a mutatkozott CGRP-re is immunreaktívnak (12. ábra), miközben a CGRP pozitív axonterminálisoknak több mint a fele (54,42±SEM%) expresszált CB1 receptort (13. ábra). Az IB4 kötés alapján feltüntetett nem peptiderg primer afferensek axonterminálisai, korábbi leírásokkal megegyezően túlnyomórészt a IIi laminában helyezkedtek el. A CB1 receptorra pozitív profiloknak csaknem a harmada (30,59±SEM%) kolokalizált az IB4-t kötő 15

boutonokkal (12. ábra), amíg az IB4 kötésre nézve pozitív terminálisoknak 33,5±SEM%-a mutatott CB1 immunreakciót (13. ábra). 10. ábra. A gerincvelő felületes hátsó szarvából készített 1 µm vastag konfokális optikaii szelet a CB1 receptor és a CGRP immunfestődés (peptiderg primer afferens boutonok, zöld; b), illetve az IB4 kötés (nem peptiderg primer afferens terminálisok, zöld; e) ) kolokalizációjának bemutatására. Az egymásra vetített képen a keverék szín (sárga) megjelenése jelzi a kettősen jelölt terminálisokat. A kettősen jelölt terminálisokat nyílhegyek jelölik. CB1 receptor immunreaktivitás figyelhető meg mind a peptiderg, mind a nem peptiderg primer afferensek axonterminálisain. Lépték: 2 µm CB1 receptor és a gerincvelőii interneuronok markereinek kolokalizációja. Több kísérletes eredmény alapján a serkentő gerincvelői interneuronok axonterminálisainak markeréül a vezikuláris glutamát transzporter 2-t (VGLUT2) választottuk (11. ábra a-b-c része). Mások eredményeivel összhangban a VGLUT2 immunfestődéss homogén megoszlást mutatott az I-II. laminákban. A CB1 és a VGLUT2 koexpressziójának vizsgálatával a CB1 immunreaktív profiloknak 27,56±SEM%-át azonosítottuk serkentőő 16

interneuronok axonterminálisain (12. ábra), a VGLUT2-re pozitív boutonoknak pedig 22,38±SEM%-a kolokalizált a CB1 receptorral (13. ábra). 11. ábra. A gerincvelő felületes hátsó szarvából készített 1 µm vastag konfokális optikaii szelet a CB1 receptor és a VGLUT2 (serkentő gerincvelői interneuronok, zöld; b), illetve a GAD65/67 immunfestődéss (gátló gerincvelői interneuronok, zöld; e) kolokalizációjának bemutatására. Az egymásra vetített képen a keverék szín (sárga) megjelenése jelzi a kettősen jelölt terminálisokat. A kettősen jelölt terminálisokat nyilak jelölik. CB1 receptorr immunreaktivitás figyelhető meg mind a serkentő, mind a gátló intrinsic neuronok axonterminálisain. Lépték: 2 µm Általánosan elfogadott tény, hogy a gerincvelői gátló, GABAerg interneuronok a szinaptikus transzmisszióhoz szükséges γ-amino vajsavat (GABA) glutaminsav-dekarboxiláz (GAD) segítségével szintetizálják, ezért a gátló interneuron nok CB1 receptor expressziójának vizsgálatához a GABAerg terminálisok feltüntetését GAD elleni immunreakció alapján végeztük (11. ábra d-e-f része). A GAD immunfestődés homogénnek, de erőteljesnek mutatkozott a felületes hátsó szarvban. A CB1 receptorokn nak 11,8±SEM%-át azonosítottuk GABAerg boutonon (12. ábra), illetve a GAD pozitív terminálisoknak 22,71±SEM%-a festődött CB1-re is (13. ábra). 17

12. ábra. Oszlopdiagram a CB1 receptor és az alkalmazottt axonális kolokalizációjának bemutatására a gerincvelő I-II. lamináiban. markerekk 18

13. ábra.oszlopdiagram az alkalmazott axonális markerek kolokalizációjának bemutatására a gerincvelő I-II. lamináiban. és a CB1 receptorr A rhizotomia utánilumbális gerincvelői szakasz, L4-es szegmensének ép (kontralaterális) felületes hátsó szarvában a CB1 receptor disztribúciója: az I-es laminábann mediolaterális, a II belső lamina laterális részének erőteljes CB1 receptor immunfestődésee volt megfigyelhető (14. ábra a része) ).A rhizotomia utáni állapotot mutatja be a része is. Viszont ez utóbbi felvétel a kezelt (ipsilaterális) oldalt demonstrálja. 14. ábra.cb1-rr immunfestődés patkány lumbális gerincvelő felületes hátsó rhizotomia után az ép oldalon (a) illetőleg a kezet oldalon (b). Lépték: 100µm 14. ábra b szarvában, Jól látható, hogy a különböző, peptiderg és nem peptiderg primer afferensek centrális nyúlványait jelölő markerekk nem okoznak immunfestődést csak az ép oldalon (15. ábra). A kontralaterális oldalon a zöld szín a peptiderg boutonok markere, vagyis a kalcitonin gén relálációs peptid (CGRP), a kék pedig a nem peptiderg axonterminálisokat jelöli, tehát az isolectin B4 (IB4) immunreaktivitásátt jelzi. A CB1 receptor immunfestődése viszont mind az ép, mind pedig a műtött oldalon hasonló. 3.4. A CB1 receptor subcelluláris lokalizációja A CB1 receptor és a különböző axonális markerek kolokalizációjának leírása mellettt célunk volt a CB1 receptorr ellenes immunreakció megoszlásának vizsgálata ultrastrukturáliss szinten is. A CB1 receptor jelölését preembedding immunarany jelöléssel végeztük ultravékony metszeteken. A CB1 receptort jelző ezüst partikulumokat kizárólag axonokon sikerült kimutatni, sem sejttesten, sem dendriten nem találtunk ezüströgöt. A CB1 pozitív terminálisok mind szimmetrikus, mind aszimmetrikus szinapszisok kialakításában részt vettek, melyek a serkentő, illetve gátló szinapszisok morfológiai megfelelői (17., 18., 19., ábra). Az 19

aszimmetrikus szinapszisok egy részében a serkentő terminálisok dense core vesiculákat is tartalmaztak, melyek jelenléte a peptiderg primerr afferensek terminálisaira jellemző (17., 18. ábra) ). 15. ábra. Dorzális rhizotomia után készült konfokális mikroszkópos felvétel patkány gerincvelőjének hátsó szarváról. Zöld szín jelzi a peptiderg primer afferensek terminálisait (CGRP, a,d), kék színnel a nem peptiderg primer afferensek láthatók (IB4 kötés, b,d). A rhizotomia sikerességét demonstrálja, hogy a gerincvelő intakt (jobb) oldalán mind a CGRP immunreaktivitás, mind az IB4 kötés megtartott, míg a műtött oldalon a primerr afferensek markerei eltűntek. Megfigyelhető, hogy CB1 immunfestődés (piros, c,d) az ép és a műtöttt oldalon is megjelenik, és a két oldal között nincs értékelhető különbség. Lépték: 100µm 20

17. ábra. CB1 receptor fehérje subcelluláris lokalizációja.mint minden elektronmikroszkóposs ábrán, így ezen is jól látható, hogy a CB1-R immunogold jelölés számos szinaptikus vesiculát tartalmazó axonterminális (at.) membránjához kötötten jelenik meg (nyilak). A nyílhegyek egy szimmetrikus (gátló) szinapszist jelölnek, amelynek csak részletei kerültekk a metszéss síkjába, így több szinaptikus résként látható. A csillag alakú jelölések dense core vesiculák mellett találhatóak. Ezek vesiculák neuropeptid transzmitterrel töltöttek. Lépték: 500 nm. Megfigyelhető továbbá, hogy a neuronok karakterétől függetlenül a CB1 receptort jelzőő partikulumok minden esetben a plazmamembránhoz asszociáltak. A jelölés specificitását jelzi, hogy az ezüströgök a plazmamembrán protoplazmatikus felszínéhez kötöttek annak megfelelően, hogy a CB1 receptor elleni antitest a receptor intracelluláris epitópjátt ismeri fel. Az általunk megfigyelt ezüst szemcsék minden esetben extraszinaptikusan helyezkedtek el. Mind periszinaptikusan lokalizált, mind a szinapszistól távol elhelyezkedő ezüströgökett sikerült kimutatni, azonbann a szinaptikus appozícióban nem találtunk jelölődést. 21

18. ábra.cb1 receptorfehérje subcelluláris lokalizációja (nyilak).lényeges különbség az előzőő ábrához képest a szinapszis funkciójában van: a kérdéses axonvég (at.) gátló szinapszist (nyílhegy) létesít a szomszédos dendrittel (d.). A CB1 immunreaktivitás az axonterminális (at.) membránjához asszociáltan fordul elő, periszinaptikusan. A csillag jelölés itt is egy densee core vesiculát mutat. Jól látható még az aszimmetrikus szinapszis (nyílhegy), posztszinaptikuss része a dendritben (d.) amely mint posztszinaptikus denzitás mutatkozik. A képen egy neuronn sejtmagja (n.) és citoplazmája (c.) is látszik. Az a. jelzés egy myelin hüvellyel rendelkezőő axont jelöl. Lépték: 500 nm. 19. ábra.cb1 receptorfehérje subcelluláris lokalizációja (nyilak). Az ábrán egy dendrittüskével (dt.) szinaptizáló axonterminális (at.) látható. A CB1 megjelenését a nyilak jelölik: jól látható ezen a képen is, hogy a CB1 preszinaptikus, ill. periszinaptikuss elhelyezkedésű. Az aszimmetrikus szinapszist a nyílhegy jelöli. Lépték: 250 nm 22

4. Diszkusszió A CB1 receptor expressziójának felfedezése centrális és perifériális neuronokon már a 90-es években felvetette annak lehetőségét, miszerint a CB1 receptor mediált jelátvitel a fájdalomfeldolgozó folyamatok szabályzásában is részt vehet [25,26], majd az első endogén cannabinoid ligandok leírása egyre inkább valószínűsítette, hogy az endocannabinoid rendszer egyik fő feladata a fájdalom modulálása [3]. Számos kísérletes eredmény támasztja alá, hogy a cannabinoidok mérséklik a fájdalmas ingerekre adott magatartási választ mind mechanikai, mind pedig termális, vagy viscerális fájdalom esetén[27,28,29]. Ezen túlmenően több elektrofiziológiai és neurokémiai eredmény bizonyítja, hogy a cannabinoidok hatékonyan csökkentik a gerincvelői neuronok fájdalom-indukált aktivitását [30,31,32]. Ezt a hatást legalább részben a primer afferensek centrális nyúlványain expresszálódó preszinaptikus CB1 receptorok válthatják ki [12], amelyek aktivációja csökkenti a primer afferensek glutamát felszabadulását [33]. Bár mind a primer afferensek centrális axonterminálisainak, mind pedig a hátsó gyöki ganglionsejtek CB1 receptor expressziója egyértelműen bizonyított [34,35], fontos megjegyezni, hogy korábbi elektrofiziológiai vizsgálatok alapján a C és Aδ rostokkal monoszinaptikusan kiváltható posztszinaptikus potenciálokat az anandamid csak a gerincvelői interneuronok egyharmadában, illetőleg kétharmadában csökkentette, ezzel azt jelezve, hogy a primer afferensek egy csoportja nem reagál cannabinoid felszabadulásra [33]. Konfokális mikroszkópos felvételeken végzett kvantitatív elemzéseink alapján a peptiderg primer afferens terminálisoknak több mint a fele, a nem peptidergeknek pedig harmada CB1 receptort expresszál. Ez jó egyezést mutat a korábbi elektrofiziológiai vizsgálatok eredményeivel. Eredményeink alapján azonban figyelembe kell venni, hogy a peptiderg primer afferensek centrális boutonjainak csaknem a felén, a nem peptidergeknek közel kétharmadán nem sikerült CB1 receptort kimutatni jelezve, hogy a nociceptív érző információknak csak egy részét modulálja az endocannabinoid rendszer. Korábbi (neonatális capsaicin injekciót követően) autoradiográfiás [36] és (gerincvelő hemisectióját követő) immunhisztokémiai vizsgálatok [15] szerint a CB1 receptorok egy részét gerincvelői interneuronok expresszálják. Ezt a megállapítást erősíti több elektrofiziológiai vizsgálat, amelyek az endocannabinoid transzmisszióra jellemző preszinaptikus gátlást mind GABAerg [37], mind pedig glutamaterg [12] gerincvelői interneuronok terminálisain bemutatták. Saját leleteink jó egyezést mutatnak az említett morfológiai és funkcionális megfigyelésekkel egyaránt Eredményeink alapján a gerincvelő I- 23

II lamináiban kimutatható CB1 receptoroknak 11%-t GABAerg, 27%-át glutamaterg interneuronok expresszálják. Azonban a primer afferensekhez hasonlóan az intrinsic gerincvelői neuronoknak csak egy részében sikerült CB1 receptort kimutatni. Úgy találtuk, hogy a GABAerg boutonoknak 10%-a, a glutamaterg terminálisoknak 28%-a expresszál CB1 receptort. A gerincvelői interneuronoknak tehát nagyobbik hányadának működésére a CB1 receptor mediált jelátvitel nincsen hatással. A CB 1 receptor ultrastruktúrális megoszlására vonatkozó vizsgálatok többsége a receptort nem csak axonálisan, hanem a neuronok sejttestjén és dendritjén is leírja. Ezzel szemben a cannabinoidokalkalmazása a gerincvelőben speciális fiziológiai válaszokat vált ki, melyek a receptor preszinaptikus megjelenését támasztják alá [12,37]. Eredményeink és az elektrofiziológiai leírások jól korrelálnak egymással. Immunarany jelöléses vizsgálatainkban a CB 1 receptort jelző ezüstszemcséket kizárólag axonterminálisokon detektáltuk, jelölt sejttestet, vagy dendritet nem sikerült kimutatni. Eredményeink alapján a gerincvelő felületes hátsó szarvában kimutatható CB1 receptorok mind primer afferensek, mind gátló és serkentő gerincvelői interneuronok axonterminálisain jelentős mértékben expresszálódnak. Korábbi elektrofiziológiai vizsgálatokkal összhangban [12,15,] ezek az eredmények azt sugallják, hogy az endocannabinoidok a gerincvelői szintű fájdalom-feldolgozást primer afferenseken és intrinsic neuronokon egyaránt hatva képesek modulálni. Fontos hangsúlyozni azonban, hogy vizsgálataink alapján a gerincvelő I-II lamináiban expresszálódó CB1 receptoroknak körülbelül a 90%-át tudtuk az általunk vizsgált neuronális elemekhez rendelni jelezve, hogy a CB1 receptoroknak fennmaradó közel 10%-a általunk nem vizsgált neuronok axonterminálisain, vagy a gerincvelő gliális elemein expresszálódnak. 24

5.1. Rövidítések jegyzéke BrSt:agytörzs Cer: cerebellum; Col: colliculi; Cx:agykéreg CP: caudato-putamen; GP: globus pallidus; EP: entopedunclaris mag; Hi: hippocampus; SNr: substantia nigra pars reticulata; Th: thalamus 25

6. Irodalomjegyzék 1. Matsuda L. A. Lolait S. J., Brownstein M.J. Young A. C.és Bonner: Structure of a cannabinoid receptor and functional expression of the cloned cdna. Nature 346, 561-564 (1990). 2. Devane W. A. et al.: Isolation and structure of a brain constituentthat binds to the cannabinoid receptor. Science 358, 1946-1949 (1992). 3. Di Marzo V. et al.: Formation and inactivation of endogenous cannabinoidanandamide in centralneurons. Nature 372, 686-691 (1994). 4. Sugira T. et al.: 2-Arachidonoylglycerol: a possible endogenous canabinoid receptor ligand in brain. Biochem. Biophys. Res. Commun. 215, 87-97 (1995). 5. Mechoulam R. et al.: Identificationof an endogenous 2-monoglyceride, present in carine gut, that binds to cannabinoid receptor. Biochem. Pharmacol. 50, 83-90 (1995). 6. Hanus L.et al.: 2-Arachidonyl-glycerol ether, an endogenous agonist of the cannabinoid CB1 receptor. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 98, 3662-3665 (2001). 7. Piomelli D.: The molecular logic of endocannabinoid signaling. Nature Reviews/ Neuroscience, vol.4. 873-884, (2003). 8. Stella N., Schweitzer P. és Piomelli D.: A second endogenous cannabinoid that modulates long-termpotentiation.nature 388, 773-778 (1997). 9. Porter A. et al.: Characterization of a novel endocannabinoid, virodhamin with antagonist activity at the CB1 receptor. J. Pharmacol. Exp. Ther. 301, 1020-1024 (2002). 10. Freund T. F., Katona I. és Piomelli D.: Role of endogenous cannabinoids in synaptic signaing. Physol. Rev. 83, 1017-1066 (2003). 11. Ohno-Shosaku T., Hashimotodani Y., Maejima T., Kano M.:Calcium signaling and synpatic modulation: Regulation of endocannabinoid-mediated synaptic modulation by calcium. Cell Calcium 38, 369-374 (2005). 12. Morisset V., Ahluwalia J., Nagy I., Urban L.: Possible mechanisms of cannabinoidinduced antinociception in spinal cord. European Journal of Pharmacology 429, 93-100 (2001) 13. Ohno-Shosaku T., Maejima T., Kano M.: Endogenous cannabinoids mediate retrogradesignals from depolarized postsynaptic neurons to presynaptic terminals. Neuron, vol. 29, 729-738 (2001). 14. Salio C. et al.: Pre- and postsynaptic loalization of the CB1 cannabinoid receptor in the dorsal horn of the rat spinal cord. Neuroscience 110, 755-764 (2002). 26

15. Farquhar-Smith W. P., et al.: Cannabinoid CB1 receptor expression in rat spinal cord. Mol. Cell. Neurocsi. 15, 510-521 (2000). 16. WilsonR. I., Kunos G., Nicoll R. A.: Presinaptic specificity of endocannabinoid signalling in the hippocampus. Neuron 31, 1-20 (2001). 17. Daniel H.et al.: Control of Ca 2+ influx bycannabinoid and metabotropic glutamate receptors in rat cerebellar cortex requires K + chanels. J. Physiol. 537, 793-800 (2000). 18. Robbe D., et al.: Localization and mechanisms of action of cannabinoid receptorsat the glutamatergic synapes of the mouse nucleus accumbens. J. Neurosci. 21, 109-116 (2001). 19. Wilson R. I., Nisoll R. A.: Endocannabinoid signalling in the brain. Science 296, 678-682 (2002). 20. Carlson G., Wang Y., Alger B. E.: Endocannabinoids facilitate the induction of LTP in the hippocampus. Nature Neurosci. 5, 723-724 (2002). 21. Herkenham M, et al.: Cannabinoid receptorlocalization in brain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87,1932-1936 (1990). 22. Ong W.Y., Mackie K.: A light and electron microscopic study of the CB1 cannabinoid receptor in primate brain. Neuroscience 92, 1177-1191 (1999). 23. Ledent C., et al: Unresponsiveness to cannabinoids and reduced addictive effect of opiates in CB1 receptor knockout mice.science 283, (5004) (1999). 24. Munro S. et al.: Molecular characterization of a pheripheral receptor for cannabinoids. Nature 365, 61-65 (1993). 25. Herkenham M., Lynn AB., Johnson MR., Melvin LS., de Costa BR., Rice KC.: Characterization and localization of cannabinoid receptors in rat brain: a quantitative in vitro study. J. Neurosci. 11, 563-583 (1991). 26. Tsou K., Brown S., Sanudo-Pena MC., Mackie K., Wlker JM.: Immunhistochemical distribution of cannabinoid CB1 receptors in the rat central mervous system. Neuroscience 83,393-411 (1998). 27. Buxbaum DM.: Analgesic activity of 9-tetrahidrocannabinol in the rat and mouse. Psychopharmacologia 25, 275-280 (1972). 28. Welburb PJ., Starmer GA., Cheter GB., Jackson DM.: Effect of cannabinoids on the abdominal constroction response in mice: within cannabinoid interactions. Pychopharmacologia 46, 83-85 (1976). 29. Richardson JD., Anonsen L., HargreavesKM.: Antihyperalgesic effect of spinal cannabinoids. Eur. J. Pharmacol. 345, 145-153 (1998). 27

30. Meng ID., Manning BH., Martin WJ., Fields HL.: An analgesic circuit activated by cannabinoids. Nature 395, 381-384 (1998). 31. Harris J., Drew LJ., Chapman V.: Spinal anandamide inhibits nociceptive transmission via cannabinoid receptor activation in vivo. Neuroreport. 11, 2817-2819 (2000). 32. PertweeRG.: Cannabinoid receptors and pain. Prog. Neurobiol.63, 569-611 (2001). 33. Luo C., Kumamoto E., Furue H., Chen J., Yoshimura M.: Anandamide inhibits excitatory transmission to rat substantia gelatinosa neuron sin manner different from that of capsaicin. Neurosci. Lett. 321, 17-20 (2002). 34. Hohmann AG., Herkenham H.: Localization of central cannabinoid CB1 receptor messenger RNA in neuronal subpopulations of rat dorsal root ganglia: double-label in situ hybridisation study. Neurosci. 90, 923-931 (1999). 35. Bridges D., Rice AS., Egertová M., Elphick MR., Winter J., Michael GJ.: Localization of cannabinoid receptor 1 in rat dorsal root ganglion using in situ hybridisation and immunhistochemistry. Neurosci. 119, 803-812 (2003). 36. Hohmann AG., Herkenham H.: Regulation of cannabinoid and mu opioid receptor binding sites following neonatal capsaicin treatment. Neurosci. Lett. 252, 13-16 (1998). 37. Jennings EA., Vaughan CW., Christine MJ.: Cannabinoid action on rat superficial medullary dorsal horn neuron sin vitro. J. Physiol. 534, 805-812 (2001). 28