A monoacilglicerol lipáz neuronális és gliális expressziója rágcsáló gerincvelő felületes hátsó szarvában

Átírás

1 A monoacilglicerol lipáz neuronális és gliális expressziója rágcsáló gerincvelő felületes hátsó szarvában Szerző: Dóčová Klaudia Debrecen 2013

2 Tartalom Köszönetnyilvánítás... Hiba! A könyvjelző nem létezik. Rövidítések Bevezetés és célkitűzés Lumbális gerincvelő jellemzése Az endogén kannabinoid rendszer komponenseinek jellemzése Endogén kannabinoidok Anandamid AG Az endokannabinoidok szintézise Az anandamid bioszintézise A 2-AG bioszintézise Az endokannabinoidok lebontása Az anandamid lebontása, a zsírsavamid-hidroláz (FAAH) strukturális és funkcionális jellemzése A 2-AG lebontása, a monoacilglicerol lipáz (MGL) strukturális és funkcionális jellemzése Anyag és módszer Kísérleti állatok és a szöveti metszetek előkészítése Egyszeres immunfestés fénymikroszkópos vizsgálatokhoz Kettős immunfestés konfokális mikroszkópos vizsgálatokhoz Immunfluoreszcens jelölések konfokális mikroszkóppal történő analízise Eredmények Az MGL immunreaktivitás megoszlása a gerincvelő felületes hátsó szarvában

3 5.2 Az MGL immunreaktivitás kolokalizációja a nociceptív primer afferensek markereivel Az MGL immunreaktivitás kolokalizációja a glutamáterg serkentő és GABAerg gátló neuronok axon terminálisaival Az MGL immunreaktivitás kolokalizációja az asztrociták és mikroglia sejtek markereivel Összefoglalás Felhasznált irodalom

4 Rövidítések 2-AG - 2-arachidonil-glicerol ABHD α-β-hidroláz domént tartalmazó protein CB1-R 1-es típusú kannabinoid receptor CB2-R 2-es típusú kannabinoid receptor CGRP kalcitonin gén-rokon peptid DGL - diacilglicerol-lipáz DSI - depolarizáció-indukált gátláscsökkenés DSE - depolarizáció indukált serkentés csökkenés FAAH - zsírsavamid-hidroláz GABA gamma-amino-vajsav GDE1 - glicerofoszfo-diészteráz GFAP gliális fibrilláris savas protein GPCR G-protein kapcsolt receptor IB4 izolektin-b4 LTD hosszú távú szinaptikus depresszió MGL monoacilglicerol-lipáz mglur metabotróp glutamát receptor NAE- N-acil-etanolamin NAPE - N-acil-foszfatidil-etanolamin NAPE-PLD - N-acil-foszfatidil-etanolaminokat hidrolizáló foszfolipáz D PB foszfát puffer PBS foszfát-pufferes sóoldat PLA - foszfolipáz-a PLCβ - foszfolipáz-c-β STD rövid távú szinaptikus depresszió THC - Δ 9 -tetrahidro-kannabinol VGAT vezikuláris GABA transzporter VGLUT2 vezikuláris glutamát transzporter 4

5 1 Bevezetés és célkitűzés A Cannabis nemzetségbe tartozó Cannabis sativából, vagyis a kenderből izolálható pszichoaktív hatóanyagok, a kannabinoidok már ősidők óta ismert kedélyállapot javító vegyületek.gyógyító hatásáról szóló első feljegyzések Kínából i.e ből származnak, de a hinduizmus szent könyvében, az Atharvavedában lelt feljegyzések alapján jótékony hatásai Indiában is ismertek voltak már i.e ban. I.sz. 100-ban Dioszkoridész is említést tesz a Cannabisról, mint római gyógynövényről, majd i.sz. 170-ben Galénosz gyógyító hatása mellett elsőként írja le pszichotróp hatásait is(köfalvi, 2008). Az első növényi eredetű kannabinoidot a kannabinolt az1930-as években kenderből izolálták (Köfalvi, 2008), majd a legfőbbpszichoaktív származékát a 9- tetrahidrokannabinolt(thc) 1964-ben fedezték felés olyan pszichotróp hatásokat tulajdonítanak neki, mint az eufória, étvágy fokozása, késleltetett percepció vagy a memória károsodása(kano, Ohno-Shosaku et al. 2009). A kannabinoid kutatásban jelentős áttörést jelentett két receptor, a kannabinoid-1 receptor (CB1-R) (Matsuda et al., 1990), valamint a kannabinoid-2 receptor (CB2-R) (Munro et al., 1993)azonosítása 1990-ben illetve 1993-ban, majd a 90-es évek közepén e receptor két legfontosabbnak bizonyuló endogén ligandjainak, az anandamidnak (Devane et al., 1992) és a 2-arachidonil-glicerolnak (2-AG)(Mechoulam et al., 1995) az azonosítása. Az endogén kannabinoidok a szervezet által termeltlipid molekulák, melyek a kannabinoid receptorokon hatva számos élettani és patofiziológiás folyamat szabályozásában vesznek részt. Habár mind az anandamid, mind a 2-AG képes a receptorok aktiválására,a 2- AG az anandamiddal szemben hatékonyabban aktiválja a CB1-R-t,ezen felül mindkét receptor agonistájaként viselkedik(sugiura et al., 2006). Az endogén kannabinoidok közös jellemzője, hogy aktivitás-dependens módon posztszinaptikusantermelődnek(reggio, 2009), és a preszinaptikus CB1-R-on hatva rövidés hosszú távon képesek a szinaptikus ingerületátvitel megbízhatóságának csökkentésére(savinainen et al., 2012).A rövid távú plaszticitási folyamatok (kevesebb, mint 1 perc) jól ismert formája az endokannabinoidok által mediált rövid távú szinaptikus depresszió (short-term depression, STD),melynek során a posztszinaptikusan termelődő endokannabinoidok retrográd módon hatva gátolják a preszinaptikus neurotranszmitter felszabadulást. Ezt a folyamatot gátló és serkentő szinapszisok esetében több agyterületen is 5

6 leírták ésdepolarizáció-indukált gátláscsökkenés (depolarization-induced suppression of inhibition, DSI)(Ohno-Shosaku et al., 2001)valamint depolarizáció indukált serkentés csökkenés (depolarization-induced suppression of excitation, DSE)(Kreitzer & Regehr, 2001)névvel illettek. Az endokannabinoid mediált retrográd neurotranszmisszió hosszú távú (több mint 1 óra) depressziójának (long-term depression, LTD) homo- illetve heteroszinaptikus formáját is több agyterületen leírták, (Gerdeman & Lovinger, 2003, Marsicano et al., 2002). A hosszú ill. rövid távú plaszticitási folyamatokat az agy számos területén kívül a gerincvelőben is leírták, ahol a fájdalomfeldolgozó neuronhálózatok működésének szabályozásában van kitüntetett szerepük(hohmann et al., 1995, 1998). Abban, hogy a 2-AG hosszú vagy rövidtávú plaszticitási folyamatokat indukál-e, döntő szerepe van a 2-AG lebontásáért felelős enzimnek, a monoacilglicerol-lipáznak, mely expressziójának morfológiai háttére nem ismert. Munkám célja az MGL-immunreaktivitás gerincvelői megoszlásának vizsgálata rágcsálók gerincvelőjének felületes hátsó szarvában. 6

7 2 Lumbális gerincvelő jellemzése A gerincvelő - mely a nyúltvelő folytatásaként a foramen magnum szintjénél kezdődik és a kúp alakú conus terminalisban végződik - teljes lefutásán 5 szakaszt különböztethetünk meg: nyaki, mellkasi, ágyéki, keresztcsonti és coccygeális. A központi idegrendszerre jellemző szürke- és fehérállomány a gerincvelő teljes hosszában jól elkülöníthető, viszont megoszlását illetően eltér az agyra jellemző sémától: a gerincvelő fehérállománya a felületi részeket, míg a szürkeállomány a canalis centralis körül, pillangóra vagy H betűre emlékeztető formában a belső részeket foglalja el. A H betűnek a canalis centralis függőleges tengelyére merőlegesen, harántirányban húzott képzeletbeli harántvonaltól hátrafelé tekintő szárai a gerincvelő hátsó szarvát (cornu posterius)míg az előre tekintő, valamivel vaskosabb szárak az elülső szarvat (cornu anterius) reprezentálják(szentágothai, Réthelyi, 2002). A gerincvelő szürkeállományát Rexed svéd neurobiológus a Nissl-festéssel láthatóvá tett sejtek morfológiája és elrendezése alapján kilenc laminára osztott, melyek egymástól átmeneti zónákkal és nem éles határvonallal különülnek el (Rexed, 1952, 1954). Az I. lamina - mely a II. laminával együtt a gerincvelő felületes hátsó szarvát alkotja - a hátsó szarv marginális zónáját képezi, mely projekciós és interneuronokat egyaránt tartalmaz. Habár az egyes lamina tartalmazza a felületes hátsó szarv legtöbb projekciós neuronját, ez az I. lamina neuronpopulációjának mindössze 5%-t jelenti, a fennmaradó részt az interneuronok képviselik. Morfológiájukat tekintve a projekciós neuronok nagyobbak mint az interneuronok, és az I. laminára jellemző néhány óriásiprojekciós neuron, az ún. Waldeyer féle marginális sejt jelenléte (Spike et al., 2003). Közvetlenül az I. lamina alatt párhuzamosan található II. lamina jellemzője, hogy elsősorbanmielinhüvely nélküli rostok végződnek itt, így szövettani metszeteken való megjelenése gyakran áttetsző, melynek alapján substantia gelatinosa vagyis kocsonyás állománynak is hívják. A II. lamina sejtjei kis méretű interneuronok, teljes lefutásán két zónát különíthetünk el: egy nagy sejtsűrűséggel jellemezhetőkülső (IIo) és egy kevésbé kompakt belső (IIi) zónát(woolf & Fitzgerald, 1983; Light & Willcockson, 1999).A II. lamina sejtjei morfológiai sajátságaik alapján két típusra oszthatók: islet sejtek, melyek rosztrokaudális irányban orientált dendritekkel valamint lokálisan szerteágazó axonokkal rendelkeznek; stalked sejtek, melyek sejttestjei a lamina külső részében találhatók, 7

8 dendritjeik a mélyebb laminák irányába, axonjaik pedig az I. lamina irányába orientálódnak (Gobel, 1978). A II. laminától ventrálisan és párhuzamosan húzódik a vékony, mielinizált rostokat tartalmazóiii. lamina, mely ez alapján jól elkülöníthető a mielin szegény II. laminától. A III. lamina az inetrneuronokon kívül nagy projekciós neuronokat is tartalmaz (Cervero et al., 1988). A IV. V. VI. lamina alkotják a gerincvelő hátsó szarvának bázisát, melyek főként gyengemechanikai(cervero et al., 1988) ésproprioceptív (Wall, 1967)ingerekre reagáló, valamint széles dinamikus tartományú neuronokat tartalmaznak(cervero et al., 1988). A VII. lamina a gerincvelő szürkeállományának intermedier zónáját képezi, melyet a ventromediálisan elhelyezkedő VIII. lamina követ, melyben nagyobb, kommisszurális sejtek találhatók (Chaouch et al., 1983). Az elülső szarv ventro-laterális élét képező zóna a IX. lamina, mely nagy α-motoneuronokat és kisebb γ-motoneuronokat tartalmaz(swett et al., 1986). A X. lamina a canalis centralist határoló, piramis és csillag alakú, fájdalmas ingerekre reagáló sejteket tartalmazó lamina (Nahin et al., 1983). A perifériáról érkező szenzoros információkat olyan pszeudounipoláris neuronok afferens rostjai szállítják a gerincvelő felületes hátsó szarvába, melyeknek sejttesteia hátsó gyöki ganglionban találhatók. A rostokat vezetési sebességük, átmérőjük, mielinizáltságuk fokától valamint ingerlési módjuktól függően klasszifikálhatjuk. A nagy átmérőjű, vastag mielinhüvelyes Aα és Aβ rostok alacsony intenzitású (nem fájdalmas) mechanikai ingerek közvetítői, míg a kis átmérőjű, vékony mielinhüvelyű Aδ rostok intenzív mechanikus és fájdalmas hőingereket közvetítenek. A legkisebb átmérővel és mielinhüvellyel nem rendelkező C rostok nagyon intenzív mechanikus, kémiai- és hőingerekre reagálnak. A nociceptív C-rostoknak két családja ismert: peptiderg ill. nem peptiderg. A peptiderg primer afferensekre jellemző az ún. kalcitonin gén-rokon peptid (CGRP) szintézise, míg a nem peptiderg primer afferensek izolektin B4 kötő képességgel rendelkeznek(wall, 1994). 8

9 3 Az endogén kannabinoid rendszer komponenseinek jellemzése Az endokannabinoid rendszer a központi idegrendszeri szinapszisok egyik legáltalánosabb modulátora, számos fiziológiás és patofiziológiás folyamat szabályozásában vesz részt (Di Marzo, 2008;Mackie, Lai, Westenbroek, & Mitchell, 1995;Kinsey et al., 2009). Az endogén kannabinoid rendszer fő komponensei: a kannabinoid receptorok - elsősorban a legtöbb tanulmány tárgyát képező CB1-R és CB2-R(Matsuda et al., 1990; Munro et al., 1993), endogén ligandjaik, mindenekelőtt az anandamid és 2-AG(Devane et al., 1992; Mechoulam et al., 1995), valamint az őket szintetizáló és bontó enzimek. Az endokannabinoid rendszer által történő retrográd szignalizáció alapelve, hogy a posztszinaptikusan aktivitásfüggő módon termelődő endogén kannabinoid ligand visszafelé diffundálva eléri és aktiválja a preszinaptikusan elhelyezkedő CB1-R-t csökkentve így a neurotranszmitter felszabadulás valószínűségét(katona et al., 1999;Wilson & Nicoll, 2001; Castillo, Younts, Chávez, & Hashimotodani, 2012). Annak ellenére, hogy az endokannabinoidok hatását mediáló mindkét receptora rodopszinszerű G-protein kapcsolt receptorcsalád A csoportjának tagjai(freund et al., 2003),jelentős eltérés figyelhető meg megoszlásukban, hiszenacb1-relsősorban aközponti idegrendszerben expresszálódik(matsuda et al., 1990;Gérard, Mollereau, Vassart, & Parmentier, 1990),ezzel szemben acb2-r döntően az immunrendszer szerveiben és a hematopoietikus szövetekben termelődik(munro et al., 1993).Mivel az endokannabinoidmediált szinaptikus plaszticitási folyamatok kialakulásában és így a kannabinoidok által kiváltott idegrendszeri hatások kiváltásában elsősorban a CB1-R vesz részt, ezért a továbbiakban a CB1-R-rel foglalkozom részletesebben. A CB1-R agyi és gerincvelői megoszlása tükrözi az endokannabinoidok közvetítette tetrád hatást, melyekhez soroljuk a katalepsziát, csökkent motoros aktivitást, analgéziát és hipotermiát(compton, Rice et al. 1993). MagasCB1-R denzitás figyelhető meg például a bazális ganglionokbanés a kisagyban, melyek a mozgáskoordinációban érintettek(sañudo- Peña, Tsou, & Walker, 1999; Herkenham et al., 1990). A gerincvelőben, mely a nociceptív ingerek közvetítésének kulcsfontosságú központja, szintén nagy mennyiségben kimutathatók a CB1 receptorok. Peroxidáz alapú immunfestés erőteljescb1-r immunreaktivitást mutatott a lumbális gerincvelő I. laminájában ill. a II. 9

10 lamina belső részében, melyeket egymástól a II. lamina igen gyengén jelölődő külső része határol el. A hátsó szarvban végződő peptiderg primer afferensek terminálisainak mintegy felén, míg a nem-peptiderg afferensek boutonjainak mintegy 21%-án található CB1-R. Megvizsgálva a gerincvelői serkentő és gátló interneuronokat azt találták, hogy a glutamáterg axon terminálisok mintegy harmada, a GABAerg gátló terminálisok pedig csaknem 20%-a mutatott erős immunreaktivitást CB1 receptorra(hegyi et al., 2009). A CB1-R megoszlásának vizsgálatakor kiderült, hogy expressziójuk mindenekelőtt a preszinaptikus axonokon összpontosul, s elsősorban a periszinaptikus axolemmán kondenzálódnak(katona et al., 2006). Az expressziós mintázatuk tanulmányozásakor kiderült továbbá, hogy a GABAerg gátló interneuronok több CB1-R-t tartalmaznak, mint a principiális neuronok (Kano, Ohno-Shosaku et al. 2009; Stella 2010). Hatásmechanizmusukat tekintve a CB1-R-ok a G i/o proteinekkel történő interakciójukat követően számos ioncsatorna és másodlagos hírvivő molekula aktivitását befolyásolják, példáuladenilát-cikláz enzimműködés, valamint az N- és Q- típusú Ca 2+ csatornák működésének gátlását idézik elő(twitchell et al., 1997), valamint növelik az inwardly rectifyingk + channels konduktanciáját(mackie et al., 1995b). A CB1-R közvetítette hatások nagymértékben függnek a receptor-aktiváció időtartamának hosszától. Neuronális CB1-R aktiváció preszinaptikus N-típusú Ca 2+ csatornák gátlását valamint inwardly rectifying K + channels aktiválódását eredményezi, így szabályozva a neuronális excitabilitást. A hosszantartó CB1-R aktiváció különböző intracelluláris szignálútvonalak aktivációjához vezet(stella 2010), például az ERK szignálútvonal szabályozása. 3.1 Endogén kannabinoidok Anandamid Az N-aciletanolaminok (NAE) családjába tartozó anandamid már a 60-as években felkeltette a kutatók érdeklődését, mivel a kémiai felépítésükben mutatkozó különbségek ellenére a CB1-R-hoz kapcsolódva hasonló folyamatokat indítanak be, mint azexogén kannabinoidok (Onaivi, Sugiura et al. 2006). In vitro és in vivo kísérletek nagy hasonlóságot mutattak ki az anandamid és az exogén kannabinoidok által kiváltott élettani hatások közt. Patkány modellen végzett kutatások eredményei alapján ezek közé a hatások közé soroljuk az analgéziát, katalepsziát, hipotermiát valamint hipomoltiliást(compton et al., 1993; Freund et al., 2003). 10

11 Ezt a vegyületet először 1992-ben Devane és munkatársainak disznó agyból sikerült izolálni. Kémiailag az arachidonsav etanolamidjaként jellemezték és az ananda szanszkrit eredetű szóból származó anandamid névvel illették, melynek jelentése belső áldás. Később bebizonyították, hogy nagy affinitással kötődik az agyi CB1 receptorokhoz. (Devane et al., 1992b; Freund et al., 2003). A kémiai sajátságainak felderítését követően számos kísérlet irányult az anandamid agyi megoszlásának és koncentrációjának mérésére. Patkány agykéregben az anandamid mennyisége pmol/g szövet értéket mutatott(bisogno et al., 1999), míg a hippocampusban az anandamid koncentrációja pmol/g szövet(koga et al., 1997). Megoszlását tekintve fontos megjegyezni, hogy az agy több régiójában is kimutatatták, így például az agykéregben, hipotalamuszban, talamuszban, köztiagyban, középagyban, kisagyban, az agytörzsben, nyúltvelőben és az agyalapi mirigyben egyaránt (Di Marzo, Hill et al. 2000; Onaivi, Sugiura et al. 2006) AG A 2-AG-t először 1980-ban mutatták ki trombocitákban(prescott & Majerus, 1983) majd számos különböző módon stimulált sejtben is bizonyították a szintézisét, ekkor még említést nem téve a CB1 receptorokra kifejtett aktiváló hatásáról ben Mechoulam és mts.-nak sikerült kutya bélből 2-AG-t izolálni és demonstrálni, hogy jelentős biológiai aktivitással rendelkezik. Kimutatták például, hogy képes kannabinoid-1 receptor génjével transzfektált sejtek által expresszált kannabinoid-1 receptorhoz kapcsolódni, valamint egér lépben adenilát-cikláz gátló hatását is leírták(mechoulam et al., 1995, Onaivi, Sugiura, & Marzo, 2006). A 2-AG, mint a CB1-R endogén ligandja először 1997-ben került a figyelem középpontjába, mikor Bisogno és mts. ionomicinnel stimulált sejtekben(bisogno et al., 1997) valamint Stella és mts. elektromosan stimulált hippokampális metszeteken(stella et al., 1997) 2-AG szintézisét írták le(köfalvi, 2008). A 2-AG termelődését több agyi régióban is kimutatták, többek között az agykéregben, hippokampuszban, hipotalamuszban, középagyban, köztiagyban, kisagyban, agytörzsben és a nyúltvelőben is. A 2-AG koncentrációja patkány agykéregben és hippocampusban 4,3 illetve 12,6 nmol/g szövet(bisogno et al., 1999), míg gerincvelői koncentrációja nmol/g szövet(huang et al., 1999). 11

12 3.2 Az endokannabinoidok szintézise Az endokannabinoidoktermelődéselipofil neurotranszmitter jellegük révén eltér más ingerületátvivő anyagokétól. A klasszikus neurotranszmitterek szintézisüket követően a preszinaptikus axonterminálisokban vezikulákban tárolódnak, majd ingerület hatására a szinaptikus résbe ürülnek, ahol specifikusan kötődnek a receptoraikhoz így aktiválva azokat. Ezzel szemben az endokannabinoidok könnyen integrálódhatnak vagy átdiffundálhatnak a sejtmembránokon, ezért nem tárolódnak vezikulákban. Ehelyett különböző ingerület (depolarizáció és intracelluláris Ca 2+ koncentráció növekedés, mglur aktiváció) hatására ad hocszintetizálódnak(onaivi et al., 2006) és bioszintézisükért két alapvetően eltérő biokémiai útvonal felelős Az anandamid bioszintézise Az anandamidbioszintézisét Di Marzo és mts. írták le, akik kimutatták, hogy membrán-depolarizáló ágensek hatására neuronok anandamidot termeltek.nem sokkal az anandamid azonosítását követően kísérletük során neuronokban jelentős mennyiségű N- arachidonil-foszfatidil-etanloamint mutattak ki, valamint azt is bebizonyították, hogy e vegyület hidrolitikus hasításával anandamid keletkezik(di Marzo et al., 1994). Későbbi kutatások igazolták, hogy az anandamid szintézisénekfő útvonala foszfolipid-dependens, pontosabban egy prekurzor molekula,az N-acil-foszfatidil-etanolaminokból (NAPE)enzimatikus hasításával keletkezik, melyet egy NAPE specifikus foszfolipáz D katalizál (NAPE-PLD).Az enzim szerkezetének vizsgálatai kimutatatták, hogy a cink metallohidroláz szupercsalád béta-laktamáz domént tartalmazó tagja(okamoto et al., 2004),működésük bivalens kationok által stimulált(ueda, Liu, & Yamanaka, 2001; Pertwee, 2005). A fent említett klasszikus szintetikus útvonalon kívül az anandamid szintézisének alternatív útvonalát az ún. ABHD4-GDE1 kaszkádot is leírták, melyben egy NAPE-kra specifikus lizo-foszfo-lipáz, az α/β-hidroláz 4 (ABHD4) katalizálja a glicerofoszfo-nae keletkezését(simon & Cravatt, 2006), melyet ezt követően egy glicerofoszfo-diészteráz (GDE1) hidrolizál NAE és glicerin-3-foszfátra(simon & Cravatt, 2008). 12

13 3.2.2 A 2-AG bioszintézise Más monoacilglicerolokhoz hasonlóan a lipidek metabolikus útvonalainak közös pontjain a 2-AG egyes útvonalak végtermékeként, de más útvonalak prekurzoraként is funkcionál. Ez magyarázhatja azt a tényt is, hogy a 2-AG agyi koncentrációja 200x magasabb, mint az anandamidé(piomelli, 2003). A 2-AG szintézisének két fő útvonala ismert: 1. Foszfolipáz-Cβ (PLC) és diacilglicerol-lipáz (DAG lipáz) közvetített 2- AG szintézis 2. Foszfolipáz-C és foszfolipáz-a (PLA 1 ) közvetített 2-AG szintézis. Nakane és mts. bebizonyították, hogy a 2-AG arachidonsav-tartalmú lizofoszfatidsav foszfatáz által történő hidrolitikus hasításával is képződhet(nakane et al., 2002). A 2-AG szintézisénekplcβ és DAG lipáz közvetített útvonalát először 1983-ban Prescott és Majerus írta le mint az arachidonsav tartalmú diacilglicerol lebontását trombocitákban(prescott & Majerus, 1983) ben Stella és mts. kimutatták, hogy ionomycin-kezelt neuronokban a 2-AG szintézis két fő enzime a PLCβ és a DAG-lipáz (Stella et al., 1997), majd Kondo és mts. kimutatták, hogy ez az útvonal közvetíti a Ca 2+ -indukálta 2- AG szintézist (Kondo et al., 1998;Köfalvi, 2008). A 2-AG szintéziséhez szükséges legfontosabb prekurzor molekula a diacilglicerol(dag), mely az arachidonsavat tartalmazó membránfoszfolipidek PLCβ általi hidrolízisével jönnek létre (Kano et al., 2009). Ezt követően a 2-AG egy specifikus DAG lipáz (DGL) működése által keletkezik.a DGL két izoenzimét (DGLα és DGLβ) is klónozták és funkcionálisan jellemezték. Mindkét enzim membránkötött, működésükre a Ca 2+ ionok serkentő hatással vannak ésexpressziójukat a dendrit tüskéken, pontosabban azok periszinaptikus részén mutatták ki (Bisogno et al., 2003), ahol mglur5 receptorok jelenlétét is igazolták (Lujan et al., 1996; Luján et al., 1997). A szerin proteázokra jellemző katalitikus triád is fellelhető a szerkezetükben (Pertwee, 2005), melyet különböző hosszúságú aminosav szekvencia követ a két izotípus esetében (Bisogno et al., 2003). DGLα-/- egerekben kimutatták, hogy a 2-AG agyi és gerincvelői szintje 80%-kal alacsonyabb, mint a vad típusú egérben mért koncentráció(gao et al., 2010). További vizsgálatok során a DGLα-/- egérben a rövid távú szinaptikus plaszticitás egyik formájának, a DSI-nek a hiányát figyelték meg míg DGLβ-/- egérben nem történt változás a vad típusú egérben megfigyelt endokannabinoid-mediált retrográd szinaptikus gátlás folyamataiban(gao et al., 2010; Tanimura et al., 2010). 13

14 3.3 Az endokannabinoidoklebontása Az anandamidlebontása, a zsírsavamid-hidroláz (FAAH) strukturális és funkcionális jellemzése Az anandamid lebontásáért felelős enzimről szóló első adatokkal Chin és mts. szolgáltak, akik 1993-ban több sejtvonalban is sikeresen kimutatták az anandamid bontó enzimének aktivitását és anandamid amidohidroláznak nevezték el(deutsch & Chin, 1993). Nem sokkal az anandamid amidohidroláz felfedezését követően Cravatt és mts. sikeresen klónozták az oleamid alvásindukáló lipid lebontó enzimétamely az oleamid mellett az anandamid lebontására isképes, ezért zsírsavamid-hidroláznak nevezték el (Cravatt et al., 1996; Onaivi et al., 2006). Mára bebizonyosodott, hogy az anandamid amidohidroláz és a FAAH ugyanazt az enzimet takarja (Onaivi et al., 2006), s mivel bomlástermékeik a CB1 receptorokat nem aktiválják, ez egy valódi inaktivációs mechanizmusnak tekinthető. Ez az enzim az amidáz családba tartozó, alkalikus ph optimummal rendelkezőintracelluláris membránkötött szerin-hidroláz, mely a aminosav között egy jellegzetes amidázt kódoló, szerinben és glicinben gazdag konszenzus szekvenciát tartalmaz, mely szekvencián belül a Ser-241, Ser-217 és a Lys-142 alkotják az enzim katalitikus egységét (Pertwee, 2005). Immunkémiai módszerek segítségével több szervben és az agy számos régiójában is bizonyították a FAAH jelenlétét, ahol a legnagyobb expressziós ráta az agykéreg piramis sejtjeiben és a hippokampuszban volt kimutatható, alacsonyabb expresszió figyelhető meg a kisagy Purkinjesejtjeiben, a talamuszban valamint a szaglógumó sejtjeiben(freund et al., 2003; Onaivi et al., 2006) A 2-AG lebontása, a monoacilglicerol lipáz (MGL) strukturális és funkcionális jellemzése A 2-AG lebontásának 98%-a három enzim aktivitásához köthető. Az MGL felelős a 2- AG 85%-nak lebontásáért, míg két másik enzim, azabhd12 és ABHD6 működésével 14

15 hozható összefüggésbe a 2-AG 9%-nak illetve 4%-nak a lebontása(blankman et al., 2007) ben Dinh és mts.-nak sikerült az MGL klónozása patkány agy cdns könyvtára alapján, és megállapították, hogy a katalitikus triádot a lipázokra jellemző, konzerválódott aminosavszármazékok alkotják (S122-D239-H269), az MGL szekvencia analízise során posszttranszlációs motívumokat nem találtak, viszont számos konszenzus foszforilációs szekvencia jelenlétét fedezték fel(dinh et al., 2002). Röntgenkrisztallográfiai kísérletek segítségével megállapították, hogy az MGL strukturális sajátságai megfelelnek az α/β-hidrolázokra jellemző szerkezeti sajátságoknak, tehát egy β-redő, melyet hét parallel és egy antiparallel lánc alkot, melyet az α-helix láncai vesznek körül. Az enzim aktív centruma az enzim hidrofób alagútjának mélyén fekszik (Bertrand et al., 2010). Az enzim további szerkezeti eleme a hidrofil, ún. kilépési hely, melyen a 2-AG lebontása során keletkezett glicerol távozik (Savinainen et al., 2012). A northern blot és in situ hibridizációs kísérletek alapján megállapították, hogy az MGL mrns expresszió legmagasabb azokon a területeken, ahol a CB1 receptorok is expresszálódnak, így például az agykéregben, hippocampusban és a kisagyban. A hippocampuson végzett immunhisztokémiai vizsgálatok azt mutatták, hogy az MGL kizárólag preszinaptikusan, a serkentő és gátló neuronok axonterminálisain található(dinh et al., 2002; Labar, Wouters, & Lambert, 2010).Gulyás és mts. megállapították, hogy a hippokampuszban az MGL mindenekelőtt a szemcsesejtek, a CA3 piramis sejtek valamint az interneuronok axon terminálisain expresszálódnak, hasonlóképpen a kisagy szemcsés rétegében is(gulyas et al., 2004). 15

16 4 Anyag és módszer 4.1 Kísérleti állatok és a szöveti metszetek előkészítése Kísérleteinket kilenc felnőtt patkányon (Wistar-Kyoto, g, Gödöllő, Magyarország), két vad-típusú és egy MGL génkiütött egéren végeztük. Az állatkísérleteket a Debreceni Egyetem Munkahelyi Állatkísérleti Bizottsága által kiadott protokol alapján végeztük melyek megfeleltek az Európai Únió előírásainak. Az állatok előzetes nátriumpentobarbitállal (50 mg/kg, i.p.) történő mély altatásátkövetően transzkardiálisan perfundáltuk fiziológiás sóoldattal, majd fixáló oldattal. A kettős fluoreszcens immunohisztokémiai vizsgálatokhoz használt három ivarérett patkány, valamint az összes egér esetében 1M foszfát pufferben (PB, ph 7,4) oldott 4% paraformaldehid oldatát használtunk. A transzkardiális fixálást követőn a gerincvelő L3-L5 lumbális szegmentumait eltávolítottuk, négy órán keresztül az eredeti fixáló oldatban utófixáltuk, majd 1M PB-ben feloldott szacharóz 10% és 20% oldatába merítettük, amíg le nem süllyedt. Ezt követően a gerincvelőket folyékony nitrogén fölött fagyasztottuk, majd 1M PB-be merítettük elősegítve ezzel a reagensek penetrációját. Az így előkészített gerincvelőből vibrotóm segítségével 50µm vastagságú metszeteket készítettünk, majd ezeket 0,1 M PB-ben mostuk. 4.2 Egyszeres immunfestés fénymikroszkópos vizsgálatokhoz Az MGL lamináris megoszlásának tanulmányozására egyszeres immunfestési protokolt alkalmaztunk. Úszó metszeteket 10 %-os normál kecske szérummal blokkoltuk (katalógus szám: S-1000, Vector Labs., Burlingame, California, USA) 50 percig, ezt követőennyúlban termeltetett anti-mgl antitesttel inkubáltuk 48 órán át 4 C-on, majd biotinilált kecskében termeltetett anti-nyúl-igg antitesttel 12 órán át 4 C-on. Ezt követően a metszeteket avidin-biotinált tormaperoxidáz komplexel kezeltük 5 órán keresztül szobahőmérsékleten, majd a reakciót 3,3 - diaminobenzidin (katalógus szám: D-5637, Sigma, St. Louis, MO) kromogén reakcióval zártuk. Az antitestek higítása 10 mm triszfoszfát pufferelt izotóniás sóoldattal (TPBS, ph 7.4) történt, melyhez 1%-os normál kecskeszérumot adtunk (katalógus szám.: S-1000, Vector Labs., Burlingame,CA). 16

17 4.3 Kettős immunfestés konfokális mikroszkópos vizsgálatokhoz Kettős immunfestési protokolt alkalmaztunk az MGL immunreaktivitás valamint azaxonokat jelölő markerek immunreaktivitásának együttes előfordulásának, vagyis kolokalizációjának vizsgálatára. Azúszó metszeteket10% normál kecske szérummal (katalógus szám: S-1000, Vector Labs., Burlingame, California, USA) blokkoltuk 50 percig, majd az antitestek olyan oldatával inkubáltuk, mely nyúlban termeltetett anti-mgl (hígítás 1:30)és az alábbi antitestek egyikét tartalmazta: (1) tengerimalacban termeltetett anti-kalcitonin gén-relációs peptid (CGRP) (1:5000 higítás, katalógus szám: T5027, Peninsula Labs, San Carlos, CA), (2) biotinilált izolektin B4 (IB4) (1:2000 higítás, katalógus szám: I21414, Invitrogen, Eugene, OR), (3) tengerimalacban termeltetett anti-vezikuláris glutamát transzporter 2 (VGLUT2) (1:2000 higítás, katalógus szám: AB2251, Millipore, Temecula, CA), (4) tengerimalacban termeltetett anti-vezikuláris GABA transzporter (VGAT) (1:500 higítás, katalógus szám: ), (5) egérben termeltetett anti-gliális fibrilláris savas fehérje (GFAP) (1:500 higítás, katalógus szám: MAB3402, Millipore, Temecula, CA), (6) egérben termeltetett anti-cd11b (1:500, katalógus szám: MCA275G, AbD Serotec, Oxford, UK). A metszeteket a primer antitestek szérumával 2 napig inkubáltuk 4 C-on. Ezt követően a metszeteket 1% normál kecske szérummal mostuk (3x15 min), majd két órán át a következő szekunder antitestek megfelelő keverékét tartalmazó oldattal inkubáltuk: (1) Alexa Fluor 488 cal konjugált kecske anti-nyúl IgG (1:1000 higítás), (2) Alexa Fluor 555-tel konjugált kecske - anti-tengerimalac IgG (1:1000 higítás), (3) Alexa Fluor 555-tel konjugált kecske anti-nyúl IgG (1:1000 higítás), (4) Alexa Fluor 555-tel konjugált kecske anti-egér IgG (1:1000 higítás), (5) Alexa Fluor 488-cal konjugált streptavidin (1:1000 higítás) Az antitesteket 1%-os normál kecske szérumban higítottuk. Az antitestekkel történő inkubálást követően a metszeteket PBS-ben mostuk (3x15 min), majd tárgylemezre szedtük és Vectashielddel (katalógus szám: H-1000, Vector Labs, Burlingame, CA) fedtük le. 17

18 4.4 Immunfluoreszcens jelölések konfokális mikroszkóppal történő analízise A z-tengely mentén, az egyes rétegek közti 0,5 µm vastagságú átfedéssel1 µm vastagságú optikai szeleteket készítettünk egy Olympus FV1000 típusú konfokális mikroszkóppal. A fényképezéshez 60x nagyítású olaj-immerziós objektívet (NA: 1.42) használtunk nagy figyelmet fordítva arra, hogy a konfokális mikroszkóp beállításai (lézer erősség/intenzitás, konfokális apertúra mérete, gyorsítófeszültség) az optikai szeletek készítése során azonosak maradjanak valamint ügyelve arra, hogy az immunreaktív foltokhoz tartozó pixelek ne legyenek túltelítettek. Az MGL és az egyes markerek kolokalizációjának kvantitatív analízise egy 10x10 standard négyzetháló segítségével történt, melyben az egyes négyzetek éleinek hosszúsága 5µm (a négyzetháló teljes mérete tehát 50x50 µm). A négyzetháló elhelyezési területének minden esetben a konfokális képek azon régióit választottuk, melyek a gerincvelő felületes hátsó szarvának I. ill. II. laminájának felelnek meg. Az I. ill. II. lamina pontos elhelyezkedésének megállapításakor a következő kritériumokat vettük figyelembe: a) a gerincvelő hátsó szarva és a hátsó köteghatára beazonosítható az immunfestés intenzitása alapján b) a II. ill. III. lamina határát előzetes ultrastrukturális leírások alapján határoztuk meg(molander et al., 1984) A metszeteket három állat gerincvelőjének lumbális régiójából készítettük, a kvantitatív elemzés pedig egy-egy gerincvelő három véletlenszerűen kiválasztott metszetének két hátsó szarvában történt (összesen 18 mérési terület). 18

19 5 Eredmények 5.1 Az MGL immunreaktivitás megoszlása a gerincvelő felületes hátsó szarvában A peroxidáz alapú egyszeres immunfestés erőteljes MGL immunreakciót mutatott a gerincvelő felületes hátsó szarvában mind vad típusú egér mind pedig vad típusú patkány gerincvelőjében. Az MGL immunreakció egyértelműen megfigylehető az I. laminábann valamint a II. lamina belső zónájában (II i ). E két erős immunreakciót mutató területetegymástól egy vékony sáv választ el, ahol az immunreaktivitás intenzitása alacsonyabb. Ez a sáv a II. lamina külső zónájának (II o ) felel meg (1. ábra). 1. ÁBRA: Az MGL antitest specificitása és az MGL immunreaktivitás lamináris megoszlása a gerincvelőő felületes hátsó szarvában 19

20 5.2 Az MGL immunreaktivitás kolokalizációja a nociceptív primer afferensek markereivel A C és Aδ típusú primer afferensek, melyek a perifériás receptorok felől érkező nociceptív információk szállításáért felelősek szinte kizárólag a gerincvelő felületes hátsó szarvának I-II laminájában végződnek(todd, 2002). A primer afferensek egy csoportja a klasszikus neurotranszmitterek mellett különböző neuropeptidet szabadítanak fel, mely alapján a primer afferensek között megkülönböztetünk peptiderg illetve nem peptiderg primer afferenseket. A nem peptiderg primer afferensekre jellemző egy poliszacharid köpeny jelenléte, mely nagy affinitással képes különböző lektin molekulák megkötésére. Ezen sajátságok az immunhisztokémiai vizsgálatok során a különböző primer afferensek markereiként szolgálhatnak. Eképpen a peptiderg és nem peptiderg primer afferenseket a következő markerek segítségével különböztettük meg: a) a peptiderg primer afferensek által termelt kalcitonin gén-relációs peptid (CGRP) b) a nem peptiderg primer afferensek membránjában található poliszacharidkötött izolektin-b4 (IB4)(Todd, 2002; William D. Willis, 2004; Hegyi, Hollo, Kis, Mackie, & Antal, 2012) A kvantitatív analízis során összesen 225 CGRP immunreaktív foltot számoltunk meg, melyből 17,8 ± 3,5% MGL immunreaktivitást is mutatott a gerincvelő felületes hátsó szarvának I. laminájában. A gerincvelő felületes hátsó szarvának I. ill. IIi laminájában az összesen 964 IB4 immunreaktív foltból mindössze 1,14 ± 0,3%-nál találtunk pozitív MGL jelölést is (2/a. és 3. ábra). Az összesen 387 MGL immunreaktív folt 10,03 ± 2,5%-a mutatott CGRP immunreaktivitást is, míg 1090 MGL immunreaktív foltból csupán 1,1± 0,3% mutatott IB4 immunreaktivitást is (2/b. és 3. ábra). 20

21 2/a ÁBRA: Marker-IR foltok százalékos megoszlása axonális és gliális profilokon 2/b ÁBRA: MGL-IR foltok százalékos megoszlása axonális és gliális profilokon 21

22 3 ÁBRA: Az MGL-IR foltok kolokalizációja peptiderg (CGRP, piros; a) és nem peptiderg (IB4, piros; d) primer afferensek markereivel 1 µm vastagságú konfokális mikroszkópos felvételen (lépték: 5 µm) 5.3 Az MGL immunreaktivitás kolokalizációja a glutamáterg serkentő és GABAerg gátló neuronok axon terminálisaival A gerincvelő felületes hátsó szarvi serkentő és gátló interneuronok axonterminálisainak kimutatására általánosan elfogadott marker a VGLUT2(Li et al., 2003; Scherrer et al., 2010)valamint a VGAT(McIntire et al., 1997; Chaudhry et al., 1998). Ezért a glutamáterg és GABAerg gerincvelői neuronok MGL-lel való kolokalizációjának vizsgálatára e két markert használtuk. A megszámolt 751 VGLUT2immunreaktív folt 10,79 ± 1,05%-a, valamint a 609 VGAT immunreaktív folt 2,45 ± 0,72%-a MGL-re is immunreaktív volt (2/a.és 4. ábra). Az összesen 1251 MGL immunreaktív folt 6,3 ± 0,5%-a kolokalizált a VGLUT2 markerrel, és a megszámolt 524 MGL immunreaktív folt mindössze 2,96 ± 0,83%-a mutatott VGAT immunreaktivitást is (2/b. és 4. ábra). 22

23 4 ÁBRA: Az MGL-IR foltok kolokalizációja serkentő interneuronok (VGLUT2, piros; a) és gátló interneuronok (VGAT, piros; d) axonterminálisainak markereivel 1 µm vastagságú konfokális mikroszkópos felvételen (lépték: 2 µm) 5.4 Az MGL immunreaktivitás kolokalizációja az asztrociták és mikroglia sejtek markereivel A CB1 receptor agyi glia sejtek általi expresszióját már Matsuda és mts. bizonyították 1990-ben(Matsuda et al., 1990), dekésőbb a gerincvelő hátsó szarvában is kimutatták a jelenlétét(salio et al., 2002, Hegyi et al., 2009). Ezt követőena glia sejtek, mint az endokannabinoid szignalizáció aktív komponensei egyre több kutatás tárgyát képezték és több eredmény is igazolta, hogy az endokannabinoidok szintézisében és lebontásában is részt vesznek(carrier et al., 2004; Stella, 2004; Walter et al., 2004). Az asztrociták immunhisztokémiai detektálása az asztrocita-specifikus GFAP által, míg a mikrogliák azonosítása a CD11b sejtfelszíni integrin által történt. Az összesen 674 GFAP immunreaktív folt 20,29 ± 0,9%-a, míg a 455 CD11b immunreaktív folt 2,3 ± 1,47%-a mutatott MGL immunreaktivitást is (2/a. és 5. ábra). A 794 MGL immunreaktív folt 17,4 ± 1,11%-a volt GFAP pozitív és az összesen 1245 MGL immunreaktív folt mindössze 1,02 ± 0,41%-a volt CD11b pozitív is (2/b. és 5. ábra). 23

24 5ÁBRA: Az MGL-IR foltok kolokalizációja asztrociták (GFAP, piros; a) és mikroglia (CD11b, piros; d) markereivel 1 µm vastagságú konfokális mikroszkópos felvételen (lépték: 5 µm) 24

25 6 Összefoglalás A központi idegrendszeri szinapszisok működésének szabályozásában az endokannabinoid rendszer kitüntetett helyet foglal el. Mint retrográd hírvivő molekulák a 90- es évek elejénaz anandamid és a 2-AG felfedezésével egyidejűleg lettek ismertek, melyek mint kiderült a szervezet által termelt legfontosabb endogén kannabinoidok, melyek a CB1-Ron hatva fejtik ki hatásukat. A CB1-R-k preszinaptikusan elhelyezkedő 7 transzmembrán régióval rendelkező G i/o -protein kapcsolt receptorok, melyek aktiválása befolyásolja számos ioncsatorna és intracelluláris enzim működését. A legfontosabb hatások között említhetjük az adenilát-cikláz enzim működésének gátlását, a MAPK aktivitásának stimulálását, az N-, P/Qtípusú feszültségfüggő Ca 2+ csatornák gátlását, és az inwardly rectifying K + channels stimulálását is. A 2-AG szintéziséért felelős DGL-α posztszinaptikus expressziója is igazolja, hogy az endokannabinoidok mint retrográd hírvivő molekulák a posztszinaptikus termelődésüket követően visszafelé diffundálva elérik és aktiválják a preszinaptikusan elhelyezkedő CB1-R-t. Ezzel szemben a 2-AG lebontásáért felelős enzim, az MGL preszinaptikusan található, ahol működésükkel befolyásolják az endokannabinoidok által közvetített hatások időtartamát. Az endokannabinoid-mediált szinaptikus plaszticitási folyamatok két típusa ismert, a rövid távú szinaptikus depresszió (STD) valamint a hosszú távú szinaptikus depresszió (LTD), melyeknek homo- és heteroszinaptikus formáját is leírták gátló és serkentő szinapszisok esetében is. Ezeket a folyamatokat a központi idegrendszer számos területén kimutatták, beleértve a gerincvelő felületes hátsó szarvát is, ahol a fájdalomfeldolgozó neuronhálózatok működését befolyásolják. E plaszticitási folyamatok lefolyásának időtartamát pedig nagyban befolyásolhatja a lebontását katalizáló enzimnek, az MGL-nek a jelenléte és működése. Korábbi adatok alapján a gerincvelő felületes hátsó szarvában a primer afferensek és interneuronok axonterminálisainak, valamint a gliasejteknek egy része erős CB1-R expressziót mutat. Ebből kiindulva feltételezhető, hogy ezen axonterminálisokon és gliasejtekena 2-AG hatásának terminálását katalizáló MGL is expresszálódik. Eredményeink alapján azonbanaz MGL expressziója meglehetősen heterogén képet mutatott a gerincvelő különböző neuronális és gliális elemei között. Az MGL elsősorban peptiderg primer afferensek és a serkentő interneuronok axonterminálisain, továbbá az asztrocitákon 25

26 expresszálódik a gerincvelő hátsó szarvában, ami azt sugallja, hogy ezeken a sejteken a CB1 receptorhoz kötődő 2-AG-t az MGL valószínűleg lebontja, és ezzel a 2-AG hatása rövid latenciával lecseng. Az endokannabinoidok a nem peptiderg primer afferensek és a gátló interneuronok axonterminálisainak egy részén is CB1-R aktiválásán keresztül hatnak, ahol azonban nem sikerült MGL immunreaktivitást kimutatni. Ezért feltételezhető, hogy a 2-AG a nem peptiderg primer afferensek és gátló interneuronok axonterminálisain található CB1-Rok aktiválásán keresztül elhúzódóbb hatást válthat ki. Korábbi irodalmi adatok alapján a mikrogliákban a 2-AG lebontására egy szerin hidroláz enzim, az ABHD-12 is képes.mivel azáltalunk vizsgált mikroglia sejtek szinte kivétel nélkül negatívak voltak MGL-re, feltételezhető, hogy a mikrogliákban a 2-AG elsődleges bontó enzime valóban nem az MGL, hanem az ABHD12. A kapott eredmények azt sugallják, hogy a gerincvelő hátsó szarvában a 2-AG mediált szinaptikus plaszticitás a különböző típusú szinapszisokban különböző formában jelentkezhet, és azt, hogy a felszabaduló 2-AG rövid vagy hosszú távú plaszticitási folyamatokat indukál-e, az MGL expressziója vagy annak hiánya feltételezhetőleg döntő mértékben fogja meghatározni.. 26

27 7 Felhasznált irodalom Bertrand, T., Augé, F., Houtmann, J., Rak, A., Vallée, F., Mikol, V., Berne, P.F., Michot, N., Cheuret, D., Hoornaert, C., & Mathieu, M. (2010) Structural basis for human monoglyceride lipase inhibition. Journal of molecular biology, 396, Bisogno, T., Berrendero, F., Ambrosino, G., Cebeira, M., Ramos, J.A., Fernandez-Ruiz, J.J., & Di Marzo, V. (1999) Brain regional distribution of endocannabinoids: implications for their biosynthesis and biological function. Biochemical and biophysical research communications, 256, Bisogno, T., Howell, F., Williams, G., Minassi, A., Cascio, M.G., Ligresti, A., Matias, I., Schiano-Moriello, A., Paul, P., Williams, E.-J., Gangadharan, U., Hobbs, C., Di Marzo, V., & Doherty, P. (2003) Cloning of the first sn1-dag lipases points to the spatial and temporal regulation of endocannabinoid signaling in the brain. The Journal of cell biology, 163, Bisogno, T., Sepe, N., Melck, D., Maurelli, S., De Petrocellis, L., & Di Marzo, V. (1997) Biosynthesis, release and degradation of the novel endogenous cannabimimetic metabolite 2-arachidonoylglycerol in mouse neuroblastoma cells. Biochem J, 322 ( Pt 2, Blankman, J.L., Simon, G.M., & Cravatt, B.F. (2007) A comprehensive profile of brain enzymes that hydrolyze the endocannabinoid 2-arachidonoylglycerol. Chem Biol, 14, Carrier, E.J., Kearn, C.S., Barkmeier, A.J., Breese, N.M., Yang, W., Nithipatikom, K., Pfister, S.L., Campbell, W.B., & Hillard, C.J. (2004) Cultured rat microglial cells synthesize the endocannabinoid 2-arachidonylglycerol, which increases proliferation via a CB2 receptor-dependent mechanism. Mol Pharmacol, 65, Castillo, P.E., Younts, T.J., Chávez, A.E., & Hashimotodani, Y. (2012) Endocannabinoid signaling and synaptic function. Neuron, 76, Cervero, F., Handwerker, H.O., & Laird, J.M. (1988) Prolonged noxious mechanical stimulation of the rat s tail: responses and encoding properties of dorsal horn neurones. The Journal of physiology, 404, Chaouch, A., Menetrey, D., Binder, D., & Besson, J.M. (1983) Neurons at the origin of the medial component of the bulbopontine spinoreticular tract in the rat: an anatomical study using horseradish peroxidase retrograde transport. The Journal of comparative neurology, 214, Chaudhry, F.A., Reimer, R.J., Bellocchio, E.E., Danbolt, N.C., Osen, K.K., Edwards, R.H., & Storm-Mathisen, J. (1998) The vesicular GABA transporter, VGAT, localizes to synaptic vesicles in sets of glycinergic as well as GABAergic neurons. J Neurosci, 18,

28 Compton, D.R., Rice, K.C., De Costa, B.R., Razdan, R.K., Melvin, L.S., Johnson, M.R., & Martin, B.R. (1993) Cannabinoid structure-activity relationships: correlation of receptor binding and in vivo activities. J Pharmacol Exp Ther, 265, Cravatt, B.F., Giang, D.K., Mayfield, S.P., Boger, D.L., Lerner, R.A., & Gilula, N.B. (1996) Molecular characterization of an enzyme that degrades neuromodulatory fatty-acid amides. Nature, 384, Deutsch, D.G. & Chin, S.A. (1993) Enzymatic synthesis and degradation of anandamide, a cannabinoid receptor agonist. Biochem Pharmacol, 46, Devane, W.A., Hanus, L., Breuer, A., Pertwee, R.G., Stevenson, L.A., Griffin, G., Gibson, D., Mandelbaum, A., Etinger, A., & Mechoulam, R. (1992) Isolation and structure of a brain constituent that binds to the cannabinoid receptor. Science, 258, Di Marzo, V. (2008) Targeting the endocannabinoid system: to enhance or reduce? Nature reviews. Drug discovery, 7, Di Marzo, V., Fontana, A., Cadas, H., Schinelli, S., Cimino, G., Schwartz, J.C., & Piomelli, D. (1994) Formation and inactivation of endogenous cannabinoid anandamide in central neurons. Nature, 372, Dinh, T.P., Carpenter, D., Leslie, F.M., Freund, T.F., Katona, I., Sensi, S.L., Kathuria, S., & Piomelli, D. (2002) Brain monoglyceride lipase participating in endocannabinoid inactivation. Proc Natl Acad Sci U S A, 99, Freund, T.F., Katona, I., & Piomelli, D. (2003) Role of endogenous cannabinoids in synaptic signaling. Physiol Rev, 83, Gao, Y., Vasilyev, D. V, Goncalves, M.B., Howell, F. V, Hobbs, C., Reisenberg, M., Shen, R., Zhang, M.-Y., Strassle, B.W., Lu, P., Mark, L., Piesla, M.J., Deng, K., Kouranova, E. V, Ring, R.H., Whiteside, G.T., Bates, B., Walsh, F.S., Williams, G., Pangalos, M.N., Samad, T. a, & Doherty, P. (2010) Loss of retrograde endocannabinoid signaling and reduced adult neurogenesis in diacylglycerol lipase knock-out mice. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience, 30, Gérard, C., Mollereau, C., Vassart, G., & Parmentier, M. (1990) Nucleotide sequence of a human cannabinoid receptor cdna. Nucleic acids research, 18, Gerdeman, G.L. & Lovinger, D.M. (2003) Emerging roles for endocannabinoids in long-term synaptic plasticity. British journal of pharmacology, 140, Gobel, S. (1978) Golgi studies of the neurons in layer II of the dorsal horn of the medulla (trigeminal nucleus caudalis). The Journal of comparative neurology, 180, Gulyas, A.I., Cravatt, B.F., Bracey, M.H., Dinh, T.P., Piomelli, D., Boscia, F., & Freund, T.F. (2004) Segregation of two endocannabinoid-hydrolyzing enzymes into pre- and 28

29 postsynaptic compartments in the rat hippocampus, cerebellum and amygdala. Eur J Neurosci, 20, Hegyi, Z., Hollo, K., Kis, G., Mackie, K., & Antal, M. (2012) Differential distribution of diacylglycerol lipase-alpha and N-acylphosphatidylethanolamine-specific phospholipase d immunoreactivity in the superficial spinal dorsal horn of rats. Glia, 60, Hegyi, Z., Kis, G., Hollo, K., Ledent, C., & Antal, M. (2009) Neuronal and glial localization of the cannabinoid-1 receptor in the superficial spinal dorsal horn of the rodent spinal cord. Eur J Neurosci, 30, Herkenham, M., Lynn, a B., Little, M.D., Johnson, M.R., Melvin, L.S., De Costa, B.R., & Rice, K.C. (1990) Cannabinoid receptor localization in brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 87, Hohmann, A.G., Martin, W.J., Tsou, K., & Walker, J.M. (1995) Inhibition of noxious stimulus-evoked activity of spinal cord dorsal horn neurons by the cannabinoid WIN 55, Life sciences, 56, Hohmann, A.G., Tsou, K., & Walker, J.M. (1998) Cannabinoid modulation of wide dynamic range neurons in the lumbar dorsal horn of the rat by spinally administered WIN55, Neuroscience letters, 257, Huang, S.M., Strangman, N.M., & Walker, J.M. (1999) Liquid chromatographic-mass spectrometric measurement of the endogenous cannabinoid 2-arachidonylglycerol in the spinal cord and peripheral nervous system. Zhongguo yao li xue bao = Acta pharmacologica Sinica, 20, Kano, M., Ohno-Shosaku, T., Hashimotodani, Y., Uchigashima, M., & Watanabe, M. (2009) Endocannabinoid-mediated control of synaptic transmission. Physiol Rev, 89, Katona, I., Sperlágh, B., Sík, A., Käfalvi, A., Vizi, E.S., Mackie, K., & Freund, T.F. (1999) Presynaptically located CB1 cannabinoid receptors regulate GABA release from axon terminals of specific hippocampal interneurons. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience, 19, Katona, I., Urbán, G.M., Wallace, M., Ledent, C., Jung, K.-M., Piomelli, D., Mackie, K., & Freund, T.F. (2006) Molecular composition of the endocannabinoid system at glutamatergic synapses. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience, 26, Kinsey, S.G., Long, J.Z., Neal, S.T.O., Abdullah, R.A., Poklis, J.L., Boger, D.L., Cravatt, B.F., & Lichtman, A.H. (2009) Blockade of Endocannabinoid-Degrading Enzymes Attenuates Neuropathic Pain 330, Koga, D., Santa, T., Fukushima, T., Homma, H., & Imai, K. (1997) Liquid chromatographicatmospheric pressure chemical ionization mass spectrometric determination of 29

30 anandamide and its analogs in rat brain and peripheral tissues. Journal of chromatography. B, Biomedical sciences and applications, 690, Kondo, S., Kondo, H., Nakane, S., Kodaka, T., Tokumura, A., Waku, K., & Sugiura, T. (1998) 2-Arachidonoylglycerol, an endogenous cannabinoid receptor agonist: identification as one of the major species of monoacylglycerols in various rat tissues, and evidence for its generation through CA2+-dependent and -independent mechanisms. FEBS Lett, 429, Köfalvi, A. (2008) Cannabinoids and the Brain. Springer. Kreitzer, a C. & Regehr, W.G. (2001) Cerebellar depolarization-induced suppression of inhibition is mediated by endogenous cannabinoids. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience, 21, RC174. Labar, G., Wouters, J., & Lambert, D.M. (2010) A review on the monoacylglycerol lipase: at the interface between fat and endocannabinoid signalling. Curr Med Chem, 17, Li, J.L., Fujiyama, F., Kaneko, T., & Mizuno, N. (2003) Expression of vesicular glutamate transporters, VGluT1 and VGluT2, in axon terminals of nociceptive primary afferent fibers in the superficial layers of the medullary and spinal dorsal horns of the rat. J Comp Neurol, 457, Light, A.R. & Willcockson, H.H. (1999) Spinal laminae I-II neurons in rat recorded in vivo in whole cell, tight seal configuration: properties and opioid responses. Journal of neurophysiology, 82, Lujan, R., Nusser, Z., Roberts, J.D., Shigemoto, R., & Somogyi, P. (1996) Perisynaptic location of metabotropic glutamate receptors mglur1 and mglur5 on dendrites and dendritic spines in the rat hippocampus. The European journal of neuroscience, 8, Luján, R., Roberts, J.D., Shigemoto, R., Ohishi, H., & Somogyi, P. (1997) Differential plasma membrane distribution of metabotropic glutamate receptors mglur1 alpha, mglur2 and mglur5, relative to neurotransmitter release sites. Journal of chemical neuroanatomy, 13, Mackie, K., Lai, Y., Westenbroek, R., & Mitchell, R. (1995a) Cannabinoids activate an inwardly rectifying potassium conductance and inhibit Q-type calcium currents in AtT20 cells transfected with rat brain cannabinoid receptor. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience, 15, Mackie, K., Lai, Y., Westenbroek, R., & Mitchell, R. (1995b) Cannabinoids activate an inwardly rectifying potassium conductance and inhibit Q-type calcium currents in AtT20 cells transfected with rat brain cannabinoid receptor. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience, 15,