A hypophysis prolaktin elválasztásának szabályozása: intracelluláris mechanizmusok és a glükokortikoidok szerepe Dr. Horváth Katalin Mónika A doktori (Ph.D.) értekezés tézisei Semmelweis Egyetem, Doktori Iskola, Idegtudományok Program Budapest, 2001 Témavezető: Prof. Dr. Nagy M. György Neuroendokrin Kutatólaboratórium, Humánmorfológiai és Fejlődésbiológiai Intézet, Semmelweis Egyetem, Budapest 1
ÖSSZEFOGLALÁS Az emlősállatok agyalapi mirigyének mammotrop sejtjei által termelt prolaktin nélkülözhetetlen szerepet játszik a laktáció megindításában és fenntartásában. E hormon ürítése a mediális bazális hypothalamusban termelődő dopamin tónusos és domináns gátló hatása alatt áll, azonban laktáció során a megemelkedett plazma prolaktinszint ellenére a dopaminerg tónus jelentősebben nem csökken. Munkacsoportunk korábbi megfigyelései arra utalnak, hogy ennek egyik lehetséges magyarázata a mammotrop sejtek aktív részvétele a hypothalamikus és egyéb extracelluláris szignálok szabályozó hatásának közvetítésében. A jelen értekezésben leírt kísérleteink célja az volt, hogy 1) felderítsük azon intracelluláris mechanizmusok egy részét, melyek a mammotrop sejtek válaszkészségének szopás-indukálta változásában játszanak szerepet, főként az intracelluláris foszforilációs és defoszforilációs útvonalakra összpontosítva; és 2) bővebb információt kapjunk a mellékvesének és glükokortikoid hormonjának a szerepéről a szopási-, illetve más fiziológiás és farmakológiás stimulusok által kiváltott prolaktin válaszban. Kísérleteinkhez kölykeiktől elválasztott illetve elválasztást követően különböző ideig szoptató Sprague-Dawley patkányokat használtunk. Eredményeinket összefoglalva megállapítható, hogy az akut szopási inger átmenetileg kioltja a dopamin receptorok által közvetített gátlást (deszenzitizáció), és hosszantartóan fokozza a prolaktin ürítésnek mind a receptor-függő mind a jelátvivő rendszeren keresztüli közvetlen aktiválhatóságát (szenzitizáció). Adataink arra engednek következtetni, hogy a szopás-indukálta érzékenyítési jelenségért felelős egyik mechanizmus a D 2 dopamin receptor és az intracelluláris jelátvivő rendszer átmeneti szétkapcsolódása, ami nagy valószínűséggel egy vagy több szabályozó fehérje fokozott foszforilációjának (a szopás átmenetileg fokozza a ciklikus adenozin-monofoszfát szintet az adenohypophysis belső zónájában) ill. csökkent defoszforilációjának (szopási stimulust követően a protein foszfatáz 2A szintje csökken az adenohypophysisben) a következménye. Eredményeink továbbá arra utalnak, hogy a mellékvese illetve annak glükokortikoid hormonja fontos szerepet játszik nemcsak a prolaktin elválasztás gátlásában, de a serkentő szignálokra adott válaszában egyaránt. Ez feltehetően a prolaktin sejtek válaszkészségére kifejtett hatásán keresztül valósul meg. Végül, a laktáló anyák adenohypophysisében a glükokortikoid receptorok mennyisége jelentősen alacsonyabb, mint nem laktáló petefészekirtott anyákban, valamint kölykeiktől történő elválasztást követően e receptorok molekulasúlya megváltozik, mely poszttranszlációs módosulásra, feltehetőleg foszforilációra utal. BEVEZETÉS Prolaktin (PRL) a hypophysis elülső lebenyének peptid hormonja, mely emlősökben döntő szerepet játszik a laktáció előkészítésében és fenntartásában. A szopási inger a PRL szekréció legfontosabb természetes stimulusa és a szopás által indukált PRL elválasztás egy széles körben tanulmányozott neuroendokrin reflex mechanizmus. A reflex ív afferens komponense neurális és a mellbimbóban valamint annak közvetlen környezetében elhelyezkedő számos mechanoreceptor ingerlése aktiválja. Ezt követően az idegi jel a gerincvelőn, agytörzsön és középagyon keresztül bejut a hypothalamusba ahol a hypothalamikus neuronok által termelt PRL szekréciót fokozó illetve gátló faktorok ürítésének módosulásán keresztül humorális (PRL ürítés) efferens kimenetté transzformálódik. A PRL elválasztást befolyásoló kémiai anyagok elsődlegesen a hosszú portális erek útján jutnak el a hypophysis elülső lebenyéhez, ahol közvetlenül hatnak a mammotrop sejteken. Továbbá a hypophysis középső és hátsó 2
lebenyébe lejutó illetve ott termelt anyagok a rövid portális ereken keresztül érkeznek a mammotrop sejtekhez. Régóta ismert, hogy a hypophyseális PRL szekréció főregulátora a mediális bazális hypothalamusból származó dopamin (DA). A többi hypophyseális hormonnal ellentétben, melyeket serkentő és gátló faktorok egyaránt szabályoznak, úgy tűnik, hogy a PRL ürítése főként a DA domináns és tónusos gátló hatása alatt áll. A PRL szekréciónak ez a különleges természete évtizedek óta ösztönzi a kutatókat a még ismeretlen, PRL elválasztást fokozó hypothalamikus főfaktor megtalálására és a tónusos DA gátlás sejtszintű mechanizmusának jobb megértésére. A mammotrop sejtek alapvető tulajdonsága, hogy a PRL-t folyamatosan és nagy mennyiségben szintetizálják és ürítik. Azonban, in vivo körülmények között e szekréciós aktivitás jelentősen gátolt a hypothalamikus DA tónusos fékező hatása által. A DA G- fehérjéhez kapcsolt D 2 dopamin receptorokon keresztül gátolja az adenilát cikláz és a foszfolipáz C aktiválta intracelluláris útvonalakat, valamint a Ca 2+ csatornákat. Továbbá, a DA képes aktiválni K + csatornákat is, mely a sejtek hiperpolarizációját eredményezi. Az akut szopási stimulus jelentősen megváltoztatja a mammotrop sejtek válaszkészségét, mégpedig azoknak a DA gátló hatása iránti érzékenysége csökken, míg a PRL ürítést serkentő faktorok (mint pl. a thyreotropin-releasing hormon/trh) iránti érzékenysége fokozódik (ún. érzékenyítési jelenség). Továbbá, Nagy és mts. (1991) kimutatták, hogy a hypophysis elülső lebenyének ún. centrális vagy belső zónájában elhelyezkedő mammotrop sejtek különbözőképpen vesznek részt a szopás-indukálta PRL elválasztásban, mint a külső zónában található sejtek. Úgy tűnik, hogy a szopási stimulus kezdetekor a hypothalamikus DA ürítésben bekövetkező hirtelen fellépő és átmeneti csökkenés a mammotropok válaszkészség változásában fontos szerepet tölt be. Az pontosan nem ismert, hogy a dopamin hogyan módosítja a mammotropok érzékenységét, de egyik lehetséges magyarázat a következő. Az eukarióta sejtek közös szabályozó mechanizmusa az intracelluláris fehérjék reverzibilis foszforilációja, melynek révén a sejtek gyorsan változtatni képesek az extracelluláris ingerekkel szembeni válaszkészségüket. Ezeknek a fehérjéknek a foszforilációs állapotát protein-kinázok és protein-foszfatázok szabályozzák, melyek fontos szerepet játszanak a sejten belüli jelátvitelben. Korábbi vizsgálatainkban kimutattuk, hogy egy rövid (10 perces) szopási stimulus szignifikánsan csökkenti az egyik fő intracelluláris defoszforiláló enzim, a foszfoprotein-foszfatáz 2A (PP2A) szintjét a hypophysis elülső lebenyében (Murányi és mts., 1998). Ezen eredmény alapján úgy gondoltuk, hogy a PP2A szerepet játszik olyan fontos fehérjék szabályozásában, melyek a dopamin PRL szekrécióra kifejtett hatását továbbítják. Továbbá, a D 2 dopamin receptor jelátvivő rendszerét követve feltételezzük, hogy az adenilát cikláz (AC) ciklikus adenozin monofoszfát (camp) proteinkináz A (PKA) kaszkád és a Ca 2+ aktivált protein-kináz C (PKC) útvonalak felelősek lehetnek a PP2A hatásának ellensúlyozásáért ugyanazon szabályozó fehérjék foszforilálásán keresztül. Ezenkívül, az adenilát cikláz egy fontos találkozási pont lehet a camp és Ca 2+ másodlagos hírvivők által aktivált útvonalak interakciójának komplex hálózatában, ugyanis az AC nemcsak a Gs- (s=serkentő) és Gi-fehérjék (i=gátló) és alegységei által szabályozott eseményekben vesznek részt hanem a PKC-indukálta folyamatokban is. Továbbá a PKC módosítani képes az adenilát cikláz válaszkészségét a G-fehérjékkel szemben. Feltételezzük, hogy a szopási stimulus a foszforilációs események intracelluláris egyensúlyában egy átmeneti eltolódást idéz elő, nevezetesen az AC-cAMP-PKA és a Ca 2+ - PKC útvonalak aktiválásával valamint a PP2A aktivitásának csökkentése révén. Ennek ellenére, a PP2A-nak a mammotrop sejtek szopás-indukálta szenzitizációjában játszott pontos szerepe és helye nem ismert és további kutatásokat kíván, csakúgy mint a PKA és PKC útvonalak szopási stimulus által okozott változásai. 3
A PRL elválasztás szabályozásában szerepet játszó neurális mechanizmusok bizonyos elemei különösen érzékenyek a mellékvese és a petefészek szteroid hormonjai iránt. Míg számos tanulmány azt bizonyította, hogy a glükokortikoidok gátló hatással vannak a PRL elválasztásra mind nem laktáló és laktáló állatokban, más adatok azt mutatják, hogy a mellékvese jelenléte szükséges a zavartalan laktációhoz. Glükokortikoid kezelés laktáló nőstényekben csökkenti a tej szintézisét, ugyanakkor paradox módon a mellékvese kiírtása is csökkenti a tejtermelést. Csoportunk korábban már leírta, hogy szoptató patkányokban, ellentétben a nem szoptatókkal, különböző stressz stimulusok mint pl. éter, formalin, vagy immobilizációs stressz nem okoznak PRL-szint emelkedést, sőt úgy tűnik, hogy a stressz csökkenti a plazma PRL-szintet a kölykeikkel folyamatos együttlévő laktáló állatokban (Bánky és mts., 1994). Összefoglalva, több kérdés is felmerül, nevezetesen mi a glükokortikoidok pontos szerepe a szopás illetve az anyáknak a kölykeiktől történő elválasztása által indukált akut PRL válaszban, és vajon modulálni képesek-e a mammotrop sejtek válaszkészségét. CÉLKITŰZÉSEK 1. A szopás-indukálta PRL ürítés előkészítésében és fenntartásában szerepet játszó intracelluláris mechanizmusok vizsgálata A) A G-fehérje/adenilát cikláz rendszernek a szopás-indukálta érzékenyítési jelenségében játszott lehetséges szerepének vizsgálata. Ez szoptatott es nem szoptatott mamákbol származo mammotrop sejtek PRL ürítésének in vitro meghatározásával történt. Az adenilát ciklázt közvetlenül aktiváló forskolin és a G- fehérjét gátló pertussis toxin valamint cholera toxin hatását teszteltük azok in vitro alkalmazását követően. A hypophyseális elülső lebenyi sejtek PRL szekrécióját egyedi sejt szinten mértük a Reverz Hemolitikus Plakk Assay (RHPA) segítségével. B) A PP2A szerepének tanulmányozása a mammotropok válaszkészség-változásának két aspektusában, nevezetesen a serkentő faktorok iránti érzékenység fokozódásban és a DA iránti deszenzitizációban. Nem-szoptatott mamákból származó mammotrop sejtek forskolin- és TRH-indukálta PRL válaszát mértük okadánsav előkezelés után (illetve nélkül), olyan dózist alkalmazva mely szelektíven gátolja a PP2A-t. A sejtek PRL ürítését ismét az RHPA technika alkalmazásával határoztuk meg. C) Az intracelluláris camp koncentráció szopás-indukálta változásainak meghatáarozása a hypophysis különböző lebenyeiben. A camp-szinteket radioimmunoassay segítségével mértük a hypophysis elülső lebenyének belső és külső zónájában, valamint közti és hátsó lebenyében. A kísérlet során még plazma PRL-szintet mértünk, mely a szopási stimulus erősségéről adott információt, valamint az -melanocyta stimuláló hormon ( MSH) plazma szintjét, mely a mammotropok szopás-indukálta érzékenyítésének egyik lehetséges mediátora. 2. A glükokortikoidok szerepe a PRL szekréció szabályozásában a laktáció során 4
A) A mellékveseírtás és dexamethasone (szintetikus glükokortikoid agonista, DEX) kezelés hatásának vizsgálata az in vivo PRL elválasztás szabályozására laktáló anyaállatokban, különös tekintettel a szopási-, illetve más fiziológiás és farmakológiás stimulusok által kiváltott prolaktin válaszra. B) In vivo DEX kezelés hatásának tanulmányozása individuális mammotrop sejtek in vitro bazális PRL ürítésére és a dopamin gátló hatásával szembeni válaszkészségükre. Nemszoptatott illetve szoptatott és fiziológiás sóoldattal- vagy DEX-injektált anyákbol származó mammotrop sejtek PRL ürítését hasonlítottuk össze a RHPA technika alkalmazásával. C) A glükokortikoid receptorok expressziójában bekövetkező szopás- és szeparációindukálta változások vizsgálata a szemikvantitatív Western blotting technika segítségével. ANYAGOK és MÓDSZEREK Kísérleteinkben elsô laktáló Sprague-Dawley patkányokat használtunk. Mindegyik kísérletben a kölykök számát az alomban egységesen nyolcra redukáltuk a laktáció elsô napján, és a különbözô kísérleteket a laktáció elsô hetének a végén hajtottuk végre. Az állatokat standard körülmények között tartottuk (légkondicionált szoba, 21-23 C, alternáló 14 órás világos (reggel 6 órától) és 10 órás sötét ciklusok). Patkánytáp és ivóvíz igény szerint állt rendelkezésre. Intracelluláris mechanizmusok vizsgálata a Reverz Hemolitikus Plakk Assay-vel A G-fehérje/adenilát cikláz rendszer valamint a PP2A szerepét vizsgálva a mammotropok szopás-indukálta válaszkészség-változásában, nem-szoptatott (4 órára elválasztott) és szoptatott (a szeparációt követôen 10 vagy 30 percig vagy elválasztás nélkül folyamatosan szoptatott) laktáló patkányok hypophysisét kivettük a laktáció 7-11 napján és az elülsô lebenyt RHPA-val feldolgoztuk. Dopamint (10-7 M), TRH-t (10-7 M) vagy forskolint (10-5 M - 10-7 M) adtunk a sejtekhez a RHPA teljes 1 órás inkubációs ideje alatt. A kísérletekben, melyekben cholera toxint (10 g/ml) vagy pertussis toxint (1 mg/ml) használtunk, az elülsô lebenyi sejtek (1 millió sejt/ml) 1 óráig voltak a toxinokkal elôkezelve (37 C-on, CO2 inkubátorban) közvetlenül a diszperzió után. Míg a diszpergált hypophyseális sejtek egy másik csoportját 2 nm okadánsavval vagy anélkül preinkubáltuk 120 perccel a RHPA-t megelôzôen. Az in vivo glükokortikoid kezelésnek a mammotrop sejtek szekréciójára és DA iránti érzékenységére kifejtett hatásának vizsgálatához: az állatok fiziológiás sóoldat vagy dexamethasone injekciót kaptak a dekapitáció elôtt 24 órával (DEX: 400 g/testsúly kg) és 2 órával (DEX: 200 g/testsúly kg) a bôr alá beadva. Majd a hypophysis elülsô lebenyét gyorsan kivettük a nem-szoptatott (közvetlenül a dekapitáció elôtt 4 órára a kölykeiktől elválasztott) vagy szoptatott (10 percig a szeparáció után) patkány anyákból (a laktáció 5-6-ik napján), és sejtek PRL elválasztását RHPA módszerrel vizsgáltuk tovább. A PRL bazális ürítésének mérésén kívül a DA gátló hatását is teszteltük 10-7 M DA-t hozzáadva az inkubációs médiumhoz. A Reverz Hemolitikus Plakk Assay-t Nagy és munkatársai (1988) módszere alapján végeztük. Röviden, laktáló anyákból a hypophysis elülsô lebenyét aszeptikus módon eltávolítottuk, majd trypsinnel diszpergáltuk. A monodiszpergált sejteket (30000 sejt/ml higításban) protein A-hoz kapcsolt birka vörösvérsejtekkel elegyítettük és 70-100 l 5
aliquotokat poly-l-lysine-nel fedett ún. Cunningham kamrákba infundáltuk, melyben a sejtek monolayer réteget képeztek. A 45 perces preinkubációt (37 C-on, CO2 inkubátorban) követően a monolayer réteget specifikus PRL antiszérummal 1 óráig inkubáltuk és ezt 30 perces tengeri malac komplementtel történô inkubáció követte. A plakkformáló sejteket megszámoltuk és a plakkok méretét a mikroszkópba helyezett kalibrált háló segítségével lemértük. 3-4 teljesen különálló kísérletben 200-200 sejt illetve plakk (100-100 a kettôs lemezeken), leszámolása után, meghatároztuk a plakkformáló sejtek százalékos elôfordulását (a szekretoros mammotropok számát) és a plakk terület átlagát (átlagosan ürített PRL/mammotropok). Ezt követôen kiszámoltuk a teljes szekréciós indexet (plakkformáló sejtek százalékos aránya x plakk területek átlaga), mely az integrált hormon szekréciót fejezi ki. Intracelluláris camp szintek mérése a hypohysisben A szopás-indukálta hypophyseális camp szintek változásának meghatározásához a kölyköket 9 órakor elválasztottuk az anyjuktól (a laktáció 5-9 napján), és 4 órával késôbb az anyák egy része kölykeik visszahelyezése után 10 illetve 30 percig szoptathatott. Ezt követően az állatokat gyorsan dekapitáltuk és vérmintát gyűjtöttünk plazma PRL- és -MSHszintek meghatározásához. A hypophysiseket gyorsan eltávolítottuk és a hátsó-közti lebenyt elválasztottuk az elülsô lebenytől. Ezután a közti és hátsó lebenyt is elválasztottuk egymástól egy finom csipesz segítségével mikroszkóp alatt. Majd mikrodisszekciós technikával az elülső lebenyt is 2 külön részre választottuk. Az egyik részt (belsô lebeny) az elülsô lebeny centrális régiója alkotta, mely közvetlenül a közti lebeny alatt helyezkedik el és a határai pirosas színe miatt jól kirajzolódnak. A maradék szövet (külsô lebeny) perifériásabban helyezkedett el és sokkal világosabb volt. A szövetminták camp tartalmát specifikus radioimmunoassay (Gottshall és mts., 1988) segítségével határoztuk meg. A mellékveseírtás és dexamethasone kezelés hatása az in vivo PRL szekrécióra 3 kísérletet hajtottunk végre a laktáció 7. napján. Mindegyik kísérletben volt egy mellékveseírtott és egy álműtött (kontroll) csoport. Továbbá, a mellékveseírtott állatok és a kontroll állatok fele dexamethason kezelést kapott, a B kísérletben a mellékveseírtott állatok egy további csoportja pedig kortikoszteron tablettát. Az A kísérletben, a kölykök elválasztásának hatását vizsgáltuk a mama plazma PRL szintjére. Vérmintákat gyűjtöttünk reggel közvetlenül a szeparációt megelôzôen 0 perckor (9 órakor) és 5, 15, 30, 60 perccel az elválasztást követôen. A B kísérletben a szopás-indukálta PRL választ vizsgáltuk. Vérmintákat gyűjtöttünk elválasztást megelôzôen (9 órakor) és 4 órával az elválasztást követôen. Ezután a kölyköket visszahelyeztük az anyákhoz és ezt követôen 30 es 60 perccel késôbb ismét vérmintákat vettünk. A C kísérletben, folyamatosan szoptató anyákat a dopamin receptor antagonista domperidonnal (i.v. 20 g/testsúly kg) kezeltük és ezt követôen 25 perccel késôbb formalinnak a bôr alá történő injektálásával (0.2 ml 1% formalin oldatot egy beültetett kanulán át) stresszeltük az állatokat. 6
Műtétek és hormonális kezelések Mellékveseírtás: Kétoldali mellékveseírtást hajtottunk végre éter altatásban a laktáció 3. napján. A sóvesztés kompenzálása végett a patkányok igény szerint fiziológiás sóoldatot ihattak. A kölykök súlyát naponta mértük, és gyakran cseréltük ôket a mellékveseírtott és kontroll mamák között, hogy a szopási stimulus intezitásbeli különbségeket elkerüljük. Dexamethasone kezelés: Az A kísérletben az állatok 400 g/testsúly kg-nak megfelelô dexamethasone-foszfát injekciót kaptak a bôr alá 24 órával a tesztet megelôzôen, valamint egy második injekciót a véreztetés napján 2 órával az elválasztást megelôzôen, míg a nem kezelt állatok fiziológiás sóoldattal lettek beinjektálva. A B kísérletben, 2 különbözô DEXkezelést alkalmaztunk. Az egyik csoportban az anyák 400 g/testsúly kg DEX-et kaptak a bôr alá 24, 48 és 72 órával a véreztetést megelôzôen (dex-i csoport). A másik csoportban egyrészt ugyanezt a kezelést alkalmaztuk és a véreztetés napján 2 órával a szopási stimulus elôtt még 250 g/testsúly kg DEX injekciót is kaptak az állatok (dex-ii). A többi állatot fiziológiás sóoldattal injektáltuk be. A C kísérletben, 400 g/testsúly kg DEX-et injektáltunk 24 órával a tesztelés előtt és 200 g/testsúly kg-ot a véreztetés napján (9 órakor), 2 órával a domperidon infúzió előtt. A többi állat ismét fiziológiás sóoldatot kapott. Kortikoszteron tabletta: kortikoszteron tablettát (100 mg) ültettünk be a bôr alá a melléekveseírtás napján. Vérminták gyűjtése (véreztetés) Két nappal a véreztetést megelôzôen, permanens kanulát ültettünk be a juguláris vénába éter altatásban, mely lehetôvé tette a gyakori vérminta vételeket szabadon mozgó állatból. Hogy az állatok habituálva legyenek a véreztetés eseményéhez a véreztetô szondát minden nap a beültetett kanülhöz csatlakoztattuk néhány órára. A kísérlet napján minden alkalommal 200 l vért vettünk és ebből késôbb plazma PRL- és kortikoszteron- (a B kísérletben a kortikoszteron tablettás állatoknál) szint meghatározást végeztünk. Glükokortikoid receptorok mérése a Western blotting metodikával A laktációnak a hypophyseális glükokortikoid receptorra kifejtett hatását vizsgáltuk nôstény patkányok 3 különbözô kísérleti csoportjában: 1) petefészekírtott nem-laktáló nôstények, 2) a dekapitáció elôtt kölykeiktől 4 órára elválasztott laktáló anyák (nemszoptatott) és 3) folyamatosan szoptatott laktáló nôstények (szoptatott). A dekapitáció után a hypophysiseket gyorsan eltávolítottuk, a közti-hátsó lebenyt elválasztottuk az elülsô lebenytôl, majd az elülső lebenyt belső és külső zónára választottuk szét és további meghatározásig -80 C-on tároltuk a szövetmintákat. A teljes sejthomogenizátum glükokortikoid receptor tartalmát a Western blot technika segítségével határoztuk meg 8%-os bis-acrylamid gélt használva a gél elektroforézishez. Majd immunoblottingot hajtottunk végre nitrocellulóz membránon és a GR reaktív sávok optikai denzitását Sigmagel képanalizáló rendszer segítségével mértük meg. Hormonszintek meghatározása A vérmintákat jéggel hűtött heparin tartalmú csövekbe fogtuk fel, lecentrifugáltuk és a plazmákat a hormon meghatározásokig -20 C-on tároltuk. A PRL-szinteket specifikus radioimmunoassay segítségével határoztuk meg (NIDDK). Standardként NIDDK patkány prolaktint (RP-3) használva az assay szenzitivitása 1 ng/ml volt. Az -MSH-szinteket érzékeny radioimmunoassay-vel határoztuk meg (Vecsernyés és mts., 1997). Mindegyik mintát duplikátumban mértük. Az assay-ek közötti variancia koefficiens 10%-os míg az assay-n belüli variancia koefficiens 5% volt. Plazma kortikoszteron-szint a kompetitív protein-kötô radioassay-vel lett meghatározva (Murphy 1967). 7
Az eredmények kiértékelése A Reverz Hemolitikus Plakk Assay, a camp meghatározás és az in vitro kísérletek hormon mérésének eredményeit kétszempontos analízis varianciáaval (ANOVA) analizáltuk, a többszörös összehasonlításokhoz pedig Dunnett s tesztet használtunk. Azokban a kísérletekben, melyekben a mellékveseírtásnak és a dexamethasone kezelésnek az in vivo PRL szekrécióra kifejtett hatását vizsgáltuk, a különbözô kísérleti manipulációknak a PRL szekrécióra kifejtett hatását a repeated measures ANOVA-val teszteltük, melyben a különbözô kezelések between subject faktorként szolgáltak míg a vérvételek idôpontjai mint within subject faktorként. A laktáló állatok kiindulási PRL értékei közötti különbséget mindegyik kísérletben a kétszempontos ANOVA-val analizáltuk. A csoportokon belüli PRLszint változásokat páros T-teszttel analizáltuk. A különbözô tesztekben statisztikai szignifikanciaként a <0.05-nél kisebb P értéket fogadtuk el. EREDMÉNYEK 1. Intracelluláris szabályozó mechanizmusok A) Szopás-indukálta változások az adenilát cikláz rendszer érzékenységében és a G- fehérjék szerepe a mammotrop sejtek válaszkészségében A nem-szoptatott anyákból származó diszpergált elülső lebenyi sejtek érzékenyek voltak a DA (10-7 M) gátló dózisával szemben, azonban teljesen érzéketlenek maradtak forskolin (10-6 M) iránt. Korábbi megfigyeléseinkkel megegyezően (Nagy és mts. 1990), 10 perces szopási stimulus a DA gátló hatásának megszűnését eredményezte. Ezzel egyidejűleg a mammotropok szignifikánsan érzékenyebbé váltak a forskolinnak a PRL ürítésre kifejtett serkentő hatása iránt, és ez a hatás dózis-függő volt. Harminc perces szoptatás után a mammotrop sejtek DA iránti válaszkészsége ismét detektálható volt, míg a forskolinindukálta PRL ürítés fennmaradt. Azok a sejtek, melyek folyamatosan szoptatott anyákból származtak, érzékenyek voltak mind a DA gátló valamint a forskolin stimuláló hatása iránt. A nem-szoptatott anyákból származó hypophyseális sejtek bazális szekretoros aktivitását mérhetően nem befolyásolta a pertussis vagy cholera toxinokkal történt in vitro előkezelés, a plakkformáló mammotropok száma és a plakkok átlagos plakk méretet nem változott. Azonban a pertussis toxin előkezelés kivédte a DA-nak a PRL szekrécióra kifejtett gátló hatását, valamint szopási stimulushoz hasonlóan, érzékenyítette a mammotrop sejteket a TRH-nak és a forskolinnak PRL serkentő hatása iránt. A cholera toxin előkezelésnek nem volt hatása sem a DA-indukálta gátlásra sem a mammotropok TRH és forskolin iránti érzéketlenségére. B) A PP2A szerepe a mammotrop sejtek szenzitizációjában A kölykeiktől elválasztott mamákból származó hypophyseális sejteket először 2 nm okadánsavval preinkubáltuk. Az okadánsav ebben a koncentrációban a PP2A-t szelektíven gátolja. A preinkubációt követően a sejteket TRH-val vagy forskolinnal inkubáltuk. Nemszoptatott anyák mammotrop sejteinek TRH és forskolin kezelés iránti érzéketlenségét az okadánsavas előkezelés teljesen megváltoztatta. Az előkezelés után mindkét anyag serkentette a PRL elválasztását. C) A szopási stimulus hatása a hypophyseális camp-szintre A szopás-indukálta camp koncentráció változásoknak az elülső lebeny belső ées külső zónájában történt vizsgálata a camp-szint szelektív emelkedését mutatta ki 10 perces szoptatás után a belső zónában. Azonban amikor a szoptatás további 20 percig folytatódott 8
hasonló változást nem sikerült kimutatnunk. Ezzel egyidőben, a camp-szint szignifikáns csökkenése volt megfigyelhető a hátsó lebenyben mind a 10- es 30-perces szopási periódust követően. Igaz a mért camp-szintek magasabbak volt a közti lebenyben összehasonlítva a hátsó lebennyel, ezek szintje nem változott sem 10 sem 30 perces szoptatás után. A hormonális meghatározások alacsony plazma PRL-szinteket jeleztek a 4 órás elválasztás után. A 10 es 30 perces szopási stimulus szignifikáns plazma PRL-szint emelkedést eredményezett, míg a plazma -MSH szintjében semmilyen változás nem volt kimutatható. 2. A mellékvese és glükokortikoid hormonjának a szerepe A) A mellékveseírtás és dexamethasone kezelés hatása a PRL in vivo szekréciójára A. kísérlet - Elválasztás-indukálta PRL válasz Kontroll állatokban a kölyköktől történő elválasztás szignifikáns PRL-szint csökkenést eredményezett. Ez a csökkenés már 5 perccel az elválasztást követően megfigyelhető volt, de a beavatkozás utáni 15, 30 perc múlva még kifejezettebbé vált és 60 perccel később az aktuális plazma érték rendkívül alacsony volt. Mellékveseírtott állatokban vagy teljesen hiányzott vagy nagyon kismértékű volt a PRL-szint csökkenés 30 perccel az elválasztást követően, azonban 30 perccel később (60 perccel az elválasztás után) kifejezetten csökkent és ekkor a plazma PRL-szintek a kontrollban mért alacsony értékkel voltak közel azonosak. A mellékvese-intakt állatok DEX kezelése szignifikáns plazma PRL-szint csökkenést eredményezett, mely már a szeparációt megelőzően megfigyelhető volt és a 60 perces szeparációs periódus alatt nem változott. Mellékveseírtott és DEX-kezelt állatok PRL válasza a nem kezelt kontroll állatok és a mellékveseírtott állatok válasza között volt. B kísérlet - A szopási stimulus hatása a PRL ürítésre A szopás-indukálta karakterisztikus plazma PRL-szint emelkedés elmaradt azoknál az állatoknál, melyeknél mindkét mellékvesét eltávolítottuk. Ezekben az anyákban miután a kölyköket visszahelyeztük és azok szopni keztek plazma PRL-szint emelkedés nem volt megfigyelhető. Azokban a mellékvese-intakt állatokban melyek DEX kezelést kaptak a véreztetés előtti napokban, de nem a teszt napján (dex-i), a PRL-szint a szopási stimulust követően megemelkedett, igaz ez a válasz inkább közepes mértékű volt. Mellékveseírtott állatok hasonló DEX kezelése visszaállította a szopás-stimulálta PRL választ az állatok többségében. Hasonló hatást figyeltünk meg a kortikoszteronnal-kezelt mellékveseírtott anyákban is. Ezekben az állatokban a plazma kortikoszteron-szint a kontroll szoptató anyákban mért szinttel volt összehasonlítható. Azonban, ha DEX kezelést alkalmaztunk a kísérlet napján is, 2 órával a szopási stimulus előtt (dex-ii), a PRL válasz teljesen elmaradt mind a kontroll mind a mellékveseírtott állatokban. C kísérlet - A mellékveseírtás és DEX kezelés hatása folyamatosan szoptató anyák plazma PRL szintjére melyek domperidon és formalin stressz kezelésben részesültek A véreztetés kezdetén, a mellékveseírtott állatokban szignifikánsan magasabb volt a plazma PRL-szintje mint kontroll állatokban, de a DEX kezelésnek nem volt szignifikáns hatása. Az első vérminta levétele után (-120 perc), az anyákat vagy fiziológiás sóoldattal vagy DEX-vel injektáltuk be. Ez a manipuláció, mely során az anyákat egy rövid időre el kellett választani a kölykeiktől, mérhető plazma PRL-szint csökkenést eredményezett, de ez a csökkenés statisztikailag csak a kontroll +DEX csoportban és a mellékveseírtott+dex csoportban volt szignifikáns. A második véreztetés után ( 0 perc ) minden állat domperidonnal lett beinjektálva, mely plazma PRL-szint emelkedést eredményezett. Mellékveseírtott illetve DEX-kezelt álműtött állatokban a domperidonnak ez a hatása 9
szignifikánsan fokozott volt, és a plazma PRL-szint e két csoportban kétszer olyan magas szintet ért el mint a kontroll csoportban. Ezzel ellentétben, a mellékveseírtott+dex-kezelt állatokban a domperidon injekcióra adott PRL válasz a kontroll állatokéval volt összehasonlítható. Huszonöt perccel a domeridon kezelést követően az összes állatot formalinnal stresszeltük. A kontroll csoportban a formalin beadását követő 30 percen belül nem volt említésre méltó változás a vér PRL koncentrációjában. Ezzel egyidőben, a formalin stressz kifejezett plazma PRL-szint csökkenéshez vezetett a mellékveseírtott illetve DEXkezelt csoportokban. Azokban a mellékveseírtott állatokban melyek DEX kezelést kaptak a formalin injekcióra adott PRL válasz hasonló volt a kontroll csoportéval. B) Az in vivo glükokortikoid kezelés hatása a mammotrop sejtek in vitro PRL szekréciójára Először az in vivo dexamethasone kezelésnek a bazális PRL szekrécióra kifejtett hatását vizsgáltuk. Nem-szoptatott laktáló anyákból származó mammotrop sejtek in vitro PRL ürítése szignifikánsan csökkent az in vivo glükokortikoid kezelés után. Ezzel ellentétben a szoptatott anyákból származó sejtek bazális szekretoros aktivitása nem változott. A DA gátló hatását vizsgálva az in vivo fiziológiás sóoldattal-kezelt állatokban a már jól ismert hatásokat találtuk, azaz a nem-szoptatott anyák sejtjeinek PRL ürítése kifejezetten gátolt volt, míg a 10 percig szoptatott anyaállatok sejtjei viszonylagosan érzéketlenek maradtak a dopamin gátló hatása iránt. Azonban amikor az állatok in vivo DEX kezelést kaptak a dopamin kifejezett gátló hatása volt megfigyelhető mind a nem-szoptatott de ami fontosabb, a szoptatott anyák mammotrop sejtjeinek PRL ürítésére is. C) Laktáció-indukálta változások a hypophyseális glükokortikoid receptor expressziójában Az elülső lebeny mind belső mind külső zónájából származó homogenátumban két elkülöníthető glükokortikoid receptor immunoreaktív sáv volt megfigyelhető. Az immunoblotton az egyik vonal körülbelül 94 kda magasságban helyezkedett el, mely megfelel a teljes hosszúságú glükokortikoid receptor molekulasúlyának, valamint egy második sávot is detektáltunk kb. 33 kda-nál, mely kisebb mint a teljes-hosszúságú receptor molekulatömegének a fele. Az alsó sáv kifejezettebbé vált amikor nagyobb mennyiségű fehérjét futtattunk a gélen. A közti-hátsó lebenyi mintákban, glükokortikoid receptor immunoreaktív sávok jelentek meg kb. 33 kda magasságban, és igaz nagyon gyengén jelölődve de a teljes-hosszúságú receptor magasságában is láttunk sávokat. A felső sávok optikai denzitásának mérése szignifikánsan erősebb glükokortikoid receptor immuno-jelölést mutatott petefészekírtott nem laktáló állatok elülső lebenyi mind belső és külső zónájában, összehasonlítva a szoptatott illetve kölykeiktől elválasztott laktáló nőstényekkel. Mikor a szoptatott és nem-szoptatott anyákból származó mintákat hasonlítottuk össze szignifikáns különbséget nem találtunk a glükokortikoid receptor sávok optikai denzitásában. Azonban az elválasztott anyákból származó mintákban szélesebb immunoreaktív sávok voltak megfigyelhetőek, és jelölődés történt ~94 kda-nál magasabb pozícióban is, 94-97 kda tartományban, míg a szoptatott anyákból származó glükokortikoid receptor immunopozitív sávok pozíciója azonos volt a petefészekírtott nem laktáló állatokéval. Mivel a felső sávok nagyon gyengén jelölődtek a közti-hátso lebenyi mintákban, ezért itt az alsó sávok optikai denzitását határoztuk meg, mely nem mutatott különbséget a csoportok között. 10
MEGBESZÉLÉS 1. A szopás-indukálta PRL ürítés előkészítésében és fenntartásában szerepet játszó intracelluláris mechanizmusok A) Eredményeink azt mutatják, hogy nem-szoptatott anyákban az adenilát cikláz viszonylagosan érzéketlen a forskolin direkt stimuláló hatása iránt. A szopási inger azonban érzékenyíti a mammotrop sejteket, mivel 10 perces szopási ingert követően a sejtek szignifikáns PRL ürítéssel válaszolnak a forskolin kezelésre. Továbbá, a szopás indukálta adenilát cikláz válaszkészség fokozódás a dopamin iránti válaszkészség csökkenéssel párhuzamosan alakul ki. Azonban, míg ez utóbbi esemény átmeneti, az adenilát cikláz szenzitizációja hosszan fennmarad. Jól ismert, hogy a pertussis toxin érzékeny gátló G- fehérjék (Gi/o) a dopamin hypophysiseális PRL szekréció szabályozásának a mediátorai. Valóban adataink azt igazolják, hogy az adenohypophyseális sejtek pertussis toxinnal történő előkezelése a DA-nak a PRL szekrécióra kifejtett hatását teljesen megszünteti, mely arra utal, hogy a Gi/o-fehérjék fontos szerepet játszanak a D 2 dopamin receptor aktivációt követő jelátviteli folyamatokban. Ezenkívül a pertussis toxin-kezelt hypophyseális mammotrop sejtek egy TRH/forskolin érzékeny állapot felé tolódnak el. Ez a megfigyelés azt jelzi, hogy a D 2 dopamin receptornak a gátló G-fehérjéktől (Gi/o) történő szétkapcsolódása hasonló változásokat eredményez a mammotrop sejtek válaszkészségében, mint amit a szopási stimulus első perceiben megfigyelhetünk. Jóllehet a D 2 receptor lehetséges szétkapcsolódása a szopási stimulust követően csak átmeneti (rövidebb mint 30 perc) jelenség viszont a DA receptoron keresztüli jelátvitel kezdeti érzeketlen periódusa felveti, hogy a DA gátló hatásának átmeneti megszűnése a PRL ürítést fokozó szignálok indukciójának elengedhetetlen feltétele. Ezenkívül a gátló útvonalnak az átmeneti deszenzitizációt követő reaktivációja valószínűleg nemcsak a DA gátló hatását állítja helyre, hanem valójában a PRL szekréció fokozottabb stimulációját eredményezi a G-fehérje alegységein keresztül, melyek aktiválni képesek a koincidencia detektor adenilát ciklázokat. Ez tovább igazolhatja az adenilát ciklázokat hosszú távú érzékenyítődésének fontosságát, hiszen így lehetővé válik többféle hormonális inputnak az integrációja mely a PRL szekréció szabályozásának a finom beállítását eredményezi. B) A PP2A szerepének, mint lehetséges disztális komponensnek további vizsgálata a szopás-indukálta G-fehérje/adenilát cikláz útvonal érzékenyítődésében azt mutatja, hogy a PP2A szelektív gátlásával a szopási stimulus utánozható, amennyiben az nem-szoptatott anyákbol származó sejteken a TRH-nak és forskolinnak a PRL ürítést serkentő hatását eredményezi. C) Azok a faktorok, melyek fontos szerepet játszanak a szopás-indukálta PRL válaszban, úgy mint DA megvonás, angiotenzin II vagy a vazoaktív intesztinális peptid, mind képesek indukálni a camp termelést. Jelen megfigyeléseink a camp-szint régió specifikus változásaival kapcsolatban megegyeznek korábbi eredményeinkkel melyek azt bizonyították, hogy a laktáló patkányokból származó hypophyseális elülső lebenyi belső és külső zóna sejtek a szopást követően különbözőképpen reagálnak a gátló és serkentő faktorokra. A camp mérés eredményei és a PP2A szerepével kapcsolatos megfigyeléseink együttesen arra utalnak, hogy a mammotrop sejtek szekretoros működésében bekövetkezett szopásindukálta változások foszforilációs és defoszforilációs folyamatokhoz kapcsoltak. Mivel a hypophysis elülső lebenyében a szopási inger-indukálta camp koncentráció és PP2A aktivitás változások időben egybeesnek a mammotropoknak a DA gátló hatása iránti 11
deszenzitizácójával, ezért feltételezzük, hogy vagy a D 2 receptor, a G-fehérje alegységek vagy az adenilát cikláz foszforilációjának a módosulása felelős a mammotropok válaszkészségének változásáért. Feltételezzük, hogy a fent említett molekulák legalább egyikének foszforilációja a D 2 dopamin receptornak a gátló G-fehérjéktől (Gi/o) történő szétkapcsolódását és a szekretoros útvonalat stimuláló Gs-fehérjékhez történő kapcsolódasát eredményezi. Ez a mammotropoknak a dopamin gátló hatása iránti válaszkészség csökkenéséhez és a PRL ürítést fokozó faktorok serkentő hatása iránti érzékenyítődéshez vezethet (1. Ábra). Ezekben az érzékenyített sejtekben, a PRL-szekréciót serkentő faktorok melyek az adenilát cikláz vagy inozitol-foszfát útvonalakon hatnak az intracelluláris camp és Ca 2+ szintek a robbanásszerű emelkedését okozzák, mely a szekretoros vezikulumokból történő masszív PRL ürítést eredményez. Emellett a camp a camp-response element binding fehérjén keresztül a PRL gén transzkripcióját és új hormon szintézisét indukálja. A kísérleteinkben kimutatott átmeneti camp koncentráció emelkedés azt sugallja, hogy a sejt foszforilációs szintje visszatér a szopás előtti állapotra kb. 10-30 perccel a szopási stimulus kezdete után annak ellenére, hogy a szopás folytatódik. Igaz, a PP2A aktivitásáról e későbbi időpontból nincsen adatunk, de a fehérje foszforilációs reakciók dinamikus természetét valamint a kinázok és a foszfatázok koordinált kontrolját figyelembe véve feltételezhető, hogy a PP2A szintje is visszatér a nem szoptatott állapothoz hasonló értékre. Ezzel összefüggően a sejteknek a DA gátló hatása iránti válaszkészsége 30 perces szopás után visszatér, igaz az adenilát cikláznak a serkentő faktorok iránti érzékenysége fennmarad. 12
NEM-SZOPTATOTT Serkentő faktor Y D 2 - P PP2A PKA/PKC Dopamin D 2 K + 2+ Ca X Serkentő faktor G s G P PP2A PKA/PKC camp PKA G i &G o AC [Ca 2+ ] ic G q/11 PL-C DAG IP 3 PKC SZOPTATOTT PRL ürítés csökkent Dopamin szint PP2A PKC Serkentő faktor Y D 2 - P PKA/PK D 2 K + 2+ Ca X Serkentő faktor G s G i/o PP2A AC- AC- P G i &G o G q/11 AC PL-C PKA/PKC DAG IP 3 camp PKC PKA [Ca 2+ ] ic PRL ürítés 1. Ábra: A mammotrop sejtek szopás-indukálta PRL szekréciójában szerepet játszó sejtszintű mechanizmusok. A szürke nyilak és vonalak a PRL ürítés tónusos gátlásában szerepet játszó útvonalakat jelzik, míg a fekete nyilak és vonalak serkentő útvonalakat jelölnek. A vastag nyilak és vonalak aktivált útvonalakat mutatnak, míg a vékonyak deaktivált útvonalakat vagy csökkent aktivitású jelátvivő utakat jelölnek. Továbbá, a fehér-szürke nyilak csökkent aktivitást míg a fekete nyilak az enzimek fokozott aktivitását jelzik. ( : gátlás, :serkentés; X,Y= serkentő faktorok receptorai; P= foszfát csoport). 13
2. A mellékveseírtás és a glükokortikoid kezelés hatása a PRL szekréció szabályozására a laktácio során A) Az értekezés eredményei arra utalnak, hogy a mellékvese és a glükokortikoid hormonok fontos szerepet játszanak a PRL ürítés szabályozásában a laktáció során. A mellékvese eltávolítása laktáló anyákból élettani és gyógyszertani stimulusok által indukált alapvető hypophyseális PRL válaszokkal interferál. A hozzáférhető adatok azt sugallják, hogy a glükokortikoidok bizonyos szintje szükséges a mammotropok érzékenységének a fenntartásához mind a serkentő és gátló faktorokkal szemben. Jelen megfigyeléseink, melyek azt mutatják, hogy az akut szopási stimulus a mellékveseírtott állatban elmarad és ez a válasz dexamethasone illetve kortikoszteron kezeléssel visszaállítható az első kimutatása annak, hogy alapvető hypophyseális PRL válaszokhoz a glükokortikoidok jelenléte szükséges. In vivo eredményeink nem nyújtanak közvetlen információt a glükokortikoid hatás pontos helyéről, de feltételezzük, hogy a serkentő hatás a hypothalamuson keresztül mediálódik, valószínűleg a glükokortikoidoknak a hypothalamikus PRL ürítést serkentő faktorokra (úgy mint a TRH, vazoaktív intesztinalis peptid, és oxytocin) kifejtett hatása révén. Azonban, egy módosult dopaminerg kontroll sem kizárható. A szopás-indukálta PRL válaszban játszott serkentő befolyás mellett, a mellékvese és glükokortikoid hormonjai gátló hatást is kifejtenek a plazma PRL-szintre, amint ezt a következő megfigyelések bizonyítják: mellékveseírtott laktáló patkányokban i) a bazális plazma PRL-szint megemelkedett; ii) elválasztást követően a PRL-szint csökkenés elhúzódó; iii) a laktáció késői stádiumát jellemző PRL-szint csökkenés elmarad (Van der Schoot és de Greef, 1983); iv) dopamin receptor blokkoló haloperidol (Kiem és mts., 1991) és domperidon beadását követően a PRL válasz fokozott; valamint a tesztelés napján adott akut dexamethasone kezelést követően a szopás-indukálta PRL ürítés gátolt (Bartha és mts., 1991; és a jelen értekezés). A mellékvesekéreg hormonok PRL szekrécióra kifejtett gátló hatásának a pontos helye és mechanizmusa még nem ismert, de feltételezzük, hogy ez a glükokortikoidnak a hypophysis elülső lebenyére kifejtett hatásán alapul és/vagy a központi idegrendszerre, különösen a hypothalamikus tuberoinfundibuláris és a periventriculohypophyseális dopaminerg rendszerre kifejtett hatáson. B) Továbbá, in vitro adataink azt mutatják, hogy in vivo DEX kezelés hatással van a mammotrop sejteknek mind a bazális PRL szekréciójára mind a DA gátló hatásával szembeni válaszkészségükre. Mivel az állatok DEX injekciót kaptak 24 és 2 órával a dekapitáció előtt, ezért azt nem tudjuk alátámasztani, hogy a DEX kezelés ezen hatásai gén transzkripciós változások-e, melyek néhány órától napokig tartanak, vagy a jelátvivő útvonalakra kifejtett közvetlen non-genomikus hatások következményei. C) Eredményeink azt mutatják, hogy a glükokortikoid receptorok mennyisége a hypophysisben szignifikánsan csökken a laktáció során összehasonlítva a petefészekírtott nem laktáló nőstényekkel. A hypophyseális glükokortikoidok ilyen mértékű csökkénése (downregulációja) a mellékvese laktáció alatti krónikus aktivációjának lehet a következménye (Voog és mts., 1969). Nem volt szignifikáns különbség a szoptatott es nemszoptatott anyák immunoreaktív glükokortikoid receptor sávjainak teljes optikai denzitásai között. Igaz GR meghatározás az elülső lebeny teljes belső és külső zónájából történt, mivel a laktáció során a mammotrop sejtek az elülső lebenyi sejtek 50%-át alkotják ezért feltételezzük, hogy eredményeink főleg a mammotrop sejtekben bekövetkezett glükokortikoid receptor változásokat reflektálják. A kölykök elválasztásának hatására a glükokortikoid receptor molekulatömege megnő az elülső lebenynek mind a belső mind a 14
külső zónájában. Ez a változás poszttranszlációs módosulásra, feltételezhetően foszforillációra utal. Összefoglalva, az értekezés eredményei azt mutatják, hogy a hypophyseális mammotrop sejtek szopás-indukálta érzékenyítési jelensége intracelluláris fehérje foszforilációs és defoszforilációs útvonalak aktivitásának a koordinált változásán alapszik. Adataink arra is rámutatnak, hogy a mammotrop sejtek hasznos eszköznek bizonyulnak a receptor-jelátvivő rendszerek szenzitizációs és deszenzitizációs folyamatainak tanulmányozásában. Ezenkívül, azt a következtetést vonhatjuk le, hogy a plazma PRL-szint szabályozása a laktáló patkányban különösen érzékeny a mellékveséből származó szabályozó jelek iránt. Továbbá a mellékvese és glükokortikoid hormonjának a PRL ürítés kontrolljában játszott szerepe komplex. 15
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Köszönetemet szeretném kifejezni mindazoknak akiknek segítsége és támogatása nélkül ez az értekezés nem készülhetett volna el. Mindenekelőtt meg szeretném köszönni témavezetőmnek, Professzor Dr. Nagy M. Györgynek, kutató munkám során nyújtott értékes tudományos és személyes támogatását. Külön köszönettel tartozom különösen a stimuláló vitákért és a közlemények valamint a jelen értekezés megírásában nyújtott segítségéért. Nagyra értékelem nagyfokú lelkesedését a hormon hatások sejtszintű szabályozásával kapcsolatban és optimista szemléletét. Továbbá, köszönetemet szeretném kifejezni Halász Béla Professzor Úrnak támogatásáért és a munkám iránti serkentő érdeklődéséért, valamint konstruktív megjegyzéseiért és segítségéért a publikációk és a doktori értekezés megírásában. Köszönettel tartozom még Dr. Somogyvári-Vigh Anikónak a camp mérésekért, Dr. Bánky Zsuzsannának gyakorlati segítségéért a véreztetéses kísérletek végrehajtása során; Mészáros Máriának mindennapi laboratóriumi munkában, de különösen a Reverz Hemolitikus Plakk Assay-ben nyújtott segítségéért; Dr. Tóth Bélának és asszintenseinek Balázs Máriának és Szentmiklósi Karolának a PRL mérésekért; Dr. Vecsernyés Miklósnak a plazma -MSH szintek meghatározásáért és Bodnár Ibolya Ph.D. hallgatónak az értekezés kivitelezésében nyújtott segítségéért. Végül, de nem utolsósorban köszönetemet szeretném kifejezni a név szerint nem említett társszerzőknek, és a Humánmorfológiai és Fejlődésbiológiai Intézet összes munkatársának a stimuláló környezet biztosításáért a Ph.D. munkám során. Igaz gyakorlati értelemben a Ph.D. munkámhoz közvetlenül nem járultak hozzá, de hálámat szeretném kifejezni középiskolai biológia-kémia tanárnőmnek, Dr. Schweighoffer Ernőnének és a Veszprém megyei kórház belgyógyász főorvosának Dr. Csillag Józsefnek. Végezetül köszönetemet szeretném kifejezni családomnak és barátomnak folyamatos támogatásukért és hogy mindig ott álltak mögöttem amikor szükségem volt rájuk. 16
PUBLIKÁCIÓS JEGYZÉK Tudományos közlemények 1. Nagy G.M., Göőz P., Horváth K.M., Tóth E.B. Regulation of prolactin secretion, Encyclopedia of Reproduction, edited by Knobil, E., and Neill, J.D., Academic Press, San Diego, California, USA. Vol. 4. pp 60-66, 1998. 2. Horváth K.M., Radnai B., Tóth B.E., Fekete M.I.K., Nagy G.M. Inhibition of protein phosphatase 2A (PP2A) mimics suckling-induced sensitization of mammotropes: Involvement of a pertussis toxin (PTX) sensitive G-protein and the adenylate cyclase (AC). Molecular and Cellular Endocrinology 149: 1-7, 1999. 3. Meerlo P., Horvath K.M., Nagy G.M., Bohus B., Koolhaas J.M. The influence of postnatal handling on adult neuroendocrine and behavioural stress reactivity. Journal of Neuroendocrinology 11: 925-933, 1999. 4. Horváth K.M., Somogyvári-Vigh A., Kandár Z., Vecsernyés M., Arimura A., and Nagy G.M. Suckling-induced increase in cyclic AMP exclusively in the central region of the rat adenohypophysis. Brain Research 873: 140-144, 2000. 5. Buwalda B., Felszeghy K., Nyakas C., Horvath K.M., de Boer S.F., and Koolhaas J.M. Temporal and spatial dynamics of corticosteroid receptor down-regulation in rat brain following social defeat. Physiology and Behaviour 72: 349-354, 2001. 6. Horváth K.M., Bánky Z., Tóth B.E., Nagy G.M., Halász B. Dual role of glucocorticoids in suckling-induced prolactin secretion. Endocrine, közlés alatt, 2001. 7. Horváth K.M., Bánky Z., Tóth B.E., Nagy G.M., Halász B. Effect of adrenalectomy and dexamethasone treatment on prolactin secretion of lactating rats. Brain Research Bulletin, közlés alatt, 2001. Előadások és poszter prezentációk tudományos konferenciákon 1. Góth M., Horváth K.M., Czirják S., Szilágyi G., Szabolcs I., Kovács L., Dohan O., Nagy G.M. Investigation of hormone secretion of human hypophyseal tumors at individual cell level. XVIth Congress of the Hungarian Endocrinological and Metabolical Society, Debrecen, Hungary, 1996. 2. Horváth, K.M., Bánky, ZS., Tóth, E.B., Nagy, G.M., Halász B.: A mellékvesekéreg szteroidok in vivo és in vitro hatásának vizsgálata laktáló patkányok laktotróp sejtjeire, előadás, poszter, Magyar Endokrinológiai és Anyagcsere Társaság XVI. kongresszusa, 1996, Debrecen. 3. Horváth K.M., Bánky ZS., Tóth E.B., Nagy G.M., Halász B. Adrenal steroids influence pituitary mammotropes of lactating rats: Evidence obtained from in vivo and in vitro 17
studies. 10th International Congress of Endocrinology, San Francisco, USA, 1996.Góth M.I., 4. Horváth K.M., Czirják S., Szilágyi G., Szabolcs I., Kovács L., Dohán O., Nagy G.M. Analysis of growth hormone secretion of individual pituitary adenoma cells from an acromegalic patient as determined by the reverse hemolytic plaque assay (RHPA). Endocrinology and Metabolism, Vol. 4, Suppl. A (1997). First International Meeting of the Growth Hormone Research Society, London, UK, 1997. 5. Meerlo P., Horvath K.M., and Koolhaas J.M. Early postnatal handling affects adult behavioural and neuroendocrine stress reactivity. Second Dutch Endo-Neuro Meeting, Doorwerth, The Netherlands, June 3-5, 1998. 6. Buwalda B., Felszeghy K., Nyakas C., Horvath K.M., de Boer SF., and Koolhaas J.M.: Dynamics in time and space of corticosteroid receptor binding in rat brain after social defeat. Third Dutch Endo-Neuro Meeting, Doorwerth, The Netherlands, June 2-4, 1999. 7. Horvath K.M., Van der Borght K., Toth B.E., Luiten P.G.M., Halasz B., Nagy G.M. Alterations in rat pituitary glucocorticoid receptors during lactation. IXth Semmelweis Science Fair Past, Present and Future of Neuroendocrinology, Budapest, Hungary, November 4-5, 1999. 18