Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Idegtudományi Doktori Iskola NUKLEOTID RECEPTOR KARAKTERIZÁCIÓ PRIMER AGYI KAPILLÁRIS ENDOTHEL SEJTEKEN A SZABADGYÖK TERMELÉS VIZSGÁLATA IN SITU NEURONÁLIS EREDETÛ MITOKONDRIUMOKBAN Ph.D tézisek Témavezetõ: Prof. Ádám Veronika egyetemi tanár dr Sipos Ildikó Semmelweis Egyetem Orvosi Biokémia Intézet BUDAPEST 2003
ÖSSZEFOGLALÁS Az Abbott és mtsi. (1992) által kifejlesztett RBCE sejttenyésztési módszert továbbfejlesztettük a képalkotó fluorimetriás mérések követelményeinek megfelelõen. A sejteket extracelluláris biológiai mátrixszal (ECM) bevont üveglemezen tenyésztettük, ezáltal fluoreszcencia jelentõsen csökkent. Az ECM-on nevelt primer RBCE sejtek agonista-indukálta Ca 2+ -válaszai jóval uniformabbnak bizonyultak, mint a kollagénes felszínen nevelt RBCE sejteké. Az ECM-on nevelt RBCE sejtekben kimutattuk a P2Y 2 és egy P2Y 1 -szerû receptor együttes jelenlétét. Elsõként bizonyítottuk az adenozin [Ca 2+ ] i emelõ hatását primer RBCE sejtekben, mely A 1 -receptoron keresztül jön létre. Egyre több bizonyíték áll rendelkezésünkre arról, hogy a komplex I csökkent mûködése fontos tényezõ a Parkinson-kór etiológiájában. a mitokondriális légzési komplex gátlás és a ROS termelés közötti összefüggést vizsgáltuk in situ neuronális eredetû mitokondriumokban. Az in situ ROS hatás detektálására az akonitáz aktivitás mérést használtuk, illetve közvetlenül is detektáltuk a H 2 O 2 felszabadulást. Kimutattuk, hogy a komplex I kritikus helye a mitokondriális ROS képzõdésnek, már kismértékû 16%-os komplex I gátlás is jelentõs ROS felszabadulással járt. A komplex III és IV esetében a ROS termelésben nem történt változás addig, ameddig a komplex gátlás meg nem haladta a 70%-os küszöböt, ennek élérése után drámai növekedés Kimutattuk, hogy in situ mitokondriumokban a rotenonutóbbi a komplex I gátlása esetén is képes ROS termelésre, ilyenkor a 1
rotenon gátlás helyétõl disztálisan belépõ elektronok járulnak hozzá a ROS képzéshez. Bizonyítottuk, hogy in situ agyi mitokondriumokban a komplex I és a komplex III gátlása okozta ROS termelés független a ÄØ m - tól. SUMMARY We adapted and modified the rat brain capillary endothelial cell (RBCEC) culturing method, originally described by Abbott et al. (1992), to the requirements of fluorescence measurement techniques. The biological extracellular matrix (ECM) -coated glass coverslips have much less background fluorescence than the commonly used collagen-coated plastic surfaces. Moreover, RBCE cells grown on ECM produced by corneal endothelial cells grow more rapidly and uniformly to confluence, and show a more uniform spindle-shaped cell morphology characteristic of differentiated brain endothelial cells. We demonstrated pharmacologically the presence of P2Y 2 and P2Y 1 like nucleotide receptors in RBCE cells, and in addition the presence of an A 1 - type adenosine receptor. The agonist-induced [Ca 2+ ] i changes were significantly higher when cells were grown on ECM, than in identical culture conditions without ECM, which highlights the role of ECM in the regulation of pharmacological phenotype of brain endothelial cells. Reactive oxygen species (ROS) generated in the respiratory chain was measured and the quantitative relationship between inhibition of the respiratory chain complexes and ROS formation was investigated in isolated nerve terminals. Inactivation of complex I to a small extent (16 ± 2 %) resulted in a significant increase in ROS formation, while 71 % 2
threshold inhibition were detected for complex III and IV, above that substantial aconitase inactivation was observed, indicating an enhanced ROS generation. This was confirmed by direct detection of H 2 O 2 under similar conditions. Dissipation of ÄØ m by FCCP or DNP had no effect on the H 2 O 2 production induced by rotenone or antimycin. When antimycin was m was totally dissipated, but the ROS production decreased only by 15%. In the presence of rotenone, antimycin remained capable of inducing an enhanced ROS formation, though to a smaller extent than without inhibition of complex I. These experiments suggest that in in situ mitochondria of synaptosomes when complex I is completely inhibited electrons entering the respiratory chain distal from the rotenone site could fuel ROS formation. BEVEZETÉS Disszertációmban két, egymással szorosan nem összefüggõ témát foglaltam össze: i) primer patkány agyi kapilláris endothel sejtek nukleotid receptorainak karakterizációját, és ii) in situ neuronális eredetû mitokondriumokban a légzési komplex bénítók hatására bekövetkezõ reaktív oxigén származék termelõdés vizsgálatát. E kettõsség abból adódik, hogy munkám kezdetén az agyi kapilláris endothel sejtek tenyésztésének elsajátítása és a tenyészetek karakterizációja volt a cél, azonban hosszútávú célunk az agyi kapilláris endothel sejtek oxidatív stressz iránti érzékenységének és az oxidatív stresszben betöltött szerepének vizsgálata. Ez utóbbi mérések módszertani elõkészítése során 3
egy, a primer agyi endothelnél könnyebben vizsgálható rendszert -izolált idegvégzõdéseket- használtam, azt a preparátumot, amelyrõl a munkacsoport hosszú évekre visszanyúlóan nagy ismeretekkel rendelkezik. Ezért a disszertáció második felét az izolált idegvégzõdések vizsgálata során kapott eredmények képezik. I. Az agyi endothelium nukleotid receptorai és a vér-agy gát permeabilitásának szabályozása Az asztrocita végtalpak és a pericyták által szorosan behüvelyezett agyi kapilláris endothel sejtek hozzák létre a vér és az agy közötti dinamikus barriert, amit röviden (angolul blood-brain barrier; BBB) nevezünk. A vér-agy gátat alkotó agyi kapilláris endothel sejtek barrier az endothel sejtek közötti szoros kapcsolódásnak (zonula occludens) köszönhetik. Az agyi endothelium azonban nem teljesen átjárhatatlan, a BBB-en keresztüli szigorúan szabályozott anyagáramlást az endothel sejtek plazmamembránjában elhelyezkedõ receptorok, ioncsatornák és specifikus transzporterek biztosítják in vitro agyi kapilláris endothel preparálási módszer ismert, melyek során a BBB-re in vivo megõrzõdött, így ezek az egyszerû, dinamikus kisérleti rendszerek nagyban hozzájárultak a BBB mûködésének mélyebb megismeréséhez. A primer patkány agyi kapilláris endothel sejtek (RBCEC) növekedésük során konfluens monolayert alkotnak és a BBB-re in vivo jellemzõ morfológiai és biokémiai tulajdonságokkal bírnak. A nukleotid receptorok jelenlétét az agyi endothel sejtek felszínén in vivo és in vitro modellen végzett vizsgálatok egyaránt igazolták. Az endothel sejtek felszínén található adenozin receptorokat A 1 -A 3 4
csoportba soroljuk, míg a nukleotid receptorokat általánosságban P2-vel jelöljük. A P2 család két nagy csoportra oszlik, a P2X és P2Y receptorcsaládokra. Az elõbbiek szerkezetüket tekintve ligand-vezérelt ioncsatornák, míg az utóbbiak hét transzmembrán doménnel rendelkezõ, G-fehérjéhez kapcsolt receptorok. A különbözõ nukleotid receptor alcsaládok között farmakológiailag az agonisták hatáserõsségi sorrendje alapján és specifikus antagonisták segítségével tehetünk különbséget. A P2X receptorokról általánosságban elmondható, hogy leginkább ATP-re 1 alcsalád fõként ADP-re és annak mesterséges származékaira érzékeny, a P2Y 2 és P2Y 4 típusú receptorok ATP-re és UTP-re egyaránt érzékenyek, az utóbbi UTP iránti affinitása valamivel nagyobb. A nukleotid receptorok természetes ligandjai (ATP, ADP, UTP) hatásukat kifejthetik a luminális (vér felõli) és az abluminális (agy felõli) oldalon egyaránt. A nukleotidok a vérben fõleg vérlemezkékbõl származnak, míg az agyi oldalon simaizom vagy neuronális eredetûek lehetnek. A vérlemezkékbõl felszabaduló nukleotidok az agyi endothel sejtek felszínén található P2Y nukleotid receptorokon hatva szabályozzák az endotheliális NO és prosztaciklin (PGI 2 ) szintézist, ezen keresztül antiproliferatív és simaizom relaxáló hatást fejtenek ki, II. Légzési komplexek gátlása és a következményes szabadgyök keletkezés in situ agyi mitokondriumokban a neurodegeneratív betegségek etiológiai háttérrel bírnak. Napjainkban azonban egyre szélesebb körben lehet a 5
Komplex I károsodást mutattak ki Huntingtonkórban a komplex II-III hibáját feltételezik, és egyre több bizonyíték áll rendelkezésünkre a komplex IV károsodás mitokondriális légzési komplexek mûködésének hibája csökkent energiatermeléshez vezet, melynek következtében megnövekszik az intracelluláris kalcium szint, megnõ a proteáz és foszfolipáz aktivitás, valamint a szabadgyök termelés. Ezen hatások együttesen a neuronok szelektív pusztulásához vezetnek. A fenti megfigyelések fordították figyelmünket a mitokondriális légzési komplex gátlás és a ROS keletkezés közötti összefüggések alaposabb vizsgálatára in situ A sejtekben a mitokondriumok fiziológiás mûködése során is keletkeznek reaktív oxigén származékok (ROS). ROS termelésre termodinamikailag mind a négy légzési komplex képes, de izolált mitokondriumon végzett komplex I és a komplex III a ROS keletkezés kiemelt helyei a mitokondriumban. Az irodalomból ismert, hogy a komplex I gátló rotenon adagolásra az A mitokondriális légzési komplexek gátlása membránpotenciál (ÄØ m ) változáshoz vezethet, arról azonban, hogy ez befolyásolja a ROS termelést egymásnak ellentmondó erdemények jelentek meg. Parkinson-kórban a substantia nigra sejtjei különösen érzékenyek lehetnek a szabadgyökökre, hiszen nagy mennyiségben tartalmaznak szabad vasat, mely a Fenton-reakcióban további szabadgyök képzõdés forrása lehet. A komplex I gátlás az oxidatív 6
foszforiláció gátlását is erdeményezi; a komplex I 25%-os gátlása szignifikáns csökkenést mutatott az ATP szintézisben és az oxigénfogyasztásban, mely bioenergetikai deficit sejtpusztuláshoz vezethet. Azt, hogy a szabadgyök képzõdés oka vagy következménye a mitokondriális károsodásnak nem tudjuk, de egyre több bizonyítékkal rendelkezünk arról, hogy a ROS keletkezés fontos tényezõ a Parkinsonkór etiológiájában. A ROS termelõdés detektálásának sokféle módszere ismert, ezek egyike a akonitáz aktivitásának mérése. Az akonitáz rendkívül a szuperoxidra, de érzékeny szenzora a peroxinitritnek és az extracellulárisan adott H 2 O 2 -nak is. A szuperoxid a mitokondriális szuperoxid dizmutáz hatására nagyon gyorsan H 2 O 2 -dá alakul, s mivel a H 2 O 2 könnyen átjut a sejtmembránon, ezért a H 2 O 2 felszabadulás mértékét a mitokondriális szuperoxid termelés jó indikátorának tekinthetjük. Az in situ mitokondriumok vizsgálata azért fontos, mert ilyenkor a mitokondriumokat -szemben az izolált mitokondriumokkal, amelyek kivülrõl hozzáadott szubsztráttal mûködnek és számos funkciójuk a szubsztrát fajtájától függ - a fiziológiás citoplazmatikus közeg veszi oxidációja során keletkeznek, és a mitokondriumban illteve a mechanizmusok. mûködnek a szabadgyököket elimináló 7
CÉLKITÛZÉSEK Munkánk során a következõ célokat kívántuk megvalósítani: 1. Primer agyi kapilláris endothel tenyésztés módszerének fejlesztése és adaptálása a fluoreszcens mérési technika követelményeinek megfelelõen úgy, hogy a sejtkultúra tisztasága és növekedésének sebessége ne változzon. 2. Biológiai mátrixon tenyésztett agyi kapilláris endothel sejtek purinerg receptorainak farmakológiai karakterizálása képalkotó fluorimetriás módszerrel. 3. In situ mitokondriális légzési komplexek aktivitásának vizsgálata gátlószereik jelenlétében izolált agyi idegvégzõdésekben (szinaptoszómákban). 4. aktivitásának mérésével. in situ az akonitáz enzim 5. felszabadulás vizsgálata fluorimetriás módszerrel szinaptoszómákban. 6. vizsgálata a membránpotenciál függvényében szinaptoszómákban. 8
MÓDSZEREK Primer patkány agyi kapilláris endothel tenyészet A sejttenyésztés során a Semmelweis Egyetem etikai kódexének állatkisérletekre vonatkozó utasításainak megfelelõen jártunk el. A kb. 300 grammos hím Wistar patkányokat dekapitáltuk és a patkányok agyából primer endothel kultúrát készítettünk az Abbott és mtsi. (1992) által leírtak alapján. Ez összefoglalva a következõ: a fehérállományt eltávolítottuk, a szürkeállományból homogenizálás és centrifugálási lépések után mikroér darabokat nyertünk. 3 órás kollagenáz/diszpázos emésztést követõen Percoll grádiens centrifugálással izoláltuk a kapilláris fragmentumokat, melyeket ezután extracelluláris mátrixszal elõzetesen bevont üveglemezekre ültettünk ki. Kisérleteinket 6-9 napos, konfluens agyi endothel sejttenyészeteken végeztük. A sejtek endotheliális eredetét immuncitokémiai módszerrel (von Willebrand faktor pozitivitás) bizonyítottuk. A tenyésztõ médium 20% marha szérumot tartalmazó standard Dulbecco s modified Eagle s médium (DMEM) oldatból készült a következõ anyagok hozzáadásával: 75 µg ml -1 endotheliális növekedési faktor, 100 i.u. ml -1 penicillin / 100 µg ml -1 streptomycin, 2 mm glutamin, 80 µg ml -1 inzulin, transzferrin és szelén. Marha korneális endotheliumból származó extracelluláris mátrix A vágóhídról beszerzett friss marhaszemek korneájából primer korneális endothel tenyészetet készítettünk, amelyet 3-4 passage után végül steril 9
ázó üveg fedõlemezeket nyílt láng felett sterilizáltuk. Miután a korneális endothel sejtek konfluenssé váltak, a sejteket 20mM NH 4 OH segítségével denudáltuk. Az így visszamaradó sértetlen extracelluláris mátrixszal bevont lemezek ezután 3-6 hónapig eltarthatók steril izotóniás sóoldatban Intracelluláris [Ca 2+ ] mérés képalkotó fluorimetriás módszerrel A [Ca 2+ ] i méréshez az endothel sejteket kalcium szenzitív festékkel (Fura- 2 AM, 6 µm, 1 h, 37 ºC) töltöttük fel. Ezután a fedõlemezeket áthelyeztük az inverz Nikon Diaphot 200 mikroszkópra helyezett fûtött (37 ºC) perfúziós kamrába, majd a különféle perfúziós oldatokat a kisérletek során a sejtek közelébe helyezett üvegkapillárison keresztül juttattuk a perfúziós 2+ ] i szignálokat képalkotó fluorimetriás mikroszkóppal (Fluor 40/1.3 objektív, Nikon) mértük. A mérések során polikromátorral elõállított 340 és 380 nm excitációs hullámhosszakat használtunk, a fluoreszcens emissziót 510 nm-en mértük. A kisérleti eredmények legalább három különbözõ lemezen mért adatok átlagát jelentik, egy látómezõben átlagosan 20-40 sejt volt látható. A [Ca 2+ ] i nagyságát a fluoreszcens ratio-ból a Grynkiewicz-egyenlet alapján számoltuk. Az max) és a minimum (R min ) ratio értékét, valamint 380 nm-en a szabad festék és a Ca 2+ -kötött festék arányát (S f2 /S b2 ) az in vitro kalibráció során határoztuk meg. 10
Izolált agyi idegvégzõdés (szinaptoszóma) preparálása A tengerimalacokat dekapitáltuk, majd az állatok agykérgébõl szinaptoszómát készítettünk, a módszert lásd részletesebben Chinopoulos and Adam-Vizi (2001) közleményben. A 20 mg/ml protein tartalmú szinaptoszómát 0.32 M szukrózban szuszpendáltuk fel, ezután a törzsoldatot jégen tartva abból mintákat vettünk ki a további kisérletekhez. A standard inkubáló médium összetétele a következõ volt (mm): 140 NaCl, 3 KCl, 2 MgCl 2, 2 CaCl 2, 10 PIPES, 10 glukóz, ph 7.38. Mitokondriális légzési komplexek aktivitásának meghatározása Az 1 mg/ml proteint tartalmazó szinaptoszóma mintákat 20 percig 37ºC-on standard médiumban inkubáltuk különbözõ koncentrációjú légzési komplex gátlók (rotenon, antimycin vagy cianid) jelenlétében. A mintákból háromszori gyors fagyasztás / kiolvasztás után 200 µl-t áttettünk a mérõmédiumba (2 ml). A kisérletek során az abszorbancia változásokat GBC UV/VIS 920 spektrofotométeren követtük. A komplex I aktivitás meghatározásánál a NADH oxidációt 340 nm-en mértük az elektron akceptor koenzim Q 1 jelenlétében. A komplex III aktivitás mérésénél a redukált koenzim Q 2 oxidációját mértük 550 nm-en, az elekton akceptor a citokróm c volt. A komplex IV aktivitás méréseke során a citokróm c oxidációját mértük 550 nm-en. Akonitáz aktivitás mérése Az akonitáz aktivitás meghatározásánál a mérõmédiumba (2 ml) szinaptoszóma aliquotokat (200 ìg protein) tettünk, amelyeket elõzõleg 11
ºC-on inkubáltunk. A mérõelegy összetétele a következõ volt: 50 mm Tris-HCl, 0.6 mm MnCl 2, 30 mm nátrium-citrát, 0.2 % Triton X-100, 2 U/ml izocitrát dehidrogenáz (NADP + + hozzáadásával indítottuk, a fluoreszcens intenzitást 344 nm-es excitációs és 460 nm-es emissziós hullámhosszakon mértük PTI Deltascan fluoreszcens spektrofotométerrel. A NADPH koncentráció változását kalibrációs görbe segítségével határoztuk meg. Hidrogén peroxid felszabadulás mérése Amplex Red módszerrel A H 2 O 2 felszabadulás meghatározáshoz Amplex Red Hydrogen Peroxide Assay Kit-et (Molecular Probes) használtunk. Torma-peroxidáz az Amplex Red reagens 1:1 sztöchiometriai arányban reagál a H 2 O 2 a antimycin jelenlétében 20 percig inkubáltuk, 100 µl mintát hozzáadtunk 100 µl Amplex Red reakcióelegyhez és a H 2 O 2 képzõdést Wallac Victor 2 mikroplate fluoriméterrel követtük 25 ºC-on. Az excitációs hullámhossz 560 nm volt, a fluoreszcens emissziót 590 nm-en mértük. Az egyes H 2 O 2 -dal. 12
EREDMÉNYEK I. Primer patkány agyi kapilláris endothel sejteken végzett kisérletek 1. Az RBCEC tenyésztés során általánosan alkalmazott I típusú kollagénnel bevont mûanyag aljzat olyan nagy háttér fluoreszcenciával bírt, amely intracelluláris kalcium méréseink során elfedte a biológiai szignált. Ezért a sejteket extracelluláris biológiai (ECM) bevont üveglemezen tenyésztettük, ezáltal a. Így a sejttenyészet alkalmassá vált mikrofluorimetriás vizsgálatokra, pl. Fura-2 kalcium szenzitív festékkel végzett intracelluláris kalcium mérésre. Immunocitokémiai vizsgálattal bizonyítottuk az ECM-mel bevont üveglemezen tenyésztett sejtek endothel eredetét, elektronmikroszkópos vizsgálattal kimutattuk az agyi kapilláris endothelre jellemzõ kapcsoló struktúrák (tight junction) jelenlétét. Kimutattuk, hogy az ECM-on nevelt primer RBCE sejtek agonista-indukálta Ca 2+ -válaszai jóval egységesebbek és reprodukálhatók, mint a saját illetve más szerzõk által közölt kollagénes felszínen nevelt RBCE sejtekbõl származó adatok. 2. ására nem következett be [Ca 2+ ] i változás, és az ATP kiváltotta [Ca 2+ ] i ligandvezérelt Ca 2+ -csatornák hiányára utal primer RBCE sejteken. Kisérleteinkben az ATP és 2-MeSATP jelenlétében mérhetõ additív válasz, a 2-MeSADP kiváltotta jel és annak gátlása PAPS-al világos farmakológiai bizonyítékul szolgáltak egy 1-szerû receptor jelenlétére ECM-on nevelt primer RBCE sejtekben. Az 13
ATP és az UTP kiváltotta [Ca 2+ ] i emelkedés közel azonos nagyságú volt primer RBCE sejtekben, és ATP folyamatos jelenlétében az UTP nem okozott [Ca 2+ ] i emelkedést. A fenti agonistákat suramin jelenlétében tesztelve, amely a P2Y 2 receptor altípus szelektív gátlószere, nem tapasztaltunk [Ca 2+ ] i emelkedést. Mindezen megfigyeléseket figyelembe véve farmakológiailag bizonyítottnak P2Y 2 receptor jelenlétét primer RBCE sejtekben. Elsõként bizonyítottuk az adenozin [Ca 2+ ] i emelõ hatását primer RBCE sejtekben, mely A 1 -receptoron keresztül jön létre. II. 1. Kimutattuk, hogy a komplex I kritikus helye a mitokondriális ROS képzõdésnek in situ neuronális eredetû mitokondriumban. A ROS szenzitív akonitáz enzim aktivitását követve bizonyítottuk, hogy a komplex I, III és IV gátlása egyaránt ROS termelés növekedéséhez vezet, de a folyamatok dinamikájában jelentõs eltérések mutatkoznak. A komplex III és IV esetében nem történt változás a ROS termelésben ameddig a gátlás meg nem haladta a 70%-os küszöböt, ennek elérése után drámai növekedése következett be. Ettõl eltérõen, határ nem volt megfigyelhetõ, a két paraméter közötti összefüggés közel lineáris volt, de már kismértékû (16 ± 2%) komplex I gátlás esetén is szignifikáns ROS termelõdést tapasztaltunk. A vagy-semmi típusú H 2 O 2 válasszal, míg emelkedõ rotenon koncentrációra emelkedõ H 2 O 2 felszabadulással reagáltak az 14
Amplex Red-del végzett mérések során, ahol a H 2 O 2 felszabadulást közvetlenül mértük. 2. További kisérleteinkben kimutattuk, hogy in situ neuronális eredetû mitokondriumok ROS termelése nem függ a ÄØ m tõl, tapasztaltakkal, ugyanakkor eredményünk eltér a glutamát/maláttal lélegeztetett izolált mitokondriumokon mértektõl, ahol az FCCP okozta membránpotenciál csökkenés jelentõs csökkenést okozott ROS termelésében. Légzési komplex az ATP-szintáz gátló oligomycin együttes jelenlétében a membránpotenciál teljesen kisül, de kisérleteink során ilyenkor is jórészt megtartott maradt a ROS képzõdés. Ez újabb bizonyíték arra, hogy a ÄØ m nem in situ agyi mitokondriumokban. 3. Kisérleteinkben az antimycin-indukálta H 2 O 2 felszabadulás még akkor is jelentõs mértékû volt, amikor a komplex I-et rotenonnal teljesen gátoltuk. Ebben az esetben valószínûnek látszik, hogy a komplex III-ra érkezõ, a rotenon hatás helyétõl disztálisan - a komplex II szintjén - belépõ elektronok még akkor is bekapcsolódhatnak a ROS termelésbe, amikor a komplex I rotenonnal teljesen gátolt. 15
KÖZLEMÉNYEK A dolgozat témáját alkotó publikációk 1. Dömötör, E., Sipos, I., Kittel, A., Abbott, N.J. and Adam-Vizi, V. (1998). Improved growth of cultured brain microvascular endothelial cells on glass coated with a biological matrix. Neurochem. Int., 33, 473-478. IF: 2,175 2. Sipos, I., Dömötör, E., Adam-Vizi, V. and N.J. Abbott. (2000). The pharmacology of nucleotide receptors on primary cultured brain endothelial cells grown on a biological extracellular matrix: effects on intracellular calcium concentration. Br. J. Pharmacol., 131, 1195-1203. IF: 3,689 3. Sipos, I., Tretter, L. and Adam-Vizi, V. (2003). Quantitative relationship between inhibition of respiratory complexes and formation of reactive oxygen species in isolated nerve terminals. J. Neurochem. 84, 1-7. IF: 4,834 4. Sipos, I m- independent production of reactive oxygen species in intact isolated nerve terminals. Neurochem. Res. (közlésre elfogadva). IF: 1,638 A dolgozat témájához szorosan nem kapcsolódó publikációk 1. Sipos, I., Törõcsik, B. and Adam-Vizi, V. (2003). Alteration of ph homeostasis by oxidative stress in rat brain capillary endothelial cells. Cell Mol. Neurobiol. (kézirat). 16
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Szeretném megköszönni témavezetõmnek Prof. Ádám Veronikának a bizalmat és a munkámhoz nyújtott segítségét. Közös munkánk során megtanultam, hogy az erdeményesség nem szerencse kérdése, a kitûzött cél elérése elsõsorban rajtunk múlik. Szakmai igényessége, munkabírása és kitartása volt erre a példa, és a jövõben is például szolgál számomra. Köszönöm Prof. Joan Abbottnak, hogy megismertette velem a vér-agy gát ; lelkesedése és a téma iránti elkötelezettsége engem is magával ragadott. Dr Tretter Lászlónak köszönöm a barátságát és türelmét; az utóbbit laborbeli ténykedéseim során sokszor próbára tettem. Köszönöm munkatársaim kitartó segítségét, és örülök, hogy sokukat egyben barátomnak is tekinthetem. Végül köszönetet szeretnék mondani a családomnak, akik akkor is hittek bennem, amikor önmagam kételkedtem a sikerben. 17