A szteroidok mint antioxidánsok és ennek klinikai jelentosége a hormonpótló kezelésben

A szteroidok mint antioxidánsok és ennek klinikai jelentosége a hormonpótló kezelésben Ph. D. értekezés tézisei DR. BÉKÉSI GÁBOR Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola Vezeto: PROF. DR. TULASSAY ZSOLT az orvostudomány doktora, klinikaigazgató 2/1-s program: A hepatológia immunológiai és szabadgyökös vonatkozásai Programvezeto és témavezeto: PROF. DR. FEHÉR JÁNOS, az orvostudomány doktora Semmelweis Egyetem Budapest, 2003 1

Összefoglaló Háttér: Számos kísérletes és klinikai adat szól amellett, hogy az élettani és patológiás szteroid státus változások fontos szerepet játszhatnak bizonyos megbetegedések iránti fogékonyság létrejöttében illetve megváltoztathatják azok gyakoriságát. A szteroidok számtalan biokémiai mechanizmust képesek befolyásolni, és ezáltal lényeges szerepet játszanak alapveto fiziológiai folyamatokban. Ennek legpregnánsabb példája, hogy az ösztrogének specifikus endokrinológiai hatásaikon túl a lipid és csont-anyagcserében is fontos szerepet töltenek be. Az utóbbi években növekvo számmal találkozunk az irodalomban a szteroid hormonok antioxidáns szerepére utaló adatokkal. Abból kiindulva, hogy a morbiditási és mortalitási statisztikákat világszerte vezeto megbetegedések patogenezisében a szabadgyököknek érdemi szerep jut, továbbá abból, hogy a gyöktermelés egyik legfontosabb helye a neutrofil granulocita, logikusnak tunt aziránti érdeklodésünk, hogy a szteroid hormonok miként befolyásolják ezen gyulladásos sejtek gyöktermelo aktivitását, és hogy milyen következményei lehetnek ennek a hatásnak a kardiovaszkuláris megbetegedések tekintetében. Célkituzések: Azt vizsgáltuk, (1) hogy a menopauza együtt jár-e a neutrofil granulocitákban található és a szabadgyökös reakciókban szereplo mieloperoxidáz enzim aktivitásának változásával, (2) hogy a hormonpótló kezelés befolyással van-e ezen enzim mennyiségi és aktivitási viszonyaira, (3) hogy a fentieknek vannak-e következményei a szabadgyökök termelését illetoen. Azt is tanulmányoztuk, (4) hogy hogyan változik a mieloperoxidáz enzim plazma koncentrációja az életkor elorehaladtával és nemek szerint, (5) és hogy a szteroid hormonok antioxidáns szerepe és a mieloperoxidáz enzim e kifejtett hatása között milyen kapcsolat áll fenn. Módszerek: Az intracelluláris mileoperoxidáz aktivitási eloszlásokat a Semmelweis Egyetem II. számú Belklinikájának random válogatott betegeinél az egyéb célú vérképvizsgálatok során Technicon H-3 hematológiai készülékkel automatikusan megmért átlagos peroxidáz index értékek összegyujtésével határoztuk meg. Ezt az automatát használtuk az ösztrogén és a prednizolon mieloperoxidáz aktivitásra kifejtett hatásainak megítélésére is. Az egészséges önkéntesektol nyert plazmákban illetve neutrofil sejtjeik flülúszóiban található mieloperoxidáz enzim kimutatására ELISA módszert alkalmaztunk. A szuperoxid anion meghatározása fotometriával történt a mieloperoxidáz enzim, az enzim inhibitorai és az egyes szteroidok hatásának megítélése során. 2

Eredmények, új megállapítások: Az intracelluláris mieloperoxidáz aktivitás és az enzim plazma szintje a hatodik évtizedben a korábbi évekhez képest szignifikáns csökkenést mutat mindkét nemben. Menopauzás nok ösztrogén pótlását követoen az enzim aktivitása és a neutrofilekbol felszabaduló mennyisége viszont szignifikánsan növekszik. Hasonló növekedést tapasztaltunk az intracelluláris enzim aktivitás tekintetében prednisolon, az extracelluláris enzim felszabadulást illetoen pedig tesztoszteron adásával. Neutrofil granulocitákhoz in vitro hozzáadott mieloperoxidáz hatására a szuperoxid anion szabadgyök mennyiségének szignifikáns csökkenését lehetett elérni. Mieloperoxidáz inhibitoroknak neutrofil sejtekkel történo in vitro inkubálása révén a szabadgyök termelés szignifikáns növekedését találtuk, ugyanakkor ezen inhibitorok felfüggesztették több szteroid hormon szuperoxid anion produkciót csökkento hatását. A mieloperoxidáz enzim által katalizált reakció végterméke, a hipoklorit anion viszont szintén a szuperoxid gyök termelésének csökkenését okozta rendszerünkben. Következtetések: Eredményeink amellett szólnak, hogy bizonyos szteroid struktúrák antioxidáns hatásúak, és ez a hatás minden bizonnyal legalábbis részben a mieloperoxidáz enzim mennyiségének és aktivitásának fokozásán keresztül valósul meg. A mieloperoxidáz enzim az antioxidáns képesség új indikátoraként és a szabadgyökös eredetu betegségek esetleges prediktoraként is szóba jöhet a nem túl távoli jövoben. Minden olyan törekvés tehát, amely az antioxidáns szteroidok szintje élettani csökkenésének hátráltatását, hiányzó mennyiségük pótlását, esetleg a mieloproxidáz enzim mennyiségének vagy aktivitásának növelését célozza, ígéretesnek látszik a számtalan, szabadgyökök által mediált megbetegedés elleni harcban. 3

Célkituzések A szteroidok több támadáspontú antioxidáns képességének hátterében számos, eddig csak részben tisztázott mechanizmus állhat. A hormonálisan aktív korú nok védettsége a kardiovaszkuláris betegségekkel szemben, az ateroszklerózis szabadgyökös eredete és a fehérvérsejtek aterogenezisben játszott szerepe alapján kézenfekvonek látszott a neutrofil granulociták aktivitás változásának vizsgálata ennek megbízható markere a sejtekben található mieloperoxidáz enzim (MPO) aktivitása és mennyisége - szteroid hatásra. In vivo vizsgálatok Izgalmas kérdésként merült fel számunkra, hogy a menopauza milyen hatással van a granulociták mieloperoxidáz aktivitására, illetve hogy az intracelluláris MPOaktivitás, illetve a plazma MPO szint értékében van-e különbség a hormonálisan aktív és a menopauzás nok, valamint a fiatal és az idosebb férfiak csoportjai között. Szükségesnek véltük továbbá megvizsgálni, vajon milyen változás következik be a neutrofil granulociták aktivitásában a noi hormon hatására. Tisztázni kívántuk, hogyan változik a MPO enzim intracelluláris aktivitása, illetve extracelluláris mennyisége hormonpótlást kapó, menopauzás nok esetében. A tesztoszteron és a kortizol hatását az MPO termelésre szintén vizsgáltuk. In vitro kísérletek Annak tisztázására, hogy a mieloperoxidáz enzim milyen szerepet játszik a szuperoxid termelésben, egészséges önkéntesek izolált neutrofil sejtjeihez növekvo mennyiségu MPO-t adtunk, majd ezzel történo inkubációjukat követoen megmértük szuperoxid anion termelésüket. További in vitro kísérletekben vizsgáltuk az izolált neutrofil granulociták szuperoxid termelését MPO-gátlók és natrium-hipoklorit (az MPO által katalizált reakció végterméke) adására, valamint különbözo szteroidokkal való inkubáció után. Mértük továbbá, hogy az MPO-gátlók mennyiben módosítják a különbözo szteroidok hatását a granulociták szuperoxid termelésére. 4

Eredmények In vivo vizsgálatok Az intracelluláris MPO-aktivitás hormonálisan aktív és menopauzás nok valamint fiatal és idosebb férfiak esetében 3 2 1 MPXI 0 *** * -1-2 -3 Nõ 30-45 év Nõ 55-65 év Férfi 30-45 Férfi 55-65 év 1. ábra: Intracellularis mieloperoxidáz aktivitás (MPXI) random módon szelektált 30-45 éves férfiak és nok (n=34 ill.39) valamint 55-65 éves férfiak és nok (n=35 ill.27) vérmintáiban. Átlagok±SEM. ***: p<0,001; *: p<0,05 5

A plazma mieloperoxidáz koncentrációja hormonálisan aktív és menopauzás nok, valamint fiatal és idosebb férfiak esetében 60 p<0.005 Plazma MPO koncentráció (ng/ml) 50 40 30 20 10 44.30 42,01 No 28,11 28,68 Férfi 0 20-40 50-70 Életkor (év) 2.ábra: 20-40 illetve 50-70 éves nok és férfiak plazma MPO koncentrációi. Átlagok±SEM. P<0,005 mind a posztmenopauzális hormonálisan aktív nok, mind az idosebb - fiatalabb férfiak viszonylatában. A granulociták intracelluláris mieloperoxidáz-aktivitásának és a belolük felszabaduló mieloperoxidáz mennyiségének változása a hormonpótló kezelés hatására 2 1 0 p<0,001-1 MPXI -2-3 SE=2,0 SE=1,8-4 -5-6 -7-8 átlag: -5,5; n=11 átlag: -0,2; n=11 Ösztrogén kezelés elõtt 12 napos ösztrogén kezelés után 3.ábra: 12 napos ösztrogén kezelés hatása a neutrofil granulociták intracelluláris mieloperoxidáz aktivitására menopauzás nok esetében. Átlagok±SEM. 6

350 MPO a felülúszóban (mu/ml) 300 250 200 150 100 p<0,05 SE=70 50 0 SE=7,7 átlag: 52,8; n=11 átlag: 251,4; n=11 Ösztrogén kezelés elõtt 12 napos ösztrogén kezelés után 4.ábra: 12 napos ösztrogén kezelés hatása a neutrofil granulocitákból történo MPO felszabadulásra menopauzás nok esetében. Átlagok±SEM. A tesztoszteron hatása az MPO termelésre 700 600 p<0.005 MPO a felülúszóban (mu/ml) 500 400 300 200 439,11 602,81 100 0 kezelés elõtt kezelés után 12 nappal 5.ábra: 12 napos tesztoszteron kezelés hatása a humán neutrofil granulocitákból történo spontán MPO felszabadulásra. Átlagok±SEM. n=7 7

Glukokortikoid hatása az intracelluláris mieloperoxidáz aktivitásra 3,5 3,0 p<0.05 2,5 MPXI 2,0 1,5 2,68 1,0 0,5 0,80 0,0 kezelés elõtt 2 órával kezelés után 6.ábra: 25 mg prednisolon kezelés hatása humán neutrofil granulociták intracelluláris mieloperoxidáz aktivitására. Átlagok±SEM. n=4. In vitro vizsgálatok A sejtszuszpenziókhoz adott mieloperoxidáz hatása a granulociták szuperoxidtermelésére 7.ábra: Egészséges, önkéntes, humán donoroktól származó neutrofil granulociták szuperoxid anion termelése 70, 140 illetve 280 ng/ml in vitro hozzáadott MPO hatására párhuzamos kontrolokkal (C 1-3 ) történo összehasonlításban.? OD=a 0 (fmlp stimulust közvetlenül megelozo idopont) és az 5. percben mért optikai denzitás különbsége. Átlagok±SEM. n=20. 8

A neutrofil granulociták szuperoxid termelésének változása különbözo szteroidok, MPO-gátlók, szteroidok + MPO-gátlók és natrium-hipoklorit hatására 0,22 0,21 0,2 Szuperoxid anion (? OD ) 0,19 0,18 0,17 0,16 0,15 0,14 kontroll ABH 50 * ABH 100 * cort * cort+abh 50 * cort+abh 100 * ald ald+abh 50 * ald+abh 100 * cortex cortex+abh 50 * cortex+abh 100 * estr * estr+abh 50 * estr+abh 100 * prog * prog+abh 50 * prog+abh 100 * test * test+abh 50 * test+abh 100 * 8.ábra: Humán neutrofil granulociták szuperoxid anion termelése 50 és 100 µmol ABAH-hal, különbözo, 10-7 M koncentrációjú szteroiddal külön-külön illetve a két típusú vegyületcsoport kombinációjával történo inkubáció után. n=17 önkéntes, egészséges donor.? OD= a 0 (fmlp stimulust közvetlenül megelozo idopont) és az 5. percben mért optikai denzitás különbsége. 0,15 0,14 0,13 0,12 0,11 0,10 0,09 0,08 0,07 0,06 kontroll ind 15 * ind 40 cort * cort+ind 15 * cort+ind 40 * Szuperoxid anion (? OD ) estr * estr+ind 15 * estr+ind 40 * prog prog+ind 15 * prog+ind 40 * test * test+ind 15 * test+ind 40 * DHE * DHE+ind 15 * DHE+ind 40 * DHES * DHES+ind 15 DHES+ind 40 * 9. ábra: Human neutrofil granulociták szuperoxid anion termelése 15 és 40 µmol indometacinnal, különbözo, 10-7 M illetve 10-5 M (DHEA és DHEAS) koncentrációjú szteroiddal külön-külön illetve a két típusú vegyületcsoporttal együttesen történo inkubáció után. n=7 egészséges, önkéntes donor.? OD= a 0 (az fmlp stimulust közvetlenül megelozo idopont) és az 5. percben mért optikai denzitás különbsége. 9

0,12 0,11 Szuperoxid anion (? OD ) 0,1 0,09 0,08 0,07 0,06 kontroll NaClO 1 NaClO 10 * NaClO 100 * 10. ábra Humán neutrofil granulociták szuperoxid anion termelése 1-10 és 100 µmol NaClOval történo inkubáció után. n=5 önkéntes, egészséges donor.? OD= a 0 (az fmlp stimulust közvetlenül megelozo idopont) és az 5. percben mért optikai denzitás különbsége hasonlóan az elozo ábrákhoz. 10

A kísérleti eredmények összefoglalása, új megállapítások 1. A plazma mieloperoxidáz koncentrációja és az intracelluláris mieloperoxidáz aktivitás is alacsonyabb idosebb korban - mind férfiaknál, mind noknél. 2. Posztmenopauzában lévo nok esetében az ösztrogénpótló terápia növeli a granulocitákból felszabaduló mieloperoxidáz enzim mennyiségét és az intracelluláris mieloperoxidáz aktivitást. 3. Az ösztrogénhez hasonlóan a tesztoszteronkezelés szintén fokozza a granulocitákból felszabaduló mieloperoxidáz mennyiségét. 4. Prednisolon injekciója után két órával no az intracelluláris mieloperoxidáz aktivitás. 5. A szeparált neutrofil granulocitákhoz adott külso mieloperoxidáz csökkenti azok szuperoxid termelését. 6. Ezzel szemben a granulocita-szuszpenziók inkubációja MPO-gátlókkal (ABAH és indometacin) fokozza a granulociták szuperoxid produkcióját. 7. A granulocita-szuszpenziókat natrium-hipoklorittal - az MPO által katalizált reakció végtermékével - inkubálva csökken azok szuperoxid termelése. 8. A 17?-ösztradiol, a progeszteron, a tesztoszteron, a kortizol, a dehidroepiandroszteron és a dehidro-epiandroszteron-szulfát egyaránt csökkenti a granulociták szuperoxid-termelését in vitro. Az aldoszteron és a kortexolon azonban nem fejt ki ilyen hatást. 9. Az MPO-inhibitorok megakadályozzák a szteroid hormonok szuperoxid-termelést csökkento hatását, a sejtszuszpenziókat együttesen inkubálva szteroidokkal és MPOgátlókkal a szuperoxid termelés fokozódása észlelheto. Következtetések In vivo és in vitro vizsgálataink eredményeit összegezve úgy tunik, eddig nem ismert éllettani szabályozási szisztéma alapjaihoz sikerült utat találnunk. Az általunk leírt összefüggésrendszer értelmében a fehérvérsejtekben - dominálóan a neutrophil granulocitákban - található mieloperoxidáz enzim mennyiségi és aktivitási viszonyai szteroid szabályozás alatt állnak. Erre utalnak azok a vizsgálataink, amelyek során sikerült elsoként igazolnunk az ösztrogén-pótlás, a tesztoszteron és a prednisolon MPO-ra kifejtett, fokozó hatását. Az izolált neutrofilekhez növekvo mennyiségben hozzáadott MPO egyértelmuen csökkentette az egyik legfontosabb és kifejezett patogenetikai szereppel bíró 11

szabadgyök, a szuperoxid anion mennyiségét. Az említett szteroidok a granulocitákkal inkubálva ugyancsak gátló hatásúnak bizonyultak e gyökre nézve, tehát antioxidáns hatásuk minden bizonnyal az MPO-n keresztül valósul meg. Ezt támasztja alá a MPO inhibitorok prooxidáns viselkedése is rendszerünkben. Az életkor elorehaladtával természetszeruleg hanyatló szexuál szteroid szintézissel (férfiakban és nokben egyidejuleg ez leginkább a dehidroepiandroszteron-szulfátra érvényes) párhuzamosan ugyancsak csökkeno mértéku MPO termelést találtunk mindkét nemben, és e megfigyelést a szakirodalomban újdonságként sikerült regisztrálnunk. Úgy látszik, nem maga a MPO enzim, hanem az általa katalizált reakció végterméke, a hipoklorit anion az, ami igazából felelos lehet a gyöktermelés gátlásáért. Az általunk joggal feltételezett szabályozási rendszer lényege tehát, hogy bizonyos szteroid struktúrák képesek a MPO enzim felszabadulását fokozni, ezáltal a hipoklorit anion termelését növelni, ami a számos más, ugyancsak patogén gyök forrásául szolgáló szuperoxid anion szempontjából gátló, tehát antioxidáns hatású. Lényegét tekintve tehát egy a humán rendszerekbol jól ismert, negatív feed back-szeru szabányozási modellrol van szó, hiszen a hipoklorit anion egy reakciósor harmadik tagjának terméke, amely gátlólag hat vissza az elso reakció enzimjére, a szuperoxid termeléséért felelos NADPHoxidázra (11.ábra). Logikusnak tunik tehát, hogy az életkorral fokozódó gyakoriságú, többségében szabadgyökös eredetunek tartott megbetegedés (ateroszklerózis, malignómák, emfizéma, katarakta, az öregedés maga, stb.) kialakulásában legalábbis részben a szteroid-mpo-hipoklorit anion tengely antioxidáns jellegu muködésének kiesése illetve csökkenése állhat. Ennek konkrét gyakorlati-terápiás következményeivel is számolhatunk. Értelemszeruen elonyösnek látszik a szteroid hormonok fiatalkori fiziológiás szintjének lehetoség szerint minél tovább történo biztosítása akár termelésük fokozása, akár kívulrol történo pótlásuk révén. Még ígéretesebbnek tunik az a lehetoség, hogy a felelos szteroid struktúra részlet megtalálásával olyan új vegyületek kifejlesztése irányában nyílik meg az út, amelyek elonyös antioxidáns hatásúak, de nem rendelkeznek endokrinológiai mellékhatásokkal. Ezek jellege és jelentosége az orvosi irodalomban jól ismert. Példaként említhetjük a glukokortikoidok immunszuprimáló tulajdonságát. 12

( O 2.- O 2 ) 2O 2 + NAD(P)H 2O.- 2 + NAD(P) + + H + NAD(P)H-OXIDÁZ 2O.- 2 + 2H + H 2 O 2 + O 2 H 2 O 2 + CL - SOD CLO - + H 2 O gátló hatás MPO O 2.- + H 2 O. O 2 2 OH - O 2.- + R-OOH OH. O 2.- + NO. fém katalízis ONOO - + OH + OR - + +? 1 O 2 O 2 NO+. 2 NO 2. OH 11. ábra: Szabadgyök reakciók a neutrofil granulocitákban. A reaktív oxigén intermedierek sötét keretben láthatók (felulrol lefelé haladva: szuperoxid anion, hidrogén peroxid, hipoklorit anion, hidroxil gyök, szinglet oxigén, nitrogén monoxid, peroxinitrit, nitronium ion és nitrogén dioxid). A világos 13

keretek az enzimeket jelzik (felu lrol lefelé haladva: NADPH-oxidáz, szuperoxid dizmutáz és mieloperoxidáz). A vékony nyilak a reakciók irányát, a vastagok a katalizáló hatást ábrázolják. Az ábra jól demonstrálja, hogy a szuperoxid anion más, fontos szabadgyökök forrása. A negyedik reakcióban a molekuláris oxigén helyett szinglet oxigén is képzodhet (egymás alatt). Az utolsó reakcióban a divergáló nyilak a peroxinitrit átalakulásának lehetséges variációit mutatják. Az ábra demonstrálni igyekszik a szteroidok MPO-ra kifejtett fokozó hatását és az MPO-hipohalit rendszernek a szuperoxid anion termeléséért felelos NADPH-oxidázon érvényesülo gátló befolyását is. Munkánk eddigi, megítélésünk szerint eloremutató eredményei mellett számos kérdés marad nyitva ezután is: Tisztázandó a szteroidális antioxidáns hatás pontos mechanizmusa, helye és módja. Igazolandó a NADPH-oxidáz enzim tényleges gátlása a szteroidok illetve a hipoklorit anion által. Vizsgálandók a többi szteroid hormonok illetve ezek prekurzorai is kísérleti rendszerünkben. További bizonyítékul szolgálna a szteroid struktúrák pozitív hatása különbözo állatmodellekben. Részletesebben vizsgálandó a két nem közötti kardiovaszkuláris mortalitásbeli különbözoség patogenetikai háttere a mi kérdésfeltevéseink oldaláról tekintve. Ezekre a problémákra szeretnék legalábbis részben - választ találni a közeli és távolabbi jövoben, amennyiben sikerül érdemesnek maradni arra, hogy munkámhoz a legalapvetobb feltételek ezután is teljesülhessenek. Összefoglalás A szteroid szabályozás alatt álló mieloperoxidáz szerepet játszik a fehérvérsejtek szabadgyök termelésének regulációjában, és ezáltal ez az enzim a számos, szabadgyökök által is mediált megbetegedés diagnosztikájában és terápiájában is alkalmazást nyerhet az elkövetkezo idoszakban, amennyiben a további, részletekbe meno kutatások eredményei a jelen értekezésben is tárgyaltakkal összhangban maradnak. 14

Köszönetnyilvánítás E munka létrejöttéhez nélkülözhetetlenek voltak azok a körülmények és feltételek, amelyeket Tulassay Zsolt Professzor Úr, a II. számú Belgyógyászati Klinika igazgatója biztosított számomra. Hálás köszönet illeti ot ezért a nem mindannapi segítségért. Hasonlóképpen köszönöm a külföldi és hazai közlemények tartalmi és stiláris színvonalának javítása érdekében kifejtett, odaadó fáradozását. Hálával tartozom program és témavazetomnek, Fehér János Professzor Úrnak, aki a szabadgyök kutatás hazai úttöroje és e szakterület nemzetközileg elismert képviseloje. Köszönöm neki a lehetoséget, hogy munkacsoportjában dolgozhattam, és dolgozhatom,hálás vagyok rendszeres, módszeres szakmai iránymutatásaiért. Végtelenül köszönöm Székács Béla Tanár Úr folyamatos, a kísérletek megtervezésétol a közlemények végleges formába való öntéséig terjedo állandó és segíto, a szükséges mértékig idonként kritikus jelenlétét e munka egész ideje alatt. Külön köszönet illeti Rácz Károly Professzor Urat az endokrinológiai vonatkozású problémák megoldásáért és azért a baráti, segíto együttmuködésért, ami nagyban megkönnyítette, hogy a nehezebb idoszakokon is túljuthassak. Köszönöm továbbá Gláz Edit Professzor Asszony, Kiss Róbert Tanár Úr és Tóth Miklós Adjunktus Úr hasznos segítségét is. Köszönöm a lehetoséget a Bécsi Egyetem 3. Számú Belklinikája kollektívájának, különös tekintettel Walter Hörl és Erich Pohanka professzoroknak valamint Robert Deicher, Sabine Schmaldienst, Roland Hofbauer és Gerald Cohen doktoroknak, hogy a fehérvérsejt kutatás alapjaival megismerkedhettem. Hálásan köszönöm Falus András Professzor Úrnak és egyben egyetemünk Biológiai Intézetének, hogy bizonyos, speciális feladatok elvégzésében készséggel együttmuködtek velünk. Szeretném megköszönni Sréter Lídia Professzor Asszony, Szombath Dezso Tanár Úr, Blázovics Anna, Kocsis Ibolya és Sárváry Eniko doktornok valamint Vereckei András és Pittlik Ervin doktorok szakmai tanácsait, amelyek mindig segítséget jelentettek a továbblépésben. Kiemelt köszönettel tartozom Hrabák András doktornak a biokémiai háttér önzetlen biztosításáért. Az általa nyújtott segítség nélkül nem sikerült volna befejezni munkánkat. Hasonlóan nélkülözhetetlen volt az a közremuködés, amiben Roth Erzsébet Professzor Asszonytól és munkatársaitól, Lantos János és Borsiczki Balázs doktoroktól részesültünk a Pécsi Tudományegyetemrol. Kakucs Réka doktorno és Várbíró Szabolcs doktor aktív és nélkülözhetetlen résztvevoi voltak munkánk valamennyi fázisának szerzotársi funkciójukkal teljes összhangban. Hasonlóan pótolhatatlan segítséget nyújtott Magyar Zoltán doktor az in vivo vizsgálatok megszervezésével. Nélkülözhetetlen volt Dinya Elek doktor munkája a számítástechnikai feladatok elvégzése során. Nagyon köszönöm segítségét. Ugyancsak köszönöm Pázmány Tamás doktor barátom, Paku Sándor doktor és Likó István hathatós szakmai együttmuködését, amely foleg a további tervek megalapozásában látszik ígéretesnek. Köszönet illeti Detlef Sprintz doktort, amiért segítségünkre volt bizonyos, Németországból könnyebben elérheto reagensek és kitek beszerzésében. Végül, de nem utolsó sorban örök hálára kötelez Nagy Krisztina asszisztensno pótolhatatlan közremuködése, amely messze túlmutatott a szigorúan vett laboratóriumi munka keretein. Hasonlóan hálás vagyok Polyák Jánosné, Lakatos Márta, Zátonyi Gyuláné, Steinbach Zsuzsa és Savanyó László asszisztensek hathatós együttmuködéséért A legnagyobb hála szüleimet illeti, akik végtelen szeretetükkel és fáradságot nem ismero munkájukkal lehetové tették, hogy most itt állhatok. Egyikojük már csak lélekben oszthatja meg e nap örömét velem. Soha nem tudom eléggé megköszönni nagybátyámnak, hogy a pályára való lépésemben a választható minta erejével is oly nagy részt vállalt. A pályakezdés nehézségei között az abszolút értékrend és az egyetlen elfogadható mérce megismertetéséért Meskó Éva Tanárnonek tartozom igaz és hálás szeretettel. Igyekeznem kell majd, hogy feleségemet és gyermekeimet kárpótolni tudjam a sok elmaradt törodésért és együttlétért, amelyek helyett munkámba temetkeztem, de sohasem kellett éreznem, hogy ok ezt nem így tartják helyénvalónak, és ez adta számomra a legnagyobb erot. Hasonlóképpen nagy segítségemre volt a kitartásban testvérem és évtizedes baráti köröm oszinte, talán meg sem érdemelt elismerése és együttérzo drukkolása munkám egész ideje alatt. Az angol nyelvu közlemények színvonalát feltétlen javította Gyarmati Angéla és David Mc Fegan odaadó segítsége a stiláris korrekció terén. E hosszúra nyúlt felsorolás ékes bizonyítéka annak, mennyire egymásra vagyunk utalva egy-egy érték létrehozásánál, legyen ez akárcsak oly szerény is, mint jelen munkánk. 15

Saját közlemények jegyzéke Az értekezés témájában megjelent saját közlemények: 1. Békési G., Ács N., Székács B. Hormonpótlás-keringo alakelemek-reológiai tényezok. Háziorvos Továbbképzo Szemle 1999; IV/5:308-311. 2. Békési G., Magyar Z., Kakucs R., Sprintz D., Kocsis I., Székács B., Fehér J. Emberi neutrophil granulocyták mieloperoxidáz-aktivitásának és a belolük fels zabaduló enzim mennyiségének változása ösztrogén hatására. Orvosi Hetilap 1999; 140/29: 1625-30. Független citációk száma: 1 3. Békési G., Kakucs R., Várbíró Sz., Rácz K., Sprintz D., Fehér J., Székács B. In vitro effects of different steroid hormones on superoxide anion production of human neutrophil granulocytes. Steroids 2000;65/12:889-894. IF:1,83 Független citációk száma:7 4. Schmaldienst S., Bekesi G., Deicher R., Franz M., Hörl WH., Pohanka E. Recombinant human granulocyte colony-stimulating factor after kidney transplantation -A retrospective analysis to evaluate the benefit or risk of immunostimulation. Transplantation 2000;69(4):527-531. IF:4,055 5. Békési G., Kakucs R., Várbíró Sz., Fehér J., Pázmány T., Magyar Z., Sprintz D., Székács B. Induced myeloperoxidase activity and related superoxide inhibition during hormone replacement therapy. British Journal of Obstetrics and Gynaecology 2001;108:474-481. IF:2,55 Független citációk száma:5 6. Békési G., Kakucs R.., Sándor J., Sárváry E., Kocsis I., Sprintz D., Várbíró Sz., Magyar Z., Hrabák A., Fehér J., Székács B. Plasma concentration of myeloperoxidase enzyme in pre-and postclimacterial people: related superoxide anion generation. Experimental Gerontology 2001;37:137-148. IF:2,62 Független citációk száma: 3 7. Békési G., Fehér J. A steroid hormonok szerepe az oxidatív stress elleni védekezésben. Lege Artis Medicinae 2001; 11: 100-106. Az értekezés témájában megjelent idézheto absztraktok: 1. Békési G., Magyar Z., Kakucs R., Székács B., Fehér J. The changes in the myeloperoxidase activity of human neutrophil granulocytes and in the amount of enzyme deriving from them under the effect of oestrogen. Menopause Review 1997;Vol II, No 2:51. 2. Békési G., Kakucs R., Sándor J., Sárváry E., Kocsis I., Sprintz D., Fehér J., Székács B. Changes in human plasma concentration and intracellular activity of myeloperoxidase in groups of different age and gender, relation to superoxide anion production. International Journal of Clinical Nutrition 1999;Volume 1: 224. 3. Békési G., Kakucs R., Magyar Z., Fehér J., Pázmány T., Sprintz D., Kocsis I., Hrabák A., Székács B. Menopause and HRT: effects on granulocyte myeloperoxidase activity, release and related free radical generation. Climacteric 1999; Volume 2, Suppl.1: 228. 4. Békési G., Kakucs R., Várbíró Sz., Rácz K., Sprintz D., Fehér J., Székács B. Effects of sex steroids on superoxide production by human granulocytes. Maturitas 2000;Vol. 35., Suppl. 1:S 65. 5. Békési G., Kakucs R.., Sándor J., Sárváry E., Kocsis I., Sprintz D., Fehér J., Székács B. Age and plasma myeloperoxidase concentration -relation to superoxide anion production. European Heart Journal 2000; Volume 21: Abstract suppl. 215. 6. Békési G., Várbíró Sz., Kakucs R., Fehér J., Székács B. Concentration of myeloperoxidase enzyme in plasmas of pre-and post-climacteric patients: relation to free radical generation. Climacteric 2002; 5, suppl.1:175. 16

Eloadások, poszterek: 7. Békési G., Magyar Z., Kakucs R., Székács B., Fehér J. The changes in the myeloperoxidase activity of human neutrophil granulocytes and in the amount of enzyme deriving from them under the effect of oestrogen. Menopause Review 1997;Vol II, No 2:51, IV.European Congress on Menopause, Vienna (Poszter díj). 8. Békési G., Magyar Z., Sprintz D., Kocsis I., Kakucs R., Székács B., Fehér J.The changes in the myeloperoxidase activity of human neutrophil granulocytes and in the amount of enzyme deriving from them under the effect of oestrogen. 5-th Free Radical Research Conference, Gödöllo 1997;20. 9. Békési G., Kakucs R., Sándor J., Sárváry E., Kocsis I., Sprintz D., Fehér J., Székács B. Changes in human plasma concentration and intracellular activity of myeloperoxidase in groups of different age and gender, relation to superoxide anion production. International Journal of Clinical Nutrition 1999;Volume 1, 224: International Congress on Atherosclerosis, Hypertension and Coronary Artery Disease, New Delhi. 10. Békési G., Kakucs R., Magyar Z., Fehér J., Pázmány T., Sprintz D., Kocsis I., Hrabák A., Székács B. Menopause and HRT: effects on granulocyte myeloperoxidase activity, release and related free radical generation. Climacteric 1999; Volume 2, Suppl.1: 228. 9-th International Menopause Society World Congress on Menopause, Yokohama.(Poszter díj). 11. Békési G., Fehér J., Kakucs R., Magyar Z., Pázmány T., Sprintz D., Kocsis I., Hrabák A., Szandányi R., Székács B. Csökkent, a nemi hormon pótlás során újra fokozódó granulocita mieloperoxidáz aktivitás menopauzában. Kapcsolat a szabadgyök képzodéssel. A Magyar Menopausa Társaság III. Országos Kongresszusa, Balatonfüred 1999; 60. 12. Békési G., Kakucs R., Várbíró Sz., Rácz K., Sprintz D., Fehér J., Székács B. Effects of sex steroids on superoxide production by human granulocytes. Maturitas 2000;Vol. 35., Suppl. 1:S 65. 5-th European Congress on Menopause, Copenhagen. 13. Békési G., Kakucs R.., Sándor J., Sárváry E., Kocsis I., Sprintz D., Fehér J., Székács B. Age and plasma myeloperoxidase concentration -relation to superoxide anion production. European Heart Journal 2000; Volume 21: Abstract suppl. 215., XXII. Congress of the European Society of Cardiology, Amsterdam. 14. Békési G., Várbíró Sz., Kakucs R., Fehér J., Székács B. Concentration of myeloperoxidase enzyme in plasmas of pre-and post-climacteric patients: relation to free radical generation. Climacteric 2002; 5, suppl.1:175.the 10-th World Congress on the Menopause, Berlin. 17