Ph.D. Tézis Új módszerek a transzgénes egér technológiában Dr Bélteki Gusztáv Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Tudományági Doktori Iskola: 7. Molekuláris Orvostudományok Program: 7/4. Témavezető: Prof. Falus András Budapest és Cambridge (UK), 2005
ÖSSZEFOGLALÁS Az emberi gének működéséről sokat tudhatunk meg az egér megfelelő génjeinek tanulmányozása révén. Az egér embrionális sejtek (ES sejtek) genetikai manipulációja lehetővé teszi, hogy a gén dózisát megváltoztassuk, és annak következményeit in vivo tanulmányozzuk. A gén inaktiválása (knock-out) és overexpressziója egyaránt kóros fenotípusokhoz vezethet, és ezek jellege tudósíthat a gén szerepéről A génműködés pontos megértéséhez azonban rendszerint számos különböző allél létrehozása valamint térben és időben szabályozható génexpresszió szükséges. Munkám során olyan új módszereket kerestem, melyek a génműködés in vivo tanulmányozását egyszerűbbé tehetik. Tanulmányoztam a φc31 integráz alkalmazhatóságát egér embrionális őssejtekben. E helyspecifikus rekombinázt korábban nem használták az egér genom manipulációjára. Bizonyítottam, hogy az integráz működőképes egér ES sejtekben, és aktivitásához nem szükséges kofaktor jelenléte. Transzgének helyspecifikus genomikus integrációja lehetséges megfelelő szelekciós stratégia alkalmazásával. A φc31 integráz expressziója nem befolyásolja az ES sejtek életképességét és fejlődési potenciálját. Ezek alapján a φc31 integráz a transzgénes egér technológia hasznos eszközévé válhat. Munkám másik része egy olyan stratégia kidolgozására irányult, mely lehetővé teszi transzgének szövetspecifikus és indukálható overexpresszióját ES sejtekben és transzgénes egérben. Kombináltam a Cre rekombináz szövetspecificitását a tetraciklin reszponzív rendszerek indikálhatóságával. Létrehoztam egy transzgénes egértörzset, amelyben Cre közvetítette rekombináció után a reverz tetraciklin transzaktivátor (rtta) és az zöld fluoreszcens fehérje (egfp) gének fejeződnek ki. A génexpresszió a minden sejtben aktív Rosa26 promoterről történik. A mutáns allél jelenléte az egerekben kóros fenotípust nem okoz. A stratégia alkalmazhatóságát háromszorosan transzgénes állatokban teszteltük, amelyek a vaszkuláris endotheliális növekedési faktort (VEGF-A) különböző szerveikben overexpresszálják génindukció esetén. Indukció nélkül a kísérleti állatok normálisak voltak, indukció hatására jellegzetes szöveti fenotípusok jelentek meg. Stratégiánk tehát jól szabályozható génexpressziót tesz lehetővé. 2
BEVEZETÉS Az emberi genom megismerésében az utóbbi évtized jelentős haladást eredményezett, ami sok korábban ismeretlen gén felfedezéséhez vezetett. E gének többségének feladata és működése ismeretlen. Az elkövetkező évtized, a posztgenomikus kor biológiai kutatásának egyik fő célja ezen gének működésének megismerése lesz. A kísérleti állatok genomjának módosítása lehetővé teszi a génműködés in vivo tanulmányozását. Az ortológ gének vizsgálata során nyert adatok megfelelő óvatossággal az emberi genomra is átültethetők. A genommanipuláció egyik legnagyobb jelentőségű módja az egér genom megváltoztatása embrionális őssejtekben (ES sejtekben). Az embrionális őssejtek alkalmazása lehetővé teszi gének célzott inaktiválását ( knock-out ), pontmutációk létrehozását ( knock-in ) és random mutagenezist is ( gene trapping, transzpozon mutagenezis). A kívánt genetikai változást tartalmazó ES-sejteket injekcióval vagy aggregációval korai (blasztula illetve morula stádiumú) egér embriókba juttathatjuk, s ezzel kiméra egyedeket hozhatunk létre. Amennyiben az ES-sejtek részt vesznek a kimérák ivarsejtjeinek képzésében is, az ES-sejtek genomja (és az abban lévő mutáció) az utódnemzedékre átöröklődik (germinális transzmisszió). A vizsgált gén pontos szerepének megértéséhez szükség lehet több, a gén különféle mutációit tartalmazó egértörzs létrehozására. Sok adatot nyerhetünk a kondicionális egérmodellek vizsgálatából is, amelyeknél a gén működésének megváltozása (inaktivációja illetve overexpressziója) térben és időben szabályozható. E rendszerek szövetspecificitást illetve indukálható génexpressziót tesznek lehetővé. A kondicionális transzgénes rendszerek létrehozását a helyspecifikus rekombinázok (Cre, Flp) alkalmazása teszi lehetővé; ezek az enzimek genetikai átrendeződést katalizálnak felismerési helyeik (loxp illetve FRT) között. Sajnos a fenti rekombinázokkal nem minden genetikai átrendeződés hozható létre. Kívülről bevitt DNS szakaszok genomiális integrációja igen kis hatékonysággal történik, pedig ez a stratégia leegyszerűsítené mutáns allélsorok létrehozását. Ugyancsak várat magára az ideális, térben és időben egyaránt jól szabályozható génexpressziót biztosító rendszer kifejlesztése is. 3
CÉLKITŰZÉSEK Munkám célja olyan új technológiák kifejlesztése volt, amelyek bővíthetik lehetőségeinket a transzgénes egérmodellek létrehozása terén. I. A φc31 integráz használatának bevezetése az embrionális őssejt technológiába. Az integráz kombinált alkalmazása a már széles körben használt helyspecifikus rekombinázokkal (Cre, Flp) tovább bővítheti az egérgenom célzott megváltoztatására irányuló lehetőségeket. Jellemzőinél fogva a φc31 integráz különösen alkalmas lehet a célzott genomikus integrációt igénylő stratégiák során. Vizsgálatainkkal az alábbi kérdésekre kerestünk választ: 1. Működőképes-e a φc31 integráz egér ES sejtekben? 2. Lehetséges-e genomikus integráció csökkentett hosszúságú (kb. 50 bp) felismerési helyek alkalmazásával? 3. Szükséges-e szelekció alkalmazása a helyspecifikus integráció eléréséhez? 4. Befolyásolja-e a φc31 integráz expressziója az ES sejtek életképességét és fejlődési potenciálját? II. Megkíséreltük összekapcsolni a Cre egértörzsek szövetspecificitását a tetraciklin transzaktivátor indukálhatóságával. Célunk egy olyan technológia kifejlesztése volt, mely térben és időben szabályozható génexpressziót tesz lehetővé. Célkitűzéseink a következők voltak: 1. Knock-in egér létrehozása, mely a reverz tetraciklin transzaktivátort (rtta) az ubiquitaer (minden szövetben és az egyedfejlődés minden szakaszában aktív) Rosa26 lókuszról fejezi ki. 2. Az rtta gén csak Cre-mediálta DNS átrendeződés után kapcsolódik be, így biztosítva a szövetspecificitást. 3. A rendszer szabályozhatóságának tesztelése ES-sejtekben in vitro és transzgénes egérben in vivo. 4
MÓDSZEREK A φc31 integráz alkalmazhatóságának vizsgálatához genomiális dokkoló helyeket hoztam egér ES-sejtek genomjában. A dokkoló helyek tartalmazzák φc31 integráz felismerési helyét és maguk expresszálják az integrázt. Az elektroporációval a sejtekbe juttatott plazmid DNS random módon épült be a genomba. Southern hibridizációval választottam ki a transzgén egyetlen példányát tartalmazó sejtvonalakat. Ezekbe a sejtvonalakba szintén elektroporációval juttattam be az integrációs plazmidot szupercirkuláris vagy linearizált formában. G418 (gentamycin) szelekciót alkalmaztam a genomba beépült integrációs plazmidot hordozó sejtklónok izolálására. Az izolált sejtvonalaknál a helyspecifikus integráció kimutatására polimeráz láncreakciót (PCR) használtam. Southern hibridizációval elemeztem az integrációs termékeket és az integráció lehetséges mechanizmusát. A genomiális dokkoló helyet tartalmazó ESsejtekből kiméra egyedeket hoztunk létre morula aggregációval. A transzgén germinális transzmisszióját PCR-rel igazoltuk. A szövetspecifikus és indukálható génexpressziós rendszer megvalósításához szintén egér ES-sejtek genomját manipuláltam. A Rosa26 gén knock-in alléljének létrehozásához plazmid alapú target vektort készítettem, és azt elektroporációval R1 ES-sejtekbe juttattam. A megfelelő genomiális változást tartalmazó szubklónokat G418 szelekcióval izoláltam és Southern hibridizációval elemeztem. A loxp helyek működőképességét és a rendszer tetraciklinnel indukálhatóságát in vitro vizsgáltam Cre rekombináz expressziós vektor transzfekcióját követően. Morula aggregációval kiméra egyedeket hoztunk létre a megfelelő genomiális változást tartalmazó sejtvonalakból. Az erős kimérák utódaiban az ES-sejtek és a mutáns allél germinális transzmisszióját észleltük. Az utódok egymás közötti keresztezésével homozigóta mutáns egyedeket hoztunk létre. A rendszer in vivo teszteléséhez háromszorosan transzgénes egyedeket hoztunk létre amelyek tartalmazták az általunk létrehozott Rosa26-rtTA allélt, a tet-o- VEGF-A allélt és a különféle szöveti expressziót mutató Cre allélek valamelyikét. A VEGF-A génexpresszió aktiválásához a vemhes nőstények illetve a kifejlett egyedek ivóvízébe doxciklint adagoltunk. Az VEGF-A overexpresszió fenotípusbeli következményeit hisztológiai módszerekkel vizsgáltuk. 5
EREDMÉNYEK A φc31 integráz alkalmazásával helyspecifkus genomiális integrációt értem el, amennyiben a dokkoló helyek attp felismerési helyet, az integrálódó plazmid attb helyet tartalmazott. A felismerési helyek egyéb kombinációi nem eredményeztek integrációt. Pozitív szelekciós stratégia alkalmazásával a helyspecifikus integráció aránya 74% és 97% között volt, a dokkoló hely genomiális helyétől függően. Szupercirkuláris plazmid alkalmazása nagyobb számban eredményezett rekombinációt, mint lineáris plazmid használata. A reakció eredménye az esetek 52%-ában a teljes plazmid integrációja (popin intermedier), 32%-ban komplett kazettacsere, 6,5%-ban pedig mozaik mintázat volt. (n=200). Random promoter csapda esemény csak az esetek 9,5%-ában fordult elő. Nemszelektív körülmények között nem tudtam helyspecifikus integrációt igazolni. Három, egymástól különböző genomiális dokkoló helyet tartalmazó sejtvonallal germinális transzmissziót értünk el. A transzgénes utódok fenotípusa nem különbözött vad típusú alomtársaikétól. A Rosa26 knock-in allél létrehozásakor az izolált drogrezisztens szubklónok között a homológ rekombinánsok aránya 8% volt. Az in vitro Cre rekombináció zöld fluoreszcencia megjelenését idézte elő valamennyi homológ rekombináns sejtvonal esetén (n=12). Funkcionális in vitro vizsgálatokkal bizonyítottam, hogy a Cre rekombinációt követően a sejtek ugyancsak expresszálták a reverz tetraciklin transzaktivátor génjét. Két független sejvonallal germinális transzmissziót értünk el, és knock-in egértörzseket hoztunk létre. A hetero- illetve homozigóta transzgénes utódok kóros fenotípust nem mutattak. A Rosa26-rtTA egértörzs in vivo vizsgálatához keresztezéssel háromszorosan traszgénes egyedeket hoztunk létre. Az állatok a Rosa26- rtta knock-in allélen kívül tartalmazták a tetraciklinnel indukálható teto-vegf-a allélt és három különböző szövetspecificitású Cre expressziós allélt (pcaggs-cre, Nestin-Cre illetve Podocin-Cre). A pcaggs-cre allél esetén a doxiciklin indukció az embrionális életben letalitást és a szikzacskói vérkeringés zavarát, kifejlett állatban pedig szintén letalitással járó máj és thymus elváltozásokat idézett elő. A Nestin-Cre allél esetén az embrionális életben idegrendszeri vérzések fellépését, a Podocin-Cre allél esetén kifejlett állatban nephrosis szindrómát észleltünk. 6
MEGBESZÉLÉS A φc31 integráz alkalmazhatósága az egér ES sejt technológiában tovább bővíti lehetőségeinket az egér genom célzott manipulációja terén. Kombinált alkalmazása a már rutinszerűen használt helyspecifikus rekombinázokkal (Cre és Flp) lehetővé teheti olyan egér modellek létrehozását, amelyek több célra felhasználhatók (pl. kondicionális knockout és fluoreszcens knock-in allél egyben). Reakció-mechanizmusánál fogva különösen hasznos lehet a φc31 integráz a genomikus integrációt igénylő stratégiák során. Ilyen például az allél sorok létrehozása egyazon lókuszon genomiális dokkoló hely kialakításával és annak másodlagos módosításával. Ez lehetővé teheti, hogy különböző szekvenciák (pl. mutáns cdns-ek) összehasonlító funkcionális elemzését a pozíció hatás zavaró tényezője nélkül végezzük. Ugyancsak lehetséges knock-out allélek vagy géncsapda inszerciók másodlagos módosítása. A φc31 integráz másik fő alkalmazási területét a génterápiás próbálkozások fogják jelenteni, mivel potenciálisan szükségtelenné teheti a vírusok alkalmazását a terápiás gén bejuttatása során. A reverz tetraciklin transzaktivátor (rtta) expressziója a Rosa26 lókuszról jól szabályozható génexpressziót tesz lehetővé. A minden sejtben kifejeződő Rosa26 gén knock-in allélje kóros fenotípust homozigóta formában sem okoz. A tetraciklin inducibilis rendszerek fő problémája rendszerint a nemkívánatos génexpresszió induktor hiányában. Esetünkben Cre rekombináció illetve doxiciklin hiányában génexpresszió nem figyelhető meg, vagyis a rendszer pontosan szabályozott. Az allél in vivo tesztelésére alkalmazott VEGF-A gén igen dózis érzékeny. Egy allél elvesztése illetve a gén overexpressziója egyaránt embrionális letalitáshoz vezet. Doxiciklin hiányában az indukálható VEGF-A allélt hordozó egyedek normálisan fejlődtek. Doxiciklin indukció esetén kóros fenotípusok jelentek meg, amelyek jellege tükrözte az alkalmazott Cre allél szövetspecificitását. A Rosa26-rtTA allél lehetővé teszi a különböző Cre egértörzsek és a tetraciklinnel indukálható allélek kombinált alkalmazását. 7
AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁBAN MEGJELENT KÖZLEMÉNYEK Belteki G., Gertstenstein M, Ow D., Nagy A.: Site-specific cassette exchange and germline transmission with mouse ES cells expressing PhiC31 integrase. Nature Biotechnology, 21(3), 321 324, 2003 IF: 17,721 (2003) Belteki G, Haigh J, Kabacs N, Haigh K, Sison K, Costantini F, Whitsett J, Quaggin S, Nagy A: Conditional and inducible transgene expression in mice through the combinatorial use of Cre-mediated recombination and tetracycline induction. Nucleic Acids Research 33(5), e51, 2005 IF: 7,260 (2004) EGYÉB KÖZLEMÉNYEK Korets-Smith E., Lindemann L., Tucker K.L., Jiang C., Kabacs N., Belteki G., Haigh J., Gertsenstein M., Nagy A.: Cre recombinase specificity defined by the tau locus. Genesis, 40(3), 131-138, 2004, IF: 2,93 (2003) Bélteki G, Pataki M., Csanády K.: Kollodium baby phenotypusában megjelenő lamellaris ichthyosis újszülöttkori esete. Gyermekgyógyászat. 49, 352-357, 1998. Bélteki G., és mtsai.: A benignus familiaris újszülöttkori görcsök (BFNC) genetikája Pediáter, 1999. (VIII. Évfolyam) 1. Szám Kálmánchey és Bélteki: Chromosoma rendellenességek és dysmorphiás syndromák. In: Kálmánchey (szerk.): Gyermekneurologia. Medicina, Budapest, 2000. 8