Mycobacterium tuberculosis tenyészetének növekedését gátló peptidkonjugátumok szintézise és funkcionális jellemzése

Tudományos Diákköri Dolgozat BARANYAI ZSUZSA Mycobacterium tuberculosis tenyészetének növekedését gátló peptidkonjugátumok szintézise és funkcionális jellemzése Témavezetők: Dr. Bősze Szilvia, tudományos főmunkatárs Dr. Horváti Kata, tudományos munkatárs Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar Budapest, 2009

Tartalomjegyzék 1. BEVEZETÉS... 5 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS... 7 2.1. A Mycobacterium tuberculosis kórokozó baktérium... 7 2.2. A tuberkulózis kezelésében alkalmazott legfontosabb antituberkulotikumok és jellemzőik... 8 2.3. A rezisztens, gyógyszeres kezelésnek ellenálló baktériumtörzsek megjelenése... 11 2.4. A hatóanyagok célbajuttatása konjugátumok alkalmazásával... 12 2.4.1. Anyagfelvétel a sejtmembránon keresztül... 13 2.4.2. A hatóanyagok fertőzött makrofágokba történő célbajuttatására elméletileg alkalmazható hordozómolekulák bemutatása... 14 2.4.3. A hatóanyag hordozó egység között kialakítható kémiai kötések típusainak bemutatása... 16 2.4.4. A spacerek (távolságtartó egységek) szerepe a hatóanyag molekulák hordozóhoz történő kapcsolása során... 18 2.4.4.1. A GFLG szekvencia spacer peptidként (távolságtartó egység) való alkalmazása... 18 2.4.5. Antituberkulotikum hordozó konjugátumok áttekintése... 20 2.5. Új, lehetséges antituberkulotikumok meghatározása in silico módszerek alkalmazásával... 21 3. CÉLKITŰZÉS... 23 4. A KÍSÉRLETI MÓDSZEREK ELMÉLETI ALAPJAINAK ÁTTEKINTÉSE... 24 4.1. Szilárdfázisú peptidszintézis... 24 4.1.1. A Boc/Bzl módszer... 24 4.1.2. Az Fmoc/tBu módszer... 25 4.1.3. A peptidkötés kialakítása a szintézis során... 25 4.1.4. A kapcsolási reakciók követése... 26 4.2. Szintetikus peptidekben a cisztein oxidációs állapotának meghatározása... 26 4.3. Minimális gátló koncentráció és telepszám meghatározása... 27 4.4. Az áramlási citometria... 29 2

5. A KÍSÉRLETI MUNKA... 31 5.1. A peptidek és peptidszármazékok szintézise... 31 5.1.1. A H-GFLGC-NH 2 peptidamid és származékainak szintézise Boc/Bzl stratégiával... 31 5.1.2. A H-[TKPKG] 2 C-NH 2 peptidamid és származékainak szintézise Fmoc/tBu stratégiával... 33 5.1.3. Az in silico meghatározott hatóanyag jelöltek származékainak (vegyület 102 és 103) konjugálása... 34 5.2. A hordozóban a cisztein oxidációs állapotának ellenőrzése a konjugálási reakciót megelőzően... 35 5.3. A hordozó peptiszármazék dimerizációjának követése a konjugálási reakciót megelőzően... 35 5.4. A konjugálási reakcióban alkalmazott klóracetilezett SAK származék előállítása... 35 5.5. A 103-Aoa-OT10-Cys konjugálása ClAc-SAK-hoz... 36 5.6. A konjugátumok minimális gátló koncentrációjának és telepszámának meghatározása... 36 5.7. A hordozómolekulák és a konjugátumok sejtekbe történő bejutásának, felvételének vizsgálata áramlási citometriával... 37 5.7.1. A Cf-GFLGC előállítása... 37 5.7.2. A Cf-GFLGC konjugálása klóracetilezett SAK-hoz... 38 5.7.3. A Cf-GFLGC-SAK konjugátum karboxifluoreszcein tartalmának meghatározása... 38 5.7.4. A Cf-GFLGC peptidszármazék sejtbejutásának vizsgálata MonoMac6 humán monocita sejtvonalon áramlási citometriával... 38 5.7.5. A Cf-GFLGC-SAK peptidszármazék sejtbejutásának vizsgálata MonoMac6 humán monocita sejtvonalon áramlási citometriával... 39 5.8. Tisztítási és analitikai módszerek... 40 5.8.1. Analitikai és preparatív RP-HPLC... 40 5.8.2. ESI-MS spektrometria... 40 5.8.3. A peptidek és a konjugátumok aminosavanalízise... 41 6. EREDMÉNYEK... 44 6.1. A GFLGC, az Aoa-GFLGC és az Aoa-OT10-Cys peptidek, peptidszármazékok előállítása... 44 6.2. 102-Aoa-GFLGC és 103-Aoa-OT10-Cys előállítása, az előállított vegyületek vizsgálata... 47 3

6.3. ClAc-SAK előállítása... 53 6.4. A 103-Aoa-OT10-Cys-SAK előállítása... 53 6.5. A vegyületek, konjugátumok MIC és CFU értékei... 54 6.6. Cf-GFLGC és Cf-GFLGC-SAK előállítása, és a kapott konjugátumok sejtekbe történő bejutása... 55 7. ÖSSZEFOGLALÁS... 62 Rövidítésjegyzék... 63 Irodalom... 65 Köszönetnyilvánítás... 71 4

1. BEVEZETÉS A gümőkór vagy tuberkulózis (tbc) egy fertőző betegség, melyet a Mycobacterium tuberculosis (továbbiakban M. tuberculosis) baktérium okoz. A tuberkulózist okozó baktériumot Robert Koch 1882-ben fedezte fel, kutatásaiért 1905-ben Nobel-díjat kapott [1] (1. ábra). A betegség elsősorban a tüdő szöveteit érinti (pulmonáris tbc), a beteg tüdejében rögök keletkeznek, innen a betegség magyar neve: gümőkór [2]. A baktérium megtámadhatja a központi idegrendszert (meningitisz), a nyirokrendszert, a keringési rendszert (miliáris tbc), az ivarszerveket, a húgyutakat, a csontokat és az ízületeket is. A B 1. ábra: (A és B) Robert Koch, a tuberkulózist okozó baktérium felfedezője A tuberkulózis a történelem során a legtöbb halálesetet okozó fertőző betegségek egyike. A betegség gyógyítható, de napjainkban több mint kétmilliárd ember fertőzött a baktériummal. A harmadik világ országaiban évente kilencmillió új fertőzést és kétmillió halálesetet jelentenek. A fertőzöttek élete során kb. 10%-ban a fertőzés biztosan megbetegedéshez vezet. A rezisztens, vagyis a gyógyszeres kezelésnek ellenálló baktériumtörzsek okozta megbetegedések száma évről évre lassú növekedést mutat. 2006- ra félmilliónyira tehető a multirezisztens esetek száma. A fejlettebb országokban főként az immunrendszer csökkent védekezőképessége teszi lehetővé a tbc-s fertőzést. A legtöbb megbetegedést Afrikának a Szaharától délre eső részéről, illetve Dél-Kelet-Ázsiából (India, Kína) jelentik [3] (2. ábra). Ez a mutató a HIV és AIDS terjedése miatt évről évre drasztikusan emelkedik. Világszerte az AIDS-es betegek 15%-a hal meg tuberkulózisban [3-5]. 5

2. ábra: A tuberkulózis incidencia 2007-ben [3] Magyarországon a tuberkulózis incidenciája tartósan a legmagasabb Szabolcs-Szatmár- Bereg megyében, de kiemelkedik Hajdú-Bihar, Jász-Nagykun-Szolnok, Borsod-Abaúj- Zemplén megye illetve Budapest is. Hazánkban a szűrési fegyelem lazulása mellett az alkoholizmus, a romló szociális helyzet, a munkanélküliség játszanak szerepet az incidencia emelkedésében. A szűrővizsgálattal kiemeltek korcsoportos vizsgálata azt mutatja, hogy a legmagasabb arány az új tbc-s esetek között a fiatal és középkorú korcsoportokban van [6]. Egy tbc-ben szenvedő, kezeletlen személy évente kb. 10-15 embert fertőzhet meg [3]. Csak azok fertőznek, akiken már kitört a betegség, a látensek nem. A baktérium dormans állapotban évekig lehet a szervezetben, amely csak az immunrendszer legyengülésére vár, és már robban is. Dolgozatomban röviden összefoglalom a tuberkulózist okozó baktérium jellemzőit, valamint a betegség kezelésében alkalmazott antituberkulotikumokat és legfontosabb jellemzőiket. Bemutatom a hatóanyagok szelektív célbajuttatásának lehetőségeit. 6

2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 2.1. A Mycobacterium tuberculosis kórokozó baktérium A M. tuberculosis egy lassan szaporodó, intracelluláris, obligát aerob baktérium (3. ábra). A baktérium 16-20 óránként osztódik. Ez más baktériumok osztódási idejéhez képest lassúnak számít. A baktériumok osztódási ideje többnyire percekben mérhető az Escherichia coli húszpercenként osztódik, de a szintén mikobaktériumok közé tartozó Mycobacterium leprae húsznaponként. A M. tuberculosis pálcika alakú baktérium, ami ellenáll a gyengébb fertőtlenítőknek. Hetekig tűri a szárazságot, de csak a gazdaszervezeten belül képes osztódni (in vitro tenyészetet csak hosszú idő után sikerült a baktériumból létrehozni és fenntartani) [2]. 3. ábra: A M. tuberculosis mikroszkópos képe Ziehl-Neelsen festést követően, forrás: http://www.kimicontrol.com/edu-e.html A M. tuberculosis 60% lipidet tartalmaz, ennek jelentős része a sejtfalban lokalizált. Ez lehet az egyik fő oka annak, hogy a baktériumsejt nagymértékben rezisztens a hőmérséklet változásaival szemben. A sejtfal külső rétegeinek peptidláncai képezik a sejtfal tömegének 15%-át és a biológiailag fontos antigének is itt találhatók. Ezek felelősek a celluláris immunválasz kiváltásáért. A baktérium maga beszáradt exhalációs cseppecskékben, köpetben 6 hónapig is életképes maradhat. Rendkívül ellenálló savakkal és lúgokkal szemben is [7]. Stewart Cole és munkatársai 1998-ban közölték a M. tuberculosis H 37 Rv virulens baktériumtörzs teljes genomjának szekvenciáját [8]. A projekt során kapott információkat az interneten hozzáférhető TubercuList (http://genolist.pasteur.fr/tuberculist/) adatbázisban gyűjtik. A frissített adatok szerint [9, 10] a teljes genom ~4,4 millió bázispárból áll és összesen 4066 gént tartalmaz. Ebből 4009 fehérje kódoló gén, 57 gén RNS-t kódol. A fehérjéket kódoló gének elnevezése Rv kóddal kezdődik (pl. Rv2654), ami a H 37 Rv törzsre utal. 7

2.2. A tuberkulózis kezelésében alkalmazott legfontosabb antituberkulotikumok és jellemzőik A tuberkulózisos betegeket antibiotikumokkal, ún. antituberkulotikumokkal kezelik. A ma alkalmazott alapvető hatóanyagokat nagyrészt még az 50-es években fejlesztették ki. A megfelelően megválasztott kezelés az esetek döntő többségében teljes gyógyulást eredményez. A legelterjedtebben használt antituberkulotikumok a következők [11, 12] (4. ábra): első vonalbeli antituberkulotikumok: izoniazid (INH), rifampicin (RAMP), pirazinamid (PZA), etambutol (ETB), sztreptomicin (SM) második vonalbeli antituberkulotikumok: aminoglikozidok, polipeptidek, fluorokinolonok, tioamidok, cikloszerin (CS), p-aminoszalicilsav (PAS) 4. ábra: Az első vonalbeli antituberkulotikumok, és néhány másodvonalbeli antituberkulotikum szerkezeti képlete [12] 8

A M. tuberculosis baktérium szaporodását döntően befolyásolja a környezet oxigén szintje és kémhatása. A magas oxigéntenzió és az enyhén lúgos kémhatás mellett a tüdő kavernákban a legmagasabb a baktérium anyagcseréjének aktivitása és szaporodási frekvenciája is. Az antituberkulotikumok hatékonyságát a M. tuberculosis szaporodási sebessége és a környezet kémhatása nagymértékben befolyásolja. A neutrális és enyhén lúgos közegben, gyorsan szaporodó baktérium populációkkal szemben az INH a leghatékonyabb, bár a RAMP és a SM is hatásosnak bizonyult. A RAMP a semleges ph-jú sajtos gócokban lassan szaporodó baktériumokkal szemben is kimagasló aktivitással rendelkezik. A PZA intracellulárisan savas kémhatásnál fejti ki hatását [13] (5. ábra). 5. ábra: A leggyakrabban alkalmazott antituberkulotikumok feltételezett hatása az egyes baktérium populációkra [13] 9

Sok antituberkulotikumot használtak évtizedeken keresztül, anélkül, hogy ismerték volna a hatásmechanizmusaikat. A hatásmechanizmus kiderítésére irányuló kutatások eredményét mutatja be vázlatosan az 1. táblázat. Tulajdonság zsírsav bioszintézis inhibitorok Antituberkulotikum INH: prodrug, a KatG géntermék aktiválja, mikolsav (a mikobakteriális sejtfal fontos építőeleme) szintézist gátolja, NADH-val képez származékot, ezáltal a metabolizmust is megzavarja PZA: szerkezete hasonlít az INH-hoz, prodrug, aktiválódik Tioamidok (etionamid, protionamid): prodrug arabinogalaktám és peptidoglikán bioszintézis inhibitorok ETB: arabinozil-transzferáz inhibitor, növeli a sejtfal áteresztő képességét azáltal, hogy nem tud létrejönni a mikolsav-arabinogalaktám komplex D-cikloszerin: gátolja a D-alanin-racemáz és D-alanin-ligáz enzimeket, melyek szükségesek az UDP-muramil-pentapeptid szintéziséhez (sejtfal kialakításában van szerepe) fehérje szintézis inhibitorok SM: a baktérium riboszómájának 30S alegységéhez kötődik (az emberi sejtek riboszómája különbözik, ezért szelektív a baktériumsejtekre) Aminoglikozidok Polipeptidek DNS alapú folyamtok inhibitora dihidrofolátreduktáz inhibitorok RAMP: az RNS szintézist gátolja, a DNS-függő RNS-polimeráz béta alegységéhez köt, ezzel megakadályozza a transzkripció folyamatát Fluorokinolonok: az ATP-függő DNS-girázt (topoizomeráz II) és az ATPfüggő topoizomeráz IV-et gátolják, ezért akadályozzák a DNS replikációt és a transzkripciót (eukarióta sejtekben nincsenek ilyen enzimek) PAS: kötődik a mikobakteriális dihidrofolát-reduktáz enzimhez, így gátolja a DNS szintézist, mely sejthalálhoz vezet 1. táblázat: A főbb antituberkulotikumok irodalomban leírt lehetséges hatásmechanizmusa [12] 10

A makrofágok olyan intracelluláris kórokozók gazdasejtjei lehetnek, mint a M. tuberculosis. A tbc megbetegedést okozó baktérium a makrofágok fagoszómáiban (sejten belüli membránnal határolt sejtalkotó, amely a fagocitózis során jön létre) képesek kikerülni a szervezet védekező mechanizmusait. A makrofágok reaktív oxigéngyökök, nitrogén-oxidok, lizozim, hidrolitikus enzimek segítségével bontják le a baktériumokat savas vezikulumaikban. Az aktivált makrofágok nem képesek elpusztítani az összes bekebelezett baktériumot. Ha a fertőzött makrofágok elpusztulnak, a kiszabaduló baktériumok újabbakat fertőzhetnek meg [14]. A fertőzött makrofágok eljuthatnak a környező nyirokcsomókba, illetve a véráram útján egyéb szövetekbe is. Intracellulárisan a M. tuberculosis alacsony anyagcsereszinten, dormans állapotban hosszú ideig életképes marad. Az antituberkulotikumok többsége az inaktivált makrofágokból kiszabaduló extracelluláris baktériumokra hat [13]. 2.3. A rezisztens, gyógyszeres kezelésnek ellenálló baktériumtörzsek megjelenése A helytelen, rendszertelen és nem kellő ideig tartó gyógyszerszedés a rezisztencia kialakulásának leggyakoribb oka. Az 1990-es évek során világszerte új fenyegetésként jelent meg a multirezisztens (multidrug-resistant, MDR) tuberkulózis, amely a két leghatékonyabb gyógyszerrel, az INH-dal és RAMP-nel szemben ellenállóvá vált M. tuberculosis törzsek megjelenését jelenti. A tuberkulózisos megbetegedések 5%-a MDR tuberkulózis. Ennek a formának a kezelése a másodvonalbeli antituberkulotikumokkal lehetséges. Ezek az antituberkulotikumok azonban az első vonalbeli hatóanyagokhoz képest lényegesen kevésbé hatékonyak, alkalmazásuk sokkal több és kellemetlenebb mellékhatással jár [11, 14]. A MDR törzsek csoportján belül megjelent egy ún. extenzíven rezisztens (extensively drug resistant, XDR) forma, amely már nemcsak az elsővonalas készítményekkel, de a jelenleg használt hat fajta második vonalas gyógyszer közül hárommal szemben is ellenálló. Évente 40 ezer XDR megbetegedést jelentenek [3]. A rezisztens törzsek többsége genetikai változások és az utólagos szelekció útján jön létre. A spontán létrejött ellenálló mutációk szelekcióját a gátlóanyag jelenléte biztosítja. A kemoterápia során megjelenő gyógyszerrezisztencia lehetőségének minimumra csökkentését azzal érik el, hogy a szövetekben és szervekben a hatóanyagnak olyan magas szintjét alakítják ki, mely elnyomja mind a kórokozó eredeti populációjának, mind az esetlegesen létrejött mutánsainak szaporodását. Továbbá két olyan hatóanyagot igyekeznek egyszerre alkalmazni, melyek alkalmazásakor keresztrezisztencia nem alakul ki, illetve a két hatóanyag megakadályozza a másikkal szemben kialakuló mutánsok szaporodását [15]. 11

2.4. A hatóanyagok célbajuttatása konjugátumok alkalmazásával A betegség kezelésében alkalmazott antituberkulotikumok korlátozott mértékben, diffúzióval juthatnak be a fertőzött makrofágokba a sejtmembránon keresztül. A betegség kezelése hosszú (minimálisan 6-12 hónap), ezért számolni kell az antituberkulotikumok mellékhatásaival, így a szervezet egészét érintő nem specifikus toxicitásukkal. A szervezet kiválasztórendszere gyorsan kiürítheti a gyógyszert a véráramból. A hatóanyag konjugátumok alkalmazása csökkentheti a mellékhatásokat, mivel lehetőséget adhat a hatóanyagok szelektív, specifikus célbajuttatására a fertőzött makrofágokba. Továbbá a hatóanyag fokozatos felszabadulása a konjugátumokból retard (elnyújtott) hatást eredményez és ezáltal a hatóanyag lassabban ürül ki a szervezetből. Hatóanyagok és a természetes, vagy a szintetikus eredetű makromolekulák konjugálása 50 évvel ezelőtt kezdődött. Jatzkewitz dipeptid spacert (más szóval: távolságtartó egységet) használt, hogy egy hatóanyagot polivinilpirrolidonhoz kapcsoljon [16]. Mások számos vízoldható polimer hatóanyag konjugátumot szintetizáltak [17], hatóanyagot konjugáltak immunoglobulinokhoz. Leírtak olyan polimereket is, melyek irányítható célbajuttatóként használhatóak [18]. A gyógyszerhordozó rendszerek különféle egységekből épülnek fel. Inert szintetikus polimer hordozóra kapcsolják a hatóanyagot, aminosav vagy peptid spacerrel összekötve. A rendszer tartalmazhat még célbajuttató egységet [19] (6. ábra). 6. ábra: Egy gyógyszerhordozó rendszer sematikus ábrája 12

2.4.1. Anyagfelvétel a sejtmembránon keresztül A kemoterápiában használt kis molekulasúlyú gyógyszerek diffúzióval bejutnak bármilyen típusú sejtbe a sejtmembránon keresztül. A szelektivitás hiánya csökkenti ezeknek a vegyületeknek a hatékonyságát, továbbá nem kívánatos mellékhatások kialakulásához vezet. Az endocitózis során az anyagok felvétele korlátozott. Endocitózisnál a sejtet határoló membrán egy része körbeveszi, mintegy elnyeli a makromolekulát, majd belül leválik egy ún. intracelluláris hólyagot formálva, mely tartalmazza a bekerített makromolekulát. A hatóanyagok konjugációja hordozókhoz segíthet abban, hogy a gyógyszerkonjugátumokat specifikusan azokba a sejtekbe irányítsuk, amelyekben a kívánt hatást el akarjuk érni. A makromolekulák az endocitózist követően lizoszómákba kerülnek, ahol a hidrolítikus enzimek találhatóak. A polimerhordozó hatóanyag kötés érzékeny a lizoszomális hidrolízisre, elbomlása során felszabadul a hatóanyag a célsejt citoplazmájában. Ilyen rendszerek tervezésénél két kritériumot kell figyelembe venni: (1) olyan gyógyszer hordozó kémiai kötést kell tervezni, mely elbomlik a lizoszomális hidrolízis során, viszont képes ellenállni az enzimek működésének a véráramban; (2) fontos továbbá, hogy a konjugátum (hatóanyag hordozó rendszer) felvétele specifikus legyen, csak a célsejtekbe kerüljön be hatóanyag, és minimálisan jusson be más sejtekbe. Az endocitózis szelektivitása javítható a molekula súlyának változtatásával, de nagyobb szelektivitás érhető el, ha specifikus célbajuttató egységet építenek be a makromolekulába. Célbajuttató részek lehetnek peptidek, fehérjék, szénhidrátok, szénhidrát származékok és antitestek, amelyek a célsejtre jellemző sejtfelszíni struktúrákat ismernek fel [19]. A sejtek felületén specifikus receptorok és antigének találhatók, melyek felismernek és kapcsolatba lépnek bizonyos típusú molekulákkal [19]. A hatóanyagok szelektív transzportja antituberkulotikumok esetén a fertőzött makrofágokba történhet receptor mediált endocitózissal. A hatóanyag molekulát olyan célbajuttató egységhez kapcsoljuk, amely specifikusan a makrofágok sejtfelszínén található struktúrához, receptorhoz kötődik. Ilyen receptorok lehetnek a scavenger és a tuftsin receptorok [20, 21]. A kötődés után a konjugátum bekerül a sejtbe, majd lizoszomális degradáción megy keresztül [22, 23]. A scavenger receptorok főként a makrofágok és a makrofágszerű sejtek felszínén expresszálódnak, a mintázatfelismerő receptorok közé tartoznak. Elsősorban a módosult LDL-t (low density lipoprotein, kis sűrűségű lipoprotein), pl. oxidált LDL, acetilezett LDL veszik fel a keringésből [24, 25.]. Továbbá ezek a receptorok polianionos ligandumok [26], endogén anyagok, anionos foszfolipidek, kollagén, zsírsavak, peptidek, apoptotikus sejtek, mikrobális lipopeptidek [27, 28] megkötésére képesek, melyek ezután bejutnak a sejtbe endocitózissal [29, 30]. 13

A makrofágokon, monocitákon megtalálható tuftsin receptor is alkalmas hatóanyagok célzott sejtbejuttatására. A tuftsin-konjugátum (a tuftsin a γ-globulinból származó frakció, egy tetrapeptid [31]) kötődése a receptorához nem csak az endocitózist segíti elő, hanem a makrofág aktiválódását is eredményezi. Az aktivált makrofág már képes az intracelluláris parazitákat elpusztítani [20, 23, 32, 33]. 2.4.2. A hatóanyagok fertőzött makrofágokba történő célbajuttatására elméletileg alkalmazható hordozómolekulák bemutatása Az első konjugátumoknál természetes makromolekulákat használtak hordozóként. A szintetikus polimerek alkalmazása több előnnyel jár: (1) a molekulatömeg tartomány befolyásolható, (2) eltérően sok természetes makromolekulától, ezek a szintetikus hordozók általában nem immunogének, (3) a polimerláncok térhálósíthatók a gélképződési szint eléréséig [19]. Fehérjék széles köre használható hordozóként: egy mélytengeri csiga hemocianinja (keyhole limpet hemocyanin, KLH), marha szérum albumin (bovine serum albumin, BSA), ovalbumin (OVA), tetanusz toxoid (TT) és tisztított fehérje kivonatok (purified protein derivative, PPD). A természetes vegyületek alkalmas hordozók, mert növelik a kapcsolt epitóp immunogenitását, de jelentős hordozóspecifikus ellenanyagválasz kialakulása miatt, alkalmazásuk a humán terápiában nem ajánlott. Ezekkel a természetes eredetű hordozókkal ellentétben a szintetikus polimereknek és szekvenciális oligopeptideknek általában nincs immunogén hatása [34]. A szintetikus hordozókat polimerizációval előállított (pl. elágazó láncú polipeptidek, N- vinil-pirrolidon maleinsav kopolimer) és diszkrét molekulákra oszthatjuk. Az előbbi csoporttal kapcsolatban problémaként felmerül a megfelelő jellemezhetőség, illetve a reprodukálhatóság hiánya, ami a klinikai alkalmazásuk komoly gátja. A kémiailag jól jellemezhető molekulák közül a legelterjedtebbek a lizin dendrimerek és a lizin tartalmú szekvenciális oligopeptidek. N-(2-hidroxipropil)-metakrilamid (HPMA) alapú szintetikus polimerek a daganatterápiában bizonyultak megfelelő hordozónak. Az ilyen polimerek oldhatóak vizes közegben és biokompatibilisek. Továbbá N-metakriloil oligopeptidek p-nitrofenilésztereinek hozzákapcsolásával kombinálhatók sok olyan gyógyszerrel, melyek primer aminocsoportot tartalmaznak [35]. A kisebb méretű lineáris peptidek gyógyászatban való alkalmazását nehezíti, hogy az élő szervezetbe kerülve igen gyorsan lebomlanak, ezért nem jutnak el a kívánt hatás helyére. A terápiás alkalmazhatóság céljából nagy jelentősége van a peptidek makromolekuláris hordozókhoz való konjugálásának. Szintetikus hordozóként régóta alkalmaznak elágazó 14

láncú poli-α-aminosavakat, mert ezek a vegyületek megfelelőnek bizonyultak a természetes fehérjék modellezésére. Szemben a természetes antigénekkel, egyszerű, könnyen variálható szerkezettel rendelkeznek, ezáltal megkönnyítik az immunológiai eredmények értelmezését. Polilizin gerincű, elágazó láncú szintetikus polipeptideket Sela és munkatársai alkalmaztak először hordozóként [36]. Az oldalláncok N- vagy C- terminálisa egy optikailag aktív aminosavat tartalmaz. Az oldallánc végén lévő aminosav jelentős hatással van a molekula fiziko-kémiai, illetve biológiai tulajdonságaira. A peptidkonjugátumok előállításához az MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoportban kifejlesztett szintetikus polipeptidek alkalmasak hordozónak (általános képletük: poli[lys(x i -DL-Ala m )], (XAK), ahol i 1, m 2-4, és X: optikailag aktív aminosav). Ilyen polilizin gerincű, elágazó láncú polipeptid a SAK és az EAK (7. ábra). 7. ábra: A SAK és EAK polipeptidek sematikus vázlata A polilizin lánc kb. 100 lizinegységből épül fel, melyek ε-aminocsoportjaihoz átlagosan 3 DL-alaninból álló oligomer kapcsolódik. Az oldallánc N-terminálisához szerin illetve glutaminsav van kötve. A kemotaktikus receptorok érzékenyek a ligandum szerkezeti változásaira, megkülönböztetik a D-, L-aminosavakat [37]. Az EAK polipeptid amfoter karakterű molekula, a SAK polikationos, vízoldékonysága nagy a hidroxil csoportot tartalmazó szerin oldalláncok miatt. Hosszabb ideig stabilak a véráramban. Citotoxikus aktivitásuk nincs vagy elenyésző [38]. Az MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoportban vizsgálták a makrofágok polimerfelvételét. Összehasonlították a mintázatfelismerő scavenger receptoron keresztül a polilizin gerincű, elágazó láncú molekulák sejtbejutását [28, 30]. 15

Az 1970-es évek elején Najjar és munkatársai azonosítottak egy frakciót a γ-globulinból (leukokinin), mely specifikusan kötődik a vér neutrofil granulocitáihoz, és monocitáihoz. Ez a molekula egy tetrapeptid, a tuftsin, melynek szekvenciája embernél: TKPR, kutyánál: TKPK. A szervezetben a tuftsint két enzim hasítja ki a γ-globulinból [31]. A tuftsin befolyásolja a fagocitózist, a kemotaxist, magas koncentrációban immunstimuláló, antimikrobális és daganatellenes hatása van. Ezek a tulajdonságok teszik a tuftsint figyelemreméltó hordozó jelöltté a sejtspecifikus célbajuttatásnál [39]. Egyéb természetes eredetű tuftsinanalóg tetrapeptidek (TRPR, TKPK, TRPK) is a tuftsinhoz hasonló tulajdonságokkal rendelkeznek [31]. Az MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoportban a hordozóként alkalmazható szekvenciális oligopeptidek egy új csoportját fejlesztették ki: az ismétlődő pentapeptid egységet tartalmazó oligotuftsin származékokat: [TKPKG] n (n=2, 4, 6, 8). Ezek a vegyületek jól jellemezhetőek, nem toxikusak, biodegradábilisak és tuftsinszerű biológiai tulajdonságokkal rendelkeznek [34]. Hatékonyan használhatók hatóanyag hordozóként fertőzött makrofágok esetében mint a tuberkulózis vagy leishmaniasis a liposzómához kapcsolt tuftsinszármazékok. A TKPR antimikrobiális aktivitása jelentősen növekedett azáltal, hogy a C-terminálishoz zsírsav származékot kapcsoltak etiléndiamin spaceren (távolságtartó egység) keresztül. A palmitoil tuftsint tartalmazó liposzómák bejutnak a monocitákba, a makrofágokba és a polimorfonukleáris (PMN) leukocitákba [40]. 2.4.3. A hatóanyag hordozó egység között kialakítható kémiai kötések típusainak bemutatása Az antituberkulotikum hatásának megőrzésében fontos a hatóanyag és a hordozó között lévő kötés kémiai jellege. A hatóanyag tulajdonságai előnytelenül változhatnak, ha a molekula nem funkcionálisan aktív, megfelelő kémiai szerkezettel szabadul fel. A konjugációnál leggyakrabban amid, észter, éter, oxim, tioéter, hidrazon és hidrazin jellegű kötéseket alkalmaznak (8. ábra). Az amidkötés kialakítását általában a lépésenkénti szintézis során alkalmazzák, a hordozó szabad aminocsoportja és a peptid aktivált karboxilcsoportja között jön létre. Ez a reakció azonban csak védett peptidekkel kivitelezhető. Diszulfidhídon keresztül való kapcsoláshoz nem-védett peptidszármazékok is használhatók, de a konjugátumok stabilitása nem minden esetben megfelelő. Tioéterkötés kialakításával kemoszelektív ligációra van lehetőség. Így kémiailag stabilabb konjugátum állítható elő és a kapcsoláshoz nem kell védett peptideket alkalmazni. A tioéterkötést tartalmazó konjugátumok szintézise során az epitóppeptidet ciszteinnel 16

hosszabbítjuk, és ezt a származékot oldatban reagáltatjuk a hordozón kialakított haloacetilezett aminocsoporttal [34, 41]. A stratégia hátránya, hogy a cisztein tartalmú peptidek diszulfidhíd kialakításával dimerizálódnak lúgos közegben. Ez a mellékreakció különösen gyors abban az esetben, amikor a cisztein a peptid N-terminálisán van, és az N-terminális szabad aminocsoportként van jelen. A gyors dimerizáció kiküszöbölhető az N-terminális aminocsoport acetilezésével vagy a cisztein C-terminálisra kapcsolásával [42]. Hidrazon-, tiazolidin- és oximkötések kialakítása egy aldehidcsoport és egy gyenge bázis tulajdonságú oldallánc között megy végbe, savas közegben. Ezek a gyenge bázisos oldalláncok lehetnek aminooxicsoportok, hidrazincsoportok a peptid N-terminálisán [43]. Az oximkötés létrejöttét gyorsítja a poláris aprotikus oldószerek (DMF, DMSO) használata. Az oximkötés kialakítása során mellékreakciók is fellépnek. Az egyik ilyen reakció a többszörös aceileződés [44, 45]. Megfelelő megoldás az etoxietilidén védőcsoport használata, mely átmeneti oximkötést hoz létre (hasítás: 5% TFA 47,5% acetonitril, 47,5% víz, 1 óra) [46]. Az aminooxiacetil csoport stabil oximot képezhet a laboratóriumban jelen lévő aldehidekkel és ketonokkal, mint például az aceton, ezért ezen vegyületeket jelenlétét igyekeznünk kell kiküszöbölni a reakció alatt [47]. amid oxim tioéter diszulfidhíd -NH-CO- -CH=N-O- -CH 2 -S-CH 2 - -CH 2 -S-S-CH 2 - tiazolidin S hidrazon hidrazin -NH-N=CH- -NH-NH-CH 2 - N H 8. ábra: A konjugálás során a hatóanyag és a hordozó molekula között kialakítható kötések A konjugátumból a hatóanyag felszabadulhat hidrolízissel (pl. észter- és amidkötés), enzimatikus degradációval vagy ph kontrollált reakcióval. Tam és munkatársai hidrazon-, tiazolidin- és oximkötést tartalmazó peptid dendrimerek stabilitásának ph függését vizsgálták. A tiazolidinkötésű vegyület stabil ph=3-9 oldatban; az oximkötésű származék savas és semleges ph-n stabil; a hidrazonkötésű konjugátum savas (ph=3) és lúgos (ph=9) oldatban disszociálódik [43, 48]. 17

Zeng és munkatársai két epitóppeptidet kapcsoltak össze különböző kötésekkel, hogy tanulmányozzák a kötések befolyását a biológiai aktivitásra. A tioéterkötés nem változtatott a peptidek funkcionális aktivitásán, az oximkötés enyhén, a diszulfidhíd jelentősen csökkentette a funkcionális aktivitást [41]. 2.4.4. A spacerek (távolságtartó egységek) szerepe a hatóanyag molekulák hordozóhoz történő kapcsolása során A hatóanyag és a polimerhordozó összekötéséhez a peptidek alkalmasnak bizonyultak. Különböző enzimekkel (pl. kimotripszin, tripszin, papain, katepszin B) végeztek tanulmányokat, annak érdekében, hogy kiderítsék, milyen peptidek a legmegfelelőbbek erre a célra. A lizoszomális enzimek között nagy számban találunk proteázokat. A hatóanyag és a hordozó közé épített peptid spacerek degradálhatóak lizoszomális enzimekkel. Az elhasított kötés rendszerint a hatóanyag és a szomszédos aminosav között van. A lizoszomális hidrolízis hatásfokát a spacert alkotó aminosavak minősége, száma, valamint szerkezeti tényezők befolyásolják [19]. Irodalmi adatok alapján (elsősorban a proteolitikus enzimek peptidekkel alkotott komplexének szerkezetéről írt tanulmányok szerint) spacerként alkalmazhatóak az alábbi peptidek, amelyekben az alkotó aminosavakat egybetűs kódokkal jelöltem: GG, GFG, GFF, GLG, GVA, GFA, GLF, GLA, AVA, GFLG, GFFL, GLLG, GFYA, GFGF, AGVF, GFFG, GFLGF, GGFLGF [19]. Funkcionális vizsgálatokat folytattak különböző polimer hordozók, hatóanyagok és spacerek kombinációira. A GFLG szekvenciájú peptid spacer több kísérlet eredménye alapján is megfelelőnek bizonyult [19, 35]. 2.4.4.1. A GFLG szekvencia spacer peptidként (távolságtartó egység) való alkalmazása A hatóanyagot peptid spaceren keresztül kapcsolhatjuk a hordozóhoz. A spacer konjugálása a hordozóhoz többféleképpen történhet. A ciszteinnel hosszabbított spacer konjugálását a tiolcsoporton keresztül szelektíven végre lehet hajtani. A diszulfidkötést tartalmazó konjugátumok biológiai rendszerekben való stabilitása sokat vitatott, előnyösebb a tioéterkötés kialakításán keresztül való kapcsolás. A tioéterkötés előnye, hogy nem igényel védett peptidet, kémiailag és biológiailag stabilabb kötést biztosít, nem antigén karakterű. A tioéterkötés kialakítása történhet a ciszteinnel hosszabbított konjugálandó peptid tiolcsoportja és a hordozó molekulán kialakított klóracetilezett aminocsoport között [34] (9. ábra). 18

PEPTID-NH-CH-CONH 2 + Cl-CH 2 -CO-NH-HORDOZÓ CH 2 SH -HCl PEPTID-NH-CH-CONH 2 CH 2 S-CH 2 -CO-NH-HORDOZÓ 9. ábra: Tioéterkötés kialakítása klóracetilezett hordozó és cisztein tartalmú peptid között Az MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoportban a Herpes simplex vírus glikoproteinjének peptidepitópjait, Alzheimer-kór specifikus β-amiloid peptidet, és tumorellenes aktivitású GnRH-III peptidet ciszteinnel hosszabbítottak és közvetlenül, vagy spacer közbeékelésével klóracetilezett tetratuftsin származékhoz kapcsoltak tioéterkötésen keresztül. A konjugálás eredményességét növelte a spacer, a GFLG vagy oligoglicin szekvenciájú peptidek alkalmazása. Tanulmányozták a spacer régiónak a peptid dimerekhez vezető diszulfidhidak kialakulásában betöltött szerepét. A spacer szekvencia beépítésével csökkenthető a diszulfidhíd képződés valószínűsége, mert a spacer beépítése növelheti a konjugálási reakció sebességét, így csökkentheti a melléktermékként keletkező dimerek mennyiségét. A cisztein helyzete jelentősen befolyásolja a konjugálási reakciót és az intermolekuláris diszulfid dimerek létrejöttét [34]. A Kutatócsoportban előállítottak GFLG spacerrel módosított tetratuftsin származékot (Ac- [TKPK(ClAc-GFLG)G] 4 -NH 2 ). A peptid szintézise során a lizin oldallánc védőcsoportok különbözőek voltak, a szelektív kapcsolás miatt. A 2-es pozíciójú lizin ε-aminocsoportján 2-klórbenziloxikarbonil (ClZ), a 4-es pozíción 9-fluorenilmetiloxikarbonil (Fmoc) védőcsoportot alkalmaztak. Az Fmoc-csoport szelektív hasítását követően a GFLG spacert a 4-es pozíciójú lizin oldalláncán építették be. A GFLG szakasz N-terminálisát klóracetilezték, a ciszteinnel hosszabbított epitóppeptiddel kialakították a tioéterkötést [34]. 19

2.4.5. Antituberkulotikum hordozó konjugátumok áttekintése Az irodalomban találunk példát antituberkulotikum hordozóhoz konjugálásáról: a PAS molekulát konjugálták maleilezett marha szérum albuminhoz (MBSA). A makrofágokon található MBSA kötőhelyek, sejtfelszíni receptorok segítségével a konjugátum hatékonyan bejutott a sejtekbe. A lizoszómában hidrolízis útján felszabadult a hatóanyag aktív formája. A kísérleteket egérből származó fertőzött peritoneális makrofágokon végezték. A vizsgálatok alapján a konjugátum százszor hatékonyabban pusztította el az intracelluláris M. tuberculosis baktériumokat, mint a szabad PAS. Tehát a konjugátum alkalmazásával a hatékonyság eléréséhez nem szükséges akkora mennyiség, mint a szabad PAS esetén. Hasonló eredményeket értek el acetilezett lipoproteinek hordozóként való alkalmazásával is [49]. A RAMP antituberkulotikum alkalmazása során tuftsinnal konjugált, foszfatidilkolinból álló liposzóma belsejébe juttatták be a hatóanyagot, és így meghosszabbodott terápiás hatást értek el [40]. Az MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoportban INH antituberkulotikumot tartalmazó peptidkonjugátumokat terveztek, és ezek biológiai aktivitását vizsgálták. Hordozóként tuftsinszármazékokat (GTKPKG (T6), és [TKPKG] 4 (OT20)) [42] és az M. tuberculosis immundomináns 16 kda fehérjének egy T-sejt epitóppeptidjét ( 91 SEFAYGSFVRTVSLPV 106 ) választották [50, 51]. Az INH hordozóhoz konjugálása során kétféle szintézis módszert alkalmaztak. A munka célja a kémiai kötés funkcionális aktivitásra kifejtett hatásának vizsgálata volt. Egyik esetben az epitóppeptidet szerinnel hosszabbították, majd szelektíven oxidálták NaIO 4 -tal. Az INH-t közvetlenül a peptidhez kapcsolták hidrazonkötés kialakításával (10. ábra). A másik esetben az INH-t glioxilsavval módosították, a keletkezett izonikotinoilhidrazono-ecetsavat NaBH 3 CN-del redukálták izonikotinoilhidrazino-ecetsavvá. Az aktivált (DIC/HOBt) izonikotinoilhidrazino-ecetsav reagált a még gyantán lévő peptid aminocsoportjával, amidkötés létrejötte során (11. ábra). Ezen vegyületek segítségével tanulmányozták a kémiai átalakítások hatását az INH in vitro antituberkulotikus aktivitására. Mindegyik konjugátum hatásosnak bizonyult a M. tuberculosis H 37 Rv tenyészeten [50]. 20

NH 2 -CH-CO-PEPTID ph 8,2 O=CH-CO-PEPTID ph 4,6 CO-NH-N=CH-CO-PEPTID CH 2 OH NaIO 4 CO-NH-NH 2 Ser-PEPT ID izoniazid hidrazon N N 10. ábra: Izoniazid konjugálása peptidaldehidhez hidrazonkötés kialakításával CO-NH-NH 2 CO-NH-N=CH-COOH N izoniazid O=CH-COOH glioxilsav N izonikotinoilhidrazono-ecetsav NaBH 3 CN CO-NH-NH-CH 2 -COOH HOBt DIC N izonikotinoilhidrazino-ecetsav NH 2 -PEPTID- N CO-NH-NH-CH 2 -CO-NH-PEPTIDhidrazid 11. ábra: Izoniazid-peptid konjugátum kialakítása szilárdfázison hidrazidkötés létrejöttével 2.5. Új, lehetséges antituberkulotikumok meghatározása in silico módszerek alkalmazásával A rezisztens és multirezisztens törzsek terjedése miatt egyre nagyobb szükség van új típusú antibiotikumokra. Új hatóanyagok keresése történhet ún. in silico módszerek segítségével. A baktérium anyagcseréjében kis molekulatömegű vegyületek létfontosságú enzimekhez való kötődését (és ezen keresztül közvetve ezen enzimek gátlását) dokkolóalgoritmusok alkalmazásával lehet jósolni. Az in silico módszer lényege, hogy ismert háromdimenziós (NMR, vagy röntgenkrisztallográfia) szerkezettel rendelkező fehérjékhez dokkolják egy több millió molekulából álló vegyülettár elemeit. A kísérletekben használt 21

molekulatár a nyilvános Zinc adatbázis (Zinc a free database for virtual screening, http://zinc.docking.org/) [52, 53]. A M. tuberculosis túléléséhez fontos enzimekhez kötődő vegyületeket egy újonnan kifejlesztett dokkolási algoritmus segítségével az ELTE Számítógéptudományi Tanszékén Dr. Grolmusz Vince kutatócsoportjában határozták meg. A ligandumok dokkolása a DUTPáz enzimhez történt, mely a baktérium anyagcseréjében kulcsfontosságú szerepet játszik [54]. Az így talált molekulák in vitro antibakteriális hatása meghatározható. Az in vitro antibakteriális hatást mutató vegyületek hatékonysága ezután szintetikus optimalizálási lépések sorozatával javítható, így az eredeti kiindulási vegyületek lehetséges gyógyszer jelölt molekulákká alakíthatók. 22

3. CÉLKITŰZÉS A dolgozatban összefoglalt munka célja a fertőzött makrofágokba való szelektív célbajuttatásra alkalmas hatóanyag hordozó konjugátumok előállítása és funkcionális vizsgálata volt: peptid típusú távolságtartó egység és hordozómolekulák előállítása szilárdfázisú peptidszintézissel, a vegyületek kémiai jellemzése; új in silico meghatározott és in vitro antituberkulotikus hatású vegyületek származékainak oligo-, illetve polipeptid típusú hordozómolekulákhoz kapcsolása, a konjugátumok kémiai jellemzése; a hatóanyag-hordozó konjugátumok in vitro antituberkulotikus hatásának vizsgálata M. tuberculosis H 37 Rv tenyészetén; fluoreszcensen jelölt konjugátumok előállítása és kémiai jellemzése; fluoreszcens származékok in vitro sejtbejutásának vizsgálata áramlási citométerrel. 23

4. A KÍSÉRLETI MÓDSZEREK ELMÉLETI ALAPJAINAK ÁTTEKINTÉSE Ebben a fejezetben foglaltam össze röviden az általam alkalmazott módszerek elméleti hátterét. A kísérleti munkám leírásai, illetve a műszeres mérések körülményei az 5. fejezetben olvashatók. 4.1. Szilárdfázisú peptidszintézis A szintetikus munka során a peptideket szilárdfázisú peptidszintézissel állítottam elő. A szilárdfázisú szintézis lényege, hogy az első aminosavat hozzákapcsoljuk egy szilárd hordozóhoz, majd újabb aminosavat kapcsolunk az előzőhöz, és az egyenkénti kapcsolást a kívánt lánchossz eléréséig folytatjuk. A szintézis C-terminális N-terminális irányban halad, mert így kisebb az epimerizáció előfordulásának valószínűsége. A szintézis során olyan aminosavszármazékokat használunk, melyek nukleofil oldalláncaikon állandó védőcsoportokkal, az α-nh 2 csoportjaikon pedig átmeneti védőcsoportokkal vannak ellátva. Egy aminosav kapcsolása előtt az előző aminosavszármazékról az átmeneti N α - védőcsoportot eltávolítjuk és a kapcsolni kívánt aminosavszármazék karboxil-terminálisát aktiváljuk. A kész peptidet lehasítjuk a hordozóról, és ezzel egy időben távolítjuk el az állandó oldallánc védőcsoportokat is. A szilárdfázisú módszer nagy előnye, hogy az aminosavakat és egyéb reagenseket a reakció végén egyszerű szűréssel el lehet távolítani. A lehasított peptid oldatát szintén szűréssel lehet megkapni. Az oldatból a peptid hosszadalmas tisztítási lépések mellőzésével, viszonylag tisztán különíthető el. A szilárdfázisú peptidszintézisnek két, széles körben elterjedt stratégiája van, a terc-butiloxikarbonil/benzil (Boc/Bzl) módszer és a 9-fluorenilmetiloxikarbonil/terc-butil (Fmoc/tBu) módszer. 4.1.1. A Boc/Bzl módszer A Boc/Bzl módszer a különböző erősségű savakra érzékeny (átmeneti) és kevésbé érzékeny (állandó) védőcsoportokon alapul. A terc-butiloxikarbonil (Boc) védőcsoport lúgokkal és nukleofil reagensekkel szemben stabil, de szervetlen vagy szerves savakkal eltávolítható [55]. Hasítóelegyként 33% trifluorecetsav (TFA) / 67% DCM V/V elegyet alkalmazunk. Mivel az acidolízis során az N α -aminocsoport trifluoracetát sója jön létre, ezért a hasítás után semlegesítenünk kell. Ekkor tercier-amin hatására jön létre a szabad N α - aminocsoport. Semlegesítő elegyként a 10% diizopropiletilamin (DIEA) / 90% DCM V/V elegyét használjuk. A Boc/Bzl módszernél az oldallánc védőcsoportok a benzil-alkohol éter-, 24

észter- ill. uretán- származékai [56]. Ezek az oldallánc védőcsoportok csak erős savak jelenlétében hasíthatóak, tehát a Boc-csoport lehasítása során stabilak maradnak. A szilárd hordozóról a peptidet és az oldallánc védőcsoportokat hidrogén-fluorid (HF) segítségével távolítottuk el, teflon készülékben, gyökfogók jelenlétében. 4.1.2. Az Fmoc/tBu módszer Az Fmoc/tBu szintézis stratégia kiküszöböli a Boc/Bzl stratégia hátrányait: 1. az állandó és átmeneti védőcsoportok is savérzékenyek, 2. a speciális készüléket igénylő HF alkalmazása [57]. Ezen módszer esetében az aminosavszármazékok átmeneti védőcsoportja a 9-fluorenilmetiloxikarbonil-csoport (Fmoc), mely savakkal szemben stabil, bázisokkal szemben viszont labilis. A hasítást 2% piperidin / 2% DBU / 96% DMF V/V hasítóelegyével végezzük. A hasítás során dibenzofulvén átmeneti termék keletkezik, mely reaktív, de a piperidinnel stabil adduktot képez, ezáltal elkerülhetőek az alkileződési mellékreakciók. Bizonyos peptidszekvenciák esetében a kísérletek azt igazolták, hogy a 2% piperidint és 2% 1,8-diazabiciklo[5.4.0]-undek-7-ént (DBU) tartalmazó eleggyel gyors, hatékony hasítás érhető el, ezen kívül csökkenthető az enantiomerizáció valószínűsége és nagyobb az effektív hasítás mértéke térbeli gátlás esetén [58-60]. Az állandó oldallánc védőcsoportok (tbu, OtBu, Boc, Trt, stb.) hasítása és a peptidek gyantáról való eltávolítása általában TFA-val történik [56]. Mivel a hasítás során reaktív karbokationok keletkeznek, gyökfogók használata szükséges. 4.1.3 A peptidkötés kialakítása a szintézis során A peptidkötést a gyantához kötött szabad N-terminálisú aminosav vagy peptid és a karboxilcsoportján aktivált és aminocsoportján védett aminosavszármazék között alakítjuk ki. A kapcsolás in situ aktív észter kialakításával történik. A használt kapcsolószerek a DIC és a HOBt. A DIC O-acil-izourea származékot képez az aminosavszármazék karboxilcsoportjával és ez acilezi a szabad aminocsoportot HOBt jelenléte nélkül, N,N -diizopropil-urea képződése mellett. A karbodiimidek felhasználhatók aktív észterek kialakításhoz is, amelyeket in situ a reakcióelegyben 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) segítségével alakítanak ki. Ezáltal gyors kapcsolás érhető el és az aszparagin és glutamin esetében a dehidratáció megelőzhető [61, 62]. 25

4.1.4. A kapcsolási reakciók követése A kapcsolás és védőcsoport eltávolítás végbemenetelét Kaiser (ninhidrin)-próba és izatin-próba segítségével ellenőrizzük [63]. Kaiser-próba a szabad amino-terminálissal rendelkező (primer aminocsoport) aminosav- és peptidszármazékok kimutatására alkalmas. A keletkező vegyület sötét ibolya színű (abszorpciós λ max = 570 nm) primer aminocsoportot tartalmazó α-aminosavak esetén (12. ábra). A szekunder aminocsoportot tartalmazó prolin esetében a keletkező vegyület sárga színű (abszorpciós λ max = 440 nm), ezért a szilárdfázisú peptidszintézisnél alkalmazott gyanták szintén sárga színe miatt nem érzékelhető. Az izatinpróba a szabad iminocsoportok jelenlétét jelzi [64], ezt alkalmazzuk a prolin N-terminálisának védőcsoport eltávolításának ellenőrzésére, valamint a prolin utáni aminosav kapcsolás sikerességének ellenőrzésére. O OH O OH 2 O OH + H 2 N CH R COOH -3 H 2 O -CO 2 -RCHO O N O 12. ábra: A ninhidrin a primer aminocsoportot tartalmazó α-aminosavakkal a fenti reakcióba lép, a keletkező vegyület sötét ibolya színű 4.2. Szintetikus peptidekben a cisztein oxidációs állapotának meghatározása Sok esetben a konjugátumokban a hordozót és a spacerpeptidet, vagy a hatóanyag származékot tioéterkötésen keresztül kapcsoljuk egymáshoz. A tioéterkötés kialakítását a cisztein tiolcsoportja és egy haloacetilezett csoport között végezzük. A szintetikus peptidek cisztein tartalmának meghatározására a klasszikus aminosavanalízis módszere nem mindig alkalmas, mert a cisztein a hidrolízis során cisztinné oxidálódhat. A megfelelő jellemezhetőség érdekében pontosan ismernünk kell az adott vegyületben a cisztein oxidációs állapotát. Az oxidáció a szintézis vagy a peptid tárolása során is bekövetkezhet, így nem lehet megállapítani, hogy az oxidáció az analízis előtt vagy után történt. További probléma a cisztein meghatározásánál az ioncserélő kromatográfiás elválasztást követő ninhidrines származékképzés alapú módszer esetén, hogy a cisztein és a prolin retenciós ideje közel azonos. Ezen problémák miatt szükséges egy módszer a szintetikus cisztein tartalmú peptidek szabad tiolcsoportjának mérésére. Erre a célra megfelelőnek bizonyult a szabad tiolcsoport és az N-etilmaleimid (NEM) reakciója (13. ábra). A reakció rövid idő alatt, 26

semleges vagy enyhén bázisos közegben végbemegy. A peptidet N-etilmaleimiddel reagáltatva stabil S-(N-etilszukcinimido)-származék keletkezik, mely molekula RP-HPLC körülmények között elválasztható a kiindulási peptidtől, és tömegspektrométerrel azonosítható. A kvantitatív meghatározáshoz kevesebb, mint 0,1 µm peptid elegendő [65]. O O H 2 C SH + N Et PBS ph 7,0 H 2 C S -NHCHCO- -NHCHCO- N Et O O cisztein oldallánc N-etilmaleimid S-(N-etilszukcinimido)-szár mazék 13. ábra: N-etilmaleimid reakciója ciszteintartalmú peptiddel 4.3. Minimális gátló koncentráció és telepszám meghatározása Az antibiotikumok hatásának kvantitatív jellemzésére a minimális gátló koncentráció (minimal inhibitory concentration, MIC) meghatározása szolgál. A MIC az a legkisebb hatóanyag mennyiség, amely 1ml térfogatban gátolja a baktériumtörzs szaporodását. Mértékegysége µg/ml, mg/l. A MIC érték meghatározását folyékony táptalajban ún. hígításos leves módszerrel végezzük, ahol az adott antibiotikumra nézve csökkenő koncentrációjú csöveket befertőzzük a baktérium megfelelő sűrűségű szuszpenziójával [2]. A minimális gátló szintet annak a csőnek a vegyület koncentrációja jelenti, amelyben a kellő időtartamú inkubálás után szabad szemmel még nem észleltünk növekedést. A minimális gátló koncentráció értéke függ az alkalmazott táptalajtól, a táptalaj ph értékétől, az inokulum (az oltáshoz felhasznált mikróba-sejttömeg) kolónia számától, az inkubáció hőmérsékletétől, atmoszférájától és időtartamától. A baktériumok esetében ez a jelenség a mikroszervezetek gyors adaptív tulajdonságával magyarázható, nem örökletes, modifikatív sajátság. A MIC leolvasást követően a baktériumnövekedést nem mutató csövekből szilárd táptalajra való kioltással meghatározható a telepszám (colony forming unit, CFU). A telepszámlálásos módszerek alkalmazhatóságának alapfeltétele, hogy a táptalajokon kinőtt telepek egyetlen sejt szaporodásából származzanak, és a telepek számolhatók legyenek, vagyis a cél olyan lemeztenyészetek előállítása, amelyen az egyedülálló telepek száma 10-300 közötti. A CFU/ml érték megadja, az adott minta esetében, az egységnyi térfogatban jelenlévő életképes sejtek közelítő számát, amelyekből a számolható telepek kifejlődtek. A módszer lényegét a 14. ábra foglalja össze. 27

14. ábra: Minimális gátló koncentráció (MIC) és telepszám (CFU) meghatározásának sematikus vázlata 28

4.4. Az áramlási citometria Az áramlási citometria [66] alkalmazásával egyszerre mérhető önálló részecskék és sejtek fényszórási és fluoreszcens tulajdonsága. A mérhető sejtek vagy részecskék átmérője körülbelül 0,2 µm és 150 µm közé esik. Az áramlási citométer vázlatos felépítését mutatja be a 15. ábra. folyadékrendszer optikai rendszer elektronika lézer detektorok 15. ábra: Egy áramlási citométer vázlatos felépítése, forrás: http://probes.invitrogen.com Az áramlási citométer több lézert is tartalmazhat. Ezek lehetnek szilárdtest lézerek (355 nm, 405 nm, 488 nm) és gázlézerek (633 nm). A készülékben folyadékáram továbbítja a sejteket. A hidrodinamikai fókuszálás biztosítja, hogy a sejtek vékony sugárban, egymás után haladjanak és a lézersugár egyenként világítsa meg őket. A sejtek a lézersugár elé kerülve kölcsönhatásba lépnek azzal, a lézersugár fénye részben szóródik, részben a sejtek előre megfestett molekuláiból fénykibocsátást vált ki (16. ábra). Az ún. előre irányuló fényszórás (forward scatter, FSC) a sejt relatív méretéről, míg az oldalra irányuló fényszórás (side scatter, SSC) a relatív granuláltságáról, belső komplexitásáról ad információt. A fluoreszcencia intenzitásból fluoreszcens anyagok, vagy fluoreszcens jelzéssel ellátott vegyületek sejtbejutásáról kapunk információt. A sejtekben jelen vannak fluoreszcens sajátságú molekulák (aminosavak, porfinvázas vegyületek, nukleinsavak, klorofill stb.), ezek 29

adják a sejtek autofluoreszcenciáját, melyet az áramlási citométerrel detektálni lehet. A legtöbb esetben a részecskéket és a sejteket ún. fluoreszcens festéssel teszik láthatóvá a citométer számára. A megfelelő fluoreszcens festék (fluorofór) kiválasztása függ az alkalmazott megvilágítás hullámhosszától, a fluorofórok abszorpciós és emissziós tulajdonságától. A sejtek és a lézerfény kölcsönhatása következtében emittálódó fényt az optikai rendszer segítségével továbbítják a megfelelő detektorok felé. A sejtek autofluoreszcenciájához viszonyítva a fluoreszcensen jelölt peptidszármazékok felvételének mértéke detektálható. Fluoreszcens jelölésre sokféle fluorofór használatos. A leggyakrabban használt az 5(6)-karboxifluoreszcein, a karboxirodamin, és ezek izotiocianát és szukcinimidil-észter származékai. Elterjedtek még pl. danzilklorid, fluoreszkamin, o-ftálaldehid, 9-fluorenilmetiloxikarbonil (Fmoc), kumarinszármazékok, nitrobenzofurán származékok [67-70]. előre irányuló szórás oldalirányú szórás fluoreszcencia 16. ábra: Egy sejt kölcsönhatása a lézersugárral, forrás: http://probes.invitrogen.com 30

5. A KÍSÉRLETI MUNKA 5.1. A peptidek és peptidszármazékok szintézise A következő szekvenciájú peptidamidokat állítottam elő manuális szilárdfázisú szintézissel: H-GFLGC-NH 2, és H-[TKPKG] 2 C-NH 2. A H-GFLGC-NH 2 peptidet Boc/Bzl stratégia, a H-[TKPKG] 2 C-NH 2 peptidet Fmoc/tBu stratégia alkalmazásával szintetizáltam. 5.1.1. A H-GFLGC-NH 2 peptidamid és származékainak szintézise Boc/Bzl stratégiával A szintézishez 4-metilbenzhidrilamin (MBHA, kapacitása: 1,2 mmol/g) gyantát használtam, az aminosavakat N α -Boc-származék formájában kapcsoltam. A felhasznált Bocaminosavak közül csak a cisztein oldalláncán volt védőcsoport: 4-metilbenzil-védőcsoport (4- MeBzl). Az MBHA gyanta hidroklorid formában kerül kereskedelmi forgalomba, ezért a gyantát a DCM-ben történő duzzasztás után 33% TFA / 67% DCM V/V hasítóelegyével kezeltem 5 + 30 percig, majd a DCM-mel való ötszöri mosást követően 10% DIEA / 90% DCM V/V elegyével 5 x 1 percig semlegesítettem, ezután újból mostam ötször DCM-mel. A gyantához az előkezelés után kapcsoltam az első Boc-aminosav származékot, a Boc-Cys(4-MeBzl)- OH-t. A gyantakapacitásra számolva háromszoros moláris feleslegben adtam az aminosavszármazékot, és az in situ aktív észter kialakításához szükséges kapcsolószereket (DIC, HOBt) DCM-ben oldva. Az egy órás kapcsolási idő lejárta után DCM-es mosási lépés következett. Ezután Kaiser-próbával ellenőriztem a kapcsolás sikerességét. Pozitív Kaiserpróba esetén a kapcsolást meg kell ismételni. A Boc-védőcsoportot minden esetben a gyanta előkezelésénél leírt hasítóeleggyel (33% TFA / 67% DCM V/V) távolítottam el, majd a DCM-mel való mosást követően semlegesítettem 10% DIEA / 90% DCM V/V eleggyel. A szintézis egy ciklusának menetét a 2. táblázat foglalja össze. 31