Az élettudományi-klinikai felsőoktatás gyakorlatorientált és hallgatóbarát korszerűsítése a vidéki képzőhelyek nemzetközi versenyképességének erősítésére TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 REKOMBINÁNS FEHÉRJÉK IPARI MÉRETŰ ELŐÁLLÍTÁSA I. 6. előadás PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEM ÁLTALÁNOS ORVOSTUDOMÁNYI KAR GYÓGYSZERÉSZI BIOTECHNOLÓGIA TANSZÉK
A REKOMBINÁNS FEHÉRJÉK IPARI ELŐÁLLÍTÁSÁNAK FŐ LÉPÉSEI: TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Az előállítani kívánt fehérje klónozása Az ideális expressziós vektor kiválasztása Az expressziós biológiai rendszer optimalizálása Bioreaktorok/fermentorok beállítása A rekombináns fehérjék kémiai és/vagy enzimatikus módosítása Tisztítás Tesztelés, minőségbiztosítás
A REKOMBINÁNS FEHÉRJÉK IPARI ELŐÁLLÍTÁSÁNAK ALAPJA A FEHÉRJE KLÓNOZÁSA
TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 KLÓNOZÁS ÖSSZEFOGLALÓ LÉPESEI: Plazmid DNS Beillesztett DNS A plazmid a baktériumban felszaporodik A plazmid DNS szekvencia Felnyitása endonukleázzal A DNS szekvencia beillesztése, ligálása Baktérium transzformálás Baktérium kolóniák Számos DNS kópia
A FEHÉRJE TULAJDONSÁGAINAK MÓDOSÍTÁSA
TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 FEHÉRJE MÓDOSÍTÁSOK Diszulfidhidak szerkezet stabilizálása Hőstabilitás növelése aszparagin, glutamin oldalláncok lecserélése (pl. treoninra, izoleucinra) Intermolekuláris diszulfidhidak létrejöttének gátlása az enzim felszínén lévő cisztein oldalláncok pl. szerinre cserélése Proteáz hasító helyek megszüntetése
HOGYAN CSÖKKENTSÜK A MAKROMOLEKULÁK MÉRETÉT A SZÖVETBE ÉS SEJTBE VALÓ BEJUTÁS ÉRDEKÉBEN TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Ismernünk kell a fehérje működési folyamatát Ismernünk kell a fehérje minimális funkcionális egységét Az előállításakor csak a minimális funkcionális szakaszt kell klónozzuk, vagy az egész molekula előállítása után enzimatikusan méretre vágjuk
PROTEÁZ-REZISZTENS MINIMÁLIS MÉRETŰ KÖTŐHELY TERVEZÉSE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 A proteáz hasítóhelyének ismeretében, megváltoztathatjuk a fehérje szekvenciáját úgy, hogy a proteáz ne tudja hasítani, de a fehérje aktív helye funkcióképes maradjon Szubsztrát Hasító hely N-terminus C-terminus Proteáz aktív hely
DOMAIN MÓDOSÍTÁS A GYÓGYSZERHATÁS NÖVELÉSE ÉRDEKÉBEN TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Aminosav szekvencia módosítás Poszttranszlációs módosítás
TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 CÉLZOTT MUTAGENEZIS (A) DNS lánc szintézise Mismatch Mismatch Egy-láncú DNS A mismatched Oligonukleotid hozzákötése Lánc szintézis Kettős-láncú DNS (B) Mutáns fágok azonosítása Blot, próba Fertőzött E. coli Bakteriofágok kiszélesztése, hogy plaque-k keletkezzenek Hibridizáció szignál mutáns fág plaque
CÉLZOTT MUTAGENEZIS SZÁMOS MÓDSZERREL KIVITELEZHETŐ TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Delíció Inzerció Indukált mutáció (1 vagy több aminósav cseréje)
AZ EXPRESSZIÓS RENDSZER MEGVÁLASZTÁSA
TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 AZ IDEÁLIS EXPRESSZIÓS RENDSZER KIVÁLASZTÁSA Expressziós rendszer Sejtmentes Bakteriális Élesztő Alga Rovar Emlős Előnyei Növelhető lépték Egyszerű Gyors expresszió, direkt a plazmidból Nyitott rendszer easily add components to enhance solubility or functionality Növelhető lépték Alacsony ár Egyszerű Eukarióta fehérjék Méret/mennyiség növelhető fermentációval (grams/ liter) Egyszerű médium Genetikai módosítás és expressziós rendszer fotoszintetikus mikroalgák számára Tökéletes kísérletes kontroll biohajtóanyagok, stb számára Optimális rendszer erőteljes és stabil szelekcióra és expresszióra Postranslational modifications similar to mammalian systems Nagyobb kitermelés, mint emlős rendszerekben Korrekt poszt-transzlációs módosulás A legvalószínűbb, hogy működőképes emberi fehérjét állít elő Problémái Nagy mennyiségű expresszió > 3 mg Protein oldhatóság Minimális poszttranszlációs módosulás Sokszor nehéz funkcionális emlős fehérjéket expresszáltatni Fermentáció szükséges a magas kitermelés elérésére Növekedési kondíciók optimalizálást igényelnek Nehezen előállítható tenyésztési körülmények Multimilligram/ liter kitermelés csak szuszpenziós kultúrákban érhetők el Nehezen optimalizálható tenyésztési körülmények
SEJTTENYÉSZTÉS IPARI MÉRETEKBEN
BIOREAKTOROK/FERMENTOROK ÁLTALÁNOS JELLEMZŐI TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Lehetőleg egyszerű tervezésű Ne legyenek benne a tisztítást nehezítő alkatrészek, könnyen sterilizálhatók legyenek Könnyen szétszedhető és összerakható legyen Biokompatibilis és biointer anyagok használata (ne legyen benne króm vagy rozsdamentes acél) Hő és alkoholos sterilizálást illetve a párás atmoszférát jól tűrje Műszeres ellenőrzés lehetséges legyen (pl hőmérő, ph mérő, pumpák, rotorok, stb)
TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 FERMENTOROKKAL SZEMBENI ELVÁRÁSOK Az ipari gyakorlatban két fő típus: Keverő tartályos (levegő bevezetés, gázbeporlasztás is lehetséges), használatuk: aerob és anaerob fermentációkhoz Buborékoltatott oszlopok (torony fermentorok), levegőliftes fermentorok (kizárólag az aerob fermentáció) Meghatározó működési paraméterei: a keverő tartályosban a keverő fordulatszáma és a levegőztetési arány, a buborékoltatott oszlopoknál egyedül a levegőztetési sebesség határozza meg a folyadék keveredését Térfogat: A keverttank fermentorok néhány száz köbméteres
FORGÓEDÉNYES BIOREAKTOROK EUKARIÓTA SEJTEK SZÁMÁRA TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Folyadék forgatás Sejtek nem ülepednek le Fixált vázelemeken ülő sejtek Növeli a sejtek vázra tapadását Forgási sebesség 60 80 rpm Térfogat 120 8000 ml 50% médium csere 2 naponként Szövetvastagság 0,5 mm érhető el a fentiek mellett primer szövetek esetében
IPARI BIOREAKTOR SZERKEZETÉNEK SEMATIKUS ÁBRÁZOLÁSA TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Sav Habzás gátló Szubsztrát Bázis Perisztaltikus pumpa Víz be Melegítő edény Ellennyomás szelep Pumpa Hab T ph po 2 Folyamat szabályzó Biztonsági szelep Electromágneses szelep hűtésre Víz ki Q szelep Irányító elektronika Q Levegő
FEHÉRJÉK KINYERÉSE A TERMELŐ SEJTEKBŐL
TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 FEHÉRJÉK KINYERÉSE I. Baktérium (avagy más organizmus) sejtek feltárása: ozmotikus sokk, kevertetés, stb A sejtfeltárás nyomon követése: fehérjetartalom, enzimaktivitás és vezetőképesség mérése Fermentlé szűrése optimálizált transzmembrán nyomással Fehérjék tisztítása vizes fázisú, egymással nem elegyedő hidrofil polimerek segítségével (PEG és dextrán)
TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 FEHÉRJÉK KINYERÉSE II. Kromatográfiás tisztítás: affinitás és ioncserélő kromatográfiák (FPLC, HPLC) Reverzfázisú HPLC a tisztulás nyomon követése Extrakció Szűrés Bepárlás Szárítószerrel történő szárítás Derítés Kristályosítás/vagy steril oldat készítése Funkcionális analízis
TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 MINŐSÉGBIZTOSÍTÁS ÉS ELLENŐRZÉS A minőségellenőrzés minden ipari lépésnél elengedhetetlen A minőség a termelt fehérje mennyiségére és funkcióképességére is vonatkozik Bármelyik lépés hibás, a termélés leállítása szükséges
KÖSZÖNÖM A FIGYELMET JELEN MUNKA AZ EURÓPAI UNIÓ TÁMOGATÁSÁVAL, AZ EURÓPAI SZOCIÁLIS ALAP TÁRSFINANSZÍROZÁSÁVAL VALÓSUL MEG, AZ ÉLETTUDOMÁNYI-KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE CÍMŰ, TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 AZONOSÍTÓSZÁMÚ PROJEKT KERETÉBEN.