Spermiumok aneuploidiájának vizsgálata fluoreszcens in situ hibridizációval kóros spermalelettel rendelkezô férfiaknál

GENETIKA Magyar Nôorvosok Lapja 69, 309 316 (2006) Spermiumok aneuploidiájának vizsgálata fluoreszcens in situ hibridizációval kóros spermalelettel rendelkezô férfiaknál KÉKESI ANNA 1, ERDEI EDIT DR. 2, DÉVAI ISTVÁN DR. 3, TÓTH ANDRÁS DR. 1 Országos Gyógyintézeti Központ, Szülészet és Nôgyógyászati Osztály (vezetô: Török Miklós dr. osztályvezetô fôorvos) 1 ; Országos Gyógyintézeti Központ, Andrológiai és Urológiai Osztály (vezetô: Papp György dr. egyetemi tanár) 2 ; Dévai Intézet (igazgató: Dévai István dr.) 3 közleménye Összefoglalás: Tanulmányunk célja az aneuploidia és diploidia gyakoriságának vizsgálata infertilis férfiak spermiumaiban. Az így kapott értékek összehasonlításra kerültek az egészséges, normozoospermiás kontroll donorokéval. Munkánk során 64 meddô férfi hímivarsejtjeinek genetikai analízisét végeztük el, melynek során a 18, X és Y kromoszómákat tanulmányoztuk fluoreszcens in situ hibridizációval (FISH). További 9 infertilis férfi esetében pedig a 13-as és 21-es kromoszómák aneuploidiáját és diploidiáját vizsgáltuk. A kontroll csoport 8 normozoospermiás férfibôl állt. Esetükben a 13, 18, 21, X és Y kromoszómák analízisét végeztük el. Csak olyan betegeket vizsgáltunk, akiknél ép, 46,XY karyotípust diagnosztizáltunk. Kerestük, van-e összefüggés a spermiumparaméterek (spermium-koncentráció, motilitás, morfológia) és az aneuploidiák elôfordulása között. Eredményeink szerint a vizsgált kromoszómákra nézve a meddô férfiak diszómia- és diploidia-értékei a kontroll donorokéhoz viszonyítva szignifikánsan magasabbak voltak. A spermium-koncentrációt, motilitást és morfológiát tekintve nem találtunk szignifikáns összefüggést a vizsgált diszómiákra vonatkozóan. A betegek többségénél a spermiumok kromoszóma-rendellenességeinek aránya nem emelkedett olyan mértékben, amely további teendôket igényelne. Abban a kevés beteget magába foglaló csoportban azonban, ahol a diszómia-értékek extrémen magasnak bizonyultak, jelentôsen megnô a rendellenes magzatok létrejöttének valószínûsége. Számukra prenatális diagnosztika vagy, lehetôség szerint, preimplantációs genetikai analízis javasolt. Kulcsszavak: férfimeddôség, genetika, FISH, kromoszóma, asszisztált reprodukció Becslések szerint a meddôség 30%-ban genetikai eredetû [1]. Az infertilitás okaként különbözô kromoszóma-anomáliák szerepelhetnek, mint reciprok transzlokáció, Robertsontranszlokáció vagy Klinefelter-szindróma [2]. Ezek a kromoszóma-anomáliák a beteg perifériás vérébôl diagnosztizálhatók, ezért kóros spermalelet megállapításakor a vérbôl történô citogenetikai vizsgálat indokolt. Az intracitoplazmatikus spermiuminjektálás (ICSI) bevezetésével lehetôvé vált, hogy súlyos oligozoospermia, esetenként azoospermia mellett Magyar Nôorvosok Lapja 69 (4) 2006. 309

is eredményt érjünk el, azonban az ICSI segítségével létrejött terhességek aránya is csak 30 50% [2]. A sikertelen ICSI ciklusoknak számos oka lehet, többek között a petesejt vagy spermium genetikai rendellenességei. Az oocyták tanulmányozása nehézségekbe ütközik, a hímivarsejtek vizsgálata azonban könnyebben kivitelezhetô. Az ép karytotípussal rendelkezô infertilis férfiaknál a meiózisban elôforduló zavarok miatt egyrészt a spermatogenezis valamilyen szintû károsodása lép fel, amely kóros spermaképet eredményez, másrészt nagyobb arányban található a hímivarsejtekben aneuploidia (számbeli kromoszóma-rendellenesség). Az aneuploidia elôfordulása igen gyakori az embernél születéskori aránya 0,3%, a halvaszülötteknél 4% és a spontán vetéléseknél 35% [3]. A legtöbb kromoszóma-anomália letális, és spontán vetélést idéz elô. Ez az asszisztált reprodukciós technikáknál mint sikertelen beavatkozás jelentkezik. Kisebb arányban azonban az érintett magzatok túlélhetik a terhességet, és többnyire súlyos fejlôdési rendellenességekkel születnek meg. A fentiek miatt rendkívül fontos minden olyan vizsgálat, amely a kromoszóma-eltérések esélyének megállapítását és a születendô gyermek egészségének biztosítását szolgálja. Az aneuploidiák elôfordulását csak közvetlenül az ivarsejtekbôl lehet kimutatni. A spermiumok citogenetikai vizsgálatára kezdetben az ún. aranyhörcsögpete-penetrációs tesztet alkalmazták [4]. A módszer lényege az, hogy megfelelô elôkezelés után az aranyhörcsög-petesejt megtermékenyíthetô a humán spermiummal. Néhány órával a megtermékenyítés után, még a pronukleuszok egyesülése elôtt, vizsgálhatók a humán kromoszómák. A módszer számos hátránya miatt az utóbbi idôben a spermiumok fluoreszcens in situ hibridizációját (FISH) alkalmazzák [5, 6]. Ennek során jelölt kromoszóma-specifikus DNS-szakaszok (szondák) segítségével a spermiumokban azonosíthatóak a vizsgált kromoszómák. A módszer révén viszonylag egyszerû eljárással nagyszámú, statisztikailag értékelhetô spermium analizálható. Jelen tanulmányunkban a már korábban elkezdett [7 ] vizsgálatainkat folytatjuk. Anyag és módszer Az ejakulátumminták hetvenegy 26 és 60 év közötti infertilis férfitól, valamint nyolc, egészséges, normozoospermiás kontroll donortól származtak. A 71 esetbôl háromnál az extrémen alacsony spermiumkoncentráció a FISH vizsgálat elvégzését nem tette lehetôvé. 5 betegünknél egy- vagy kétoldali varicocelét diagnosztizáltunk, 25 betegünknél legalább három sikertelen ICSI beavatkozást végeztek, 2 betegünk felesége habituális vetélô volt, ketten pedig kemoterápiás kezelésen estek át. Az infertilis csoport 43,7%-nál oligo-astheno-teratozoospermiát (OATS-t), 31%-nál astheno-teratozoospermiát (ATS-t), 11,2%-nál oligo-asthenozoospermiát (OAS-t), 5,7%-nál oligo-teratozoospermiát (OTS-t), 4,2%-nál teratozoospermiát (TS-t), ugyancsak 4,2%-nál asthenozoospermiát (AS-t) diagnosztizáltunk. A betegek 48%-ánál 10 millió/ml alatt, 14%-ánál 10 és 20 millió/ml között, 38%-ánál pedig 20 millió felett találtuk a spemium-koncentrációt. Az ép morfológiájú ivarsejtek átlaga 14%, a motilis spermiumoké (progresszív gyors és lassú) pedig 19,1% volt. A vizsgált férfiak mindegyikénél a perifériás vér limfocitáiból végzett kromoszóma-tenyésztéssel ép, 46,XY karyotípust állapítottunk meg. A spermiumok elôkészítése a korábban közölt módon történt [7]. A preparátumok elôkezelése esetenként változó volt, függött a minta tisztaságától. Amennyiben szükség volt rá, 0,01M-os pepszines elôkezelést alkalmaztunk. Kromoszóma-specifikus DNS-szondák A spermiumok FISH-sel történô vizsgálatához a Vysis cég Aneu Vysion EC direkt jelölt próbakomplexét használtuk az alábbi DNS-próbákkal: a 13-as valamint a 21-es kromoszómák unikális régióira (13q14 valamint 21q22.13, 21q22.2) specifikus LSI 13 Spectrum Green/ 21 Spectrum Orange és a 18, X és Y kromoszómák centromerikus régiójára specifikus α szatellita (CEP 18 Spectrum Aqua/ X Spectrum Green/ Y Spectrum Orange), 1. ábra. 1.ábra Spermiumok FISH vizsgálata 18, X és Y (CEP18/X/Y) kromoszómákra specifikus DNS-próbákkal a) Y kromoszómára nézve diszóm spermium sejtmagja: 18/Y/Y (kék/piros/piros) b) 18 (kék) és X (zöld) kromoszómát tartalmazó normál spermium sejtmagja c) e) 18 (kék) és Y (piros) kromoszómát tartalmazó normál spermium sejtmagja d) Ivari kromoszómákra nézve nulliszóm sejtmag, amely csak 18-as (kék) kromoszómát tartalmaz, X-et vagy Y-t nem 310 Magyar Nôorvosok Lapja 69 (4) 2006.

A kétpróbás FISH-hez a 13-as kromoszómát állítottuk szembe a 21-essel (LSI13/21), a hárompróbás FISH esetében pedig a 18, X és Y kromoszómákat vizsgáltuk egy idôben (CEP18/X/Y). Fluoreszcens in situ hibridizáció A mintát formamid-2xssc 7:3 elegyében 4 percig 72 C-on denaturáltuk. A hibridizációs elegy tárgylemezre cseppentése után a preparátumot 15 17 órán keresztül nedves kamrában, 37 C-on inkubáltuk. A hibridizációt követôen 0,4xSSC/0,3% NP-40 (ph: 6,8 7,0) oldatban 2 percig 73 C-on, majd 2xSSC/0,1% NP-40- ben 1 percig mostuk. Háttérfestéknek 4,6 diaminido-2- fenilindolt (DAPI-t) használtunk. A spermiumok értékelése A kiértékelés Nikon Eclipse E-400 epifluoreszcens mikroszkóppal, négy szûrô segítségével (DAPI/green/orange/aqua) történt. A DAPI szûrôvel azonosítottuk be az analizálni kívánt spermiumokat, a Spectrum Green szûrôvel vizsgáltuk a 13-as, valamint az X kromoszómát, a Spectrum Orange-zsal a 21-es és az Y kromoszómákat, végül Spectrum Aquával a 18-as kromoszómát. Az infertilis csoportban mintánként minimum ezer spermiumot értékeltünk ki, a kontroll donorok esetében pedig egyénenként legalább kétezret. Esetenként nagyobb számú ivarsejt kiértékelését a technikai körülmények nem tették lehetôvé, ugyanis nem állt módunkban automata sejtszámláló használata. A kiértékelést az infertilis csoport esetében sokszor az alacsony spermiumkoncentráció is nehezítette. Egy adott kromoszómára nézve monoszómiásnak akkor tekintettünk egy spermiumot, ha egy spermiumfejben csak egy fluoreszcens jelet találtunk, diszómnak, ha két ugyanolyan színû és méretû szignált láttunk, melyek távolsága legalább egy szignálnyi volt. Ellenkezô esetben hasadt jelrôl lehetett szó, amely csak egy kromoszómát jelölt. Kétpróbás FISH esetén diploidnak akkor tekintettük a hímivarsejtet, ha mindkét kromoszómára specifikus, két különbözô színû szignálból kettôt találtunk egy spermiumfejben. Az értékelésbôl kizártuk azokat az ivarsejteket, melyek fejei átfedésben voltak egymással. Nem értékeltük azokat sem, amelyek elvesztették a farkukat vagy a kromatin dekondenzáltsága nem volt olyan fokú, hogy a DNS-hibridizáció sikeresen végbemenjen. Kizártuk az értékelésbôl azokat a spermiumokat is, ahol a kromoszóma-szignál hiányzott, ugyanis ilyenkor nem tudható biztosan, hogy hibridizációs hibáról van-e szó vagy az adott kromoszómá(kra) nézve nulliszóm-e a sejt. Eredmények Kontroll csoport A fertilis csoport 8 egészséges, normozoospermiás, ép karyotípusú, negatív anamnézisû férfiból állt, életkoruk 26 és 40 év között volt. Ebben a csoportban 32 621 spermiumot értékeltünk. A kontroll csoport diszómia- és diploidia-értékeit a 18, X és Y kromoszómákra nézve az I. táblázat, a 13. és 21. kromoszómákra nézve a II. táblázat szemlélteti. A 18. kromoszóma diszómia-frekvenciái 0 0,2%, a 13. kromoszómáé 0 0,25%, a 21. kromoszómáé 0,06 0,5% közötti értékeket mutat- A 18, X és Y kromoszómák diszómia- és diploidia-értékei normozoospermiás donorok spermiumai esetén (n=8) I. táblázat kontroll X Y 18/18 X/X Y/Y X/Y diploid kóros átlag (%) 49 50,4 0,09 0,067 0,05 0,06 0,14 0,4 szórás 1,86 1,9 0,08 0,06 0,04 0,07 0,14 0,17 intervallum (47,3 52) (47 53,2) (0 0,2) (0 0,18) (0 0,1) (0 0,2) (0,05 0,5) (0,2 0,7) A 13. és 21. kromoszómák diszómia- és diploidia-értékei normozoospermiás donorok spermiumai esetén (n=8) II. táblázat 13/21 13/13 21/21 diploid kóros átlag (%) 99,5 0,15 0,2 0,125 0,48 szórás 0,3 0,11 0,14 0,08 0,3 intervallum (99 99,84) (0 0,25) (0,06 0,5) (0 0,25) (0,16 1) Magyar Nôorvosok Lapja 69 (4) 2006. 311

Infertilis férfiak spermiumainak 18, X, Y kromoszómákra vizsgált diszómia- és diploidia-értékei (n=64) III. táblázat X Y 18/18 X/X Y/Y X/Y diploid kóros átlag (%) 49,3 49,31 0,3 0,23 0,33 0,2 0,3 1,36 szórás 1,8 1,85 0,32 0,22 0,25 0,2 0,23 0,86 intervallum (46,7 54) (46 53) (0 0,9) (0 0,8) (0 0,8) (0 1,9) (0 1,12) (0,3 5,6) Infertilis férfiak spermiumainak 13. és 21. kromoszómákra vizsgált diszómia- és diploidia-értékei (n=9) IV. táblázat 13/21 13/13 21/21 diploid kóros átlag (%) 98,65 0,4 0,65 0,4 1,41 szórás 0,71 0,22 0,42 0,3 0,4 intervallum (97,3-99,5) (0,15-0,8) (0,15-1,3) (0-0,7) (0,6-3,1) tak. Az ivari kromoszómákat tekintve az XX diszómia 0 0,18% között, az YY diszómia 0 0,1% között, az XY diszómia pedig 0 0,2% között volt. A 18, X, Y kromoszómákat vizsgálva a diploidia 0,05 0,5% közötti arányban fordult elô, a 13, 21 kromoszómákat vizsgálva pedig 0 0,25% között. Infertilis csoport A meddô férfiak átlagéletkora 36,4±8 év volt. Munkánk során összesen 103425 spermium genetikai analízisét végeztük el. Az infertilis férfiak diszómia- és diploidia-értékeit a 18, X és Y kromoszómákra nézve a III. táblázat, a 13. és 21. kromoszómákra nézve pedig a IV. táblázat foglalja össze. A 18. kromoszóma diszómiaértékei 0 0,9% között, a 13. kromoszómáé 0,15 0,8% között, a 21. kromoszómáé 0,15 1,3% között változtak. Az ivari kromoszómákat tekintve az XX, valamint az YY diszómia 0 0,8% között, az XY diszómia pedig 0 1,9% között volt. A 18, X, Y kromoszómákat vizsgálva a diploidia 0 1,12% között változott, míg a 13., 21. kromoszómákat vizsgálva 0 0,7% közötti értékeknek bizonyult. A meddô férfiakat ejakulátumadataik alapján a következô kategóriákba soroltuk: 1. normál spermium-koncentráció mellett kóros motilitás és morfológia (ATS), 2. normál morfológia mellett a spermium-koncentráció és/vagy motilitás volt a normálistól eltérô (OAS, AS), 3. normál motilitás mellett a spermium-koncentrációt és/vagy a morfológiát találtuk kórosnak (OTS, TS). Az infertilis férfiak csoportján belül a negyedik kategória az volt, ahol a spermium-koncentráció, morfológia és motilitás egyaránt eltért a WHO által meghatározott normál értékektôl (OATS). Vizsgáltuk továbbá a 6 millió/ml alatti spermiumkoncentrációval rendelkezô férfiakat és azokat a betegeket, akik ejakulátumában a mobilis hímivarsejtek aránya nem érte el a 6%-ot. A hat kategóriát a V. táblázat mutatja be. Az eredmények összehasonlítása A szignifikancia-vizsgálatot kétmintás, heteroszcedasztikus student-féle t próbával végeztük el. Összehasonlítva a kontroll és az infertilis csoport aneuploidia- és diploidia-értékeit, megállapítottuk, hogy a 18. kromoszóma diszómiaátlaga a meddô csoportban (0,3%) szignifikánsabban magasabb volt (p=0,05), mint a kontroll donoroknál (0,09%). A 13. kromoszóma diszómia-átlaga 0,4% valamint 0,15%-nak, a 21. kromoszóma diszómia-átlaga pedig 0,65%, illetve 0,2%-nak bizonyult az infertilis és a normozoospermiás csoportokban. A diszómia-értékek mindkét kromoszómát tekintve szignifikánsan magasabbak voltak az infertilis csoportban 312 Magyar Nôorvosok Lapja 69 (4) 2006.

Meddô férfiak 18, X és Y kromoszómákra vizsgált diszómiaés diploidia-értékei spermiumokban különbözô kategóriák szerint (%) V. táblázat 18/18 X/X Y/Y X/Y diploid kóros esetszám 1. ATS 0,25 0,21 0,37 0,16 0,26 1,30 20 2. OAS+AS 0,25 0,25 0,38 0,16 0,26 1,30 11 3. OTS+TS 0,40 0,18 0,33 0,18 0,26 1,35 7 4. OATS 0,35 0,25 0,28 0,24 0,30 1,42 26 5. <6 millió 0,31 0,25 0,38 0,26 0,25 1,45 17 6. <6% mot. 0,31 0,23 0,28 0,20 0,31 1,33 18 Infertilis férfiak 13., 21., 18, X, Y kromoszómákra vizsgált diszómiaértékei spermiumokban különbözô szerzôktôl (%) VI. táblázat 13/13 21/21 18/18 X/X Y/Y X/Y Finkelstein és mtsai (1998) 0,85 0,16 0,16 0,74 Rives és mtsai (1999) 0,32 0,50 0,51 0,20 0,24 0,54 Calogero és mtsai (2001) 0,39 0,33 0,31 0,15 Jelen közlemény 0,40 0,65 0,30 0,23 0,33 0,20 (p<0,02). Az ivari kromoszómák diszómia-átlagai XX 0,23% valamint 0,067%, YY 0,33% valamint 0,05%, XY 0,2% és 0,06%-nak bizonyult a meddô és a kontroll csoportokban. Az XX, valamint az YY diszómia szignifikánsan magasabb volt az infertilis csoportban (p<0,05), azonban nem találtunk szignifikáns statisztikai különbséget az XY diszómiák között (p=0,13). A diploidia-átlag 0,3% és 0,14% volt a 18. X és Y kromoszómákat tekintve, és 0,4% és 0,125% a 13. és 21-es kromoszómákra vizsgálva a meddô és a kontroll csoportban. Mindkét esetben szignifikánsan magasabbnak találtuk a diploidiát az infertilis csoportban (p<0,05). Az infertilis csoporton belül vizsgált hat kategóriát összehasonlítva megállapítottuk, hogy nincs szignifikáns összefüggés az aneuploidiák elôfordulása, valamint a motilitás, morfológia és a spermium-koncentráció között (p>0,2). Megbeszélés Munkánk célja olyan termékenységi problémákkal jelentkezett férfiak tanulmányozása volt, akik kóros spermium-paraméterekkel (spermium-koncentráció, motilitás, morfológia) és ép karyotípussal rendelkeztek. Vizsgáltuk, hogy az ô esetükben a hímivarsejtjeik aneuploidiára és diploidiára való hajlama magasabb-e a kontroll donorokénál. Tanulmányoztuk, hogy a kóros spermium-paraméterrel rendelkezô ivarsejtekben magasabb-e a kromoszomális anomáliák elôfordulása. Vizsgálataink azt igazolják, hogy az infertilis csoport kóros ivarsejtjeinek aránya (18., X, Y kromoszómákra nézve 1,36%; a 13. 21. kromoszómákat tekintve 1,41%) szignifikánsan magasabbnak (p<0,01) bizonyult, mint a kontroll csoport aneuploid ivarsejtjeinek aránya (18., X, Y: 0,4%; 13., 21: 0,48%). A különbség oka azzal magyarázható, hogy az infertilis férfiak spermiumaiban a meiózis során a kromoszómák párosodása az esetek egy részében nem a megfelelô módon megy végbe. Ez a hibás folyamat a sejtosztódás leállásához vezethet, ami oligozoospermiát eredményez. A párosodás rendellenessége mind az autoszómákat, mind az ivari kromoszómákat érintheti. Azoknál az ivarsejteknél, ahol végbemegy a spermatoge- Magyar Nôorvosok Lapja 69 (4) 2006. 313

nezis, nagyobb lehet az esély az aneuploidiára. Az ivari kromoszómák és a kisebb kromoszómák hajlamosabbak a nondiszjunkcióra, mivel köztük a meiózis folyamán csak egy átkeresztezôdés (crossing over) jön létre. Korábbi felmérések alapján, a nemi és a 21-es kromoszómákat kivéve, ugyanazon egyén spermiumaiban a kromoszómák aneuploidia-aránya hasonló [8]. Amennyiben a vizsgált 5 kromoszóma diszómia-értékeihez hasonlónak vesszük a többi kromoszóma diszómia-gyakoriságait is, az összes kromoszómára vonatkoztatott diszómia-elôfordulás a meddô férfiak esetében hozzávetôleg 14%, míg a kontroll csoportnál csupán 4%. Feltételezve, hogy a nulliszómiák gyakorisága egyezik a diszómiák elôfordulási arányával, eredményeink alapján megállapítható, hogy a teljes aneuploidia gyakorisága a meddô férfiak esetében átlagosan 28%, a normozoospermiás csoportban pedig 8%. Morel és mtsai [9] a kontroll csoport spermiumainak aneuploidiáját 8,5 9,5%-nak találták, míg Spriggs és mtsai [10] 6%-ra becsülték. Az infertilis csoportot tekintve a nemzetközi szakirodalomban közölt diszómia-frekvenciák hasonlóak a munkacsoportunk eredményeihez VI. táblázat [11 13]. Az infertilis férfiak hímivarsejtjeiben szignifikánsan magasabb az aneuploidiák és diploidiák elôfordulása, mint a fertilis csoport spermiumaiban. A természetes szelekció következtében a genetikailag kóros spermiumokból származó embriók jelentôs része a terhesség korai szakaszában elhal vagy spontán vetélés formájában távozik. A terhesség során késôbb már csak a viszonylag kevésbé súlyos következményekkel járó aneuploidiák fordulnak elô emelkedettebb arányban. Ilyenek pl. a 21-es, 18-as, 13-as kromoszómák triszómiái és a nemi kromszómák aneuploidiái, ezért az irodalomban [14] és a saját munkánkban is elsôsorban a fenti kromoszómákat vizsgáltuk. Felmerül a kérdés, hogy a genetikus és klinikus részérôl milyen további teendôket igényel az a pár, ahol a férfinél az ivarsejtek aneuploidiáját emelkedettnek találjuk. A vizsgált infertilis csoportból a 18.X, Y kromoszómákat tekintve 8 esetben találtuk jelentôsen emelkedettnek (2,2 5,6% között, átlag: 3,03%) a kóros genetikai állományú ivarsejtek arányát, aminek következtében az összes kromoszómára vonatkoztatva a becsült aneuploidia-gyakoriság 46,5%. Amennyiben ennyire emelkedett az aneuploidiák aránya a spermiumokban, prenatális diagnosztika vagy lehetôség szerint preimplantációs genetikai vizsgálat javasolt. Több kutatócsoport is kereste az összefüggést a spermiumok morfológiai paraméterei és az aneuploidia elôfordulása között. Celik és mtsai [15] morphometriai mérései szerint az aneuploid és haploid spermiumok között nincsen értékelhetô alaki és méretbeli különbség. A globozoospermia (kerek fejû spermiumok) esetén az acrosoma hiánya miatt a megtermékenyítés csak ICSI segítségével jöhet létre. Ezek a kóros spermiumok azonban az oocyta aktiválásában is károsodottak, ezért a sikeres ICSI beavatkozások aránya alacsonyabb. Egyes intézetekben Ca-ionkezeléssel próbálnak javítani a hatékonyságon, azonban óvatosságra int az a tény, hogy a kezelés esetleges teratogén hatására még nem rendelkezünk megfelelô számú adattal [16]. Egyértelmûnek látszik, hogy a globozoospermia kialakulásában genetikai tényezôk is szerepet játszanak, azonban az eltérés pontos genetikai háttere még nem tisztázott. A kerek fejû spermiumok aneuploidia-gyakoriságára vonatkozó irodalmi adatok ellentmondóak [17]. A spermiumok egy másik morfológiai eltérése a nagy méret lehet. A nagy fejû spermiumokra vonatkozóan egyértelmûen igazolták, hogy igen magas arányban társulnak diploidiával (a teljes kromoszómakészlet megduplázódásával) [17]. Saját anyagunkban a különbözô morfológiai eltérések és a kromoszóma-anomáliák közötti öszszefüggést nehéz volt tanulmányozni, mivel a spermaleletek többségében nem részletezték a fejeltérések fajtáit. Feltételezésünk szerint azért nem találtunk összefüggést, mert ilyen szempontból a vizsgált hímivarsejtek heterogén csoportot alkottak. Ugyanígy más spermium-paraméterek, pl. a koncentráció és a motilitás sincsenek összefüggésben az ivarsejt aneuploidiára való hajlamával. Ez azt jelenti, hogy a kevésbé mozgó vagy kóros morfológiájú hímivarsejt nem feltétlenül aneuploid, ami fordítva is igaz, mivel a normál morfológiájú vagy mozgású ivarsejt is hordozhat numerikus eltérést. Ryu és mtsai [2] az infertilis férfiak ép morfológiájú spermiumaiban szignifikánsan magasabb arányban találtak aneuploidokat a 18., X és Y kromoszómákra nézve (1,8 5,5%), mint a kontroll populációban (0 2,6%). Ezek az adatok alátámasztják saját vizsgálatainkat, miszerint a meddô férfiak ivarsejtjeinek aneuploidiára való hajlama nagyobb, mint a kontroll populációé. 314 Magyar Nôorvosok Lapja 69 (4) 2006.

A fenti eredmények alapján nyilvánvaló tehát, hogy az ICSI során a spermiumok morfológiai alapon történô kiválasztása nem jelenti azt, hogy azok genetikai állománya is megfelelô. Az ICSI alkalmazásakor az éretlen ivarsejtekkel történô megtermékenyítés is emelheti a kromoszóma-aneuploidiák elôfordulását. Úgy tûnik, hogy ez a fokozott kockázat a spermiumok hialuronsavval történô elôkezelésével csökkenthetô [18]. A meddôség heterogén kóreredete miatt lényeges, hogy az éppen aktuális genetikai okot megtaláljuk, és a magzati genetikai vizsgálatokat az adott betegség/rendellenesség kimutatására végezzük el. Ezek lehetnek kromoszóma-anomáliák és számos más súlyos betegséget elôidézô génmutációk is [1]. Az invazív mintavétel vetélési kockázata a nagy nehézségek árán létrejött terhességek esetén különösen nehéz döntés elé állítja a házaspárokat. A genetikus feladata, hogy a meddôségi kezeléseket megelôzô vizsgálatok során a házaspárokat tájékoztassák a lehetséges genetikai kockázatokról, akik a felvilágosítás alapján dönthetnek a terhesség vállalásáról, valamint a magzati genetikai vizsgálat elvégzésérôl. Eredményeink alátámasztják, hogy a spermiumok aneuploidia-vizsgálata egy új és hasznos módszer ennek eléréséhez. Köszönetnyilvánítás: Köszönetet mondunk az OTKA (T037947) támogatásáért. Jelen közlemény létrejöttéhez a magyar és olasz kormányközi tudományos és technológiai együttmûködés keretében, a Kutatási és Technológiai Innovációs Alap, valamint az Olasz Külügyminisztérium is hozzájárult (I-25/03). Irodalom [1] Tóth A, Erdei E, Drávucz S, Doszpod J. Genetikai szempontok a meddôség kezelésével kapcsolatban. Magy Nôorv L 1999; 62: 79 85. [2] Ryu HM, Lin WW, Lamb DJ et al. Increased chromosome X, Y and 18 nondisjunction in sperm from infertile patients that were identified as normal by strict morphology: implication for intracytoplasmic sperm injection. Fert and Ster 2001; 76,5: 879 882. [3] Hassold T, Abruzzo M, Adkins K, Griffin D, Merril M et al. Human aneuploidy: incidence, origin, and etiology. Environ Mol Mutagen 1996; 28: 167 175. [4] Rudak E, Jacobs P, Yanagimachi R. Direct analysis of the chromosome constitution of human spermatozoa. Nature 1978; 274: 911 913. [5] Wyrobek A, Robbins W, Mehraein Y, Pinkel D, Weier H. Detection of sex chromosomal aneuploidies X-Y, Y- Y, and X-Y in human sperm using two-chromosome fluorescence in situ hybridization. Am J Med Genet 1994; 53: 1 7. [6] Martin R. Human sperm chromosome complements in chemotherapy patients and infertile men. Chromosoma 1998; 107: 523 527. [7] Tóth A, P. Tardy E, Kékesi A. A meddô férfiak spermiumainak citogenetikai vizsgálata. Elsô hazai tapasztalatok. Magyar Nôorv L 2003; 66: 143 147. [8] Martin RH. Mechanisms of nondisjunction in human spermatogenesis. Cytogenet Genom Res 2005; 111: 245 249. [9] Morel F, Mercier S, Roux C et al. Estimation of aneuploidy levels for 8, 15, 18, X and Y chromosomes in 97 human sperm samples using fluorescence in situ hybridization. Fertil Steril 1997; 67,6: 1134 1139. [10] Spriggs EL, Rademaker AW, Martin RH. Aneuploidy in human sperm: results of two- and three-colour fluorescence in situ hybridization using centromeric probes for chromosomes 1, 12, 15, 18, X and Y. Cytogenet Cell Genet 1995; 74: 47 53. [11] Finkelstein S, Mukamel E, Yavetz H, Paz G et al. Increase rate of nondisjunction in sex cells derived from low quality semen. Hum Genet 1998; 102: 129 137. [12] Calogero AE, DePalma A, Grazioso C et al. Aneuploidy rate in spermatozoa of selected men with abnormal semen parameters. Hum Reprod 2001; 16,6: 1172 1179. [13] Rives N, Saint Clair A, Mazurier S, Sibert L et al. Relationship between clinical phenotype, semen parameters and aneuploidy frequency in sperm nuclei of 50 infertile males. Hum Genet. 1999; 105: 266 272. [14] Wilding M, Forman R, Hogewind G et al. Preimplantation genetic diagnosis for the treatment of failed in vitro fertilization- embryo transfer and habitual abortion. Fert and Ster. 2004; 81;5: 1302 1306. [15] Celik-Ozenci C, Jakab A, Kovacs T, Catanalotti J et al. Sperm selection for ICSI: shape properties do not predict the absence or presence of numerical chromosomal aberrations. Hum Reprod 2004; 9: 2052 2059. [16] Schmiady H, Schulze W, Scheiber I, Pfüller B. High rate of premature chromosome condensation in human oocytes following microinjection with round-headed sperm: Case report. Hum Reprod 2005; 20: 1319 1323. [17] Machev N, Gosset P, Viville S. Chromosome abnormalities in sperm from infertile men with normal somatic karyotypes: teratozoospermia. Cytogenet Genome Res 2005; 111: 352 357. [18] Jakab A, Sakkas D, Delpiano et al. Intracytoplasmic sperm injection: a novel selection method for sperm with normal frequency of chromsomal aneuploidies. Fertil Steril 2005; 84: 1665 1673. Kékesi A., Erdei E., Dévai I., Tóth A.: Investigation of aneuploidy frequency in spermatozoa of males with abnormal semen parameters by fluorescence in situ hybridization (FISH) Magyar Nôorvosok Lapja 69 (4) 2006. 315

The purpose of this study was to analyse the frequency of disomy and diploidy for chromosomes 18, X and Y in sperm nuclei of 64 infertile men and for chromosomes 13 and 21 in spermatozoa of 9 infertile men by fluorescence in situ hybridization. The results were compared with 8 normozoospermic, control donors. Their sperm cells were analysed for chromosomes 13, 18, 21, X and Y. Only patients with normal 46,XY chromosomal karyotype were investigated. Relationship between semen parameters (sperm concentration, motility, morphology) and aneuploidy rates was examined. The mean disomy and diploidy frequency for the chromosomes studied were significantly higher in infertile males than in probands with proven fertility. There was no significant relationship between sperm count, motility, morphology and aneuploidy rates. Only in those patients who have extremely high rate of disomy, preimplantation or prenatal diagnosis is advised, as the chances of having chromosomally abnormal foetuses are increased considerably. Keywords: male infertility, genetics, FISH, chromosome, assisted reproduction Levelezési cím: DR.TÓTH ANDRÁS Országos Gyógyintézeti Központ Szülészet és Nôgyógyászati Osztály 1135 Szabolcs u. 35 e-mail: dr.atoth@gmail.com 316 Magyar Nôorvosok Lapja 69 (4) 2006.