Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Idegtudományi Doktori Iskola NUKLEOTID RECEPTOR KARAKTERIZÁCIÓ PRIMER AGYI KAPILLÁRIS ENDOTHEL SEJTEKEN

Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Idegtudományi Doktori Iskola NUKLEOTID RECEPTOR KARAKTERIZÁCIÓ PRIMER AGYI KAPILLÁRIS ENDOTHEL SEJTEKEN A SZABADGYÖK TERMELÉS VIZSGÁLATA IN SITU NEURONÁLIS EREDETÛ MITOKONDRIUMOKBAN Ph.D értekezés dr Sipos Ildikó Témavezetõ: Prof. Ádám Veronika Szigorlati bizottság: Prof. Mandl József Prof. Nagy Zoltán Dr Komjáthy Katalin Opponenesek: Dr Deli Mária Dr Ligeti László BUDAPEST 2003

TARTALOMJEGYZÉK TARTALOMJEGYZÉK...1 RÖVIDÍTÉSEK...4 TUDOMÁNYOS HÁTTÉR...5 I. Az agyi endothelium nukleotid receptorai és a vér-agy gát permeabilitásának...5 II. Légzési komplexek gátlása és a következményes szabadgyök keletkezés mérése in situ agyi mitokondriumokban...9 CÉLKITÛZÉSEK...13 MÓDSZEREK...14 a) Primer patkány agyi kapilláris endothel tenyészet...14 b) Marha korneális endotheliumból származó extracelluláris mátrix készítése...14 c) Patkányfarok kollagénnel borított üveg fedõlemezek készítése....15 d) Intracelluláris [Ca 2+ ] mérés képalkotó fluorimetriás módszerrel...15 e) Izolált agyi idegvégzõdés (szinaptoszóma) preparálása....16 f) Mitokondriális légzési komplexek aktivitásának meghatározása...16 g) Akonitáz aktivitás mérése...16 h) Hidrogén peroxid felszabadulás mérése Amplex Red módszerrel...17 EREDMÉNYEK...18 I. Primer patkány agyi kapilláris endothel sejteken végzett kisérletek...18 A. Primer patkány agyi kapilláris endothel tenyésztés módszerének továbbfejlesztése és adaptálása a fluoreszcens mérési technika követelményeihez 18 B. Nukleotid receptor mintázat farmakológiai karakterizációja primer RBCE sejteken mikrofluorimetriás módszerrel...22 a) Nukleotid receptor agonisták hatására kialakuló intracelluláris kalcium...22 b) Farmakológiai bizonyíték a P2Y 1 és a P2Y 2 nukleotid receptorok együttes jelenlétére primer patkány agyi kapilláris endothel sejteken...24 c) A P2Y 2 és P2Y 4 nukleotid receptor altípusok farmakológiai elkülönítése RBCE sejtekben...26 d) Adenozin receptor karakterizáció agyi kapilláris endothel sejteken...27 e) A nukleotid receptor fenotípus jellemzése RBCE sejteken; az ECM sejtdifferenciációt-génexpressziót segítõ hatásának vizsgálata...28 II. A légzési komplex gátlás és a reaktív oxigén származékok termelõdése közötti kapcsolat kvantitatív jellemzése izolált agyi idegvégzõdésekben...29 a) Mitokondriális légzési komplexek aktivitásának vizsgálata szelektív...29 2

b) A légzési komplex gátlás során bekövetkezõ akonitáz aktivitás csökkenés, mint a reaktív oxigén származékok keletkezésének indikátora...30 c) Kvantitatív összefüggés a légzési lánc gátlás és a reaktív oxigén származékok keletkezése között szinaptoszómákban...32 e) Hidrogén peroxid felszabadulás vizsgálata a komplex I és a komplex III...35 f) A mitokondriális membránpotenciáltól nem függõ ROS termelés rotenon és antimycin hatására...36 g) Komplex I és komplex III gátlás hatására bekövetkezõ H 2 O 2 felszabadulás oligomycin jelenlétében...38 h) A komplex I gátlás hatása az antimycin kiváltotta ROS felszabadulásra...39 MEGBESZÉLÉS...41 I. Nukleotid receptorok farmakológiai karakterizációja primer agyi kapilláris endothel sejteken...41 II. Kvantitatív kapcsolat a légzési lánc gátlás és a reaktív oxigén származékok...43 ÖSSZEFOGLALÁS...48 SUMMARY...49 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS...50 AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ SAJÁT KÖZLEMÉNYEK...51 KONGRESSZUSI ABSZTRAKTOK...52 HIVATKOZÁSOK...54 3

RÖVIDÍTÉSEK BBB ECM RBCEC [Ca 2+ ] i ROS ÄØ m PGI 2 NO PLC PKC MAPK MPP + MPTP á,â-meatp 2-MeSATP 2-MeSADP PAPS CPA NECA CGS 21680 H 2 O 2 FCCP DNP vér-agy gát extracelluláris mátrix patkány agyi kapilláris endothel sejtkultúra intracelluláris kalcium koncentráció reaktív oxigén származékok mitokondriális membránpotenciál prosztaciklin nitrogén monoxid foszfolipáz C protein kináz C mitogén aktiválta protein kináz 1-Methyl-4-Phenylpyridinium N-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin á,â-methylen-atp 2-methylthio-ATP 2-methylthio-ADP adenosine 3 -phosphate 5 -phosphosulfate N 6 Cyclopentyladenosine N ethylcarboxamidoadenosine 2-p-(2-Carboxyethyl) phenethylamino-5 -N-ethylcarboxamido adenosine hidrogén peroxid carbonyl cyanide p-(trifluoro-methoxy) phenylhydrazone dinitro-phenol 4

TUDOMÁNYOS HÁTTÉR Disszertációmban két, egymással szorosan nem összefüggõ témát foglaltam össze: i) primer patkány agyi kapilláris endothel sejtek nukleotid receptorainak in situ komplex bénítók hatására bekövetkezõ reaktív oxigén származék termelõdés vizsgálatát. E kettõsség abból adódik, hogy munkám kezdetén az agyi kapilláris endothel sejtek tenyésztésének elsajátítása és a tenyészetek karakterizációja volt a cél, azonban hosszútávú célunk az agyi kapilláris endothel sejtek oxidatív stressz iránti érzékenységének és az oxidatív stresszben betöltött szerepének vizsgálata. Ez utóbbi mérések módszertani elõkészítése során egy, a primer agyi endothelnél könnyebben vizsgálható rendszert -izolált idegvégzõdéseket- használtam, azt a preparátumot, amelyrõl a munkacsoport hosszú évekre visszanyúlóan nagy ismeretekkel rendelkezik. Ezért a disszertáció második felét az izolált idegvégzõdések vizsgálata során kapott eredmények képezik. I. Az agyi endothelium nukleotid receptorai és a vér-agy gát permeabilitásának in vitro agyi kapilláris endothel preparálási módszer ismert (Joó 1985, Abbott et al. 1992, Joó 1993, Laterra and Goldstein 1993), melyek során a vér-agy gátra (BBB) in vivo megismeréséhez. A primer patkány agyi kapilláris endothel sejtek (RBCEC) növekedésük során konfluens monolayert alkotnak és a BBB-re in vivo jellemzõ morfológiai és biokémiai tulajdonságokkal bírnak (Audus and Borchardt 1987, Miller et al. 1992). Az RBCE sejteket mûanyag aljzaton növesztve a rendszer kiválóan alkalmas sejtfelszíni receptorok, transzporterek, ioncsatornák mûködésének és az endothelre jellemzõ fehérjék génexpressziójának vizsgálatára, míg a sejteket mikropórusos membránon növesztve az oldott anyagok transzcelluláris transzportja 5

A nukleotid receptorok jelenlétét az endothel sejtek felszínén számos in vivo és in vitro modellen végzett vizsgálat igazolta. A vizsgálatokhoz használt endothel preparátumok különbözõ speciesekbõl és szervekbõl származtak, mint például patkány izolált mezenterális artéria (Ralevic and Burnstock 1996), béka in situ mezenterális artéria (He et al. 1996), humán cotyledon (Ralevic et al. 1997) valamint több jólismert sejtkultúra-típus, mint a marha pulmonáris artériából, mellékvese mikroerekbõl vagy humán köldökvéna endothel (HUVEC) sejtekbõl készített tenyészetek. Az agyi endothelium nukleotid receptoraira vonatkozó ismereteinket in situ piális mikroerein végzett (Olesen 1989), izolált agykérgi mikroerek kanülálásával nyert (Janigro et al. 1996), valamint primer és immortalizált sejtkultúrákon végzett kisérletek gazdagították (Albert et al. 1997, Vigne et al. 1994, Nobles et al. 1995). Az endothel sejtek felszínén található adenozin receptorokat A 1 -A 3 csoportba soroljuk, míg a nukleotid receptorokat általánosságban P2-vel jelöljük. A P2 család két nagy csoportra oszlik, a P2X és P2Y receptorcsaládokra. Az elõbbiek szerkezetüket tekintve ligand-vezérelt ioncsatornák, míg az utóbbiak hét transzmembrán doménnel rendelkezõ, G-fehérjéhez kapcsolt receptorok (Fredholm et al. 1997). A különbözõ nukleotid receptor alcsaládok között farmakológiailag az agonisták hatáserõsségi sorrendje alapján és specifikus antagonisták segítségével tehetünk különbséget. A P2X receptorokról általánosságban elmondható, hogy leginkább ATP-re szenzitívek. A P2Y 1 származékaira érzékeny, a P2Y 2 és P2Y 4 típusú receptorok ATP-re és UTP-re egyaránt érzékenyek, az utóbbi UTP iránti affinitása valamivel nagyobb (Barnard et al. 1996). Az endothel sejtek felszínén ható nukleotidok lehetnek citoszolikus eredetûek, ekkor a sejtek lízise során vagy transzmembrán transzport útján jutnak az extracelluláris térbe, vagy lehetnek exocitózissal felszabaduló vezikuláris eredetû nukleotidok. Az exocitózissal felszabaduló nukleotidok elsõdleges forrásai a vérlemezkék és a kapilláris fal simaizmait beidegzõ szimpatikus idegvégzõdések, ugyanakkor az endothel sejtek ekto-nukleotidáz aktivitásának köszönhetõen az így felszabaduló nukleotidok gyorsan el is bomlanak. A nukleotidokra specifikus transzmembrán transzporterek nukleotid receptorok által szabályozottak (részletesebben lásd Boarder and Hourani 1998). 6

A vér-agy gátat alkotó agyi kapilláris endothel sejtek barrier funkciójukat az endothel sejtek közötti szoros kapcsolódásnak (zonula occludens, angolul tight junction) köszönhetik. Az agyi endothelium azonban nem teljesen átjárhatatlan, a BBB-en keresztüli szigorúan szabályozott anyagáramlást az endothel sejtek transzporterek biztosítják (Abbott and Romero 1996, Tamai and Tsui 1996, Grant et al. 1998). Membránreceptorokon keresztül szabályozott pl. a véralvadási faktorok az endotheliumból, az endothelium simaizom tónusra kifejtett hatása (Boarder and Hourani 1998). 1. ábra A simaizom tónust, és ezáltal a vér-agy gát permeabilitását szabályozó nukleotid receptorok az agyi kapilláris endothel sejtek felszínén (Boarder and Hourani 1997 alapján). Receptor-mediált úton a sejtek közötti tight junction-ok számának változtatásával a sejtek permeabilitását is változtatni lehet (Abbott and Revest 1991, Abbott 2000). A 7

sejtfelszíni purin és pirimidin receptorokon keresztül érkezõ szignálok befolyásolják az NO és prosztaciklin felszabadulás mértékét az endotheliumból, és ezen keresztül a kapillárisok simaizom tónusát (Boarder and Hourani 1998) valamint a BBB permeabilitását (Olesen 1989). A nukleotid receptorok természetes ligandjai (ATP, ADP, UTP) hatásukat kifejthetik a luminális (vér felõli) és az abluminális (agy felõli) oldalon egyaránt. A nukleotidok a vérben fõleg vérlemezkékbõl származnak (Boarder and Hourani 1998), míg 1986). található P2Y nukleotid receptorokon hatva szabályozzák az endotheliális NO és prosztaciklin (PGI 2 ) szintézist, ezen keresztül antiproliferatív és simaizom relaxáló hatást fejtenek ki (1.ábra). A P2Y receptor aktiválás következtében az endotheliális nitrogén monoxid szintáz aktiválódik, és ezáltal fokozódik a NO termelés. A P2Y 1 receptoron közvetített jel a camp szint szabályozásán keresztül vezet intracelluláris [Ca 2+ ] i ) (Albert et al. 1997), míg a P2Y 2 receptor a PLC által aktivált jelátviteli úton keresztül okoz [Ca 2+ ] i emelkedést (Frelin et al. 1993). A PLC hatására bekövetkezõ MAPK út aktivációja a foszfolipáz A 2 szint, és következményesen a PGI 2 termelés megnövekedéséhez vezet, amely folyamatot az emelkedett [Ca 2+ ] i 2 receptoron közvetített hatásokat csökkenti, de a P2Y 1 hatásokat nem befolyásolja (Purkiss et al. 1994). A különféle nukleotid receptor alcsaládok együttes jelenléte az agyi kapilláris endothel sejtek felszínén azt sugallja, hogy a különbözõ receptorokon közvetített in vivo. A P2Y 1 és P2Y 2 receptorokon közvetített hatások, mint a NO és a PGI 2 használnak. Ugyanakkor a különbözõ G-fehérjékhez kapcsolt jelátviteli utak különbözõ feedback szabályozásra és kontrollra adnak lehetõséget (Boarder and Hourani, 1998). Az agyi endothelen egy adenilát-ciklázt gátló atipikus P2Y 1 receptor (Webb et al. 1996, Vigne et al. 1998) és egy részletesen nem azonosított adenilátciklázt serkentõ ATP receptor (Albert et al. 1997) jelenléte felveti a lehetõségét egy még specifikusabb, csak a vér-agy gátra jellemzõ szignáltranszdukciós útnak. Ezek a megfigyelések egyben hozzájárulnak az agyi endothel sejtekben feltételezett másodlagos messengerek közötti cross-talk egyre növekvõ bizonyítékaihoz (Vigne et al. 1994, Nobles and Abbott 1998). 8

II. Légzési komplexek gátlása és a következményes szabadgyök keletkezés mérése in situ agyi mitokondriumokban a neurodegeneratív betegségek, melyek eltérõ klinikai képpel, genetikai és etiológiai háttérrel bírnak. Napjainkban azonban egyre szélesebb körben nyer bizonyítást, hogy a mitokondriális diszfunkció lehet a neurodegeneratív kórképek kialakulásának egyik közös kóroki tényezõje (részletesebben lásd Beal, 1998). Röviden: a mitokondriális légzési komplexek mûködésének hibája csökkent energiatermeléshez vezet, melynek következtében megnövekszik az intracelluláris kalcium szint, megnõ a proteáz és foszfolipáz aktivitás, valamint a szabadgyök termelés. Ezek a hatások együttesen a hibás mitokondriális komplexet tartalmazó neuronok szelektív pusztulását okozzák. Langston és mtsi. (1983) szolgáltatták az elsõ bizonyítékot arra, hogy mitokondriális funkciózavar állhat a Parkinson-kór kialakulásának hátterében. Leírták, hogy szintetikus kábítószert (MPTP-t) fogyasztó fiatalokban az idiopathiás Parkinsonkórhoz hasonló kórkép alakult ki a kábítószer metabolizmusa során keletkezõ MPP + hatására. Az MPP + a komplex I-et gátló mitokondrium méreg, mely különösen a substantia nigra sejtjeiben halmozódik fel, melyek szelektív pusztulása jól ismert Parkinson-kórban. Ezt követõen számos közlemény jelent meg, amely szelektív komplex I aktivitás csökkenésrõl számolt be Parkinson-kóros betegek post mortem agyi preparátumában (Parker et al. 1989, Schapira et al. 1990, Mann et al. 1992). Széles körben használt peszticid a komplex I gátló rotenon, mely rendkívül hidrofób és így specifikus transzporter nélkül is könnyedén átjut a sejtmembránon. A rotenon támadáspontja a komplex I-en a mitokondriális DNS által kódolt ND-1 géntermék (Earley et al. 1987). E fehérje szerkezet a legkonzervatívabb a mitokondriális DNS által kódolt fehérjék közül, ami arra utal, hogy a komplex I mûködésében alapvetõ szerepet játszik (Attardi 1985). Patkányokban a szisztémásan adott rotenon hatására az agy egész területén komplex I gátlás alakult ki, ugyanakkor szelektív nigrostriatális dopaminerg neuron pusztulás, és a Lewy testekhez hasonló citoplazmatikus inklúziós testek megjelenése volt megfigyelhetõ a dopaminerg neuronok citoplazmájában (Betarbet et al. 2000). Az irodalomból ismert, hogy rotenon adagolásra az izolált agyi mitokondriumok megnövekedett reaktív oxigén származék (ROS) képzõdéssel reagálnak (Votyakova and Reynolds 2001, Liu et al. 2002). Parkinson-kórban a 9

substantia nigra sejtjei különösen érzékenyek lehetnek a szabadgyökökre, hiszen nagy mennyiségben tartalmaznak szabad vasat, mely a Fenton-reakcióban további szabadgyök képzõdés forrása lehet. A komplex I gátlás az oxidatív foszforiláció gátlását is erdeményezi; a komplex I 25%-os gátlása már szignifikáns csökkenést mutatott az ATP szintézisben és az oxigénfogyasztásban, mely bioenergetikai deficit sejtpusztuláshoz vezethet (Davey et al. 1996). Ugyanakkor Parkinson-kóros betegekben a mitokondriális komplex I gátlás megnövekedett szabadgyök képzõdéssel járt együtt, és apoptotikus sejthalálhoz vezetett (Swerdlow et al. 1996). Azt, hogy a szabadgyök képzõdés oka vagy következménye a mitokondriális károsodásnak nem tudjuk, de egyre több bizonyítékkal rendelkezünk arról, hogy a ROS keletkezés fontos tényezõ a Parkinsonkór etiológiájában. A sejtekben a mitokondriumok fiziológiás mûködése során is keletkeznek reaktív oxigén származékok (Lochen et al. 1971, Boveris et al. 1972). ROS termelésre termodinamikailag mind a négy légzési komplex képes, de izolált mitokondriumon végzett kutatások kimutatták, hogy a komplex I és a komplex III a ROS keletkezés kiemelt helyei a mitokondriumban (Boveris et al. 1976, Turrens and Boveris 1980, Votyakova and Reynolds 2001). Újabb közlemények azonban vitatják a komplex III pathológiás ROS termelésben betöltött szerepét (Liu et al. 2002). Izolált mitokondriumon végzett kisérletek azt bizonyították, hogy a mitokondriális ROS termelés függ az alkalmazott légzési szubsztrát fajtájától. A szukcináttal lélegeztetett mitokondrium ROS termelése jelentõs (Votyakova and Reynolds 2001, Cadenas et al. 1977, Liu et al. 2002), azonban a ROS képzõdés a komplex I inhibitor rotenon jelenlétében lecsökkent (Votyakova and Reynolds 2001, Liu et al. 2002, Korshunov et al. 1997, Hansford et al. 1997). A glutamát/maláttal lélegeztetett mitokondriumok esetén mind a rotenon, mind a komplex III inhibitor antimycin stimulálta a ROS képzõdést (Starkov et al. 2002, Votyakova and Reynolds 2001). Arról azonban, hogy a mitokondriális membránpotenciál ( ÄØ m ) változás miként befolyásolja a ROS termelést ellentmondó erdemények jelentek meg. Annak tekintetében, hogy szukcináttal lélegeztetett izolált mitokondriumokban a depolarizáció hatására csökken a H 2 O 2 termelés egységes a vélemény (Votyakova and Reynolds 2001, Korshunov et al. 1997, Hansford et al. 1997), a glutamát/maláttal ÄØ m 10

ellentmondó publikációk jelentek meg. Votyakova and Reynolds (2001) közlése szerint a protonofór FCCP okozta depolarizáció nem okozott változást a 2O 2 termelésben, mig Starkov et al. (2002) közleményében az FCCP okozta ÄØ m változástól függött a H 2 O 2 lélegeztetett izolált mitokondriumokban. A különbözõ légzési komplex gátlók in situ mitokondriumok ÄØ m -jára kifejtett hatása igen eltérõ. A rotenon okozta komplex I gátlás nem befolyásolta a mitokondriális membránpotenciált szinaptoszómákban, a komplex III antimycin okozta gátlása közben azonban jelentõs depolarizáció volt megfigyelhetõ (Chinopoulos et al. 1999). Számos neurodegeneratív betegség kialakulásában feltételezhetõ a mitokondriális légzési komplexek mûködészavara, és ehhez kapcsolódóan az oxidatív károsodás kóroki szerepe. Komplex I károsodást mutattak ki Parkinson-kór esetén (Schapira et al. 1990), Huntington-kórban a komplex II-III hibáját feltételezik (Beal 1998), és egyre több bizonyíték áll rendelkezésünkre a komplex IV károsodás Alzheimer-kór kialakulásában betöltött szerepérõl (Kish et al. 1992, Mutisya et al. 1994, Parker et al. 1994). Nagyon keveset tudunk azonban arról, hogy milyen mértékû légzési komplex gátlást viselnek el a sejtek anélkül, hogy megnövekedett ROS képzõdés és ennek következtében sejtkárosodás alakulna ki. A ROS termelõdés detektálásának sokféle módszere ismert, ezek egyike a citrátköri akonitáz aktivitásának mérése. Az akonitáz rendkívül érzékeny a szuperoxidra (Gardner et al. 1995), ezért számos kisérletben használták a szuperoxid keletkezés intracelluláris indikátoraként, bizonyítván a szuperoxid keletkezés szerepét az excitotoxikus sejthalál kialakulásában (Patel et al. 1996, Liang et al. 2000, Li et al. 2001). Az enzim érzékeny szenzora a peroxinitritnek is (Andersson et al. 1998), és az extracellulárisan adott hidrogén peroxid (H 2 O 2 mérve ugyancsak az akonitáz bizonyult a legérzékenyebbnek a Krebs-ciklus enzimei közül (Tretter and Adam-Vizi 2000). A mitokondriális légzési lánc mûködése során keletkezõ szuperoxid a mitokondriális szuperoxid dizmutáz hatására nagyon gyorsan H 2 O 2 -dá alakul (Forman and Azzi, 1997). Mivel a H 2 O 2 könnyedén átjut a sejtmembránon, ezért a H 2 O 2 felszabadulás mértékét a mitokondriális szuperoxid termelés jó indikátorának tekinthetjük (Lochen et al. 1973). Az Amplex Red reagens rendkívül érzékeny a H 2 O 2 -ra, amellyel sztöchiometrikusan 1:1 arányban reagál, s a reakció során termelõdõ színes termék 11

mennyisége fotometrálással meghatározható (Mohanty et al. 1997). Azonban az extracellulárisan alkalmazott Amplex Reddel csak a H 2 O 2 felszabadulás mértékére tudunk következtetni, hiszen a mitokondriumokban képzõdõ H 2 O 2 egy részét a sejtekben mûködõ peroxid elimináló mechanizmusok semlegesítik. Az irodalmi adatok arra utalnak, hogy a neurodegeneratív betegségek kialakulásának hátterében feltételezhetõ a közös mitokondriális eredet. Ezek az eredmények fordították figyelmünket a mitokondriális légzési komplex gátlás és a ROS keletkezés közötti összefüggések alaposabb vizsgálatára in situ neuronális eredetû mitokondriumokban. Az in situ mitokondriumok vizsgálata azért fontos, mert ilyenkor a mitokondriumokat -szemben az izolált mitokondriumokkal, amelyek kivülrõl hozzáadott szubsztráttal mûködnek és számos funkciójuk a szubsztrát fajtájától függ - a fiziológiás citoplazmatikus közeg veszi körül. Így a légzési szubsztrátok a fiziológiásnak megfelelõen a glukóz oxidációja során keletkeznek, és a mitokondriumban illteve a környezetükben mûködnek a szabadgyököket elimináló mechanizmusok. mitokondriális membránpotenciál változás és a ROS keletkezés között. A kisérleteket szinaptoszóma preparátumokon végeztük, ami azért kiemelendõ, mert számos neurodegeneratív betegségben a neurodegeneráció az axon terminálisban kezdõdik (Betarbet et al. 2000). Ezen túlmenõen, az izolált mitokondriumok vizsgálata során is eltérõ érzékenységet mutattak az egész agyból, illetve a szinaptoszómából preparált mitokondriumok a légzési komplex gátlás és ennek következményei tekintetében (Davey and Clark 1996, Davey et al. 1998). 12

CÉLKITÛZÉSEK Munkánk során a következõ célokat kívántuk megvalósítani: 1. Primer agyi kapilláris endothel tenyésztés módszerének tovább adaptálása a fluoreszcens mérési technika követelményeinek megfelelõen úgy, hogy a sejtkultúra tisztasága és növekedésének sebessége ne változzon. 2. Biológiai mátrixon tenyésztett agyi kapilláris endothel sejtek purinerg receptorainak farmakológiai karakterizálása képalkotó fluorimetriás 3. In situ mitokondriális légzési komplexek aktivitásának vizsgálata gátlószereik jelenlétében izolált agyi idegvégzõdésekben (szinaptoszómákban). 4. Mitokondriális légzési komplex gátlók szabadgyök képzõdést elõsegítõ hatásának vizsgálata in situ az akonitáz enzim aktivitásának mérésével. 5. felszabadulás vizsgálata fluorimetriás módszerrel szinaptoszómákban. 6. Légzési lánc gátlás során bekövetkezõ szabadgyök termelés vizsgálata a membránpotenciál függvényében szinaptoszómákban. 13

MÓDSZEREK a) Primer patkány agyi kapilláris endothel tenyészet. A sejttenyésztés során a Semmelweis Egyetem etikai kódexének állatkisérletekre vonatkozó utasításainak megfelelõen jártunk el. A kb. 300 grammos hím Wistar patkányokat dekapitáltuk és a patkányok agyából primer endothel kultúrát készítettünk az Abbott és mtsi. (1992) által leírtak alapján. Ez összefoglalva a következõ: a fehérállományt eltávolítottuk, a szürkeállományból homogenizálás és centrifugálási lépések után mikroér darabokat nyertünk. 3 órás kollagenáz/diszpázos emésztést követõen Percoll grádiens centrifugálással izoláltuk a kapilláris fragmentumokat, melyeket ezután extracelluláris mátrixszal elõzetesen bevont (ld. alább) üveglemezekre ültettünk ki. Kisérleteinket 6-9 napos, konfluens agyi endothel sejttenyészeteken végeztük. A sejtek endotheliális eredetét immuncitokémiai módszerrel (von Willebrand faktor pozitivitás) bizonyítottuk. A tenyésztõ médium 20% marha szérumot tartalmazó standard Dulbecco s modified Eagle s médium (DMEM) oldatból készült a következõ anyagok hozzáadásával: 75 µg ml -1 endotheliális növekedési faktor, 100 i.u. ml -1 penicillin / 100 µg ml -1 streptomycin, 2 mm glutamin, 80 µg ml -1 glutation, inzulin, transzferrin és szelén. b) Marha korneális endotheliumból származó extracelluláris mátrix készítése. A módszer kisebb módosításokkal (ld. részletesebben Dömötör et al., 1998) a Gospodarowicz által leírtakon (1984) alapul. Összefoglalva: a vágóhídról beszerzett friss marhaszemek korneájából primer korneális endothel tenyészetet készítettünk, amelyet 3-4 passage után végül steril üveg fedõlemezekre ültettünk ki. Az elõzetesen 70%-os ethanolban ázó üveg fedõlemezeket nyílt láng felett sterilizáltuk. Miután a korneális endothel sejtek konfluenssé váltak, a sejteket 20mM NH 4 OH segítségével denudáltuk. Az így visszamaradó sértetlen extracelluláris mátrixszal bevont lemezek ezután 3-6 hónapig eltarthatók steril izotóniás sóoldatban 4 ºC-on. 14

A steril üveg fedõlemezeket 0.4 mg/ml koncentrációjú patkányfarok kollagénnel (Sigma) vontuk be, majd a lemezeket egy órán át szárítottuk a steril fülkében, végül 10 perig ammóniagõzben fixáltuk a kollagént az fedõlemezekre. Az RBCE sejtek kiültetése elõtt a lemezeket háromszor mostuk izotóniás sóoldattal. d) Intracelluláris [Ca 2+ ] mérés képalkotó fluorimetriás módszerrel. A [Ca 2+ ] i méréshez az endothel sejteket kalcium szenzitív festékkel (Fura-2 AM, 6 µm, 1 h, 37 ºC) töltöttük fel. Ezután a fedõlemezeket áthelyeztük az inverz Nikon Diaphot 200 mikroszkópra helyezett fûtött (37 ºC) perfúziós kamrába, majd a kisérleteket megelõzõen 10 percig normál HEPES pufferral perfundáltuk a sejteket. A különféle perfúziós oldatokat a kisérletek során a sejtek közelébe helyezett üvegkapillárison keresztül juttattuk a perfúziós kamrába (0.5 mm kapilláris átmérõ, 10 µl s -1 perfúziós ráta); ºC-on tartottuk. A [Ca 2+ ] i szignálokat képalkotó fluorimetriás mikroszkóp (Fluor 40/1.3 objektív, Nikon) segítségével mértük, a digitális képet CCD kamera (Princeton Instruments) és Metafluor software (Universal Imaging Corp.) felhasználásával nyertük. A mérések során polikromátorral (Visitron GmbH, Germany) elõállított 340 és 380 nm excitációs hullámhosszakat használtunk, a fluoreszcens emissziót 510 nm-en mértük, a fluoreszcens képeket 2 másodperces gyakorisággal vettük fel. legalább három különbözõ lemezen mért adatok átlagát jelentik, egy látómezõben átlagosan 20-40 sejt volt látható. A [Ca 2+ ] i nagyságát a fluoreszcens ratio-ból a Grynkiewicz et al. (1985) által közölt egyenlet alapján számoltuk. Az egyenletben max) és a minimum (R min ) ratio értékét, valamint 380 nm-en a szabad festék és a Ca 2+ -kötött festék arányát (S f2 /S b2 ) az in vitro kalibráció során határoztuk meg. 15

Az eljárás során a Semmelweis Egyetem etikai kódexének állatkisérletekre vonatkozó utasításainak megfelelõen jártunk el. A tengerimalacokat dekapitáltuk, majd az állatok agykérgébõl szinaptoszómát készítettünk, a módszert lásd részletesebben Chinopoulos and Adam-Vizi (2001). A 20 mg/ml protein tartalmú szinaptoszómát 0.32 M szukrózban szuszpendáltuk fel, ezután a törzsoldatot jégen tartva abból mintákat vettünk ki a további kisérletekhez. A standard inkubáló médium összetétele a következõ volt (mm): 140 NaCl, 3 KCl, 2 MgCl 2, 2 CaCl 2, 10 PIPES, 10 glukóz, ph 7.38. f) Mitokondriális légzési komplexek aktivitásának meghatározása. Az 1 mg proteint tartalmazó szinaptoszóma mintákat 20 percig 37ºC-on 1 ml standard médiumban inkubáltuk (összetételét lásd az e. pontban) különbözõ koncentrációjú légzési komplex gátlók (rotenon, antimycin vagy cianid) jelenlétében. A mintákból háromszori gyors fagyasztás / kiolvasztás után 200 µl-t áttettünk a mérõmédiumba (2 ml). A kisérletek során az abszorbancia változásokat GBC UV/VIS 920 spektrofotométeren követtük. A komplex I aktivitás meghatározásánál a Ragan et al. (1987) által leírt módszert követtük; a NADH oxidációt 340 nm-en mértük az elektron akceptor koenzim Q 1 jelenlétében. A komplex III aktivitás mérését Rieske (1967) módszerével végeztük; a redukált koenzim Q 2 oxidációját mértük 550 nm-en, az elekton akceptor a citokróm c volt. A komplex IV aktivitás mérése során a citokróm c oxidációját mértük 550 nm-en a Wharton and Tzagoloff (1967) által leírt módon. Az akonitáz aktivitás meghatározásánál a Hausladen and Fridovich (1996) által közölt A mérõmédiumba (2 ml) szinaptoszóma aliquotokat (200 ìg protein) tettünk, amelyeket elõzõleg különbözõ légzési lánc gálókkal együtt 20 percig 37 ºC-on inkubáltunk. A mérõelegy összetétele a következõ volt: 50 mm Tris-HCl, 0.6 mm MnCl 2, 30 mm nátrium-citrát, 0.2 % Triton X-100, 2 U/ml izocitrát dehidrogenáz (NADP + + 16

hozzáadásával indítottuk, a fluoreszcens intenzitást 344 nm-es excitációs és 460 nmes emissziós hullámhosszakon mértük PTI Deltascan fluoreszcens A NADPH koncentráció változását kalibrációs görbe h) Hidrogén peroxid felszabadulás mérése Amplex Red módszerrel. A H 2 O 2 felszabadulás meghatározáshoz Amplex Red Hydrogen Peroxide Assay Kit-et (Molecular Probes) használtunk. Torma-peroxidáz jelenlétében az Amplex Red reagens 1:1 sztöchiometriai arányban reagál a H 2 O 2 -dal, miközben fluoreszcens rezorcin képzõdik (Mohanty et al., 1997). Miután a szinaptoszómát (1 mg/ml) különbözõ koncentrációjú rotenon ill. antimycin jelenlétében 20 percig inkubáltuk, 100 µl mintát hozzáadtunk 100 µl Amplex Red reakcióelegyhez és a H 2 O 2 képzõdést Wallac Victor 2 mikroplate fluoriméterrel követtük 25 ºC-on. hullámhossz 560 nm volt, a fluoreszcens emissziót 590 nm-en mértük. Az egyes 2O 2 -dal. 17

EREDMÉNYEK I. Primer patkány agyi kapilláris endothel sejteken végzett kisérletek A. Primer patkány agyi kapilláris endothel tenyésztés módszerének továbbfejlesztése és adaptálása a fluoreszcens mérési technika követelményeihez Az RBCEC tenyésztés során általánosan alkalmazott I típusú kollagénnel bevont mûanyag aljzat olyan nagy háttér fluoreszcenciával bírt, amely intracelluláris kalcium méréseink során elfedte a biológiai szignált. Ezért az Abbott és mtsi. (1992) által kifejlesztett sejttenyésztési módszert továbbfejlesztettük a képalkotó fluorimetriás mérések követelményeinek megfelelõen (Dömötör et al. 1998). A sejteket extracelluláris biológiai mátrixszal (ECM) bevont üveglemezen tenyésztettük (Gospodarowicz 1984), ezáltal a háttér fluoreszcencia jelentõsen csökkent. Így a sejttenyészet alkalmassá vált mikrofluorimetriás vizsgálatokra, pl. Fura-2 kalcium szenzitív festékkel végzett intracelluláris kalcium mérésre. Ugyanakkor meg kellett bizonyosodnuk arról, hogy az új sejttenyésztési technika során a primer RBCEC tenyészet megõrizte tisztaságát, morfológiai tulajdonságai nem változtak, és növekedésének sebessége sem csökkent. Ezért a sejteket négy különbözõ aljzatra ültettük ki (ECM-mel bevont mûanyag és üveglemez, kollagénnel borított mûanyag és üveg aljzat), az üveglemez kollagénes bevonásakor karbodiimides kezelést alkalmaztunk, mely elõsegítette a kollagén jobb letapadását az üvegre (Nobles and Abbott 1996). Ezután összehasonlítottuk a párhuzamos RBCE tenyészetekben a kapillárisok letapadási készségét valamint az endothel sejtek növekedésének Bár az RBCE sejtek mind a négy felszínen idõvel összefüggõ monolayert alkottak, a kapilláris fragmentek kitapadásának valószínûsége és a sejtek növekedésének üteme jelentõs eltérést mutatott (2. ábra). 18

kiültetett kapilláris fragmentumok és az azokból kinövõ endothel sejtek láthatók 150x-es nagyításban. A legtöbb kapilláris darabka az ECM-mel bevont üveglemez felszínén horgonyzódott ki és az endothel sejtek növekedésének üteme is itt volt a leggyorsabb. Ugyanakkor a háttér fluoreszcencia mértéke 5-20x kisebb volt, mint a mûanyag aljzat alkalmazásakor. 19

A továbbiakban immunocitokémiai vizsgálattal bizonyítottuk az ECM-mel bevont üveglemezen tenyésztett sejtek endothel eredetét, elektronmikroszkópos vizsgálattal kimutattuk az agyi kapilláris endothelre jellemzõ kapcsoló struktúrák (tight junction) jelenlétét. a b 3. ábra RBCE sejtek (a) fénymikroszkópos és (b) elektronmikroszkópos képe a tenyésztés hetedik napján. 20

Az ECM-mel bevont üvegfelszínen tenyésztett sejtek (3./a ábra, 150x nagyítás) az immuncitokémiai festés során az endothelre jellemzõ von Willebrand faktor pozitivitást mutattak. Az elektronmikroszkópos felvételen két egymáshoz szorosan kapcsolódó endothel sejt látható, a nyilak a tight junction-ra jellemzõ membránkapcsolódásokra mutatnak. A sejtekben (m) mitokondriumok és () kiterjedt 21

B. Nukleotid receptor mintázat farmakológiai karakterizációja primer RBCE sejteken Mivel az agyi kapilláris endothelium nukleotid receptoraira vonatkozó ismereteink fõleg endothel sejtvonalakból származnak (Nobles et al. 1995, Feolde et al. 1995, Vigne et al. 1998), amelyekben a receptor mintázat sok tekintetben eltérhet a fiziológiásan jellemzõ receptor mintázattól. Ezért munkánkban az elõzõekben bemutatott biológiai mátrixon növesztett primer patkány agyi kapilláris endothel sejtek nukleotid receptor karakterizációját végeztük el. A primer sejtkultúrák, fenntartásokkal bár, de a fiziológiáshoz leginkább közelálló rendszereknek tekinthetõk. a) Nukleotid receptor agonisták hatására kialakuló intracelluláris kalcium Az ioncsatorna P2X család extracelluláris kalciumot enged be a sejtekbe, a P2X receptor agonisták hatáserõsségi sorrendje általában a következõ: α,βmeatp>atp>2mesatp ~ADP (Abbracchio and Burnstock 1994). Primer RBCE sejtekben a P2X agonista á,â-meatp hatására nem következett be [Ca 2+ ] i változás, és az ATP kiváltotta [Ca 2+ ] i emelkedést a külsõ kalcium jelenléte nem befolyásolta (Dömötör et al. 1999). A P2X/P2Y agonista 2-MeSATP kiváltotta [Ca 2+ ] i szignál nagysága és alakja az extracelluláris kalcium megvonás hatására nem változott (4./a ábra). A továbbiakban a P2Y nukleotid receptorok karakterizációjához az RBCE sejteket ATP-vel és több más nukleotid receptor agonistával kezeltük. Az 2+ ] i emelkedések nagyságát összehasonlítva megállapítottuk a nukleotidok hatáserõsségi sorrendjét (4./b ábra). Az UTP kiváltotta [Ca 2+ ] i jel nagysága kissé nagyobb volt (ÄR=0.82±0.017 és ÄR=0.74±0.018, p<0.05, (ÄR= fluoreszcens ratio változás). A 2-MeSATP okozta kalcium jel (ÄR=0.69±0.04) kisebb volt mint az ATP kiváltotta, de nem volt közöttük szignifikáns különbség. Az ADP-re és adenozinra bekövetkezõ [Ca 2+ ] i változás (ÄR=0.39±0.04 és ÄR=0.19±0.05, p<0.05) szignifikánsan kisebb volt, mint az ATP okozta [Ca 2+ ] i emelkedés. A P2Y 1 agonista 2-MeSADP kiváltotta [Ca 2+ ] i szignál (ÄR=0.36±0.02) szignifikánsan kisebb volt mint az ATP jel, de nem különbözött az ADP okozta [Ca 2+ ] i változástól. 22

a 700 600 standard médium Ca 2+ -mentes médium 500 [Ca 2+ ] i nm 400 300 200 b 100 2-MeSATP 2-MeSATP 0 0 10 20 30 40 50 60 idõ (sec) 1.6 1.4 UTP Fluoreszcens ratio 1.2 1.0 0.8 0.6 ATP 2-MeSATP ADP Ade 2-MeSADP 0.4 0.2 50 sec 4. ábra (a) 2-MeSATP kiváltotta [Ca 2+ ] i szignál RBCE sejtekben. A 2-MeSATP (100 ìm, 8s) által kiváltott [Ca 2+ ] i jel nagysága Ca 2+ -os (standard) és Ca 2+ -mentes médiumban nem különbözött szignifikánsan egymástól (454 ±25.2 nm, n=37, versus 442 ±27.5 nm, n=36). (b) Az agonisták által okozott [Ca2+]i változás reprezentatív átlaggörbéi RBCE sejtekben. Az µm koncentrációban 8 szekundumon át alkalmaztuk, minden kisérletet friss, még stimulálatlan mintán végeztünk. (n= a vizsgált sejtek száma; ATP (n=140), UTP (n=147), 2-MeSATP (n=90), 2- MeSADP (n=50), ADP (n=60), adenozin (Ade) (n=50)). 23

b[ca2+]i nm b) Farmakológiai bizonyíték a P2Y 1 és a P2Y 2 nukleotid receptorok együttes jelenlétére primer patkány agyi kapilláris endothel sejteken Vigne és mtsi. (1989) B7 patkány agyi endothelium eredetû sejtvonalon kimutatták a P2Y receptor család két altípusát, az ATP-re és UTP-re egyformán szenzitív P2Y 2 altípust, és a P2Y 1 MeSATP>ADP>ATP volt. A 4./b ábrán jól látható, hogy primer kapilláris endothel sejtekben az ATP és az UTP közel azonos nagyságú [Ca 2+ ] i emelkedést okozott. Kisérleteinkben ATP-vel [Ca 2+ ] i emelkedést váltottunk ki az RBCE sejtekben, majd a jel lecsengése után ATP folyamatos jelenlétében UTP-t (5./a ábra) vagy 2-MeSATP-t (5./b ábra) adtunk a sejtekhez. Az 5. kisérletekben bizonyítottuk, hogy az ATP és az UTP közös receptoron hat, míg a 2- MeSATP kiváltotta szignál ettõl eltérõ eredetû. ATP folyamatos jelenlétében az UTP kiváltotta [Ca 2+ ] i jel elhanyagolható volt (5./a ábra), míg a 2-MeSATP-re adott [Ca 2+ ] i szignál változatlan maradt (5./b ábra). ATP és UTP együttes alkalmazásakor az endothel sejtekben a [Ca 2+ ] i emelkedés nem különbözött attól, mint amikor az agonistákat önmagukban alkalmaztuk. Ezzel szemben ATP-t és 2-MeSATP-t együttesen adva a [Ca 2+ ] i jel összeadódott (5./c ábra). a 1000 1000 800 800 2-MeSATP [Ca 2+ ] i nm 600 400 UTP 600 400 200 200 0 ATP 0 ATP 0 40 80 120 160 200 idõ (sec) 0 40 80 120 160 200 idõ (sec) 5. ábra A kereszt-deszenzitizáció jelensége, mint bizonyíték a P2Y 1 és P2Y 2 nukleotid receptor altípusok együttes jelenlétére RBCE sejtekben. Az µm koncentrációban, 8 szekundumon át alkalmaztuk minden kisérletnél. Az (a) és (b) ábra két reprezentatív on line mérést mutat be. 24

c 800 700 [Ca 2+ ] i emelkedés (nm) 600 500 400 300 200 ATP UTP 2MeSATP ATP + UTP 2MeSATP + ATP 100 5. ábra 0 (c) 2+ ] i emelkedés átlaga ± standard error látható (ATP n=140, UTP n=50, 2-MeSATP n=90, ATP+UTP n=40, ATP+2-MeSATP n=50). Az adenozin 3 -foszfát 5 -foszfoszulfát (PAPS) a P2Y 1 receptorok szelektív antagonistája (Bültmann et al., 1998). PAPS jelenlétében a P2Y 1 receptor agonista 2-MeSADP nem okozott [Ca 2+ ] i változást az RBCE sejtekben (6. ábra), ezzel további bizonyítékot szolgáltatott a P2Y 1 és P2Y 2 altípus együttes jelenlétére az agyi kapilláris endothel sejtekben. a 350 b 350 300 300 250 250 [Ca 2+ ] i nm 200 150 [Ca 2+ ] i nm 200 150 100 2-MeSADP 2-MeSADP 100 2-MeSADP 2-MeSADP+PAPS 50 50 0 0 0 20 40 60 80 100 120 140 idõ (sec) 0 20 40 60 80 100 idõ (sec) 6. ábra P2Y 1 receptor agonista és antagonista együttes hatása primer RBCE sejtek [Ca 2+ ] i [Ca 2+ ] i emelkedés (n=37). (b) A 2-MeSADP (100 µm) kiváltotta [Ca 2+ ] i jel, ) 2+ ] i jel összehasonlítása (n=35). 25

c) A P2Y 2 és P2Y 4 nukleotid receptor altípusok farmakológiai elkülönítése RBCE sejtekben Mivel a klónozott P2Y 2 és P2Y 4 receptorok egyformán szenzitívek ATP-re és UTP-re is (King et al., 1998), ezért további vizsgálatokat végeztünk, melynek eredményeként eldönthetõ, hogy az RBCE sejtekben melyik altípus található meg. 700 a Increase in [Ca2+] i nm 500 400 300 200 100 0 elsõ jel második jel harmadik jel kontroll teszt 700 b Increase in [Ca2+]i nm 500 400 300 200 100 0 elsõ jel második jel harmadik jel kontroll teszt 600 600 500 500 [Ca 2+ ] i nm 400 300 200 100 0 ATP Suramin ATP ATP [Ca 2+ ] i nm 400 300 200 100 0 Suramin UTP UTP UTP 0 50 100 150 200 250 300 idõ (sec) 0 50 100 150 200 250 300 idõ (sec) 7. ábra Suramin hatása az ATP és UTP kiváltotta [Ca 2+ ] i emelkedésre. Az elsõ (a) ATP vagy (b) UTP (100 µm, 10 s) kiváltotta [Ca 2+ ] i jel lecsengése után a sejteket suramin (100 µm, 100 s) jelenlétében másodszor is stimuláltuk az agonistákkal. Az antagonista kimosása után (a) ATP-vel (100 µm, 10 s) vagy (b) UTP-vel (100 µm, 10 s) harmadszor is agonista-indukálta [Ca 2+ ] i választ váltottunk ki az RBCE sejtekben. Az ábrán három párhuzamos mérésbõl származó adatok (40-50 sejt) átlaggörbéje látható. Az oszlopdiagramm az agonisták (a) ATP és (b) UTP hatására bekövetkezõ [Ca 2+ ] i emelkedések mértékét mutatja. A kisérletek kontrolljaként az agonistákat háromszor egymás után antagonista jelenléte nélkül alkalmaztuk (szignifikáns különbséget jelent, p< 0.05). 26

Az agonistákat suramin jelenlétében teszteltük, amely a P2Y 2 receptor altípus szelektív gátlószere (King et al., 1998, Bogdanov et al., 1998). A sejteket elõször ATP-vel kezeltük, melyre azok [Ca 2+ ] i emelkedéssel válaszoltak. Amikor az agonista megvonása után a [Ca 2+ ] i szint visszatért a kiindulási értékre, az ATP-t és a suramint együttesen alkalmaztuk, de ekkor a [Ca 2+ ] i emelkedés elmaradt. Az antagonista kimosása után az ATP kiváltotta [Ca 2+ ] i választ ismét visszakaptuk (7./a ábra). Hasonló kisérleti kondiciókban az UTP-re adott [Ca 2+ ] i jelet a suramin jelentõsen (66%) csökkentette (7./b ábra). d) Adenozin receptor karakterizáció agyi kapilláris endothel sejteken Az adenozin receptor altípus-specifikus agonistáinak alkalmazásával kerestük a választ arra a kérdésre, hogy milyen típusú adenozin receptorok találhatók az RBCE sejtekben. 300 250 [Ca 2+ ] i nm 200 150 100 nm CPA 100 0 10 20 30 40 50 60 idõ (sec) 8. ábra A 1 típusú adenozin receptor jelenléte RBCE sejtekben. A szelektív A 1 agonista CPA (100 nm, 10 s) hatására a vizsgált sejtek 40%-a [Ca 2+ ] i emelkedéssel válaszolt (n=38), míg egyéb altípus-szelektív agonisták (NECA, CGS 21680) alkalmazásakor a válasz elmaradt. Kisérleteink során mind a CGS-21680, amely az A 2A család specifikus agonistája (Poulsen and Quinn, 1998), mind az A 2B specifikus agonista NECA (Dubey et al., 2000) jelelétében elmaradt az RBCE sejtekben az agonista kiváltotta [Ca 2+ ] i válasz. 27

Az A 1 receptor agonista CPA a vizsgált sejtek 40%-ban okozott [Ca 2+ ] i emelkedést (8. ábra), és a jel nagysága kb. 25%-a volt az ATP kiváltotta [Ca 2+ ] i válasznak, amely arányaiban megegyezik a 4./b ábrán látottakkal. e) A nukleotid receptor fenotípus jellemzése RBCE sejteken; az ECM sejtdifferenciációt-génexpressziót segítõ hatásának vizsgálata Agonista Nobles et al., 1995 RBE4 választ adó sejtek száma % -ban FR/ FRATP % Albert et al., 1997 primer RBCEC választ adó sejtek száma % -ban FR/ FRATP % Sipos et al., 2000 primer RBCEC ECM-on növesztve választ adó sejtek száma % -ban FR/ FRATP % Sipos et al., 2000 primer RBCEC patkányfarok kollagénen növesztve választ adó sejtek száma % -ban FR/ FRATP on ECM % ATP 100 100 100 100 100 100 100 43 UTP 100 92 71 100 100 105 98 42 ADP 100 58 84 100 100 72 100 41 2-MeSATP 17 75 70 100 100 102 66 51 adenozin nincs adat - nincs adat - 63 30 0 0 1. táblázat Agonista-indukált [Ca 2+ ] i válaszok összehasonlítása különféle RBCE sejtekben. A kollagénes és a biológiai ECM-os felszínen nevelt RBCE sejtek farmakológiai vizsgálatából kiderült, hogy a kollagénes aljzaton nevelt sejtekben nem expresszálódott adenozin-szenzitív receptor. Továbbá a 2-MeSATP-re kevesebb sejt [Ca 2+ ] i emelkedéssel, és az agonista-indukálta Ca 2+ -jel nagysága is kisebbnek bizonyult (1. táblázat). 28

II. A légzési komplex gátlás és a reaktív oxigén származékok termelõdése közötti kapcsolat kvantitatív jellemzése izolált agyi Figyelembe véve, hogy számos neurodegeneratív betegségben a mitokondriális komplexek gátlását figyelték meg, ezért azt kivántuk vizsgálni, hogy az egyes komplexek esetén milyen mértékû gátlás szükséges ahhoz, hogy a mitokondriumokban fokozott ROS termelés történjen. Megmértük a légzési komplexek (I-es, III-as és IV-es komplex) aktivitását szelektív gátlószereik jelenlétében izolált agyi idegvégzõdésekben (szinaptoszóma), és ezzel párhuzamosan a szinaptikus mitokondriumokban in situ követtük a ROS keletkezés mértékét az akonitáz aktivitás mérésének segítségével. Emellett közvetlenül is megmértük a H 2 O 2 felszabadulást szinaptoszómákban az Amplex Red módszer segítségével a rotenon ill. antimycin kezelést követõen. a) Mitokondriális légzési komplexek aktivitásának vizsgálata szelektív A szinaptoszómákat elõinkubáltuk különbözõ koncentrációjú rotenon (komplex I gátló), antimycin (komplexet III gátló), vagy a IV-es komplexre specifikus cianid jelenlétében (20 perc, 37 ºC), majd megmértük az egyes légzési komplexek aktivitását. Miközben a rotenon koncentrációját 5-1000 nm között változtattuk az I-es komplex aktivitása a kiindulási értékrõl (50.0 ± 2.3 nmol/min/mg protein) a nullára csökkent (9./a ábra). A III-as komplex aktivitása (30.14 ± 0.92 nmol/min/mg protein) a növekvõ antimycin koncentráció (1-2000 nm) hatására folyamatosan csökkent, de némi reziduális aktivitás magas antimycin koncentrációk esetén is mérhetõ volt (9./b ábra). A cianid (1-2000 µm) dózis-függõen csökkentette a IV-es komplex aktivitását (9./c ábra). 29

a b 60 35 komplex I aktivitás (nmol/min/mg protein) 50 40 30 20 10 komplex III aktivitás 0 kontroll 0.01 0.1 1 10 100 1000 10000 (nmol/min/mg protein) 30 25 20 15 10 5 0 kontroll 0.01 0.1 1 10 100 1000 10000 rotenon (nm) antimycin (nm) 120 komplex IV aktivitás (nmol/min/mg protein) 100 80 60 40 20 c 0 kontroll 0.01 0.1 1 10 100 1000 10000 CN- (mm) 9. ábra Légzési komplex aktivitások meghatározása specifikus légzési komplex inhibitorok jelenlétében. Komplex I gátlás rotenon (a), komplex III gátlás antimycin (b) és komplex IV gátlás cianid (c) hatására. A kontroll aktivitások az egyes komplexek esetén a következõk voltak (nmol/min/mg): 50.0±2.3 a komplex I; 30.14±0.92 a komplex III és 88.2±9.15 a komplex IV Az adatok négy kisérlet átlagát jelentik ± standard error. Ahol a az átlagot jelzõ szimbólum fedi. -gal a p<0.05). a reaktív oxigén származékok keletkezésének indikátora A kisérletek során rotenon, antimycin vagy cianid növekvõ koncentrációjának függvényében követtük az akonitáz aktivitás csökkenésének mértékét (10. ábra). Kötelezõ kontrollként megmértük, hogy a légzési komplex gátlók önmagukban a 30

tisztított enzim aktivitását nem csökkentették. Rotenon jelenlétében (10-2000 nm) az akonitáz aktivitás kismértékû csökkenést mutatott (10./a ábra), és a legnagyobb alkalmazott koncentráció esetén is megmaradt a kontroll aktivitás 82%-a. Az antimycin akonitázt gátló hatása ennél jóval kifejezettebb volt, 1 µm antimycin jelenlétében a kontroll aktivitás 19%-a volt mérhetõ (10./b ábra). Cianid jelenlétében az akonitáz aktivitás dózisfüggõ csökkenést mutatott, a legmagasabb alkalmazott cianid koncentráció esetén (2 mm) a megmaradó enzimaktivitás a kontroll 57%-a volt a 100 b 100 akonitáz aktivitás (nmol/min/mg protein) 80 60 40 20 0 kontroll 0.1 1 10 100 1000 10000 c rotenon (nm) akonitáz aktivitás (nmol/min/mg protein) 100 80 60 40 20 akonitáz aktivitás (nmol/min/mg protein) 80 60 40 20 0 kontroll 0.1 1 10 100 1000 10000 antimycin (nm) 0 kontroll 1 10 100 1000 10000 CN - (mm) 10. ábra Akonitáz aktivitás mérés légzési komplex inhibitorok jelenlétében. A mintákat (1mg/ml szinaptoszóma) (a) rotenon, (b) antimycin és (c) cianid növekvõ koncentrációival 20 percig 37 ºC-on inkubáltuk. A kontroll akonitáz aktivitás 82.0±2.7 nmol/min/mg protein volt. Az adatokat legalább négy kisérletbõl számolt átlag ± standard error formájában tüntettük fel. - gal a kontrolltól szignifikánsan eltérõ értékeket jelöltük (p<0.05). 31

c) Kvantitatív összefüggés a légzési lánc gátlás és a reaktív oxigén származékok keletkezése között szinaptoszómákban A 11. ábrán a rotenon, antimycin vagy cianid növekvõ koncentrációjának jelenlétében mért légzési lánc gátlás függvényében ábrázoltuk a relatív akonitáz aktivitásokat, és megállapítottuk azt a gátlás küszöböt, amelyet meghaladva már kifejezett akonitáz gátlás mérhetõ. a akonitáz aktivitás (kontroll %-a) 100 80 60 40 20 0 (10) (50) (100) (1000) 0 20 40 60 80 100 komplex I gátlás (kontroll %-a) b akonitáz aktivitás (kontroll %-a) 100 80 60 40 20 0 (5) (25) (50) (1000) (10) 0 20 40 60 80 100 komplex III gátlás (kontroll %-a) c akonitáz aktivitás (kontroll %-a) 100 80 60 40 20 0 (0.01) (0.25) (0.5) (2) (0.1) 0 20 40 60 80 100 komplex IV gátlás (kontroll %-a) 11. ábra A légzési komplex gátlás és a reaktív oxigén származékok keletkezése közötti kvantitatív összefüggés jellemzése. Az akonitáz aktivitást a komplex I (a), komplex III (b) és a komplex IV (c) gátlásának függvényében fejeztük ki. Az enzimaktivitás és komplex gátlás %-os értékei a 9. adataiból származnak, 100%-nak a kontroll értéket tekintettük. A zárójelbe tett számok a megfelelõ gátlószer koncentrációját jelentik, a rotenon és antimycin esetén nm-ban, a cianidnál µm-ban. Az adatok négy kisérlet átlagát jelentik ± standard error. -gal a megfelelõ kontrolltól szignifikánsan eltérõ értékeket jelöltük (p<0.05). 32

Növekvõ rotenon koncentrációk okozta komplex I gátlás hatására folyamatos akonitáz aktivitás csökkenés következett be, de a komplex I teljes gátlása is mindössze 18%-os csökkenést okozott az enzimaktivitásban (11./a ábra). Az is megfigyelhetõ azonban, hogy már kismértékû (16%) komplex I gátlás hatására is szignifikáns akonitáz aktivitás csökkenés következett be. Ezzel ellentétben 71%-os antimycin okozta komplex III gátlás esetén csak jelentéktelen akonitáz gátlás volt megfigyelhetõ, ha azonban a komplex gátlás ezt a küszöböt meghaladta, akkor drámai akonitáz aktivitás csökkenés következett be (11./b ábra). Hasonló képet mutatott a komplex IV gátlásának függvényében kifejezett akonitáz aktivitás is, itt a 71%-os küszöböt meghaladó komplex IV gátlás után jelentkezett az enzimaktivitás jelentõs csökkenése (11./c ábra). felszabadulás mérése szinaptoszómában. Az Amplex Red módszer alkalmasnak bizonyult a rotenon vagy antimycin okozta légzési lánc gátlás során felszabaduló H 2 O 2 direkt detektálására, a cianid azonban reakcióba lép az Amplex Red reagenssel, ezért a komplex IV gátlás során a 2O 2 mennyiségét ezzel a módszerrel nem tudtuk meghatározni. A szinaptoszómákat rotenonnal (10-1000 nm) 20 percig elõinkubáltuk, majd az Amplex Red módszer segítségével meghatároztuk a felszabaduló H 2 O 2 mennyiségét. 50 nm-os, vagy ezt meghaladó rotenon koncentrációk esetén a kontrollhoz képest szignifikánsan nagyobb H 2 O 2 felszabadulás látottakkal (10./a ábra). Az antimycin okozta ROS termelés miatti akonitáz aktivitás csökkenéshez (10./b ábra) hasonló eredményt kaptunk a H 2 O 2 felszabadulás mérése során, kivéve a 10 nm-os antimycin koncentrációt, ahol a H 2 O 2 felszabadulás mértéke nem különbözött a kontrolltól (12./b). Az antimycin jelenlétében nagyobb mértékû H 2 O 2 felszabadulást tapasztaltunk mint a rotenon jelenlétében, mely jól tükrözi a 10. ábrán bemutatott jelenséget, ahol az antimycin kifejezettebb akonitáz aktivitás csökkenést okozott mint a rotenon. 33

a H2O2 (pmol/ min/ mg protein) b 70 60 50 40 30 20 10 0 kontroll 10 50 100 1000 Rotenon (nm) H2O2 (pmol/ min/ mg protein) 70 60 50 40 30 20 10 0 kontroll 5 10 25 50 Antimycin (nm) 12. ábra Légzési komplex gátlás során a szinaptoszómákból felszabaduló hidrogén peroxid mennyiségének meghatározása. (1mg/ml protein) (a) rotenon és (b) antimycin különbözõ koncentrációival 20 percig 37 ºC-on inkubáltuk, majd Amplex Red kit segítségével mértük a 2O 2 mennyiségét. Kezeletlen szinaptoszóma esetén 21.1±0.66 pmol/min/ mg protein volt a kontroll H 2 O 2 felszabadulás. Az adatok legalább három kisérletbõl számolt átlag ± standard error formájában vannak feltüntetve. -gal a kontrolltól szignifikánsan eltérõ értékeket jelöltük (p<0.05). 34

e) Hidrogén peroxid felszabadulás vizsgálata a komplex I és a komplex III Az elõzõekben bemutattuk, hogy a légzési lánc gátlása in situ mitokondriumokban a az Amplex Red módszer segítségével közvetlenül mértük a szinaptoszómában a komplex gátlásra bekövetkezõ H 2 O 2 felszabadulás mértékét, és bizonyítottuk a különbözõ légzési lánc gátló jelenlétében bekövetkezõ ROS képzõdés eltérõ jellegét. 280 (50) H 2 O 2 felszabadulás (a kontroll %-a) 240 200 160 120 komplex I gátlás rotenonnal komplex III gátlás antimycinnel (10) (50) (100) (5) (25) (10) (1000) 80 0 20 40 60 80 100 %-os komplex gátlás 13. ábra Hidrogén peroxid felszabadulás szinaptoszómából a légzési lánc gátlásának A kontroll értéket tekintve 100%-nak a felszabaduló H 2 O 2 mennyiségét ill. a komplex I () rotenonnal és a komplex III () antimycinnel okozott gátlásának mértékét %-ban fejeztük ki ± standard error. A szinaptoszómákat 20 percig inkubáltuk a gátlószer jelenlétében, majd 25 ºC-on megmértük a felszabaduló H 2 O 2 mennyiségét. Zárójelben feltüntettük az alkalmazott gátlószer koncentrációkat (nm). A kontroll H 2 O 2 felszabadulás mennyisége 21.1 ± 0.9 pmol/min/mg protein volt. A 13. ábra a különbözõ koncentrációjú rotenonnal ill. antimycinnel elõkezelt szinaptoszóma H 2 O 2 függvényében. Az akonitázzal végzett kisérletekhez (11. ábra) hasonlóan a komplex I kismértékû (10%) gátlása is szignifikáns növekedést okozott a H 2 O 2 felszabadulásban, 35