3. A plazmamembrán molekuláris szerveződése és annak dinamikája Fehérje-,lipid-mobilitás (laterális diffúzió) és kompartmentalizáció a plazmamembránban
Milyen információt adnak a fehérjék mozgási (diffúziós) tulajdonságai lokalizációjukról, mikrokörnyezetükről és molekuláris kapcsolatrendszerükről? D: diffúziós állandó (a mozgás sebessége) f: a vizsgált molekulák mobilis hányada (%) nyomvonal: a mozgás jellege (random walk, irányított, vagy gátolt diffúzió) ko-mobilitás: 2 molekula együtt mozog vagy nem? (korrelációs mikroszkópia, FCS; FCCS)
Speciális CLSM mikroszkópiás technológiák a fehérje diffúzió/kölcsönhatások vizsgálatára Single Particle/Dye Tracking (SPT/SDT) Fluorescence Recovery after Photobleaching (FRAP) Fluorescence Correlation Spectroscopic imaging (FCS, FCCS) Cél: lokális molekuláris diffúzió, kölcsönhatás(ok) vizsgálata sejtekben
Single Particle Tracking (SPT): video-microscopy - low light level excitation, intensified/enhanced contrast videocamera - series (n) of short exposition videoframes (dt) videomovie, tracking Rhodamine-labeled LDL particles on human fibroblasts Rhodamine-labeled Influenza virus particles on human fibroblasts Kamerasebesség: <10.000 frame/sec: nem figyelhetők meg mikrokompartmentek... (hadiipari kamera kell!)
Single Particle Tracking (SP(D)T) alacsony fényű, hiperszenzitív (gyors) videomikroszkópiával: a nyomvonalak (track) statisztikai kiértékelése /molekulák jelzése: immuno-gold gyöngy vagy fluoreszcens festék/
Az irányított mozgás esetei: (diffúzió + flow) <x 2 > = 4 D t + (V t) 2
A gátolt diffúzió esetei és lehetséges okai: - membránszkeletális kerítéshatás : hosszú citoplazmatikus doménnel rendelkező fehérjék esete - kapcsolódás citoszkeletonhoz és/ vagy citoszkeleton-kötött fehérjékhez - kompartmentalizáció lipid mikrodoménekben, diffúziós barrier
FRAP Fluorescence Recovery After Photobleaching ( Fotohalványítás utáni fluoreszcencia visszatérés )
Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) V 0.25 fl illuminated volume F(t) time
Példa: koleszterin-specifikus antitestek gátolják a célsejtek (humán makrofág és Th sejt) HIV általi fertőzését Kérdés: mi a mechanizmusa ezen ellenanyagok gátló hatásának a célsejtek felszínén? 1. Az antitestek a gangliozid-gazdag raftok koaleszcenciáját váltják ki- CLSM intenzitáseloszlás analízis 2. Az antitestek fokozzák a CXCR4 kemokin receptor raftasszociációját és kolokalizációját a CD4 molekulával CLSM kolokalizáció analízis 3. Befolyásolják-e az antitestek a CXCR4 és CD4 HIV receptor molekulák laterális mobilitását és ha igen hogyan? FCS mikroszkópiás analízis
A koleszterin-specifikus antitestek kötődése jelentősen lelassítja a CXCR4 laterális diffúzióját, de a CD4-ét és a non-raft CD2 fehérjéét (kontroll) nem! Beck és mtsai., 2010, J Lipid Research
Domain size for some proteins as detected and estimated from mobility measurements
LIPID MIKRODOMÉNEK A BIOLÓGIAI MEMBRÁNOKBAN
Jellegzetes membrán mikrodomének Caveolák 1994, Parton és mtsai. (Science) lipid raftok 1997, Simons, Ikonen (Nature) CHCP (chlatrin coated pit)
A caveola mikrodomének szerkezete Membrane protein sphingolipid glycerophospholipid cholesterol Caveolin cholesterol-binding structural/scaffolding protein caveola 50-80 nm
Caveola and CHCP microdomains: electron microscopic images Cav CHCP Cav CHCP Freeze-fractured inner surface of fibroblast : caveolas and chlatrin-coated pits
The caveolas expression is tissue/cell-type specific and Caveolin gene-dependent Caveolin-1 localization (CP,G) in resident macrophages In elicited/activated macrophages Cav1: (CP, membrán) Domain structure and binding sites of caveolin-1 protein human macrophage (U937) green: caveolin-1; red: ACHA (membrane CHOL) Biro et al, 2007 J Lipid Res
Immune-caveolas A scheme of caveola-mediated pathogen internalization and processing Cav1 Elicited macrophage (green: Cav1)
Glycosphingolipids (GSL) raft Liquid ordered (Lo) phase? GPI-proteins GPI glycerophospholipids (fluid phase) cholesterol sphingomyelin acylated proteins (e.g. Src kinases)
Solubilization of membrane proteins with detergents - strong / ionic detergents: e.g. octyl-glycoside, SDS Full solubilization - weak /non ionic detergents: e.g. Triton X-100, CHAPS, NP-40, Brij 97, Lubrol partial or full resistance! sphingolipid glycerophospholipid detergent-sensitive lipid raft cholesterol
Lipid composition of DRM fractions Lipid % of total membrane lipid in DRM Cell type - cholesterol - sphingomyelin - gangliosides - foszfatidiletanolamin (PE) - foszfatidilszerin (PS) - foszfatidilkolin (PC) - foszfatidilinozitol (PI) 26 11 30-35 32 90 50-70 67 85-90 6 10 4 5 MDCK epithel cells fibroblasts lymphocyte microglia, neuron MDCK epithel cells fibroblasts MDCK epithel cells B, T-lymphocytes MDCK epithel cells fibroblasts lymphocyte microglia - PIP2 - ceramide - DAG 50 40 50 50 MDCK epithel cells lymphocyte MDCK epithel cells A431 fibroblasts