A növényi n nyi biotechnológia és s géntechnolg ntechnológia alapjai (Bevezetés és történeti áttekintés) Oktatási segédanyag EKF Növénytani és Növényélettani Tanszék Szerkesztette: Dr. Marschall Marianna A felhasznált forrás: Dudits Dénes, Heszky László: Növényi biotechnológia és géntechnológia, Agroinform Kiadó, Budapest, 2003 1
Eszterházy zy Károly Főiskola, F Természettudom szettudományi Kar, Biológia alapképz pzési szak (BSC) forrás: HEFOP 3.3.1 p 2004 2004 06 00161.000161.0 Oktatási segédanyag a növényi biotechnológia tantárgy egyes fejezeteihez. A tantárgy leírása: A növényi biotechnológia és géntechnológia alapjait ismerteti meg a 3. félévben a törzsanyagban és a 6. félévben a differenciált törzsanyagban szereplő tárgy az in vitro növény-sejt-növény rendszer (morfogenezis, organogenezis, szomatikus embriogenezis), az ivaros szaporodás biotechnológiája (embrió- és portokkultúrák, generatív sejt-, szerv- és szövettenyészetek, az apomixis biotechnológiája), az ivartalan szaporodás biotechnológiája, a genetikailag módosított (GM) növények, az abiotikus, biotikus és az anyagcseréjükben módosított stresszrezisztens transzgénikus növények című témakörök részletes bemutatásán keresztül. Kitér a növényi géntechnológia kockázataira, társadalmi jelentőségére és törvényi szabályozására. A növényi szövettenyésztés alapjaival foglalkoznak a 6. félévben sorrakerülő gyakorlatok a kalluszkultúra indukció, a direkt és indirekt morfogenezis, a portokkultúra és haploid növények létrehozása, embriókultúra, protoplasztizoláció és kultúra című témakörök bemutatásával. 2
A problémafelvetés 1 főre jutó termőterület nagysága a világon 1950 2025 (várható) 0,51 ha 0,17 ha Az alap- és alkalmazott növénytudományok feladata a szükségletek 0.17 ha-on való kielégítése. molekuláris biológia biotechnológia, géntechnológia legújabb eredményeinek ötvözése és továbbfejlesztése 3
A növénytermesztn nytermesztés molekuláris megközel zelítésben: néhány tucat növényfaj életfolyamatainak a hasznosítása a társadalom számára cukor fehérje olaj cellulóz alkaloidok, stb előállítása vegyi üzemek = növényi sejtek által termelő folyamat: a növények anyagcseréje 4
A klasszikus biotechnológia fogalma klasszikus biotechnológia, v. biológiai technológia: v.mely élőszervezet (pl. mikroorganizmus) v. annak alkotórészei (enzimei) végzik a termék előállítását (műszaki aszpektus) Gyógyszeripar Élelmiszeripar Takarmánytartósítás főként mikrobiális fermentáció, erjesztés 5
Új j biotechnológia, növényi n nyi biotechnológia Az új biotechnológiai eljárásokban az ember által v.milyen szempontból megváltoztatott, genetikailag módosított élőszervezetek vesznek részt: - mikroorganizmusok - növényi sejtek - állati sejtek - növények - állatok Növényi biotechnológia: a növények, növényi sejtorganellumok genetikai programjának megváltoztatását és az így kialakított új képességeik technológiai felhasználását jelenti. 6
GM növényekn nyek Géntechnológiával módosított, ún. transzgénikus növények: amelyek sejtmagjába (genomjába) a géntechnológia molekuláris módszereivel idegen gént (transzgént) juttatnak be és az integrálódik, működik és öröklődik. Abban különböznek a hagyományos növényektől, hogy a növény minden sejtje sejtmagjában ált. egy vagy több transzgént, és citoplazmájában ezekről a génekről szintetizálódott fehérjéket tartalmaz. 7
A növényi n nyi biotechnológia tárgya: t A növények örökítő anyaga (DNS) ill. az azt hordozó legkisebb totipotens élő egysége, a növényi sejt. teljes genetikai információkészlete van Nem ismerünk olyan sejtnél kisebb egységet, amelyből intakt növényt lehetne regenerálni. GM sejtből regenerált GM növény minden sejtje tartalmazza a transzgént. 8
A transzgén n származ rmazási helye A Földön az élet információja ± azonos rendszer szerint van kódolva. A transzgén származhat: vírusból, baktériumból, gombából, növényből, állatból, emberből. Bárhonnan, de: a növényben működő szabályozó szekvenciákkal kell ellátni! 9
A növényi sejt és az abból izolált protoplaszt Dudits, Heszky (2003), eredeti 10
Genom projektek jelentése: a növényi genom analízise Céljuk: a genomokban lévő genetikai információ megfejtése 1.) lépés: DNS-szekvenálás (ld. Arabidopsis thaliana) 2.) lépés: funkcionális genomanalízis (a gének helyének meghatározása) 11
A növényi genom Dudits, Heszky (2003), eredeti 12
Az organelláris és nukleáris DNS főbb jellemzői (Dudits & Heszky, 2003, eredeti) 13
A géntechnolg ntechnológiai módosm dosítás s helyszínei! Sejtmag- (genom) DNS! Plasztisz-DNS! Mitokondrium-DNS extrakromoszómális tulajdonságok, anyai öröklésmenet géntechnológiai szempontból a sejt = a növénnyel! sejtekből in vitro, növények regenerálhatók 14
A biotechnológiai eredetű fajta előáll llításának sémája Dudits, Heszky (2003), eredeti 15
Dudits, Heszky (2003), eredeti 16
A növényi n nyi biotechnológia céljac és s gazdasági gi jelentősége A növények genetikai információjának módosításával új, gazdaságilag értékes fajták, hibridek előállítása, valamint új növénytermesztési technikák, szabadalmak és technológiák kifejlesztése. 17
A géntechnológiai megközelítés lényege Dudits, Heszky (2003), eredeti 18
A növényi n nyi biotechnológia módszereim 3 csoport aszerint, hogy az örökítő anyagban közvetlenül, vagy közvetve hozunk-e létre változást: Géntechnológia (molekuláris szintű megközelítés) Szomatikus sejtgenetika (sejtszintű technikák) Szaporodás biotechnológia (szövet- és szervszintű módszerek) 19
Géntechnológia! az örökítő anyag közvetlen molekuláris módosítása! molekuláris biológia, sejtgenetika és szövettenyésztés kül. módszereit alkalmazza: 1.) az egyes tulajdonságokért felelős gének izolálása, jellemzése, felszaporítása (klónozása) 2.) a gazdaságilag jelentős gén olyan vektorba építése, mellyel lehetőség van a génátvitelre a recipiens sejtbe; továbbá sejtgenomba való integrálódása és működése 3.) GM sejtekből a kifejlett szervezet (GM növény) előállítása 20
Szomatikus sejtgenetika! Objektuma: sejt v. sejtorganellum, de alkalmazásuk közvetve molekuláris szintű változásokat okoz a genomban, ill. plazmonban! Protoplasztfúzióra alapozott szomatikus hibridizáció, cibridizáció, sejtszintű mutánsizolálás, szomaklonális variabilitás 21
Szaporodás s biotechnika az ivaros és ivartalan szaporodás genetikai manipulációja szövet- és szervtenyészetekben módszerei: haploidia, embriókultúra, in vitro termékenyítés, ginogenezis, merisztémakultúra, vegetatív mikroszaporítás, szomatikus embriogenezis, stb.. + azon genetikai módszerek, amelyek a genetikai stabilitást, homozigóta állapotot, genetikai homogenitást kívánják elérni, fenntartani, felszaporítani 22
A növényin nyi biotechnológia és géntechnológia fontosabb területei, valamint módszerei Dudits, Heszky (2003), eredeti 23
A sejt-és szövettenyésztés fontosabb technikái Dudits, Heszky (2003), eredeti 24
A növényi n nyi biotechnológia és géntechnológia törtt rténete! 1838: két német kutató, a botanikus Schleiden és a biológus Schwann sejtelmélete (minden szervezetet sejtek építenek fel); a soksejtű szervezetek minden egyes differenciálódott sejtje megtartja a kiinduló egyetlen sejtben (megtermékenyített petesejt) jelenlévő információt! 1870-es évek Wöchting a Corydalis solida gumójának vágásfelületén gyökér- és levélorganizáció szomatikus sejtek totipotenciájának alapgondolata Haberlant 1902 25
A növényi n nyi szövetteny vettenyésztés s alapjainak megteremtése Haberlant 1902- elsőként próbálkozott a vegetatív sejtek tenyésztésével, intakt növény létrehozására, egyszerű táptalajon; az akkori tenyésztési körülmények miatt nem sikerült Hannig 1904- retekembriókkal sikeres kísérletek, kipreparált embriókból tápközegben (ásványi sók, szacharóz) növényeket kapott Laibach 1925- táptalajon hibrid embriókból hibrid növények felnevelése, szervkultúrák fejlődése 26
A növényi n nyi szövetteny vettenyésztés s alapjainak megteremtése Robbins (USA), Kotte (Európa) 1920-as évekgyökérmerisztémák növekedéséhez szükséges feltételek kialakítása (szervetlen sók, glükóz): izolált borsó- és kukorica-gyökércsúcsok intenzíven növekedtek táptalajon elágazó gyökérré; folyamatos tenyésztésük gátja a steril technika hiánya 1930-as évek: két szövettenyésztési iskola White (USA), Gautheret (Franciaország) 27
A növényi n nyi szövetteny vettenyésztés s alapjainak megteremtése White 1932-ovulum tenyészetek 1934- paradicsom gyökércsúcsból gyökértenyészet (szervetlen sók, szacharóz, élesztőkivonat, később B6 vitamin) folyékony táptalajon; hetente kellett átoltani oldalgyökerekről; a korlátlan idejű növényi szövettenyészet első állomása 1939- N. glauca X N. langsdorffii hibridből indított folyamatosan növekvő kallusz 28
A növényi n nyi szövetteny vettenyésztés s alapjainak megteremtése Gautheret elsőként indukált kalluszt in vitro 1939- Nobécourt-ral együtt hathetente folyamatosan átoltható sárgarépa kultúra; a táptalajt agarral szilárdították és a White-féle vitaminokkal (tiamin, piridoxin, niacin) kiegészítették 29
A növényi n nyi biotechnológia és géntechnológia törtt rténete vázlatosanv! 1940-ig: a steril technika és a legalapvetőbb módszerek kidolgozásának időszaka! 1950-1980: kül. szervek, merisztémák, haploid és szomatikus sejtek, protoplasztok totipotenciájának bizonyítása a szomatikus sejtgenetika kialakulása! 1980- a növényi géntechnológia előretörése, GM növények köztermelésbe kerülése a 90-es évek közepén 30
A tenyésztett sejtek totipotenciájának nak bizonyítása, a szomatikus sejtgenetika kialakulása Van Overbeek, Conklin és Steward kalluszindukció a már differenciálódott sejtekből szintetikus auxinnal Skoog (USA): a dohánykallusz in vitro fejlődését heringspermából kivont friss DNS nem, de a régi minta befolyásolta (friss DNS autoklávozással, enyhén savas közegben aktiválható); az osztódás serkentéséért felelős KINETIN (6-furfurilaminopurin) felfedezése később a citokininek, term. növekedésszabályozók felfedezése Auxinok, citokininek használata a táptalajon már biz. organizációt eredményezett a kalluszban Skoog & Miller 1957- a dohánykallusz hajtás- és gyökérregenerációjának hormonális szabályozása: a szükséges optimális auxin-kinetin arány csökkentésével hajtásfejlődés, növelésével gyökérfejlődés indukálható 31
A tenyésztett sejtek totipotenciájának nak bizonyítása, a szomatikus sejtgenetika kialakulása Skoog & Murashige (indiai) 1962- MS-táptalaj dohánykallusz rajta Hildebrandt és mtsai 1954- kalluszból folyékony táptalajban sejtszuszpenzió Nickell 1956- az első folyamatosan fenntartható sejtszuszpenzió (babbal) Melshers & Bergmann 1959- a szuszpenziós kultúrák tökéletesítése (máig szinte ez) A növényregeneráció a dohányon megfigyelt szervdifferenciálódás helyett azonban egy új ontogenetikai utat (az embriogenezist) követett. A berlini Reinert és a new york-i Steward 1958- szomatikus embriogenezis: a sárgarépa szuszpenzió egyedi sejtjeiből indult (előtte embrió enzimesen sejtekre lombikban) a sejtszintű klónozás alapja! 32
A tenyésztett sejtek totipotenciájának nak bizonyítása, a szomatikus sejtgenetika kialakulása A szomatikus sejtek totipotenciája ekkor már bizonyított volt, a haploid sejteké még nem (még ivarszervvel együtt preparálták az ivarsejteket) 1965: indiaiak - portokkultúrából (Datura) haploid növény regenerálása először 1968: franciák dohányon, japánok rizsen 60-as évekre: a vegetatív mikroszaporítás kidolgozása is Cocking 1960 protoplasztok tenyésztése elsőként (paradicsom gyökércsúcs sejtjeiből cellulázzal) ebből növényt csak 10 évvel később a japánok regeneráltak 1972- N. glauca X langsdorffii protoplasztfúziója ebből növényt 1978- az első szomatikus nemzetséghibrid Melchers és mtsai burgonya és paradicsom protoplasztfúziójával 33
A tenyésztett sejtek totipotenciájának nak bizonyítása, a szomatikus sejtgenetika kialakulása mutáns sejtvonalak in vitro izolálása (pl. sztreptomicinrezisztens dohány) a protoplasztfúzió lehetőséget ad arra is, hogy a sejtmagtól függetlenül csak a citoplazmát hibridizáljuk, cibridizáció a növényi extrakromoszómális genetika fellendülése sikeres kloroplasztisz- és mitokondriumtranszferek mutáns sejtek ill. növények in vitro szelekciója felhívta a figyelmet a tenyésztett sejtek genetikai instabilitására (szomaklonális variabilitás) 34
A növényi n nyi géntechnolg ntechnológia kialakulása és s felhasználása sa (1980-tól) növényi sejtfermentáció spec. anyagcsere termékek előállítása ipari méretekben (pl. sikonin) vegetatív mikroszaporítás automatizálása (rizs, búza, repce) a növ. genom molekuláris szerveződésének analízise elkezdődött 1983/84 az első GM növények (dohány) a transzformációs technika tökéletesítése (bináris vektor, marker gén) 1986 vírus-, rovar- és herbicidrezisztens GM növény előállítása 1986 USA, 1988 Európa- az első GM növények szántóföldi kísérleti kipróbálása 1994- az első GM növény közforgalomba került 35
GM növényekn nyek Első generációs GM növények cél: biotikus stressz rezisztencia (vírus, gomba, baktérium, rovar) és abiotikus stressz rezisztencia (herbicid) kialakítása; napjainkig rovar- és herbicidrezisztensek a legnagyobb területen (gyapot, szója, repce, kukorica különösen sikeresek);elterjedésük akadályai zöld- és környezetvédő mozgalmak Második generációs GM növények cél: a növény anyagcseréjének (szénhidrát, zsírsav, fehérje) és fejlődésének (érés, hímsterilitás, stb..) módosítása; paradicsom, burgonya már köztermesztésben is, de terjedésük lassabb, mint az 1-é Harmadik generációs GM növények cél: spec. anyagok előállítása főleg ipari felhasználásra (gyógyszer-, élelmiszer-, műanyagipar); a 21. sz-ban várható a köztermesztésbe kerülésük 36
A növényi biotechnológia 100 éves története egyes dekádjaiban elért legfontosabb tudományos és módszertani eredmények (Dudits, Heszky 2003, eredeti) 37
A növényi biotechnológia legfontosabb gyakorlati eredményei Dudits, Heszky 2003, eredeti) 38
A hazai növényi n nyi biotechnológia pionírjai (1930-1980) (Haberlandt a mai Mosonmagyaróváron született 1854-ben) 1838 Orsós Ottó- in vivo szervdifferenciálódás karalábén Gimesi Nándor és mtsai- első in vitro vizsg. Lilium portoktenyészet 50-es évek- szövettenyésztés: Rédei György (búzaembriók, - ováriumok in vitro), Maróti Mihály (bab gyökér- és hajtáskultúra), Faludi Béla és mtsai (burgonya kalluszkultúra) 1956-70- ELTE, Maróti Mihály a hazai növényi biotechnológia alapjainak megteremtése; vegetatív mikroszaporítási laboratóriumok és üzemek az ő munkásságára alapozva (Óbuda Tsz, Sasad Tsz, Kertészeti Mgtsz, Szombathely és Rozmaring Tsz);az első szövettenyésztési jegyzet (1972) és könyv (1976) 39
A hazai növényi n nyi biotechnológia pionírjai (1930-1980) 1960-as évek vége 70-es évek eleje: Heszky László (Országos Agrobotanikai Intézet): embriótenyésztés, androgenezis, genetikai tartalékok in vitro tárolása Maliga Pál- MTA Genetikai Intézet, majd Szegedi Biol. Központ: mutáns szelekción és protoplasztfúzión alapult organellumátvitel Kovács Ervin- ELTE Genetikai Tsz- tenyésztett sejtek genetikai instabilitása Dudits Dénes- MTA Szegedi Biol. K.- szomatikus hibridizáció Kertészeti növények: csonthéjas gyümölcsök- Vértessy Judit (Kertészeti Kut. Int, Budatétény; bogyósgyümölcsök- Zatykó József és mtsai Fertődi Kut. Áll.; gyógynövények: Verzárné Petri Gizella és Szőke Éva (SOTE Gyógynövény- és Farmakológiai Int.) 40
A sejtgenetika és s szövetteny vettenyésztés módszereinek alkalmazása (1980-tól) Gabonatermesztési Kut. Int., Szeged (Sági Ferenc, Mórocz Sándor, Pauk János, Purnhauser László) Mórocz és mtsai 1990- jól regenerálódó kukorica sejtprotoplaszt-növény rendszer; Pauk és mtsai 1997: első magyar DH búzafajta (Délibáb); Purnhauser és mtsai 1987: Ag + -ionok meghatározó szerepét bizonyították in vitro növényregenerációban MTA Mezőgazdasági Kut. Int., Martonvásár (Barnabás Beáta, Kovács Géza, Karsai Ildikó, Galiba Gábor) Barnabás és mtsai 1999: búza és kukorica ivaros folyamatainak biotechnikai módosítása, izolált gaméták mikromanipulációja, pollen krioprezervációja, in vitro genom-duplikációs módszer kidolgozása; Galiba és Sutka 1997: hidegtűrésért és jarovizációért felelős gének azonosítása és térképezése búzában; 41
A sejtgenetika és s szövetteny vettenyésztés módszereinek alkalmazása (1980-tól) Kertészeti Egyetem- Jámborné Benczúr Erzsébet és mtsai 1997: kül. cserepes (levél és virágos), évelő dísznövények, díszfák mikroszaporítási technikája; G.Juhász Anikó és mtsai zöldségnövényekből állítottak elő sikeres andro- és ginogenetikus haploidokat; Gödöllői MBK- Mitykó Judit és mtsai 1995: paprika androgenetikus haploidok előállítása; Bánfalvi Zsófia és mtsai 1996: burgonyagumó abiotikus stressz-specifikus fehérjéinek azonosítása, izolálása; Fári Miklós: több szabadalom és műszer az in vitro technikában (Propamatic és Clonmatic mikroszaporító automaták); 42
A sejtgenetika és s szövetteny vettenyésztés módszereinek alkalmazása (1980-tól) GATE Genetika és Növénynemesítés Tsz- Heszky László és mtsai- növénybiotechnológus utánpótlás nevelése graduális és posztgraduális szinten is; 1992 (Dama rizs) az első magyar biotechnológiai úton előállított növényfajta; Jekkel Zs.: a tenyésztett növényi sejtek sikeres krioprezervációja; Gyulai G.: szomaklónok, Kiss E. antiszensz GM alma, szegfű és paradicsom és Kiss J. DH nyár előállítása; Keszthelyi Egyetem Burgonyakutatási Osztály- Polgár Zsolt és mtsai 1999: szomatikus hibridek jellemzése; Fertődi Gyümölcs és Dísznövénytermesztési Kut. Áll.- Zatykó József és mtsai 1997: in vitro nitrogénkötő szamóca előállítása 43
A sejtgenetika és s szövetteny vettenyésztés módszereinek alkalmazása (1980-tól) Nyíregyházi Mezőgazdasági Kut. Int.- Dobránszky Judit és mtsai 1999: a burgonya in vitro gumóindukálása Kecskeméti Szőlészeti és Borászati Kut. Int.- Haydu Zsolt és mtsai szőlőbiotechnológia kifejlesztése 44
A hazai géntechnolg ntechnológiai kutatások kezdete és s az első eredmények Dudits Dénes munkacsoportja- MTA Szegedi Biol. K.- Koncz Csaba (1981) kukorica mitokondriumban a plazmid klónozása, transzformációs vektor kifejlesztése; Györgyei János: lucerna cdns-bank létrehozása szomatikus embriókból; az első növényi gének, amelyet M-on izoláltak lucerna hisztonfehérjéket kódoltak (Wu és mtsai 1988), ehhez genomikus génbankot Kiss Gy. Botond és mtsai készítettek; lucernagének izolálására épülő kutatások intenzíven a 90-es években; a lucerna genetikai térképének elkészítése; a sejtosztódás szabályozásában és a stresszválaszban szerepet játszó gének kutatásai Hirt és mtsai, Györgyey és mtsai 1991; a klorofill a/b kötőfehérjét (Cab1) kódoló gén promoterének részletes funkcionális vizsgálata Nagy F.; 45
A hazai géntechnolg ntechnológiai kutatások kezdete és s az első eredmények Gödöllői MBK- Bánfalvi és mtsai 1994:a burgonyagumó fejlődésével kapcs. gének sorában egy patatin cdns klónozása; Vírusok szerkezetének feltárása Burgyán és mtsai 1993; Salánki és mtsai 1994; Deák Mária és mtsai 1986: transzgénikus lucerna előállítása- Agrobacterium gén-kanamicin rezisztencia Fehér és mtsai 1992: burgonya X-vírus köpenyfehérjegén; burgonya transzformánsok virológiai jellemzése Balázs Ervin; kukorica és repce transzformánsok előállítása az SZBK-ban; Génpuskával génbeépítés rizsbe és búzába (Jenes Barnabás módszerével) 46