Növény-sejt-növény rendszer in vitro

Átírás

1 Növény-sejt-növény rendszer in vitro Oktatási segédanyag EKF Növénytani és Növényélettani Tanszék Szerkesztette: Dr. Marschall Marianna A felhasznált forrás: Dudits Dénes, Heszky László: Növényi biotechnológia és géntechnológia, Agroinform Kiadó, Budapest, 2003

2 Eszterházy Károly Főiskola, Természettudományi Kar, Biológia alapképzési szak (BSC) forrás: HEFOP p Oktatási segédanyag a növényi biotechnológia tantárgy egyes fejezeteihez. A tantárgy leírása: A növényi biotechnológia és géntechnológia alapjait ismerteti meg a 3. félévben a törzsanyagban és a 6. félévben a differenciált törzsanyagban szereplő tárgy az in vitro növény-sejt-növény rendszer (morfogenezis, organogenezis, szomatikus embriogenezis), az ivaros szaporodás biotechnológiája (embrió- és portokkultúrák, generatív sejt-, szerv- és szövettenyészetek, az apomixis biotechnológiája), az ivartalan szaporodás biotechnológiája, a genetikailag módosított (GM) növények, az abiotikus, biotikus és az anyagcseréjükben módosított stresszrezisztens transzgénikus növények című témakörök részletes bemutatásán keresztül. Kitér a növényi géntechnológia kockázataira, társadalmi jelentőségére és törvényi szabályozására. A növényi szövettenyésztés alapjaival foglalkoznak a 6. félévben sorrakerülő gyakorlatok a kalluszkultúra indukció, a direkt és indirekt morfogenezis, a portokkultúra és haploid növények létrehozása, embriókultúra, protoplasztizoláció és kultúra című témakörök bemutatásával.

3 Differenciálódás és dedifferenciálódás In vitro ontogenezis: a tenyésztett növényi sejtekből való növényregenerálás Differenciálódás: az eltérő gének működése következtében kialakulnak a különbségek a sejtek között A differenciálódás további Morfogenezis lépéseiben a sejtek szövetekbe és szervekbe tömörülnek. Dedifferenciálódás: differenciálódott sejteket tartalmazó szövetek táptalajon izolálva 2,4-D (2,4-diklórfenoxi-ecetsav) a szövet sejtjeinek intenzív osztódása

4 Dedifferenciálódás differenciálódott sejteket tartalmazó szövetek táptalajon izolálva Dedifferenciálódás 2,4-D (2,4-diklórfenoxi-ecetsav) a szövet sejtjeinek intenzív osztódása citokininek, auxinok sejtszuszpenzió folyékony táptalajba rázatás Passzálás: többszöri átoltás elsődleges kallusz szilárd táptalajon a kallusztenyészet fenntartása, szaporítása

5 Redifferenciálódás A sejtek differenciálódásának indukciója in vitro = redifferenciálódás, mely folyamat eredménye a növényregeneráció.

6 Az in vitro morfogenezis alternatív útjai In vitro rendszerben 2 fő ontogenezis út: 1. szomatikus embriogenezis 2. organogenezis 1. Szomatikus embriogenezis: mindig egyetlen sejtből indul, morfológiailag eltér a zigotikus embriogenezistől (nincs/rövidebb a szuszpenzor, nincs/kisebb/több a sziklevél, stb..) 2/1. Merisztéma differenciálódás (organogenezis I.) 2/2. Szervdifferenciálódás (organogenezis II.)

7 A morfogenezis alternatív útjai Dudits & Heszky (2003), eredeti

8 Merisztéma differenciálódás Organogenezis I-II. ált. egyszerre több kalluszsejt egyidejű differenciálódásának eredménye (tracheida, merisztéma) Hajtás/gyökérmerisztéma determináció auxin/citokinin arány* Szervdifferenciálódás ált. nem kalluszsejtek, hanem a tenyészetben már differenciálódott merisztéma-, szár-, ill. gyökérsejtek további morfogenezisének az eredménye dohánykallusz *2mg/l IES+ 1 mg/l kinetin hajtásfejlődés 2mg/l IES mg/l kinetin gyökérfejlődés

9 Növények felnevelése tenyésztett sejtekből sejt = növény biotechnológiai szempontból a teljes növény regenerálása? Az adott faj esetében hogyan funkcionál a növény-sejt-növény rendszer? Növényregenerálás aránya organogenezissel (200 faj): szomatikus embriogenezissel (70 faj): Cruciferae, Compositae Umbelliferae Solanaceae, Fabaceae, Gramineae mindkettőből jól

10 A kallusz szelekció hatása a morfogenezisre Dudits & Heszky (2003), eredeti

11 Organogenezis v. szervdifferenciálódás Járulékos szervek kialakulása Járulékos merisztémák (hajtás- és gyökér tenyészőkúpok) kialakulása a morfogenezis leggyakoribb útja Vegetatív szervek (gumó, hagyma) Generatív (virág) szervek Egypólusú tenyészőkúpok kialakulása, melyekből hajtások, vagy gyökerek fejlődnek. Az ellentétes pólus differenciálódását ált. külön táptalajon kell indukálni (ld. 3/5C-B. ábra).

12 Organogenezis dohány levélkorong tenyészetben Dudits & Heszky (2003), eredeti

13 kambiális/ parenchima sejtek (kollenchima is lehet, ami már specializált!) Az organogenezis lépései diff.lan parencima sejtekből (3/3A) hálózatos sejtfalvastagodással tracheidák (3/3B) nyalábszerűen/ centrálisan csoportosulva (3/3D) tracheida központok körül apró, kerek, nagymagvú merisztémasejtek kallusz-/sejtszuszpenzió részben diff.lan részben diff. sejtekből áll, morfogenetikai potenciáljuk különböző organogén/embriogén típusú kalluszszelekció alapja eumerisztematikus központok (merisztemoidok) (3/3C-D) ált. vagy indeterminált primordium fejlődési stádium (még nem dől el, gyökér vagy hajtás-e)

14 Hajtás Az organogenezis lépései általános merisztemoidok auxin/kinetin aránytől függően kerületi (tunika) táj, központi (korpusz) táj külső sejtrétegéből egysejtsoros felületi merisztéma=protoderma (3/3E) rajta szőrképletek+ tenyészőkúp csúcsa közelében levélprimordiumok (3/3F) prokambiális/szállítónyaláb-kezdemények levélkezdeményekkel részben takart hajtástenyészőkúp (3/4A-B) Gyökér gyökértenyészőkúpot felépítő hisztogének kaliptra, peribléma, pleroma, dermatogén már a kalluszban felismerhető 3/4D-E gyökérszőröszóna és megnyúlási szakasz még nem különül el élesen pleromában kallusz tracheida központjához kapcs.szállítónyalábok fokozatos kialakulása

15 folytatás ld. előző Az organogenezis lépései hajtás gyökér egy-egy tracheida központ körül egyszerre több merisztéma is differenciálódhat 3/4B 3/4D egypólusú tenyészőkúpok kialakulása (hajtás/gyökér?) az ellentétes pólus differenciálódását ált.külön táptalajon kell indukálni (35/C-B)

16 Organogenezis dohány levélkorong tenyészetben Dudits & Heszky (2003), eredeti

17 Hajtásmerisztéma differenciálódás dohány kalluszból Dudits & Heszky (2003), eredeti

18 Hajtás- és gyökérfejlődés dohány kalluszból Dudits & Heszky (2003), eredeti

19 A virág morfogenezise in vitro 2 francia kutató indukálta először Kiem Tran Thanh Van és mtsai 1975, továbbfejlesztés virágzó dohánynövény virágzati szár felületi nyúzat: epidermisz, szubepidermisz, 2-3 parenchimasejtsor indukció (extrém alacsony konc.): 10-6 mol auxin (naftilecetsav) 10-6 mol citokinin (benziladenin) oligoszacharidok táptalajra merisztéma* virágkezdemény *ennek a determinációja már izolálás előtt in vivo virág 3/5E

20 Organogenezis dohány levélkorong tenyészetben Dudits & Heszky (2003), eredeti

21 A virág morfogenezise in vitro Eleusine coracana vegetatív merisztéma zeatin virágrügykezdemények dedifferenciálódás nélkül! Vegetatív fejlődés helyett generatív fejlődés információja realizálódott. A merisztéma morfogenetikai szempontból többféle program hordozója, mely in vitro ki- vagy bekapcsolható.

22 Gumóindukció in vitro a burgonya hajtástenyészeteiben (gumó= módosult szár) kereskedelmi volumenű mikrogumó előállítási technológia (Tajvan, Új-Zéland) 3-hetes hajtástenyészet hajtás* lombikonként sötétben 14. naptól, szórt fényben (16h), 25 C MS-táptalaj 4 napig: 21% szacharóz, 3.2x10-6 mol benziladenin aminosavak (3.5-szeres töm.) hajtásonként 1 mikrogumó diff. a 4. v. 5. nóduszon a mikrogumó az adott nódusz levelhónaljrügye helyén növekedésük 6-8 hétig tart mindegyik hajtáson 1db d= cm számuk lombikonként = az eredeti* hajtásszámmal

23 Gumóindukció in vitro az előbbi módszer hatékonysága javítható RITA-val = 10 hét alatt 1 noduszos rügyből 3 gumó az in vitro fejl. gumók nem minden esetben hajtanak ki azonnal, nyugalmi periódusuk napig szobat-n a 80-as években sikeres mikrogumó indukciós módszer M-on sikertelenül a vetőgumó előállítás technológiájába

24 Szomatikus embriogenezis Steward & Reinert különálló sejtből sárgarépa embriók teljes ontogenezise sárgarépa-embriogenezis -2,4-D a kalluszban merisztematikus központok felületi sejtekből, a néhány sejtes proembrió (-plazm.deszm) embrionálissá vált sejtek 3/6C,D transzverzális osztódás 2-sejtes proembrió 3/6E longitudinális oszt. az apikális sejtben 3-sejtes T-alakú proembrió kvadráns 3/6G 3/6F oktáns szuszpenzor sejt, periklinális osztódás centrális, perifériális merisztématáj a hipofízis sejt is osztódik soksejtes gömbalak 3/6H szív- és torpedó stádium 3/6I bipolárissá válik az embrió gyökércsúcs sziklevelek sziklevélfejlődés megáll, embrió szöveteinek diff. indul

25 Szomatikus embriogenezis szója sziklevél eredetű kalluszban Dudits & Heszky (2003), eredeti

26 Növényregenerálás szomatikus embriógenezis indukcióval Dudits & Heszky (2003), eredeti

27 Az in vitro szerv-és embriódifferenciálódás molekuláris háttere adott növény de: a regeneráció eredményességében fontos genotípusonként eltérő lehet a regenerációs képesség táptalaj összetevőinek megváltozása fény- hőmérséklet viszonyok megváltozása kiindulási inokulum megválasztása reagáló genotípusok kiszelektálása ásványi elemek, vitaminok, C-források szerepe

28 Az in vitro szerv-és embriódifferenciálódás molekuláris háttere helyhez kötött életmód egyedfejlődési program nagyfokú rugalmassága homeotikus gének: DNS-kötési képességgel rendelkező, ún. homeodomain régiót tartalmazó fehérjéket kódolnak gyökér- ill. hajtásmerisztémák működésében szerep hajtásmerisztémák morfogenezisével kapcs. gének családjának jellegzetes képviselői: KNOTTED (KN1) SHOOT MERISTEMLESS (STM) MERISTEM L1 LAYER (ATML1) funkciójukra mutánsok analíziséből következtetnek

29 Homeotikus gének kukorica, szója, rizs KN1 gén kifejlesztése erős, konstitutív promoterrel Arabidopsis-ban, Nicotiana-ban növekedésgátlás apikális dominancia mérséklése levelek fodrosodása hajtáskezdemények fejlődése 3/8 megemelkedett citokininszint 3/9 megemelkedett citokininszint csökkenthető a kinetin szintje a táptalajban hajtásdifferenciálódás

30 Homeotikus gén cdns-ének kifejeztetése Dudits & Heszky (2003), eredeti

31 Megváltozott a hormonok mennyisége a dohány transzformánsokban Dudits & Heszky (2003), eredeti

32 Az in vitro szerv-és embriódifferenciálódás molekuláris háttere gyökérmerisztéma kialakulása RML1,2 gének (root meristemless) Arabidopsis mutánsokban szabályozó gének Ezekben az embriogén gyökérfejlődés normális, de a későbbi gyökér fejlődés jelentősen gátolt a sejtek osztódásának hiánya miatt. tenyésztett szövetekben a gyökérfejlődés oldalgyökerek kialakulása hasonló tényezők befolyása alatt: IES ABERRANT LATERAL ROOT FORMATION (ALF) mutánsok: ALF1-1 gén hibája túlzott mértékű oldalgyökér-kialakulás ok: IEStúltermelés/emelt IES-érzékenység

33 Az in vitro szerv-és embriódifferenciálódás molekuláris háttere ALF4-1-gén terméke szükséges szomatikus embriogenezis elindításához periciklus sejtek IES-hatás érzékelésében/ válaszreakcióhoz gátolhat is, ezért megvonása/alacsonyabb konc. alkalmazása szükséges! 2,4-D (2,4-diklórfenoxiecetsav) = szintetikus auxin auxinok/2,4-d bonyolult jelátviteli hálózat aktiválása

34 Az in vitro szerv-és embriódifferenciálódás molekuláris háttere auxinok/2,4-d membránok polarizáltságának megváltoztatása, receptorok, GTP-kötő fehérjék közreműködése inozitol-1,4-biszfoszfát szint emelkedése Ca 2+ felszabadítása az ER-ből ph-változás (embriogén aktivációhoz) Ca 2+ -jel továbbításában:- Ca 2+ -kötő fehérjék (kalmodulin), - enzimek (Ca 2+ -függő kinázok, foszfatázok) transzkripciós változások pl. gének kikapcsolása, aktiválása jelentős citoszkeleton átstruktúrálódás: mikrotubulus-hálózat rendezettsége fellazul hormonkezelt sejtek osztódása embriogén program elindulása

35 Az embriogén program elindulásának feltételei alapfeltétel: hormonaktivált sejtosztódás aszimmetrikusan lejátszódó osztódás és polaritás kialakulása szintén lényeges Embriogén sejtek kisebbek, sűrű a citoplazmájuk egymás utáni osztódások kompakt, térfogatában behatárolt, többsejtű, gömb formájú struktúrák Embriogén indukció hiányában nagyobb térfogatú sejtekből szimmetrikus osztódásokon keresztül organizálatlan kalluszszövetek

36 Az embriogén program elindulásának körülményei ivaros megtermékenyítés a zigóta első osztódása szintén aszimmetrikus apikális sejt embrió bazális sejt szuszpenzor (3/6E) 2,4-D-hatás az alábbiakon keresztül: -IES-hatás -IES-szint sejten belüli megemelkedése -ph-változás stressztényezők hatása (sebzés, hősokk, ozmotikus sokk, fémiontoxicitás) stresszgének aktiválódása sejtosztódást szabályozó ún. sejtciklus gének aktiválódása embriogén sejtállapot kialakulása auxin-aktivált gének

37 Az embriogén sejtállapot z embriogén sejtekre jellemző extracelluláris fehérjék megjelenése a szív- és torpedó stádiumú embriókon merisztémák kialakulása az embriogenezis egyes fázisai igen hasonlóak a zigótikus és szomatikus embriók esetében szomatikus embriogenezis megtermékenyítés nélküli, apomixisen alapuló magképződés biztosítása hibridhatás rögzítése, hatékony szaporítási technikák kidolgozása

38 A növényregenerálás eredményei A különböző biotechnológiai eljárások objektumai: szomatikus sejtek haploid ivarsejtek protoplasztok 3/1. táblázat

39 3/1. táblázat: A növény-sejt-növény rendszer helyzete a fontosabb kultúrnövényeknél Dudits & Heszky (2003), eredeti