Az ivaros szaporodás biotechnológiája

Átírás

1 Az ivaros szaporodás biotechnológiája Embriókultúrák Oktatási segédanyag EKF Növénytani és Növényélettani Tanszék Szerkesztette: Dr. Marschall Marianna A felhasznált forrás: Dudits Dénes, Heszky László: Növényi biotechnológia és géntechnológia, Agroinform Kiadó, Budapest, 2003

2 Eszterházy Károly Főiskola, Természettudományi Kar, Biológia alapképzési szak (BSC) forrás: HEFOP p Oktatási segédanyag a növényi biotechnológia tantárgy egyes fejezeteihez. A tantárgy leírása: A növényi biotechnológia és géntechnológia alapjait ismerteti meg a 3. félévben a törzsanyagban és a 6. félévben a differenciált törzsanyagban szereplő tárgy az in vitro növény-sejt-növény rendszer (morfogenezis, organogenezis, szomatikus embriogenezis), az ivaros szaporodás biotechnológiája (embrió- és portokkultúrák, generatív sejt-, szerv- és szövettenyészetek, az apomixis biotechnológiája), az ivartalan szaporodás biotechnológiája, a genetikailag módosított (GM) növények, az abiotikus, biotikus és az anyagcseréjükben módosított stresszrezisztens transzgénikus növények című témakörök részletes bemutatásán keresztül. Kitér a növényi géntechnológia kockázataira, társadalmi jelentőségére és törvényi szabályozására. A növényi szövettenyésztés alapjaival foglalkoznak a 6. félévben sorrakerülő gyakorlatok a kalluszkultúra indukció, a direkt és indirekt morfogenezis, a portokkultúra és haploid növények létrehozása, embriókultúra, protoplasztizoláció és kultúra című témakörök bemutatásával.

3 Az ivaros szaporodás biotechnológiája embriókultúra generatív szervtenyészetek portoktenyésztés (in vitro androgenezis) virágtenyésztés ováriumtenyésztés ovulumtenyésztés megporzás és megtermékenyítés kémcsőben generatív szövettenyészetek endospermiumtenyésztés nucellusztenyésztés izolált mikrospóra tenyésztés generatív sejttenyészetek ivarsejtek izolálása és in vitro fúziója

4 A növények ivaros szaporodásának biotechnológiája a haploid és diploid sejtek, szövetek, szervek a kettős megtermékenyítés eredményeképpen létrejövő zigótikus embrió in vitro steril tenyésztési körülményeinek módszerei

5 Embriókultúra Az embriótenyésztés az embriógenezis különböző stádiumában lévő zigótikus embrió kipreparálását, ontogenezisének fenntartását és befolyásolását jelenti táptalajon, steril, klimatizált feltételek között.

6 A kétszikű növények in vivo embriógenezisének és magfejlődésének vázlata Dudits & Heszky (2003), eredeti

7 Az egyszikű növények in vivo embriógenezisének és magfejlődésének vázlata Dudits & Heszky (2003), eredeti

8 Az embriógenezis jellegzetességei in vivo A sikeres izolálás szempontjából fontos tudnivalók a kül. fajok embriogenezisének időtartama eltérő ( nap) az érett magban az embriók helyzete, mérete, fejlettségi állapota is jelentősen eltérhet az embriók egy része a teljes anatómiai és élettani fejlettség elérését követően csíraképes, míg másoknak további érésre, nyugalmi periódusra, száradásra van szüksége a csírázó képesség megszerzéséhez

9 Magnyugalmi állapotok - Fiziológiás nyugalmi állapot (quiescence) vízvesztés eredménye, a mag beérik - Valódi nyugalmi állapot (dormancia, dormancy) magban felhalmozott növekedésgátló anyagok hatásának következménye, fajtól függően akár évekig is eltarthat Az in vitro nevelt embrió csíranyugalom nélkül csírázik!

10 Különböző növényfajok embriói Dudits & Heszky (2003), eredeti

11 Embrióizolálási módszerek az embriótenyésztés technikája fő vonalaiban megegyezik a virágszervek kultúráiéval az izoláláskori sterilitás könnyebben megoldható, hiszen az embriók az ováriumban és a magkezdeményben is sterilen fejlődnek

12 Az embrióizolálás objektumai I. I. Proembrió (3-30 napos embrió) izolálása: mérete függ: a megtermékenyítéstől eltelt napok számától kiemelése: a fajtól ovulumnedvből, fejlődő, folyékony endospermiumból gömb, korai szív stádiumban + lehetőleg a szuszpenzorral* (=egysejtsoros csírafüggesztő) együtt helyezzük táptalajra *szuszpenzor igazolt szerepe az in vitro tápanyagfelvételben túlélésük: 0-40% az izolálás csak mikroszkóp alatt méretük: µm

13 Embrióizolálás objektumai II. II. Embrió ( 1 mm) kipreparálása magkezdeményből: jellemzői: kiemelése: kompaktabb, nem áttetsző, könnyen felismerhető és elválasztható környezetétől torpedó, szikleveles, sétabot stádiumban, a szuszpenzornak ekkor már nincs szerepe a tápanyagfelvételben a sziklevél veszi át a fejlődő endospermium ill. a magkezdemény többi szövete mellől túlélésük: % 4/4. ábra

14 Dudits & Heszky (2003), eredeti

15 Anyagcsere szakaszok az embriógenezis során Az embriókultúra szempontjából az embriógenezis kétszakaszos: Heterotróf Autotróf szervetlen sók Főbb táptalajalkotók szénhidrátok nitrogénforrások természetes növényi kivonatok növekedésszabályozó anyagok

16 Táptalajalkotók 1. Szervetlen sók: KCl, CaCl 2 konc. növeléssel heterotróf stádiumú proembriók korai abortálásának elkerülése NH 4 -sók, Fe-EDTA konc. csökkentése a fiatal embriók túlélését javítja mikroelemek konc. növelése Szénhidrátok: legáltalánosabb a szacharóz + a táptalaj ozmolaritásának a biztosítása

17 Táptalajalkotók 1. Ozmolaritás változása az embriogenezis során: pl. kezdeti értékek in vivo: gyapot 980 kpa Capsella 823 kpa bab 69 kpa az éretlen magkezdemény nedv és a fejlődő endospermium ozmotikus értéke csökken in vitro nagyobb érték szükséges! 2% szacharóz végig + ozmolitikumként mannitol változó konc.ban (anyagcsere szempontjából inaktív) 0% érett embrió fokozatos csökkentés 0.1% 8-15% szacharóz szív 4% korai torpedó 1% torpedó

18 Táptalajalkotók 2. Nitrogénforrások: leggyakrabban NH 4 NO 3 és KNO 3 biz. esetekben pl. napraforgó alacsony N konc. (C/N=10) a megfelelő ozmolaritás mellett, de szója, árpa növelni kell az NH 4 -N-forrásokat cukor helyettesítéssel is! aminosavak és amidjaik glutamin, aszparagin embriófejlődésre serkentően kazeinhidrolizátum (CH)* 20 aminosav keveréke *CH, mint ozmotikum is, de az embriócsírázást gátolja

19 Táptalajalkotók 3. Természetes növényi kivonatok: kókuszdiótej (CM) általánosan használt kiegészítő embriófejlődésre serkentően* embriófaktor (hőstabil) a CM tartalmaz cukrok növekedésserkentő és más anyagok 20 aminosav keveréke Növekedésszabályozó anyagok: ABA -, gibberellinek +, citokininek*, auxinok* alkalmazásuk nem alapvető az embriótenyésztésben (korai csírázásra +-, ozmózisnyomás biztosítása )

20 szilárd táptalaj: % agar Tenyésztési feltételek folyékony táptalaj: kis O 2 -konc.val sziklevélfejlődés serkentése korai csírázás gátlása hipokotil megnyúlás csökkentése normális embriófejlődés optimális: ph = T=15-30 C megvilágítás: proembriók először sötétben majd: folyamatos/periodikus megvilágítás

21 Anyagcsere szakaszok az embriógenezis során Az embriókultúra szempontjából az embriógenezis kétszakaszos: Heterotróf (szervetlen és szerves tápanyag biztosítása) Autotróf (szervetlen sók, C-forrás) a.) autonóm stádium: fejlődésben lévő embrió, amely már képes a csírázásra b.) élettani érettség stádiuma: az embrió elérte teljes embrionális differenciáltságát, de nem képes csírázásra (csíranyugalom) c.) ökológiai érettség stádiuma: teljesen kifejlett, érett és csíraképes embrió Proembrió tenyésztés: 1., 2.a, b-ből; Fejlett-embrió tenyésztés: 2.c-ből

22 Proembriókultúrák heterotróf fázisban izolált proembriók embriogenezise csak csírázásgátló táptalajon tartható fenn majd csírázást indukáló táptalajra helyezés (Difco-Orchid tápközeg) autotróf fázis autonóm ill. élettani érettségű stádiumú proembriók csírázása a kezdő táptalajon megoldható proembriókultúrák használatának célja: a petesejt megtermékenyülése után az embriók kialakulását gátló tényezők (endogén és exogén posztzigotikus faktorok) hatásának kiküszöbölése

23 Fajhibridek Faj- és nemzetséghibridek előállítása Célja: valamely értékes tulajdonság génjének átvitele (introgressziója) vadfajokból valamely kultúrfajba fajkeresztezésekben az embrió abortálásának okai: a proembriót tápláló endospermium hiányzik, vagy fejlődésében zavarok (mikor??) lépnek fel A zavarok okai: -genetikai (zavarok a sejtosztódásban) -élettani (eltérések a növ.szab. anyagok konc.ban) endotél sejtek proliferációja ha az embriók már jól preparálhatók és tenyészthetők =autotróffá válás határán gömb v. korai szív

24 Faj- és nemzetséghibridek előállítása a gömb stádiumú embriók még differenciálatlanok, polarizációjuk még nem teljes könnyen kalluszosodnak ill. gyakran anatómiailag torz embriók fejlődnek belőlük ennek elkerülése végett két lépéses in vitro in ovulo embriótenyésztés gömb stádiumú hibridembrió az ovulumban ovulumizolálás fajtól függően (megporzást követő napon) ovulumtenyésztéssel norm. embriógenezis fenntartása Fajhibridek in vitro in ovulo Helianthus, Glycine, hibridembrió kipreparálása az ovulumból Gossypium, Allium

25 Faj- és nemzetséghibridek előállítása Valenciakeresztezések: egy faj különböző ploidszintű változatainak keresztezésekor (embrióabortálás kiküszöbölésére) sikeresen alkalmazott embriótenyésztés aploidok előállítása bulbosum technikával: genom elimináción alapul (4/5; 4/8)

26 Haploidok és távoli fajhibridek előállítása Haploid előállítási vonal Távoli fajhibrid előállítási vonal A haploid embrió csak egy ideig tud fejlődni a diploid ovulumban. abortálás vagy Dudits & Heszky (2003), eredeti Távoli fajhibrid embrió az ovulum (anya) szövettel való inkompatibilitása miatt

27 Dudits & Heszky (2003), eredeti

28 Dudits & Heszky (2003), eredeti

29 A bulbosum technika Az elimináció az inkubációs T-től is függ. 23 C alatt csökken a regenerált növények között a haploidok száma a hibridekhez képest. Dudits & Heszky (2003), eredeti

30 Hordeum vulgare X Hordeum bulbosum haploidok előállítása bulbosum technikával H. vulgare H. bulbosum megporzás előtt 18 C-on 16h majd 12 C-on 8h megporzott kalászok kezelése 217µm gibberellinnel 14 nap után embriók kipreparálása szilárd ½ MS táptalajra 14nap sötétinkubáció 12-15h-s fényre 8-10 hetes vernalizáció a virágzásért: 10 C-on, 8-10h megvilágítás diploid pollennel megporzás regenerálódó csíranövény kasztrálás kolchicin kezelés: 2.5 µm kolchicin + 2% DMSO 5h, 20 C-on új árpafajta kiültetése, vernalizációja

31 A generációváltás gyorsítása Dudits & Heszky (2003), eredeti

32 A fejlett-embrió tenyészetek alkalmazása az ún. fejlett-embrió tenyészetek: táptalajai: a proembrió kultúrák összetételéhez képest egyszerűbbek (makro- és mikroelemeken kívül, glükóz, szacharóz) kiindulás: élettani/ökológiai érettségű vagy teljesen kifejlett embriókból Felhasználási terület: -a mag hosszú érési idejének lerövidítése és ezzel a generációváltás gyorsítása -csíranyugalom megszüntetése és ezzel a generációváltás meggyorsítása -steril magfejlődés megakadályozása -minden olyan eset amikor a normális csírázásnak in situ v.milyen akadálya van