ktatási segédanyag a II. DLA szakos levelező hallgatók Analitikai Kémia I. tantárgyához Összeállította: Buglyó Péter DE TEK, Természettudományi Kar Szervetlen és Analitikai Kémiai Tanszék 2004
2 Tantárgy: Analitikai kémia I. előadás és gyakorlat, I. félév Tantárgyfelelős: Dr. Buglyó Péter (tel: (52) 512-900/2405 mellék) email: buglyo@delfin.unideb.hu 1. Elmélet, konzultáció: 10 óraszám/félév 7 óra: Klasszikus minőségi és mennyiségi analízis (Dr. Farkas Etelka) 3 óra: A kromatográfia alapjai (Dr. Buglyó Péter) ideje: 3 alkalommal a szorgalmi időszakban (szept. 25. 8-13h, okt. 15. 10-12h, nov. 6. 8-11h) helye: DE, Természettudományi Kar, Kémiai Épület, D404 2. Gyakorlat: 15 óraszám/félév 8+7 óra, ebből 3 óra kromatográfiás mérés (4 fős csoportokban, forgószínpadszerűen) ideje: December 20. 8-16h és dec. 21. 8-15h helye: DE, Természettudományi Kar, Kémiai Épület, D308 és D104 laboratórium A gyakorlaton a kiadott ismeretlenek analízise történik klasszikus módszerekkel a mellékelt tematika alapján. A meghatározásokat jegyekkel értékeljük. 3. Évközi számonkérés módjai: egy zárthelyi dolgozat a számítási feladatokból (dec. 20.) egy zárthelyi dolgozat a gyakorlat anyagából (dec. 21.) 4. Felkészülés a vizsgára: Jegyzet: Pokol György, Sztatisz Janisz (szerk.): Analitikai kémia I., Műegyetemi kiadó Burger Kálmán: Az analitikai kémiai alapjai, Semmelweis Kiadó, 1999 Silabusz: a nappali tagozatos hallgatóknak készített munkafüzetek rövidített változata és 40 kidolgozott számítási feladat (mellékelve) 5. Számonkérés: Gyakorlat: gyakorlati jegy, amely a gyakorlatok elején (lásd tematika alább) írt zárthelyik és a meghatározásokra kapott jegyekből kialakított érdemjegy. Elmélet: írásbeli kollokvium (tesztkérdésekből, egyenletrendezésből, fogalmi meghatározásokból és esszékből álló feladatsor). Javítási lehetőség: írásban vagy szóban, a tanulmányi és vizsgaszabályzatnak megfelelően.
3 Tematika (elmélet) 1-2. konzultáció: A kémiai analízis felosztása és alapfogalmai: minőségi analízis, mennyiségi analízis, klasszikus analitika, műszeres analitika. A kémiai analízis lépései. A klasszikus minőségi és mennyiségi analizísben használatos reakciók típusai és a reakciókkal szemben támasztott követelmények. Sav-bázis reakciók; savak, bázisok erőssége, sav-bázis egyensúlyokat jellemző egyensúlyi állandók, a víz sav-bázis sajátságai, a ph fogalma és számolása erős savak és egyértékű gyenge savak esetében, sav-bázis pufferek, többértékű savak. Sav-bázis reakciók alkalmazási lehetőségei a minőségi és mennyiségi analízisben: sav-bázis titrálások titrálási görbéi, indikátorai. A sav-bázis titrimetria gyakorlata. A komplexek, komplexképződési reakciók jellemzése, lépcsőzetes egyensúlyi állandók, stabilitási szorzat, a stabilitás ph-függése, komplexképződési reakciók minőségi és mennyiségi analitikai alkalmazása, komplexometria, a komplexometria legjellemzőbb ligandumai, a komplexometriás indikálás, a komplexometriás titrálási görbe. Redoxi reakciók, redoxi egyensúlyok, redoxi egyensúlyi állandó, Nernst-egyenlet, a redoxi potenciál ph-függése. Redoxi titrálások (permanganometria, bromatometria, kromatometria, jodometria), indikátoraik, redoxi titrálási görbe. Csapadékképződési reakciók. ldhatóság, oldhatósági szorzat. Az oldhatóságot befolyásoló néhány tényező (saját ion feleslegének hatása, idegen ion hatása). A csapadéképződési reakciók alkalmazása a minőségi és mennyiségi analitikában. Kationok osztályba sorolása. Argentometria, indikálási lehetőségek az argentometriában, titrálási görbe. 3. konzultáció: A gravimetria, a gravimetria lépései, megvalósítási lehetőségei. Megoszlási egyensúlyok. Extrakció. A kromatográfiás módszerek alapjai. Csoportosításuk, a kromatográfiás kifejlesztés módjai, a kromatográfiás folyamat, a sávszélesedés és okai, a kromatogramm és jellemző paraméterei, kolonna hatékonyság, elméleti tányérmagasság és tányérszám, optimális eluens áramlási sebesség. Gradiens elúció, kivitelezése. A kromatogrammok minőségi és mennyiségi kiértékelése, mennyiségi meghatározási módszerek. Papír- és vékonyrétegkromatográfia. Gélkromatográfia. Gázkromatográfia. Folyadékkromatográfia. Ioncserés kromatográfia.
4 Tematika (gyakorlat) 1. Laboratóriumi munkaszabályok ismertetése 2. Balesetvédelem 3. HCl mérőoldat készítése és pontos koncentrációjának meghatározása 4. Bórax hatóanyagtartalmának meghatározása 5. KMn 4 -mérőoldat készítése és pontos koncentrációjának meghatározása 6. Fe(III) meghatározása permanganometriásan 7. Na 2 S 2 3 mérőoldat készítése és pontos koncentrációjának meghatározása 8. Cu(II) meghatározása jodometriásan 9. Ca(II) és Mg(II) meghatározása komplexometriásan 10. Ca(II) meghatározása CaC 2 4. H 2 alakjában gravimetriásan 11. Gyógyszer hatóanyagok vizsgálata HPLC-vel (forgószínpadszerűen 4 fős csoportokban) 12. Zárthelyi dolgozat a számítási feladatok témaköréből (1. gyakorlaton) 13. Zárthelyi dolgozat a gyakorlat anyagából (2. gyakorlaton)
5 Klasszikus mennyiségi elemzés SAV-BÁZIS MÉRÉSEK 0,1 mol/dm 3 HCl mérőoldat készítése és pontos koncentrációjának a meghatározása a./ ldatkészítés: Az 500 cm 3, közelítőleg 0,1 mol/dm 3 koncentrációjú HCl oldatot a számított mennyiségű 36 (m/m) %-os 1,185 g/cm 3 sűrűségű sósavoldatból hígítással készítjük. b./ A készített oldat pontos koncentrációjának meghatározása: A meghatározás reakcióegyenlete: HC 3 + H + = H 2 C 3 H 2 + C 2 Recept: Analitikai tisztaságú KHC 3 -ból analitikai mérlegen visszaméréssel 0,1 g körüli mennyiségeket mérünk be 100-100 cm 3 -es titrálólombikokba. A bemért anyagot 20-30 cm 3 desztillált vízben oldjuk és 1-2 csepp metilvörös indikátort alkalmazva a közelítőleg 0,1 mol/dm 3 HCl oldattal hagymavörös színig titráljuk. A lombik tartalmát ezt követően (horzsakövet használva) a C 2 eltávolítása végett 2-3 percig forraljuk. A szobahőmérsékletre lehűtött oldatot cseppenként tovább titráljuk az átmeneti hagymavörös színig. Három párhuzamos mérést végzünk. A KHC 3 molekulatömege: 100,12 g/mol Forrás: Schulek-Szabó 113.o. Szilárd minta bórax-tartalmának meghatározása acidi-alkalimetriás titrálással A bórax (Na 2 B 4 7 10H 2 ) vizes oldatban két ekvivalens hidrogénion felvételére képes az alábbi egyenletnek megfelelően. A képződő igen gyenge sav, a bórsav, a meghatározást nem zavarja. A meghatározás ionegyenlete: B 4 7 2 + 2H + + 5H 2 = 4H 3 B 3 Recept: Az ismeretlen összetételű porkeveréket, mely bóraxot és inert szennyezést tartalmaz, homogenizálni kell. Homogenizálás után analitikai mérlegen visszaméréses technikával kb. 0,4 g - 0,4 g pontosan ismert mennyiséget mérünk titráló lombikokba. A három mintát desztillált vizes oldás után (térfogat 20-30 cm 3 ) két csepp metilnarancs indikátor jelenlétében, ismert koncentrációjú HCl mérőoldattal átmeneti színig titráljuk. Beadandó a minta % (m/m) bóraxtartalma. Molekulatömeg: (Na 2 B 4 7 10H 2 ): 381,37 g/mol Hibahatár: 4% KMPLEXMETRIÁS GYAKRLATK 0,01 mol/dm 3 Na 2 EDTA mérőoldat készítése
6 A mérőoldatot analitikai tisztaságú Na 2 EDTA 2H 2 (Komplexon III) analitikai pontosságú bemérésével készítjük. A ligandummolekula (H 4 EDTA) képlete: - C CH 2 H 2 C C - H + N CH 2 CH 2 NH + HC CH 2 H 2 C CH Ca(II)- és Mg(II)-ionok meghatározása egymás mellett komplexometriásan A kalcium- és magnéziumionok 1:1 összetételű, az oldat ph-jától függő stabilitású komplexet képeznek az EDTA-val. Erősen lúgos körülmények között (ph > 12) csak a Ca 2+ lép kölcsönhatásra a komplexképzővel, így az megfelelő indikátor mellett megtitrálható. A minta ph-ját csökkentve a Mg 2+ is mérhető, ennek meghatározását a [CaEDTA] 2 formában jelenlevő kalciumionok már nem zavarják. Reakcióegyenletek: A ph-t > 12-re állítva: Ca 2+ + EDTA 4 = [CaEDTA] 2 Ugyanezen mintát ph 10-nél továbbtitrálva: Mg 2+ + EDTA 4 = [MgEDTA] 2 Recept: Az ampullában kiadott ismeretlent maradék nélkül 100 cm 3 -es mérőlombikba mossuk jelig töltjük és homogenizáljuk. 10,00 cm 3 -es részleteit desztillált vízzel 40-50 cm 3 -re hígítjuk és 2 cm 3 10 %-os NaH oldattal elegyítjük. Az oldatot 0,1-0,2 g szilárd hígítású murexidet használva indikátorként, pirosból ibolya színig titráljuk. A megtitrált oldatot 3 cm 3 20 %-os sósavval átsavanyítjuk, felmelegítjük, hogy a murexid elbomlását siettessük. A lehűtött elegyhez 6 cm 3 25 %-os ammóniaoldatot öntünk, majd 0,1-0,3 g szilárd hígítású eriokromfekete T indikátor mellett addig titráljuk, míg az oldat ibolyáspiros színe állandó kékre változik. Beadandó a minta kalcium- és magnéziumion-tartalma milligrammban. Atomtömegek: Ca: 40,08; Mg: 24,32 g/mol. Hibahatár: Ca(II): 2 %; Mg(II): 3 %. Forrás: Schulek-Szabó 329.o. Sajó: Komplexometria: 157.,167-168.o. Erdey: Bevezetés a kémiai analízisbe. II: 288.o. Al(III)ion meghatározása komplexometriásan Mivel az alumínium(iii) nagy stabilitású, 1:1 összetételű EDTA komplexe csak lassan jön létre, kvantitatív képződését melegítéssel és a komplexképző feleslegben való alkalmazásával
7 segítjük elő. Ismert mennyiségű EDTA-t alkalmazva és annak feleslegét alkalmas módon megmérve (pl. cinkion mérőoldattal), az alumíniumion mennyisége egyszerűen számolható. A meghatározás egyenletei: Al 3+ + fölös mennyiségű EDTA 4 = [Al(EDTA)] + EDTA fölösleg EDTA fölösleg + Zn 2+ = [Zn(EDTA)] 2 Recept: Az ampullában kiadott ismeretlent maradék nélkül 100 cm 3 -es mérőlombikba mossuk jelig töltjük és homogenizáljuk. 10,00 cm 3 -es részleteit sósavval ph = 2-3 értékűre állítjuk be. A reakcióelegyhez 20,00 cm 3 0,01 mol/dm 3 koncetrációjú EDTA mérőoldatot csurgatunk majd az elegyet néhány percig forraljuk. A komplex kialakulása érdekében a még forró oldathoz 2-3 csepp fenolftalein indikátor jelenlétében annyi 5 %-os ammónia oldatot csepegteünk, míg az rózsaszínű lesz. Az elegyet 1-2 percig ismét forraljuk. Lehűtjük, néhán csepp 5 %-os sósavval átsavanyítjuk és 1-2 szilárd hexametiléntetramint adunk hozzá. Az oldatot desztillált vízzel 50-60 cm 3 -re kiegészítve, az EDTA fölösleget pontosan ismert, kb. 0,01 mol/dm 3 koncentrációjú cink(ii) mérőoldattal visszatitráljuk. Indikátor: 0,1-0,3 g szilárd hígítású metiltimolkék. Az oldat színváltozása: sárgából kezdődő kékbe (figyelem, itt nem állandó színig titrálunk). Beadandó a minta alumíniumion-tartalma milligrammban. Atomtömegek: Al: 26,98. Hibahatár: 3%. Forrás: Schulek-Szabó 325.o. Sajó: Komplexometria: 116.,136.o. GRAVIMETRIÁS FELADATK Kalciumionok meghatározása CaC 2 4 H 2 alakjában Ammónium-oxalát hatására kalciumionokat tartalmazó forró oldatból jól szűrhető és mosható kalcium-oxalát-monohidrát csapadék válik le, amely vízoldhatósága kicsiny (K So = 2,6 10-9 ). Híg ecetsavas közegben (ph = 3) a kalcium kvantitatíven leválik, ezért az eljárás alkalmas a kalciumionnak magnéziumiontól való elválasztására is. A meghatározás egyenlete: Ca 2+ + (C) 2 2- + H 2 = Ca(C) 2. H 2 Recept: Az ampullában kiadott ismeretlent maradék nélkül 100 cm 3 -es mérőlombikba mossuk jelig töltjük és homogenizáljuk. A törzsoldat 10,00 cm 3 -es részletét főzőpohárban desztillált vízzel 100 cm 3 -re hígítjuk, 3 g ammónium-kloridot és 10 cm 3 1 mólos ecetsavat adunk hozzá. A forrásig melegített oldathoz osztott pipettával cseppenként 20 cm 3 ammónium-oxalátoldatot adunk. A csapadékos oldatot ezután még 1-2 percig forrásban tartjuk. Óraüveggel lefedve 2-3 órahosszán át állni hagyjuk, majd a csapadékot előzőleg tömegállandóságig szárított és analitikai mérlegen lemért G 4-es szűrőre gyűjtjük, 50 cm 3 hideg desztillált vízzel mossuk és 3 órán át 100 o C-on szárítjuk. M CaC2 4 H2 :146,11 g/mol; A kalcium atomtömege: 40,08 g/mol
8 Beadandó a kiadott ismeretlen kalciumion-tartalma milligrammban. Hibahatár: 3% CSAPADÉKS TITRÁLÁS KCl-KBr porkeverék összetételének meghatározása Mohr szerint, indirekt módszerrel Az igen kis oldékonyságú, fehér vagy sárgás színű ezüst-halogenidek formájában leváló bromid- és kloridionok ezüst-nitrát mérőoldattal határozhatók meg, kromátion mint indikátor mellett. A titrálás végpontját a titrálószer feleslegének a kromáttal képződő csapadéka, az Ag 2 Cr 4 vöröses színe jelzi. Reakcióegyenletek: Ag + + Cl = AgCl Ag + + Br = AgBr Recept: Az előzetesen már homogenizált keverék kb. 0,50 g-nyi analitikai pontossággal mért részletét veszteség nélkül 100 cm 3 -es mérőlombikba mossuk, feloldjuk, a mérőlombikot jelig töltjük és az oldatot homogenizáljuk. A törzsoldat 10,00 cm 3 -es részleteit 100 cm 3 -es titrálólombikba pipettázzuk, majd térfogatukat desztillált vízzel ~ 50 cm 3 -re egészítjük ki. Ezt követően a titrálás indikátorául szolgáló 5 %-os K 2 Cr 4 1-1 cm 3 -ét adjuk a mintákhoz, majd AgN 3 mérőoldattal titrálunk. A végpont megállapítása a következő módon történhet. Egy mintát gyors, tájékozodó titrálással túltitrálunk. (A kezdetben leváló zöldessárga csapadékos oldat ilyenkor pirosas árnyalatúvá válik). A következő mintához annyi mérőoldatot adunk, hogy néhány tized cm 3 -re megközelítse a végpontot, de ne érje el azt. E két oldat szolgál vonatkoztatási alapul a végpont megállapításánál. Nevezetesen a titrálást addig folytatjuk, míg az utóbbi félretett mintához viszonyítva enyhe színváltozást észlelünk. A "változást okozó" tört csepp térfogatát a teljes fogyásból levonva kapjuk a tényleges ekvivalens mérőoldat térfogatát. A KCl molekulatömege: 74,56 g/mol A KBr molekulatömege: 119,01 g/mol Beadandó a kiadott ismeretlen összetétele % (m/m)-ban kifejezve. Forrás: Schulek-Szabó 274.és 527.o. REDXI REAKCIÓKN ALAPULÓ MEGHATÁRZÁSK Bromatometria 0,02 mol/dm 3 koncentrációjú KBr 3 mérőoldat készítése Analitikatisztaságú vegyszerből analitikai mérlegen bemérve készítjük a KBr 3 törzsoldatot. A KBr 3 molekulatömege: 167.02 g/mol Forrás: Schulek-Szabó: 206. o. C-vitamin hatóanyagtartalmának meghatározása
9 A meghatározás egy példa a bróm-addíciós meghatározásokra. A reakcióban az aszkorbinsav dehidroaszkorbinsavvá oxidálódik. Az oxidációhoz szükséges brómot bromid- és bromátion reakciójával nyerjük. A bromidot feleslegben alkalmazva a bromát határozza meg a képződő bróm mennyiségét. A titrálás végpontjában megjelenő fölös brómot az indikátor színváltozása jelzi. A meghatározás egyenletei: 5 Br + Br 3 + 6 H + = 3Br 2 + 3 H 2 H H H + Br 2 H Br H H Br H H H + 2H + + 2Br - H Recept: A homogenizált vizsgálati mintából analitikai mérlegen 1 g körüli mennyiséget bemérünk, melyet aztán maradék nélkül 100 cm 3 -es mérőlombikba mossunk át. ldódás után a lombikot desztillált vízzel jelig töltve és összerázva nyerjük a törzsoldatot. A törzsoldatból 10,00 cm 3 -es részleteket 100 cm 3 -es titrálólombikokba pipettázunk, majd minden mintához 10 cm 3 10 (m/m) %-os HCl oldatot és annyi desztillált vizet adunk, hogy térfogatuk 40-50 cm 3 legyen. A reakcióelegyekben 0,2-0,2 g KBr-ot oldunk és 2 csepp p-etoxikrizoidin indikátor jelenlétében KBr 3 mérőoldattal titrálunk. A aszkorbinsav molekulatömege: 176,12. Beadandó a szilárd porkeverék hatóanyagának tartalma (m/m) %-ban. Hibahatár: 4 % Forrás: Schulek-Szabó 209-210.o. Permanganometria 0,02 mol/dm 3 KMn 4 mérőoldat készítése és koncentrációjának meghatározása a./ ldatkészítés: A 0,02 mol/dm 3 KMn 4 oldat készítéséhez a számított mennyiségű, analitikai tisztaságú vegyszert táramérlegen mérjük be. A frissen elkészített oldatot ülepítjük, majd pár óra elteltével G4-es üvegszűrőn átszűrjük. b./ A készített oldat pontos koncentrációjának meghatározása nátrium-oxalátra: A meghatározás ionegyenlete: 2 Mn 4 + 5(CH) 2 + 6H + = 2 Mn 2+ + 10 C 2 + 8 H 2 Na 2 (C) 2 törzsoldat készítése: A megfelelő tisztaságú szilárd Na 2 (C) 2 analitikai mérlegen történő bemérésével készül az 0,05 mol/dm 3 koncentrációjú oldat. Recept: A Na 2 (C) 2 törzsoldat 10,00 cm 3 -es részleteit 100 cm 3 -es titrálólombikba visszük, térfogatukat desztillált vízzel ~30 cm 3 -re növeljük majd 10 cm 3 10 (m/m)%-os H 2 S 4 oldatot
10 adunk az egyes mintákhoz. A reakcióelegybe 0,2-0,3 g MnS 4 -ot szórunk, majd a 60-80 o C-ra melegített oldatot a KMn 4 mérőoldattal halvány rózsaszínig titráljuk. Időben elhúzódó titrálásnál a mintát a titrálás vége felé ismét felmelegítjük. A KMn 4 molekulatömege: 158,04. A Na 2 (C) 2 molekulatömege: 134,00 g/mol Forrás:Schulek-Szabó 184.o. Fe(II)-Fe(III) meghatározása permanganometriásan A meghatározás során először a kiadott keverék vas(ii)-tartalmát mérjük, majd a minta teljes vas(iii) mennyiségét ón(ii)-kloriddal vas(ii)-vé redukálva és a redukálószer feleslegét higanykloriddal elbonva az összvas-tartalmat vas(ii) formájában újratitráljuk. A két mérés különbsége adja az eredeti vas(iii)-tartalmat. A meghatározás ionegyenletei: 5Fe 2+ + Mn 4 + 8H + = Mn 2+ + 5Fe 3+ + 4H 2 2Fe 3+ + SnCl 2 + 2Cl = 2Fe 2+ + SnCl 4 SnCl 2 + 2Hg 2+ + 4Cl = SnCl 4 + Hg 2 Cl 2 Recept: A kapott mintát maradék nélkül 100 cm 3 -es mérőlombikba mossuk, azt jelig töltjük és összerázzuk. Az így nyert törzsoldat 10,00 cm 3 -es részleteit 100 cm 3 -es titrálólombikba pipettázzuk. 15-15 cm 3 Zimmermann-Reinhardt oldatot adunk egy-egy mintához, majd hidegen a KMn 4 mérőoldattal a halvány rózsaszín megjelenésig titrálunk. (A halvány rózsaszín legalább 30 s-ig megmarad!) A megtitrált mintához 10 cm 3 20 (m/m) %-os sósavat adunk, majd horzsakő jelenlétében forrásig hevítjük. A forró oldathoz cseppenként cc. HCl-val frissen készült 15 (m/m) %-os SnCl 2 -ot adunk, az oldat teljes elszíntelenedésig. Célszerű ezután még egy csepp SnCl 2 -ot juttatni a rendszerbe. Ezt követően lehűtjük az oldatot, majd hirtelen mozdulattal 10 cm 3 5 (m/m) %-os HgCl 2 -ot adunk hozzá. Fehér, selymes fényű Hg 2 Cl 2 válik ki. 1000 (esetleg 500) cm 3 -es Erlenmeyer-lombikba 300 cm 3 desztillált vizet, pár csepp permanganátot adunk az oldathoz (amit a teljes fogyásba természetesen beszámítunk), majd maradéktalanul belemossuk a már előzőleg redukált vassó oldatot, és állandó kevergetés közben a KMn 4 mérőoldattal tartós halvány rózsaszínig titráljuk. A vas atomtömege: 55,85. Beadandó a minta vas(ii)- és vas(iii)-tartalma milligrammban kifejezve. Hibaszázalék: Fe(II):3 %; Fe(III): 4 %. Forrás: Schulek-Szabó 186-187.o Jodometria 0,02 mol/dm 3 Na 2 S 2 3 mérőoldat készítése és koncentrációjának meghatározása a./ ldatkészítés: A megfelelő tisztaságú szilárd anyagot táramérlegen bemérve készítjük a mérőoldatot. Molekulatömeg: Na 2 S 2 3 5H 2 : 248,19 g/mol
11 b./ A készített oldat pontos koncentrációjának meghatározása: A meghatározáshoz ismert mennyiségű jódot állítunk elő feleslegben vett jodidion és pontosan mért jodátion reakciójával, savas közegben. A képződő jódot tioszulfát mérőoldattal titrálva az ismét a színtelen jodidionná redukálódik, így a titrálás végpontjának jelzése a még jelenlevő jód és a hozzáadott keményítő indikátor között képződő ibolyaszínű addukt elszíntelenedésével tehető érzékenyebbé. A meghatározás ionegyenletei: I 3 + 5 I + 6H + = 3I 2 + 3H 2 2S 2 3 2 + I 2 = S 4 6 2 + 2I Recept: Ismert koncentrációjú KI 3 törzsoldat 10,00 cm 3 -es részleteit csiszolatos üvegdugós Erlenmeyer lombikokba pipettázzuk. A mintákhoz ~20-20 cm 3 desztillált vizet, 1-2 cm 3 20 (m/m) %-os HCl-at adunk, majd 0,5 g KI-ot oldunk bennük. Desztillált vízzel megnedvesített üvegdugóval azonnal lezárjuk a lombikokat, majd sötét helyre tesszük. 3-5 perc elteltével a kivált jódot tioszulfát mérőoldattal titráljuk. A titrálás vége felé a reakcióelegybe néhány csepp 1 %-os keményítőoldatot juttatunk. A végpontot az oldat kék színének eltűnése jelzi. Irodalom:Schulek-Szabó 229-232.o. Cu(II) meghatározása jodometriásan A meghatározás alapja az, hogy a réz(ii) jóddá képes oxidálni a jodidiont és a képződő Cu(I) fehér, oldhatalan réz(i)-jodidot képez a jodid feleslegével. A rézionnal ekvivalens jód tioszulfát mérőoldattal meghatározható, a CuI csapadék a mérést nem zavarja. A meghatározás ionegyenletei: 2Cu 2+ + 4 I = 2CuI + I 2 2S 2 3 2 + I 2 = S 4 6 2 + 2I Recept: Az ampullában kiadott ismeretlen oldatot maradéktalanul 100 cm 3 -es mérőlombikba mossuk, jelig töltjük és homogenizáljuk. A törzsoldat 10,00 cm 3 -es részleteit csiszolatos üvegdugós Erlenmeyer-lombikokba pipettázzuk. A minták térfogatát desztillált vízzel kb. 50 cm 3 -re egészítjük ki, majd 3-3 cm 3 10 (m/m) %-os ecetsavval elegyítjük. A reakcióelegyben 1 g KI-ot oldunk, és desztillált vízzel megnedvesített üvegdugóval a lombikot azonnal lezárjuk, sötét helyre tesszük. Kb. 5 perc elteltével a kivált jódot tioszulfát mérőoldattal megtitráljuk. A titrálás vége felé pár csepp 1 %-os keményítőoldatot juttatunk a reakcióelegybe. A titrálást lassan fejezzük be. A réz atomtömege: 63,54 g/mol Beadandó a minta réz(ii)-tartalma milligrammban kifejezve. Hibahatár:2 %. Irodalom:Schulek-Szabó 242.o.
12 NAGYNYMÁSÚ FLYADÉKKRMATGRÁFIA (HPLC) 1. A HPLC-ről A nagynyomású (vagy nagy teljesítményű) folyadékkromatográfiát, amely mintegy 30 éve ismert, ma az analitikai (és a szintetikus) kémia egyik legértékesebb elválasztási eljárásának tartjuk. Előnyei közé tartozik, hogy a méréseket szobahőmérsékleten vagy annak közelében végezhetjük, így termikusan érzékeny anyagok is vizsgálhatók vele, megfelelő szerkezeti anyagok felhasználásával pedig biológiai eredetű minták is közvetlenül analizálhatók. A kromatográfiás körülmények (kolonna töltetanyaga, eluens minősége, stb.) megfelelő megválasztásával szinte minden vegyületcsalád és minta vizsgálatára alkalmas, sőt esetenként összetett reakcióelegyek komponenseinek üzemi léptékű szétválasztására is alkalmazzák. Hozzáértő kromatográfus kezében a HPLC olyan eszköz, amellyel a gyógyszerekkel, szerves kémiai vagy biológiai eredetű mintákkal kapcsolatos legtöbb analitikai jellegű probléma nagy pontossággal és nagy megbízhatósággal megoldható. Előnyei mellett nem szabad megfeledkeznünk arról, hogy még egy alapkiépítettségű HPLC készülék is meglehetősen drága, folyamatos üzemeltetése pedig szintén nagy anyagi terheket jelent. A legutóbbi években elterjedőben vannak azok a nagyon kis belső átmérőjű kolonnák, amelyekkel a felhasznált eluens mennyisége az analitikai felbontóképeesség megtartása, sőt esetenként növekedése mellett a korábbi mennyiség töredékére csökkenthető. A legelterjedtebb, általános célokra szolgáló kolonnák mellett ma már számos, célzottan csak egy bizonyos vizsgálatra kifejlesztett kolonna is hozzáférhető, amelyekkel nagy számú mintát gyorsan elemezhetünk. A kromatográfiás csúcsok jellemzése Egy képzeletbeli kétkomponensű minta kromatogramja látható az 5.4.1. ábrán, a jelölések magyarázatai pedig az 5.4.1. táblázatban olvashatók. A közvetlenül meghatározott paraméterekből számított származtatott egységek az 5.4. 2. táblázatban találhatók. 5.4.1. ábra A kromatográfiás csúcsok jellemzésére szolgáló legfontosabb kísérleti paramétereket feltüntető mintakromatogram.
13 5.4.1. táblázat Az 5.4.1. ábrán látható mintakromatogram jelöléseinek magyarázata. A táblázatban a mérési eredményekből (kromatogramból) közvetlenül meghatározható, ún. elsődleges vagy primer adatok szerepelnek. Az ezek felhasználásával számítható származtatott, másodlagos jellemzőket az 5.4.2. táblázatban soroltuk fel. 5.4.2. táblázat A primer kísérleti adatok felhasználásával számítható származtatott kromatográfiás paraméterek. Jelölés w k' N Jelölés Mértékegység Név, jelentés Értelmezés t 0 min., sec. holtidő Annak a kompenensnek a retenciós ideje, amely egyáltal nem kötődik meg a tölteten. Gyakran az alapvonalon az injektálás következtében megjelenő kis intenzitású zavarjelet használjuk egy nemkötődő komponens helyett a t 0 azonosítására. t R,1 min., sec. Az 1. komponens retenciós ideje t R,2 min., sec. A 2. komponens retenciós ideje h csúcsmagasság a detektorválasz maximuma az alapvonalhoz viszonyítva w 1/2 min., sec. a csúcs a csúcsmagasság 50%-ánál mért csúcsszélesség félértékszélessége a 10% csúcsmagasságnál mérve a csúcs elejétől a csúcs maximumáig mért távolság b 10% csúcsmagasságnál mérve a csúcs maximumától a csúcs végéig mért távolság Mértékegység Név, jelentés min., sec. a csúcs talpponti (alapvonalon mért) szélessége dim. nélküli dimenzió nélküli kapacitásfaktor elméleti tányérszám H m, mm elméleti tányérmagasság Értelmezés Közelítő geometriai módszerrel meghatározva (érintőmódszer) a csúcs felfutó és lefutó ágához illesztett érintők által az alapvonalból kimetszett szakasz hossza. k = t R -t 0 t0 ptimális esetben k'=2-5 N=5,54* t 2 R w1/ 2 A desztilláció elméletéből a gázkromatográfián keresztül átvett analógia szerint megadja azt, hogy az adott kolonna az adott kromatográfiás körülmények között hány elméleti tányért tartalmazna, azaz hányszor következne be a teljes megoszlási egyensúly. H= L N
14 A s dim. nélküli aszimmetriatényező A S = b a Akkor tekintünk egy csúcsot jó alakúnak, ha az aszimmetriatényező értéke 0,9 1,4. Az 1,6-nél nagyobb, vagy 0,8-nél kisebb érték esetén a csúcs alakja nem adható meg egy Gauss-féle görbével, az elméleti tányérszám értéke már nem megbízhatóan jellemzi az adott komponensre nézve az elválasztási körülményeket. Szükség esetén (a szomszédos csúcsok helyzetétől függően) nem ideális alakú csúcsok esetén is tudunk mennyiségi meghatározást végezni, azonban ilyenkor nagyon ajánlott a közvetlen számolás helyett az adott komponensre készített kalibráló görbéből történő visszakeresés. Milyen paramétereket kell megadnunk egy HPLC-s rendszer, illetve kromatográfiás mérés leírása során? Általában meg kell adni, hogy a mérést milyen gyártmányú készüléken, vagy milyen modulokból összeállított készüléken végeztük, ezen felül minden olyan speciális jellemzőt, ami eltér a szokásos rozsdamentes acélból készült, nem biokompatibilis rendszerektől. Az előtétkolonna és a kolonna leírása során azok hosszúságát és belső átmérőjét kell megadni, valamint kötelezően szerepeltetni kell a szorbens (töltetanyag) nevét, típusát, szemcseméretét, valamint minden speciális tulajdonságát (pl. endcapped, mikrogyöngy, stb.). A mérési paraméterek előtt soroljuk fel az eluens(ek) nevét, tisztaságát, minőségét, esetleges kezelésük vagy tisztításuk során azok részletes leírását. A kromatogramon elsősorban azt tüntetjük fel, hogy a megadott jelű (számú, összetételű) mintát milyen kolonnán és milyen eluenssel analizáltuk. Megadjuk továbbá az elúció módját (izokratikus vagy gradiens), az alkalmazott áramlási sebességet, a gradiensprofil részletes leírását, az injektálás módját és az injektált minta pontos mennyiségét (térfogatát), a kolonnatéri hőmérsékletet, valamint azt, hogy történt-e termosztálás, vagy sem. 2. A gyakorlaton használt HPLC készülék leírása A gyakorlaton használt Jasco gyártmányú HPLC készülék összefoglaló rajza az 5.4.2. ábrán látható. Az áttekinthetőség kedvéért az eluensszállító csöveket csak részben jelöltük, az elektromos vezetékeket, adatátviteli vonalakat és a számítógépes adatgyűjtő rendszert egyáltalán nem ábrázoltuk.
15 5.4.2. ábra A laboratóriumi gyakorlaton használt Jasco HPLC készülék modulrendszerű felépítése. Jegyezzük meg a készüléket alkotó fő modulokat! Eluenstároló edények, szerkezeti anyagok A gyakorlatban többféle edényt használnak, kezdve a nagyon drága, kifejezetten professzionális célokra készült, törésgátló műanyagréteggel bevont, kúpos aljú, porszűrő ventillel ellátott edényektől egészen az egyszerű vegyszeres üvegekig. Az eluenstárolók és az eluenssel érintkező szerkezeti anyagok megválasztásakor a következő általános szempontokat kell figyelembe venni: 1. A tárolóedénynek, a csővezetékeknek és egyéb szerkezeti anyagoknak kémiailag teljesen inertnek kell lenniük az alkalmazott oldószerrel szemben. 2. Az oldószertároló edényeknek lehetőség szerint minél zártabbnak (de nem légmentesen zártnak!) kell lenniük. Ezzel megakadályozzuk a por bejutását az oldószerbe, valamint a gyakran egészségre veszélyes oldószergőzöknek a levegőbe kerülését. 3. Az oldószer-vezetéket feltétlenül el kell látni egy finom szűrővel, amely az oldószerbe véletlenül belekerült, szemmel láthatatlan szennyezőket eltávolítja. A rendszerbe került szilárd szennyezők a pumpát súlyosan károsíthatják, a kolonnát pedig eltömik! ERC 3315 on-line eluens gázmentesítő A HPLC vizsgálatokhoz használt oldószereket nagyon gondosan meg kell szabadítani a bennük oldott gázoktól. Nagy gáztartalmú oldószert használva a kolonnában és a detektorban buborékok képződnek, amelyek eredményeképpen az elválasztás jelentősen romlik, a sávok kiszélesednek, alakjuk torzul, a kolonnán mérhető nyomás, az oldószeráramlás sebessége ingadozik. Az eddigi gyakorlatban több eljárást is kidolgoztak az oldószerek gázmentesítésére, ezek röviden a következők: 1. Ultrahangos gázmentesítés (szonikálás). Az ultrahang által mikroszkópikus
16 méretekben keltett, gyorsan váltakozó nagy nyomás és vákuum hatására az oldószerben oldott gázokból makroszkópikus méretű buborékok képződnek, amelyek kibuborékolnak az oldatból. 2. Héliumos gázmentesítés. A hélium gyakorlatilag elhanyagolható mértékben oldódik az oldószerekben, ezért héliummal alaposan átbuborékoltatva az eluenst vele ki lehet űzni az oldott gázokat. Előnye, hogy nagyon jó minőségű, fluoreszcenciás detektorokhoz is jól használható oldószert állít elő, hátránya, hogy működtetése meglehetősen költséges. 3. Vákuumos gázmentesítés. Megvalósítható akár úgy, hogy az oldószert alacsony nyomáson kevertetve éppen forrásba hozzuk, amikor is az oldott gázok eltávoznak, vagy úgy, hogy az oldószeráramlás útjába (on-line) helyezünk egy folyamatosan működő, vákuumkamrás gázmentesítő egységet, amely mindig csak annyi oldószert gázmentesít, amennyi éppen felhasználásra kerül. Mindhárom eljárásnak vannak előnyei és hátrányai, a legutóbbi időben azonban az alkalmazás egyszerűsége, kényelme és alacsony fenntartési költségei miatt az on-line gázmentesítő egységek terjednek el. A gyakorlatban bármely fenti módszerrel találkozhatunk. A végeredményt tekintve mindhárom eljárás megbízható eredményt ad. A laboratóriumi gyakorlaton használt on-line gázmentesítő (degasser) rajza az 5.4.3. ábrán látható. 5.4.3. ábra Az ERC 3315 on-line gázmentesítő készülék elölnézeti rajza A készülék úgy működik, hogy vákuumkamrába helyezett gázáteresztő membránok között vezetjük át az oldószereket, ahol a bennük oldott gázok felszabadulnak és a membrán falán átjutva eltávoznak. A membránon csak a kis gázmolekulák jutnak át, az oldószer molekulái már nem. A készülék a működését tekintve teljesen automatikus, a bekapcsoláson illetve kikapcsoláson kívül vele más teendő nincs. Jasco LG-980-02 kisnyomású gradiensképző egység A gradiensképző egységig minden oldószer tiszta állapotban jut el, itt történik meg azok megadott arányú összekeverése. A készülék a pumpa által adott vezérlőjel hatására három elektromágneses szelep megfelelő idejű ki/be kapcsolásával állítja elő a kívánt összetételű elegyet. A manuális üzemmód a készülék feltöltésénél, hibakeresésnél, buborékmentesítésnél használatos. A gyakorlaton csak programvezérelt módban használjuk.
17 5.4.4. ábra A kisnyomású gradiensképző egység rajza Bekapcsolás után győződjünk meg arról, hogy a készülék PRGM (programvezérelt) üzemmódban van (azaz az ilyen feliratú lámpa világít). Ha MANU (kézi vezérlésű) üzemmódban van, akkor kapcsoljuk át a PRGM/MANU gomb egyszeri megnyomásával. Jasco PU-980 pumpa A készülék rajza az 5.4.5. ábrán látható. A pumpa az analitikai célokra használt teljes térfogati áramlási sebesség-tartomány (0-5 ml/perc) adagolására alkalmas, maximálisan 500 bar nyomás mellett. Bekapcsoláskor a készülék önellenőrzést végez, ha semmilyen hibaüzenetet nem kaptunk, akkor pár másodperc múlva a pumpa üzemkész. 5.4.5. ábra A PU-980 típusú, programveszérlésű pumpa elölnézeti rajza Az oldószerrel érintkező részek polírozott rozsdamentes acélból készültek. Az eluens szállítását két, egymással ellentétes fázisban mozgó dugattyú végzi, a folyadék visszaáramlását visszacsapó szelep akadályozza meg. Általában analitikai munkáink során nem dolgozunk a készülék teljesítőképességének határán, a szokásos térfogati áramlási sebesség 0,5-3 ml/perc, a maximális nyomás 300 400 bar. A nyomáskorlátozás betartása azért is fontos, mert a gyakorlaton szereplő összeállításban a csatlakozók egy része a könnyebb szerelhetőség kedvéért kézzel, szerszámok nélkül megszorítható, kémiailag ellenálló, nagy erősségű műanyagból készült, amelyek ennél nagyobb nyomást nem bírnak ki.
18 A készülék saját mikroprocesszoros vezérléssel rendelkezik, ami folyamatosan figyeli a rendszer legfontosabb paramétereit és gondoskodik azok beállított értéken tartásáról, emellett vezérli a kisnyomású gradiensképző egységet. Memóriájában sok lépéses, oldószerváltással és gradiensképzéssel, valamint időzítéssel összeállított programot tárolhat, amely a készülék kikapcsolása után sem vész el. Újbóli bekapcsoláskor automatikusan a legutóbb használt paramétereket állítja be. A kijelzőn egyszerre hat paraméter aktuális értékét lehet látni, a további paraméterek a MNIT gomb lenyomásával tehetők láthatóvá. Program üzemmódban a billentyűzet segítségével lehet beállítani a kijelzőn az A és B eluensek százalékos arányát, a harmadik komponens mennyiségét a készülék automatikusan kiszámítja (így nem lehet összesen 100%- nál nagyobb értéket figyelmetlenségből beállítani). A térfogati áramlási sebesség, a minimális és maximális nyomás egyszerűsített módon állítható, akár működés közben is, de a biztonság kedvéért ezt a lehetőséget általában nem használjuk ki. A HPLC vizsgálatok során gyakran használunk különböző koncentrációjú puffereket, sóoldatokat vagy savakat. A dugattyúk idő előtti elhasználódásának megelőzésére a dugattyúk mögötti teret általában desztillált vízzel folyamatosan öblítjük, hogy az esetleg kiszivárgó és bepárlódó sóoldat ne karcolja végig a dugattyúk polírozott felületét. Minden sóoldat alkalmazása után célszerű a pumpát leállítás előtt tiszta oldószerekkel átmosatni. A gyakorlaton elvégzendő feladatok a készülék fontos paramétereinek megváltoztatását nem kívánják meg. Csak az előírt feladatot végezzük, hozzá nem értésből, a gombok ötletszerű nyomogatásával rövid idő nagyon nagy kárt is okozhatunk! A pumpának a hálózati kapcsolóval történő kikapcsolását csak akkor szabad elvégezni, ha a PUMP gomb melletti lámpa nem ég, azaz a dugattyúk már nem mozognak. Ha még ég a lámpa, akkor először a pumpa meghajtómotorját kell kikapcsolni a PUMP gombbal, és csak azután szabad a készüléket is kikapcsolni. Ha nem így járunk el, a készülékben komoly károk keletkezhetnek, mert a dugattyúk meghajtó tengelye nem megfelelő állásban lesz, aminek eredményeképpen a következő bekapcsoláskor akár el is törhet! Rheodyne 7725i manuális injektor és 20 mikroliteres mintabemérő hurok A gyakorlaton egy olyan injektort használunk, amelyet világszerte a legszélesebb körben alkalmaznak, és megbízhatóságával kiemelkedik a hasonló termékek közül. Normál beállításban fém tömítésekkel és vezetékekkel 345 bar nyomásig használható, de minimális utánszabályozással 482 bar nyomáson is szivárgásmentesen üzemel. Az injektor és vele összeszerelt mintabemérő hurok működési elve az 5.4.6. ábrából könnyen megérthető. A mintabemérő hurok biztosítja, hogy mindig ugyanakkora térfogatot mérjünk be, ami megnöveli a bemérés reprodukálhatóságát. Lehetőség van a huroknál kisebb térfogatok kézi bemérésére is, ekkor azonban a pontosság és a reprodukálhatóság nagyon függ a kezelő ügyességétől.
19 5.4.6. ábra Az injektor forgó részének elhelyezkedése a LAD (feltöltés) és az INJECT (injektálás) állásokban A bemérő hurok feltöltését az injektor LAD állásában egy olyan, kifejezetten HPLC-s célokra készült 25 vagy 50 µl-es Hamilton fecskendővel végezzük, amely tűjének a vége nem hegyes, hanem merőleges síkba köszörült. Hagyományos injekciós tűvel az injektorba piszkálni szigorúan tilos, ugyanis annak a hegye beletörik, az éle pedig elvágja a tű vége körüli tömítést! A hurkot buborékmentesen kell feltölteni, hiszen az itt bekerült levegőbuborék akadálytalanul továbbkerül a kolonnára. Feltöltés után a fecskendőt nem húzzuk ki, hanem az injektorban hagyjuk, majd egy határozott mozdulattal átfordítjuk a kart az INJECT állásba (1/6 fordulat lefele, az óramutató járásával megegyező irányban, ütközésig). Lassú vagy nem teljes átfordítás esetén a pumpában a nyomás meghaladja a beállított maximális értéket, hiszen fordulás közben a pumpa felé zárt rendszer jön létre. Ekkor hibaüzenetet kapunk és a pumpa leáll. A pumpába beépített nyomáskorlátozás miatt nem történik károsodás, de ne kísérletezzünk a rendszer életre keltésével, hanem szóljunk a gyakorlatvezetőnek! Az injektor egy elektromos kapcsolóval van egybeépítve, amely az adatgyűjtő szoftver és a pumpa számára jelzi, hogy mikor történt az injektálás. A szoftver ennek a jelnek a hatására kezdi meg a tényleges adatgyűjtést, addig csak várakozik. A pumpa a jel hatására a kiindulási feltételekből (Initial conditions) továbblépve megkezdi a megadott program végrehajtását. Az injektor tömítése egy Vespel nevű poliamid műanyagból készült, ami kémiailag csak ph=10-ig ellenálló, erre oda kell figyelni a készülék tisztítása során. Mivel a kolonna ilyen nagy ph-n már nem használható, normális működtetés során nem fordulhat elő a tömítések oldódása. Más kolonnával lúgos közegben is lehet dolgozni, ekkor a tömítéseket Tefzel-ből készültekre ki kell cserélni. A Tefzel tulajdonságait tekintve a teflonhoz hasonló, valamennyivel kisebb ellenállóképességű, de olcsóbb polimer, amely gyakorlatilag a teljes ph-tartományban használható. Előtétkolonna és analitikai kolonna Az elválasztást Nucleosil 100 5 µm szemcsenagyságú C18-as (fordított fázisú) oszlopon végezzük, ugyanilyen anyaggal van töltve az előtétkolonna is. Az előtétkolonna az
20 analitikai kolonna védelmét szolgálja. Megakadályozza annak eltömődését, az egyes rendkívül erősen kötődő komponensek irreverzibilis kötődését az analitikai kolonna töltőanyagán, valamint az aktív töltőanyag oldódását, a csatornaképződést. Az elválasztást 4,5 mm x 250 mm belső méretű analitikai oszlopon végezzük, ennél hosszabb oszlopot analitikai célokra általában nem használnak. Egyéb szokásos normál méretek a 100, 120, 150, 200, 300 mm hosszúságú, 4-5 mm belső átmérőjű oszlopok. A legutóbbi időkben egyre elterjedtebbek lesznek a kis belső átmérőjű (ún. microbore) kolonnák, amelyek 2-3 mm belső átmérőjűek (sőt már vannak 1 mm átmárőjűek is), az esetükben alkalmazott töltőanyag 3,0-3,5 µm szemcsenagyságú. Ilyen oszlopokkal azonos vagy jobb felbontás mellett harmad- vagy negyedannyi oldószerre van szükség, mint a hagyományos méretűeknél. A kolonna töltésére használt Nucleosil 100 C18 egy szilikagélen alapuló, szinte ipari szabvánnyá változott, széleskörűen használt anyag, amelynél a szilikagél poláris hidroxilcsoportjainak jó részét n-oktadecil csoportokkal helyettesítették. A felületi hidroxilcsoportok megmaradt részét metilcsoportokkal zárták le (ún. endcapped, azaz teljesen lezárt), így ezzel akár ph=9-ig is dolgozni lehet. Nem lezárt tölteteknél a szilikagél oldódása miatt csak ph 2-7 kémhatású eluensek alkalmazhatók. Ennél is nagyobb ph tartományban használhatók azok az állófázisok, amelyek C-18 csoportokat tartalmazó polimerrel bevont szilikagél szemcsékből vagy polimerbevonatos mikroszkópikus üveggyöngyökből állnak, vagy pedig nem szilikagél, hanem polisztirol alapúak. Ez utóbbiak akár a teljes ph tartományban is alkalmazhatók. A nagy működési ph-tartomány mellett hátrányuk, hogy a polimer a nyomással szemben kevésbé ellenálló, bizonyos oldószerek hatására pedig a térfogatát változtathatja (zsugorodik vagy duzzad), ami jelentős problémát okozhat. Biológiai eredetű minták vizsgálatára különösen alkalmasak. A kolonnák fala általában polírozott belső felületű rozsdamentes acélból készül, következésképpen azok mechanikusan rendkívül erősek. A fém alkatrészek azonban nem férnek össze nagyon sok biológiai mintával, mert azok komponensei fémionok hatására bomlást szenvednek, vagy túlságosan erősen kötődnek a fém falon (pl. fehérjék), de olyan anyagokkal sem lehet velük dolgozni, amelyek a fémet akár csak kis mértékben is, de oldani képesek (ilyen pl. a vas kimutatására szolgáló dietil-ditiokarbamát). A probléma megoldására készültek legújabban az üveggel bevont belső felületű rozsdamentes acél kolonnák, csövek és csatlakozók, valamint a nagy szilárdságú mérnöki műanyagokból készült, teljesen biokompatibilis rendszerek. Természetesen ez utóbbi rendszereknél a minta sehol sem találkozhat fémmel, ezért a pumpa oldószerrel érintkező részeit, az injektort, a csöveket és tömítéseket is üvegből, teflonból készítik. A biokompatibilis rendszerek ára ma még jelentősen meghaladhatja a normál készülékek árát. A kolonnák és a csövek illesztésénél vigyáznunk kell arra, hogy minél közelebb kerüljenenk a csatlakozó végek egymáshoz, hogy közöttük a holttér minimális legyen. A holttér rendkívül káros, mert benne örvénylés alakul ki, aminek következtében a minta sokkal szélesebb fronton halad végig, mint ami szükséges. Ez a csúcsok kiszélesedéséhez vezet, aminek következtében a készülék felbontása jelentősen romlik. A kolonna és egy vezeték csatlakozójának vázlatos metszeti képe látható az 5.4.7. ábrán.
21 5.4.7. ábra A kolonna és a csatlakozó csövek helyes és helytelen illesztése Fémből készült cső és fém hollandi csavar esetén a tömítésnek általában fémből kell lennie, míg műanyagcső, műanyag hollandi csavar esetén a tömítés anyaga is műanyag. A tömítés anyagának eltévesztése szivárgáshoz, valamint a csővég károsodásához vezethet. Nagyon gondosan kell eljárni a legelső csatlakoztatás végrehajtásakor (különösen fémből készült szerelvények esetén), mert a tömítés a csavar első meghúzásakor enyhén deformálódik, rápréselődik a csőfalra és az ekkor beállított helyről többé már nem távolítható el! A gyakorlat végzése során sehol sem kell szétszerelni a készüléket! Ha valamelyik illesztésnél szivárgást tapasztalunk, akkor ne saját magunk próbálkozzunk a javítással, hanem szóljunk a gyakorlatvezetőnek! Jasco UV-975 UV/VIS detektor A kromatográfhoz tartozó UV/VIS-detektor egy a teljes UV spektrum letapogatására alkalmas (ún. scanning) üzemmódban is működő, mikroprocesszor vezérlésű, programozható UV/VIS fotométer, amely a 190-600 nm tartományban dolgozik. Ezen belül tetszőleges hullámhosszértéken történhet a detektálás, a hullámhosszat működés közben manuálisan és programból vezérelve is változtathatjuk, sőt lehetőség van a hullámhossz-változtatás időbeli programozására is. A detektor két csatornán kapcsolódik az adatgyűjtő számítógéphez, az egyik csatornán a kromatogramot, a másikon - ha ilyen módban dolgozik - a beállított csúcsok maximumánál automatikusan felvett UV/VIS spektrumot továbbítja. 5.4.8. ábra Az UV-975 detektor elölnézeti rajza
22 Bekapcsoláskor önellenőrzést végez a készülék, ez a deutériumlámpa lassabb bemelegedése miatt 1-2 percig tart. Ha egyszer bekapcsoltuk a detektort, akkor hagyjuk is bekapcsolva egészen a gyakorlat végéig! A ki/be kapcsolgatás sokkal jobban károsítja, mint az, hogy egy napig működik. A készülék bemelegedési ideje legalább 30 perc, az alapvonal csak ezután lesz elfogadhatóan egyenes. Ez idő alatt mérni nem lenne érdemes, de felhasználhatjuk ezt az időtartamot a mintaelőkészítésre. Az alapvonalat a BRWIN szoftver alapvonalfigyelő menüjével követhetjük nyomon. A készülék kijelzőjén lévő ABU érték kevesebb tizedesjegyet tartalmaz, mint amit a képernyőről leolvashatunk. Amíg a készülék kijelzőjén lévő abszorbanciaérték változást mutat, semmiképpen sem lehet értékelhető mérést elkezdeni. Az ABU értéket az AUT-ZER gomb megnyomásával lehet lenullázni. A detektorból kifolyó oldat a többi hulladékkal együtt közös gyűjtőedénybe kerül. A gyakorlat során a hulladék oldószereket nem öntjük a lefolyóba, hanem a fülke alatt található veszélyeshulladék-gyűjtő üvegekbe öntjük. Az edények elmosásakor nem alkalmazunk acetont az edények kiszárítására, mert a legkisebb maradék is óriási csúcsot ad az UVspektrumban, helyette indokolt esetben metanolt vagy etanolt használunk. 3. Mérési feladatok A gyakorlat célja a HPLC elméleti és gyakorlati alapjainak megismertetése ismert gyógyszerek tiszta hatóanyagai keverékének analízise során. A felhasznált anyagok (5.4.3. táblázat) olyanok, amelyek előfordulnak (vagy régebben előfordultak) több gyógyszerben. Név, képlet Benzokain NH 2 Fenacetin HN 5.4.3. táblázat A gyakorlaton használt gyógyszer-hatóanyagok rövid ismertetése. Leírás Más néven: anesztezin, gyógyszerkönyvi neve: Norcainum. Megtalálható az Anasthesin Benzocain nevű gyári készítményben. Sebek, fekélyek, nyelési nehézségek esetén fájdalomcsillapításra használták 0,9-3 g-os napi adagolásban, de tengeribetegség ellen is hatásos volt hányingercsökkentő hatása miatt. Gyógyszerkönyvi neve: Phenacetinum, megtalálható a Phenacetin és a Acetphenetidin nevű gyógyszerekben. Láz- és fájdalomcsillapító hatású anilinszármazék. 0,5-1 g-os adagban 4-8 óráig tart a hatása. Az etilcsoport a májban lehasad, a szervezetben így jön létre a valóban hatékony metabolit, az acetaminofen (Paracetamol). Emiatt az átalakulás miatt hatása csak a bevételtől számítva kb. 1 óra múlva jelentkezik. Tartós szedése emésztőrendszeri panaszokat, súlyos máj- és vesekárosodást, vérszegénységet okozhat. Kloramfenikol Gyógyszerkönyvi neve: Chloramphenicolum. Megtalálható a Chloramphenicol és a Chlorocid gyógyszerekben, valamint több más készítményben. A Streptomyces venezuelae termelte antibiotikum, amelyet először 1948-ban izoláltak, de 1949-re megoldották a szintézisét is. Ez volt az első, ipari méretekben szintetikusan előállított, orálisan is hatékony, széles hatású antibiotikum. Mellékhatásai miatt
23 N 2 mára már csak néhány nagyon súlyos betegség gyógyítására használják (pl. tífusz, baktérium okozta agyvelőgyulladás, stb.). H HN H Cl Koffein N N N N Gyógyszerkönyve neve: Coffeinum. Mindenki által ismert, élénkítő hatású alkaloid. Ájulás, alacsony vérnyomás, testi és szellemi fáradtság érzése ellen, valamint más gyógyszerekkel kombinálva használatos. Gyógyszerként használva egyszeri adagja 50-300 mg, míg napi adagja 150-600 mg lehet. Mellékhatásként émelygés, heves szívdobogás, arra érzékenyeknél ritmuszavar, hasmenés, fokozott vizelési inger jelentkezhet. A kávé és tea jelentős mennyiségben tartalmaz koffeint, de megtalálható számos üdítőitalban, valamint a Plussssz Aktív pezsgőtablettában is. A következő felsorolásbólból tájékozódhatunk az egyes élelmiszerek koffeintartalmáról. Koffeintartalom 1 doboz üdítőitalban Coca-Cola 46 mg Diet Coke (Coca-Cola Light) 46 mg Sunkist range 42 mg Pepsi Cola 38 mg Diet Cola (Pepsi Cola Light) 36 mg jeges tea 70 mg Sprite; Fanta, 7-UP 0 mg Koffeintartalom hosszú kávé tea kakaós tej csokis tej tejcsokoládé étcsokoládé 80-240 mg (200 ml-ben) 33-147 mg (200 ml-ben) 9-27 mg (200 ml-ben) 4-7 mg (200 ml-ben) 21-53 mg (100 g-ban) 70-123 mg (100 g-ban) Paracetamol H HN Szalicilamid Más néven: acetaminofen. A lázcsillapító hatású anilinszármazékok közös metabolitja, ez a valódi hatóanyag. Szintetikusan egyszerűen előállítható, régóta használatos az orvosi gyakorlatban láz és kisebb fájdalmak csillapítására. Mellékhatásai megegyeznek a fenacetinével. Szabadforgalmú gyógyszerként hazánkban sok éves szünet után (mellékhatásai ellenére) újra forgalomba hozták. A szalicilsav-származékokhoz hasonlóan láz- és fájdalomcsillapító hatású anyag, ma már kevésbé használatos. Megtalálható volt az Eggosalil tablettában. Az acetil-szalicilsavnál (Aspirin) kevésbé
24 NH 2 H hatásos. 4. A gyakorlaton elvégzendő feladatok 1. A leírás alapján a kiadott eszközök átvétele, szükség esetén mosogatás. 2. A készülék indításának megbeszélése, a készülék bemutatása, a szoftver ismertetése. 3. A gyakorlatvezető által meghatározott 2 4 gyógyszer-hatóanyag egyenkénti meghatározása, a retenciós idők megállapítása. 4. A gyakorlatvezető által meghatározott sorszámú ismeretlenben a komponensek minőségének meghatározása. 5. Az eredmények nyomtatása, jegyzőkönyvkészítés, mosogatás, eszközök leadása. A gyakorlatra kiadott törzsoldatok koncentrációit és a szükséges hígítások mértékeit a mérések megkezdése előtt a helyszínen adjuk meg. A hígításokat a méréssel párhuzamosan kell elvégezni, ami jelentős időmegtakarítást eredményez. A mérés során a hígításokat a kis térfogatokra tekintettel nem mérőlombikban, hanem állítható térfogatú digitális pipetták sgítségével, 2 cm 3 -es mintásüvegekben, egyszerű térfogat-összeméréssel végezzük. Tekintettel arra, hogy nagyon híg oldatokkal dolgozunk, és a hígításhoz ugyanazt az oldószerelegyet használjuk, mint amiben a minta oldva van, nem kell számolnunk a térfogatadditivitástól való eltéréssel. A hatóanyagok 50% MeH - 50 % H 2 elegyben vannak feloldva, a mérést és a szükséges hígításokat is ezzel az eleggyel végezzük. Ha a hígításokhoz tiszta oldószereket és nem a futtató elegyet használnánk, akkor a kromatogramban az oldószerre jellemző pozitív vagy negatív (ál)csúcsok jelennének meg. Ennek az a magyarázata, hogy alacsonyabb hullámhosszaknál a metanol elnyelése már nem hanyagolható el, míg a víz a teljes UV-tartományban egyformán átlátszó. Víz injektálása esetén tehát negatív, metanol injektálása esetén pedig pozitív csúcsot kapunk. Mérési paraméterek A gyakorlaton a detektálást 240 nm-en végezzük. A vizsgálatok során 1 ml/min áramlási sebességet használunk, a pumpán a maximális nyomást 300 bar-ra állítjuk. Az összes futtatást 50-50 víz-metanol eleggyel végezzük, amelyet tiszta oldószerekből a gradiensképző egység segítségével állítunk elő. A mérési idő egyetlen standard anyag esetében sem haladja meg a 12 percet. Szoftver A BRWIN program ismertetése a gyakorlaton történik. Igen célszerű, ha a csoportok úgy állnak össze, hogy legalább egyikük járatos legyen a MS-Windows 3.1 és a Windows-os
25 programok kezelésében. Az angol nyelv alapjainak ismerete feltétlenül szükséges a program kezeléséhez. A mérési adatokat futtatásonként külön-külön fájlban tároljuk. A BRWIN programban a fájl neve maximum 5 betűs lehet, ehhez a program automatikusan hozzáad még egy háromjegyű sorszámot, így minden mérésnél nyugodtan használhatjuk ugyanazt a nevet. A méréssorozat kezdetekor megadjuk a program számára a legfontosabb jellemzőket, ezeket nem kell újra beállítanunk. Ne felejtsük el azonban minden egyes futtatáskor beírni, hogy éppen mit is mérünk, különben a végén nem tudjuk majd értékelni az eredményeket.
26 GYAKRLÓ FELADATK A KLASSZIKUS ANALITIKA TÉMAKÖRÉBŐL I. Sav-bázis titrálások 1. Közelítőleg 0,1 mol/dm 3 koncentrációjú HCl oldat pontos koncentrációját kívánjuk meg-határozni. Hány gramm KHC 3 -ból kell 100,00 ml törzsoldatot készíteni, ha 10-10 ml-es rész-leteit titrálva 10 ml körüli HCl oldat fogyást tervezünk. KHC 3 + HCl = KCl + H 2 + C 2 A fogyott 10 ml HCl oldatban 10 0,1 = 1 mmol HCl van közelítőleg, ami megfelel 1 mmol KHC 3 -nak a titrált mintában, tehát a 100 ml tözsoldatban 10 mmol KHC 3 kell hogy legyen. M KHC3 = 100,1 g/mol A szükséges mennyiség tehát: 100,1 10 = 1001 mg = 1,001 g KHC 3 2. Hány %(m/m) Na 2 C 3 -ot tartalmaz az a NaCl-Na 2 C 3 keverék, amelynek 1,5861 g-nyi mennyiségéből 100,00 ml törzsoldatot készítve és 10 10 ml-es részleteit HCl oldattal (c = 0,2023 mol/dm 3 ) titrálva a fogyások a következőek: I: 8,12 ml, II: 8,10 ml, III: 8,11 ml. A HCl oldat csak a Na 2 C 3 -tal lép reakcióba: Na 2 C 3 + 2 HCl = 2 NaCl + H 2 + C 2 Az I.-III. fogyások átlaga: (8,12 + 8,10 + 8,11)/3 = 8,11 ml HCl oldat n HCl = 8,11 0,2023 = 1,6407 mmol HCl, ez megfelel 1,6407/2 = 0,8203 mmol Na 2 C 3 -nak az egyenlet alapján a Na 2 C 3 mennyisége a törzsoldatban:0,8203 10 = 8,203 mmol M Na2 C 3 = 106,0 g/mol A Na 2 C 3 tömege: 8,203 106 = 869,5 mg = 0,8695 g, ez van 1,5861 g keverékben Tehát a keverék 0,8695/1,5861 100 = 54,82 %(m/m) Na 2 C 3 -ot tartalmazott. 3. Mennyi annak az ecetsav-acetát puffernek a ph-ja, amelyben az ecetsav koncentrációja 0,20 mol/dm 3, a nátrium-acetát koncentrációja 0,35 mol/dm 3 és K s = 1,86 10-5. [H + ] = K s c s /c b = 1,86 10-5 0,20/0,35 = 1,063 10-5 mol/dm 3, tehát a ph = -lg[h + ] = 4,973 4. 100-100 ml 0,15 mol/dm 3 koncentrációjú ammónia oldathoz a következő mennyiségű 0,15 mol/dm 3 koncentrációjú HCl oldatokat adtuk: a./ 70 ml b./ 100 ml c./ 125 ml Melyik esetben képződött puffer? Mennyi a ph-ja, ha K b = 1,75 10-5? NH 3 + HCl = NH 4 Cl n NH3 = 100 0,15 = 15 mmol a HCl mennyiségek: a./ 70 0,15 = 10,5 mmol, b./ 15 mmol, c./ 18,75 mmol a./ eset: puffer képződik, mert egy gyenge bázis (NH 3 ) és a gyenge bázis erős savval képzett sója (NH 4 Cl) van egyidejűleg jelen az oldatban, összemérhető mennyiségben, [H - ] = K b c b /c s = 1,75 10-5 (15-10,5)/10,5 = 7,5 10-6 mol/dm 3, így a ph = 5,125, tehát a ph = 14-pH = 8.875 b./ eset: a HCl pontosan közömbösíti az ammóniát, NH 4 Cl oldat képződik. c./ eset: 18,75-15,00 = 3,75 mmol HCl lesz feleslegben a képződő NH 4 Cl mellett (nem puffer!). 5. Egy egyértékű gyenge sav savi disszociációs állandója K s = 2,90 10-6. Mennyi a ph a 0,17 mol/dm 3 koncentrációjú oldatában?