Endoplazmás retikulum stressz skorbutban. Doktori értekezés. Dr. Margittai Éva

Endoplazmás retikulum stressz skorbutban Doktori értekezés Dr. Margittai Éva Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Molekuláris Orvostudományok Tudományági Doktori Iskola Témavezető: Dr. Csala Miklós egyetemi adjunktus, PhD Készítés helye: Semmelweis Egyetem, Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Pathobiokémiai Intézet Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Machovich Raymund egyetemi tanár, az MTA doktora Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Monostory Katalin tudományos főmunkatárs, Ph.D. Dr. Gróf Pál egyetemi docens, a biológiai tudomány kandidátusa Budapest 2006 1

Bevezető Antioxidánsok szerepe az endoplazmás retikulumban Emlőssejtekben számos fehérje (köztük a Golgi-apparátusba, a lizoszómába, a plazmamemránba, illetve a szekrécióra szánt fehérjék) a durva felszínű endoplazmás retikulum (DER) riboszómáin szintetizálódik. Ezek a polipeptidláncok az endoplazmás retikulum (ER) lumenébe kerülnek, ahol harmadlagos szerkezetük kialakul, valamint átesnek az egyik legfontosabb ko/poszttranszlációs módosuláson, a diszulfidhíd képződésén. A fehérjék tiolcsoportjainak diszulfiddá alakításához oxidáló környezetre van szükség az ER lumenében, melynek jelenléte már régóta ismert, kialakulásában és fenntartásában szerepet játszó folyamatok azonban még tisztázásra várnak. Egy feltételezett mikroszómális elektrontranszfer-lánc továbbíthatja az újonnan szintetizált fehérjék tiolcsoportjairól az elektronokat a végső elektronfelvevőre, az oxigénre. Ennek az elektrontranszfer-láncnak a fehérje komponenseit már régóta kutatják, leírták pl. egy FAD-tartalmú enzim (ER oxidáz, Ero1) és a protein-diszulfid izomeráz (PDI) szerepét a folyamatban. Feltételezhető volt azonban más, kis molekulatömegű elektronszállítók részvétele is, melyek pl. a FAD és a molekuláris oxigén közötti elektronátadáshoz járulhatnak hozzá. Leginkább a C-vitamin (aszkorbát) és az E-vitamin (tokoferol) résztvételét lehetett valószínűsíteni, ezek lévén a legnagyobb mennyiségben előforduló vízoldékony és zsíroldékony antioxidáns molekulák az ER-ban. Munkacsoportunk az elmúlt években számos kísérletet végzett ezen antioxidánsok szerepének tisztázására az ERban. In vitro kísérleteink alapján a következő modellt állítottuk fel az aszkorbát/dehidroaszkorbát és az E-vitamin oxidatív fehérje hajtogatódásban betöltött szerepére. A citoplazmában az aszkorbát aszkorbilgyökké alakul enzimatikus folyamat segítségével, ami az ER membránjának külső felszínén játszódik le. Ezt a folyamatot reaktív oxigéngyökök keletkezése kíséri. Ezután az aszkorbilgyök oxidációval vagy diszproporcionálódással továbbalakul dehidroaszkorbáttá, az aszkorbát teljesen oxidált formájává. A dehidroaszkorbát bejut az ER lumenébe, ahol a PDI szubsztrátjaként részt vesz a fehérjék ciszteinjein lévő tiolcsoportok oxidálásában. Ilymódon a dehidroaszkorbát ismét aszkorbáttá alakul, amely nem tud több diszulfidhidat létrehozni, hacsak le nem ad két elektront, és vissza nem alakul dehidroaszkorbáttá. Erre ad lehetőséget a membránban jelen lévő tokoferol, amely összeköttetést teremt a membrán külső felszínén lévő oxigénszabadgyökök és a lumenben lévő aszkorbát között. A membrán közvetlen közelében keletkező reaktív oxigéngyökök oxidálják az E- 2 Az értekezés témájában publikált saját közlemények Csala M., Szarka A., Margittai É., Mile V., Kardon T., Braun L., Mandl J., Bánhegyi G.: Role of vitamin E in ascorbate-dependent protein thiol oxidation in rat liver endoplasmic reticulum. Arch. Biochem. Biophys. 388, 55-59, 2001 Szarka A., Stadler K., Jenei V., Margittai É., Csala M., Jakus J., Mandl J., Bánhegyi G.: Ascorbyl free radical and dehydroascorbate formation in rat liver endoplasmic reticulum. J. Bioenerg. Biomembr. 34, 317-323, 2002 Margittai É.: Participation of ascorbate and vitamin E in microsomal electron transfer chain between protein thiols and oxygen. Endoplasmic Reticulum: A Metabolic Compartment, NATO Science Series, Life and Behavioural Sciences (G. Bánhegyi, A. Burchell, A. Benedetti eds.) 363, 137-142, 2004 Margittai É.: Az aszkorbát és a tokoferol szerepe a fehérjék diszulfid hídjainak kialakulásában. Biokémia 29, 2-6, 2005 Margittai É., Bánhegyi G., Kiss A., Nagy G., Mandl J., Schaff Zs., Csala M.: Scurvy leads to endoplasmic reticulum stress and apoptosis in the liver of guinea pigs. J. Nutrition 135, 2530-4, 2005 Egyéb saját közlemények Piccirella S. 1, Czegle I. 1, Lizak B. 1, Margittai E. 1, Senesi S., Papp E., Csala M., Fulceri R., Csermely P., Mandl J., Benedetti A., Banhegyi G.: Uncoupled redox systems in the lumen of the endoplasmic reticulum: Pyridine nucleotides stay reduced in an oxidative environment. J. Biol. Chem. 281, 4671-7, 2006 ( 1 megosztott első szerzőség) 15

Kísérleteinkben az aszkorbát és a tokoferol oxidatív fehérje foldingban betöltött szerepe alapján a két vitamin hiányában in vivo kialakuló ER stresszt és apoptózist tanulmányoztuk. Legfontosabb új megállapításaink a következők: vitamint E-vitamingyökké. Ez pedig képes visszaoxidálni az aszkorbátot dehidroaszkorbáttá a lumenben. Ennek a reakcióláncnak a végső eredménye az elektronok folyamatos áramlása a ciszteincsoportoktól, mint primer elektrondonoroktól az oxigénig, mint végső elektronakceptorig. Skorbutos tengerimalacok májában kimutattuk az ER stressz elemeit (chaperon- és foldázindukció). O 2 dehidroaszkorbát Az ER stressz megelőzte az aszkorbát mint antioxidáns hiánya által kiváltott fokozott lipidperoxidációt. Skorbutos tengerimalacok májában az ER stressz mellett fokozott apoptózist is észleltünk. aszkorbát aszkorbát oxidáz ROS E-vitamin redukált termék E-vitamin gyök Az aszkorbáthiánnyal kiváltott ER stressz és apoptózis aszkorbátkezeléssel kivédhető volt. Tokoferolhiányos állatokban sem ER stresszt, sem fokozott apoptózist nem észleltünk. Eredményeink megerősítik korábbi in vitro megfigyeléseinket, és azt mutatják, hogy az aszkorbát in vivo is fontos az oxidatív folding mechanizmusában. Ugyanakkor azt a következtetést is levonhatjuk, hogy a tokoferol ebből a szempontból nélkülözhető, aminek egyik lehetséges magyarázata az alternatív transzmembrán elektronszállítók jelenléte az ER membránban. S S aszkorbát dehidroaszkorbát SH PDI HS ER lumen ER membrán citoplazma Az E-vitamin hiányában az elektrontranszfer-lánc egy fontos komponense esik ki, ami megnövekedett lipidperoxidációt okoz, mert a ROS E-vitamin helyett a közeli membránban lévő egyéb lipidekkel reagál; az E- vitaminhiány emellett megnövekedett aszkorbátfogyással és csökkent tioloxidációval is jár, mert hiányzik az E-vitamingyök, amely az aszkorbátot újraoxidálja. Fontos megjegyezni, hogy az aszkorbát az E-vitaminhiányos mikroszómákban is kivált némi tioloxidációt. Így valószínű, hogy más lipidoldékony antioxidánsok, mint a K-vitamin vagy az ubikinon, hasonló funkciót töltenek be az ER membránjában. 14 3

Unfolded protein response (UPR) és ER-függő apoptózis Az ER fehérjeprocesszáló kapacitása korlátozott, ezért a sejt homeosztázisa szempontjából lényeges, hogy az ER lumenbe kerülő fehérjemennyiség (fehérje töltés) ezt ne haladja meg. Az ER fehérjetúlterheléséhez vezető legfontosabb tényezők a következők: 1) Ca 2+ -homeosztázis megváltozása pl. intraluminális Ca 2+ szintet csökkentő szerek hatására, ami azon Ca 2+ -függő fehérjék működését gátolja, melyek a félretekeredett fehérjéket felismernék; 2) a luminális tiolok redox státuszának megváltozása, ami a diszulfid hidak képződését vagy a kóros diszulfid hidak izomerizációját akadályozza meg; 3) integráns fehérjék, membránfehérjék túltermelése pl. virális fertőzésben; 4) a szervezet és ezáltal az ER lumen glukózszintjének csökkenése, ami a glikoproteinek érését gátolja (ráadásul számos glikoprotei vesz részt az unfolded proteinek felismerésében és feldolgozásában). Ha a feldolgozandó fehérjemennyiség és az ER foldingkapacitása közötti kényes egyensúly felborul azaz a fehérje töltés tartósan meghaladja a feldolgozó kapacitást veszélyesen megnő a magára hagyott (vagyis dajkafehérjék által nem támogatott) fehérjemolekulák száma. Ez pedig félretekeredett fehérjék megjelenéséhez és felszaporodásához vezet, ami az ER eredetű stressz megjelenését vonhatja maga után. Az ER stressz egy speciális adaptív mechanizmus, az unfolded protein response aktiválódását váltja ki, mely a lumenben felborult egyensúlyt hivatott helyrehozni. Az UPR három legfontosabb eleme a következő: 1) az ER foldingkapacitásának helyreállítása az ER foldázok és chaperonok szintézisének fokozásával; 2) ER méretének megnövelése a foszfolipidek és integráns fehérjék fokozott szintézisével; 3) a proteinszintézis gátlása transzkripció és transzláció szintjén egyaránt, ezéltal a fehérje töltés csökkentése 4) az ER-asszociált degradáció (ERAD) stimulálása révén a félretekert fehérjék lumenből való kijutását és lebomlását serkenti. Ezek a változások tehát elősegítik azt, hogy a félretekert fehérjék mindaddig a lumenben maradjanak, míg el nem érik natív konformációjukat, vagy pedig kijutva a citoszólba lebontásra kerüljenek. Ha az UPR során indukálódó adaptív mechanizmusok nem képesek megmenteni az adott sejtet az őt ért stressztől, ER stressz eredetű apoptózis indukálódik, ami a kóros sejt eliminációját segíti. Az apoptózis folyamatát intrinsic és extrinsic pályák irányítják. Mivel az ER lumene az extracelluláris térrel ekvivalens, nem meglepő, hogy az ER stressz mind az intrinsic, mind az extrinsic mechanizmusra jellemző vonásokat mutat. oxidációját az ER lumenben, mely érintheti az ER foldázokat (PDI, ERP72), melyek működésében a tiol-diszulfid átalakulás alapvető fontosságú. Ennek ellenére nem sikerült ezen fehérjék tioljainak redox eltolódását kimutatni a skorbutos állatok májában. Ennek egyik oka lehet, hogy a redox eltolódás átmeneti jelenség, melyet később kompenzációs mechanizmusok (mint például az UPR maga) elfedhetnek. Feltételezhető, hogy a redox eltolódás megjelenik az aszkorbáthiány egy bizonyos fokán, de az általunk vizsgált időpontokban nem volt észlelhető. Mivel a foldázok redox változását nem tudtuk kimutatni, nem mondhatjuk egyértelműen, hogy az aszkorbát antioxidáns vagy prooxidáns hatásának hiánya vezet ER stresszhez skorbutban. A patológiás történések időrendje alapján azonban inkább az utóbbi lehetőség a valószínű. A kieső antioxidáns hatás csak négy hét múlva váltott ki fokozott lipidperoxidációt, míg az UPR egyes elemei, illetve az apoptózis ennél korábban jelentkeztek. Az ER stressz kifejlődése aszkorbáthiány esetén a skorbut új, eddig le nem írt eleme, melyet számításba kell venni a skorbut mindmáig kevéssé ismert patomechanizmusának vizsgálatában. In vitro eredményeink és a skorbutos tengerimalacban észlelt változások alapján feltételeztük, hogy az ER stressz E-vitaminhiányos állapotban is kialakul. Ezért a fentiekhez hasonló vizsgálatokat tokoferolmentes diétán tartott patkányok máján is elvégeztük. A kísérletek teljesen negatív eredménnyel zárultak. Nem tudtunk chaperon- vagy foldázindukciót kimutatni, nem fokozódott az apoptózis, nem találtunk redox eltolódást a vizsgált foldázokban. A patkány modellben lehetőség volt a kaszpáz-12 aktiválódásának és az eif-2 foszforilációjának vizsgálatára is; ezek a kísérletek sem mutattak különbséget a kontroll és a tokoferol-hiányos állatok között. Az in vivo eredmények tehát azt sugallják, hogy az aszkorbát valóban fontos szerepet játszik az oxidatív foldingban, míg a tokoferol nélkülözhető. Meg kell azonban jegyeznünk, hogy (i) az eredményeket különböző fajokban kaptuk, (ii) illetve hogy a skorbutos állatokban az aszkorbát szintje mérhetetlenül alacsony volt, a tokoferol-mentes diétával viszont csak közel teljes E-vitaminhiányt tudtunk előidézni. 4 13

Következtetések Munkacsoportunk korábbi kísérletei in vitro rendszereken azt mutatták, hogy két fontos antioxidáns, az aszkorbinsav és a tokoferol, befolyásolhatja a szekréciós fehérjék oxidatív foldingját. A jelen munka legfontosabb célja az volt, hogy in vivo rendszerben is bizonyítékot találjunk a C- és E-vitamin szerepére az oxidatív fehérje foldingban. Feltételeztük, hogy a C- és E-vitamin hiánya ER stresszt, UPR-t, illetve ER eredetű apoptózist okozhat. Mind az aszkorbát, mind a tokoferol hiánya elméletileg egyaránt okozhat elégtelen, illetve túlzott oxidációt az intraluminális fehérjékben. Egyrészt az antioxidáns hiány általános oxidatív túlsúlyhoz vezethet a sejten belül. Az aszkorbát prooxidánsként működve viszont korábbi kísérleteink tanúsága szerint résztvehet az intraluminális oxidatív környezet létrehozásában. A tokoferol hiánya pedig konzerválhatja az oxidatív túlsúlyt. Hipotézisünket igazolandó, kísérleti állatainkat hosszantartó C-, illetve E- vitaminmentes diétán tartottuk. Mivel a kísérleteinkben általánosan használt patkány aszkorbát szintézisére képes, a C-vitaminhiányt tengerimalacokon váltottuk ki. Vizsgálatainkban az állatok máját használtuk fel, mely ER-ban gazdag és nagymennyiségű szekréciós fehérjét szintetizál. A skorbutos tengerimalacokban az aszkorbáthiány kifejlődésével párhuzamosan számos ER stresszfehérje (GRP94, GRP78 és PDI) expressziójának fokozódását észleltük. Az indukció némi késéssel követte az aszkorbáthiány kialakulását, ami azt mutatja, hogy az aszkorbát szintje valószínűleg nem közvetlenül szabályozza az ER dajkafehérjék és foldázok indukcióját, hanem egy másodlagos mechanizmus, vagyis a foldinghibás fehérjék intraluminális felhalmozódása révén. A skorbutos májakban az apoptózis gyakorisága is növekedett a harmadik héttől kezdve. A hatás feltehetőleg az ER-függő kaszpázok (elsősorban a kaszpáz-12) aktiválódása miatt jön létre. Mivel a tengerimalac kaszpáz-12 elleni antitest kereskedelmi forgalomban nem hozzáférhető, az ER-függő kaszpázaktiválódást nem tudtuk kísérletesen igazolni. Mind az ER stresszfehérjék indukcióját, mind az emelkedett apoptózist ki lehetett védeni az aszkorbinsav visszapótlásával. Amennyiben a C- vitaminhiányos állatok visszakapták normál tápjukat a második héttől, a negyedik hét végére nem különböztek szignifikánsan egyik paraméter tekintetében sem a kontroll állatoktól. Tehát az ER stresszt kiváltó hatás a korai stádiumban még visszafordítható volt, és teljes kifejlődéséhez több mint két hétre volt szükség. Kísérleti eredményeink tehát igazolni látszanak azt a feltételezésünket, miszerint az aszkorbáthiány csökkenti a fehérjék tiol csoportjainak Az intrinsic jelpályára jellemző, hogy stressz hatására az ER membránban a Bak és Bax proapoptotikus fehérjék konformációváltozáson vagy oligomerizáción mennek át, melynek eredményeképpen a lumenben raktározott Ca 2+ felszabadul. Az emelkedett citoszól [Ca 2+ ] aktiválja a kalpaint, mely az ER-ban található prokaszpáz-12-ből aktív kaszpáz-12-t hasít le. Az aktivált kaszpáz-12 beindítja a kaszpáz kaszkádot (kaszpáz-9 és kaszpáz-3 szekvenciális aktiválódása). A felszabadult kalciumot a mitokondrium veszi fel, ahol a kalcium túlterhelés a membránpotenciál összeomlásához és a mitokondriális apoptotikus útvonal másodlagos aktiválódásához vezet. Az UPR valamennyi jelpályája kiválthatja a CHOP/GADD153 transzkripciós faktor indukcióját. A CHOP/GADD153 a Bcl-2 antiapoptotikus fehérje szintjének csökkenését, a proapoptotikus Bax és Bak fehérjék szintjének emelkedését váltja ki. A sejt redox státusza is változik, a glutation koncentrációja csökken. Az extrinsic jelpálya aktiválódása esetén ER stresszben az IRE1 heterotrimert képezhet a TRAF2 és az ASK1 (apoptosis signal-regulating kinase) fehérjékkel, mely a c-jun N-terminális kináz aktiválásán keresztül apoptózishoz vezet. 12 5

Hipotézis és célkitűzések Munkacsoportunk korábbi in vitro eredményei szerint egyes antioxidánsok tehát szerepet játszhatnak a szekréciós fehérjék oxidatív foldingjához kapcsolódó elektronátvivő láncolatban. A kérdés az volt, hogy van-e ezen megfigyeléseknek in vivo relevanciája, vagyis aszkorbát- és tokoferolhiányos kísérleti állatokban károsodik-e az oxidatív folding mechanizmusa. Tehát az UPR, az ER stressz és az általa kiváltott apoptózis kimutatása aszkorbát- vagy tokoferolhiány esetén az ER tiolok redox eltolódására és a fehérjeérés zavarára utalna, és egyben jól mutatná e két vegyület szerepét az oxidatív foldingban. Vizsgálatainkat a kísérleti állatok májszövetén végeztük. A kísérleti munka fő célkitűzései az alábbiak voltak: - Az in vivo vizsgálatokhoz alkalmas aszkorbát- és tokoferolhiányos állatmodellek beállítása és jellemzése. megfuttattuk. Ezzel a módszerrel nem találtunk különbséget a kontroll és a négy hétig aszkorbátmentes diétán tartott tengerimalacok májából készített fehérje minták között a foldázok redox állapotát illetően. Apoptózis indukciója a májban Az ER stressz apoptózis kiváltója is lehet, különösen akkor, ha a stresszválasz (pl. UPR) nem képes helyreállítani az ER kiegyensúlyozott működését. Ezért megvizsgáltuk az apoptózis mértékét a májakból készített szövettani metszeteken. A diéta elkezdése előtt vizsgált tengerimalacok májában igen kevés apoptotikus testet találtunk. Ugyanilyen alacsony maradt az apoptózis index az aszkorbátmentes diéta első két hetében is. A diéta harmadik hetében azonban kétszeresére, a negyedik héten pedig háromszorosára emelkedett az apoptózis index a kontrollhoz viszonyítva. Azokban a tengerimalacokban, melyek két hét aszkorbátmegvonás után további két hétig újra kaptak aszkorbátot, nem fokozódott az apoptózis az apoptózis index a kontrolléval megegyező volt. - Az ER fehérjék tiol-redox-státuszában bekövetkező változások kimutatása a beállított modellekben. - Skorbutos és E-vitaminhiányos állatokban az UPR és az ER stressz legfontosabb elemeinek kimutatása. - Az ER stressz által kiváltott apoptózis vizsgálata. - Amennyiben a vizsgált antioxidánsok hiányában nem tapasztalunk ER stresszt, az esetleges alternatív mechanizmusok feltárása. 6 11

Az állatok súlygyarapodása Az aszkorbátmentes diéta az első három héten nem befolyásolta lényegesen a tengerimalacok testsúlygyarapodását, az állatok tömege ugyanabban az ütemben nőtt, mint a normál tápon tartottaké. Azoknál az állatoknál azonban, ahol az aszkorbátmegvonás négy hétig tartott a klinikai skorbut kialakulásának jeleként szignifikáns súlycsökkenést tapasztaltunk, mely az irodalmi adatok alapján is várható volt. Külön megmértük a tengerimalacok májának súlyát, ami azonban egyformán változott az aszkorbátmentes, illetve normál diéta során. A manifeszt E-vitaminhiány tünettana szegényes; az állapotot általában nem jelzik szemmel látható vagy könnyen mérhető elváltozások. Ennek megfelelően az E-vitaminmentes táplálás sem az állatok testsúlyát, sem azok májának súlyát nem befolyásolta. ER chaperonok és foldázok indukciója Miután igazoltuk, hogy az alkalmazott diéták valóban hatékonyak voltak, és mindkét esetben sikerült gyakorlatilag nullára csökkenteni a májszövetben az adott vitamin szintjét, megkezdtük a mintákban az ER stressz vizsgálatát. Az ER stresszben rendszerint indukálódó két fő chaperon (GRP78 és GRP94) expressziója fokozatosan emelkedett a skorbutizáló diéta négy hete során, és az emelkedés a harmadik héttől vált szignifikánssá. A GRP78 és GRP94 indukciója nem volt megfigyelhető azokban a tengerimalacokban, melyek a 2 hetes aszkorbátmentes diétát követően egy ugyanolyan hosszú, aszkorbátot is tartalmazó táplálásban részesültek. Megvizsgáltuk a két legfontosabb ER foldáz, a PDI és az ERP72 expresszióját is az aszkorbátmentes diéta során. Azt találtuk, hogy míg a PDI szintje az ER chaperonokéhoz hasonlóan a diéta során egyre fokozódott, addig az ERP72 szintjében az aszkorbátmegvonás nem váltott ki lényeges emelkedést. Ugyanezeknek az ER chaperonoknak és foldázoknak a szintjét megmértük az E-vitaminhiányos és kontroll patkányok májának mikroszómális frakciójában is. Az aszkorbáthiánnyal szemben, itt nem észleltünk semmilyen eltérést, tehát egyik vizsgált fehérje sem indukálódott. ER foldázok redox állapotának vizsgálata Mivel a megfigyelt chaperon- és foldázindukciók hátterében hipotézisünk szerint az ER oxidatív folding rendszerének zavara áll, megvizsgáltuk a két említett foldáz tiol redox állapotának alakulását is. Összehasonlítás céljából az in vitro oxidált, illetve redukált fehérjéket is párhuzamosan 10 Módszerek Aszkorbáthiány előidézése tengerimalacokban Kísérleteinket hím Hartley tengerimalacokon végeztük, melyeket véletlenszerű besorolással hét, egyenként négy-négytagú csoportra osztottunk. Az állatokat 0, 1, 2, 3, illetve 4 hetes aszkorbátmentes diéta után megöltük és feldolgoztuk. Egy másik csoport (kontroll) további négy héten keresztül kapta a normál, aszkorbátot is tartalmazó tengerimalac tápot. A hetedik csoport tagjai két hétig fogyasztották az aszkorbátmentes táplálékot, majd további két hétre visszakapták a normál tengerimalac tápot. E-vitaminhiány előidézése patkányokon Hím Wistar patkányokat két 6-6 tagú csoportra osztottunk. A kezelt csoportot 12 héten keresztül E-vitaminmentes diétán tartottunk, ami az irodalmi adatok alapján E-vitaminhiányossá teszi őket, a kontroll állatcsoport pedig normál diétát kapott. A 12 hét elteltével az állatokat levágtuk, és a májukat feldolgoztuk. Sejtfrakciók preparálása májszövetből A hím Hartley tengerimalacok és a hím Wistar patkányok májából standard differenciálcentrifugálással mikroszómát preparáltunk, amelyeket MOPS pufferben reszuszpendáltunk. A mikroszómát gyorsan lefagyasztottuk és felhasználásig folyékony nitrogénben tartottuk. A mikroszómális vezikulumok épségét, a szaharóz adására bekövetkező ozmotikus változások alapján fényszórás méréssel ellenőriztük. Sima és durva felszínű ER frakciók elválasztása Kísérleteinkhez sima és durva felszínű endoplazmás retikulum mikroszómákat (SER és DER) is használtunk, melyeket szacharóz grádiens oldat segítségével választottunk el. Az elkészült mikroszómákat azonnal folyékon nitrogénben lefagyasztotuk és felhasználásukig ott tároltuk. A májak aszkorbáttartalmának mérése A májszövet aszkorbáttartalmát fordított fázisú HPLC segítségével határoztuk meg az aszkorbát 254 nm-en mért fényelnyelése alapján. 7

Lipidperoxidáció vizsgálata A lipidperoxidációt mint a keletkező reaktív oxidáló ágensek keletkezésének érzékeny indikátorát máj mikroszómákon vizsgáltuk a tiobarbiturát-reaktív anyagok (TBARS) koncentrációjának mérésével. Western blot analízis Az egyes stresszfehérjék expresszióját Western blottal vizsgáltuk meg. A Western blot mérésekhez egyenlő mennyiségű mikroszómális fehérjét vittünk fel a gélre. A polipeptid láncok méret szerinti elválasztása 9 %-os redukáló SDS poliakrilamid gélen történt. Ezután a fehérjéket PVDF membránra transzferáltuk. Az egyes minták fehérjemennyiségét - ellenőrzésképpen - Ponceau-vörös festés után denzitometriás analízissel hasonlítottuk össze. Egyes fehérjék tiol/diszulfid redox állapotának vizsgálata (redox Western blot) Az ER foldázok redox állapotának meghatározásához a mikroszómát AMSsel (4-acetamido-4 -maleimidilstilbén-2,2 -diszulfonsav) jelöltük, mely a fehérjék redukált tiol csoportjaihoz kötődve lassítja azok vándorlását a gélben. A mintákat nem-redukáló SDS-PAGE és Western blot segítségével analizáltuk. Apoptózis vizsgálata májban Az apoptózist a tengerimalacok májának azonos lebenyében szövettani morfológia alapján vizsgáltuk. A paraffinba ágyazott lebenyekből készült metszeteket hematoxilin-eozinnal festettük meg, és számoltuk az apoptotikus sejtek mennyiségét. A kapott eredményeket a terminális dezoxinukleotidil transzferáz dutp nick-end labeling (TUNEL) módszerrel is ellenőriztük. Az apoptózis indexet az 1000 sejtre jutó apoptotikus sejtek/testek számaként határoztuk meg. Statisztikai módszerek Három parallellel független méréseket végeztünk. Az eredményeket átlag ± standard hiba (SEM) alakban mutattuk be, és ANOVA módszerrel, Tukey analízissel, valamint kétmintás Student t-próbával hasonlítottuk össze. Szignifikánsnak tekintettük a különbséget, ha a p alacsonyabb volt 0,05-nél. Eredmények Aszkorbát, illetve E-vitamin megvonásának hatása az állatokra A C-vitaminmentes diéta aszkorbát-depletáló hatását a kísérleti állatok májában HPLC-vel követtük nyomon. Azoknak a tengerimalacoknak a májszövetében, amelyeket a négy hetes diéta megkezdése előtt vizsgáltunk, illetve a kontroll tengerimalacokban az irodalmi adatok alapján várt magas aszkorbátszint volt mérhető. Az C-vitaminmentes diétán tartott állatokban az aszkorbát szintje 1 hét alatt kb. a kiindulási érték felére csökkent, a második héttől pedig már nem volt kimutatható mennyiségű aszkorbát a májban. A diéta aszkorbát-depletáló hatása visszafordítható volt: azoknak a tengerimalacoknak a májszövetében, amelyek 2 hetes aszkorbátmentes diéta után visszakapták a C-vitamint, szintén magas aszkorbátszint volt mérhető. E-vitaminhiányt 12 héten keresztül fenntartott E-vitaminmentes diétával alakítottunk ki patkányokban. Azt találtuk, hogy az E-vitaminmentes diéta az α-tokoferol mennyiségét a kontroll állatok máj mikroszómájában mérhetőhöz képest szinte nullára csökkentette. A lipidperoxidáció változása a diéta során A C-, illetve E-vitaminhiányos állapotban a biológiai membránok lipid összetevői jobban ki vannak téve az oxidatív károsodások veszélyének. Ezért a kísérleti állatok májából készített mikroszómális preparátumokon megvizsgáltuk a membránlipidek legjellemzőbb oxidatív károsodását, a lipidperoxidációt. A tengerimalacok esetében az in vivo bekövetkezett bazális lipidperoxidációt mértük, mely a diéta első 3 hete alatt nem változott, a negyedik héten azonban jelentős emelkedést észleltünk. Az a tengerimalac csoport, amelyik két hetes diéta után visszakapta az aszkorbátot, a kezelés negyedik hetén a kontroll, illetve a kezeletlen állatokéval azonos normál TBARS szintet mutatott. Az E-vitaminhiányos állatok esetében a máj mikroszóma membrán antioxidáns védekező képességét vizsgáltuk. Kísérleteinkben paradox módon az aszkorbátot mint prooxidánst használtuk, és azzal provokáltuk az in vitro lipidperoxidációt. Ilyen körülmények között az E-vitaminhiányos állatok májából készült mikroszómában a kontrollhoz képest fokozott lipidperoxidációt találtunk. Az E-vitaminhiányos mikroszómák csökkent antioxidáns védekezését helyre tudtuk állítani azzal, hogy előzőleg in vitro E-vitamint adtunk hozzájuk. 8 9