Az endoplazmatikus retikulum redox állapotának változásai és ennek funkcionális következményei stressz folyamán

Átírás

1 Semmelweis Egyetem, Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskola Pathobiokémia Program Doktori (PhD) tézisek Az endoplazmatikus retikulum redox állapotának változásai és ennek funkcionális következményei stressz folyamán Papp Eszter Témavezető: Prof. Csermely Péter Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Ligeti Erzsébet Tagjai: Dr. Tretter László, Dr. Váradi András Opponenesek: Dr. Mócsai Attila, Dr. Magócsi Mária Semmelweis Egyetem Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Pathobiokémiai Intézet Budapest 2006

2 Tartalomjegyzék RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE BEVEZETÉS IRODALMI ÁTTEKINTÉS STRESSZVÁLASZ AZ ER-BEN ÉS A CITOPLAZMÁBAN Az ER stresszfehérjéi, stresszválasz az endoplazmás retikulumban: rövid távú hatások Az endoplazmás retikulum közege Citoplazmatikus stresszválasz, a citoplazma stresszfehérjéi: rövid távú hatások REDOX SZABÁLYOZÁS ÉS STRESSZ AZ ER-BEN ÉS A CITOPLAZMÁBAN Redox rendszerek és redox stressz az ER-ben: rövid távú hatások Kis molekulák szerepe a redox fehérje tekeredésben Redox rendszerek és oxidatív stressz a citoplazmában: rövid távú hatások Stresszfehérjék és redox változások krónikus megbetegedésekben: hosszú távú hatások Az alfa-1-antitripszin deficiencia mint a krónikus stressz egyik modellje CÉLKITŰZÉSEK ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK ANYAGOK MÓDSZEREK EREDMÉNYEK A FAD SZEREPE AZ ENDOPLAZMÁS RETIKULUM REDOX FEHÉRJE TEKERÉSÉBEN Kis molekulák hatása a mikroszómális tiolok redox állapotára A FAD hatása a mikroszómális tiolok oxidálására A FAD hatása az oxidatív fehérjetekerő apparátus elemeire A PDI gátlásának hatása a FAD előidézte tiol-oxidációra AZ ALFA1-ANTITRIPSZIN AGGREGÁCIÓ OKOZTA VÁLTOZÁSOK AZ ENDOPLAZMÁS RETIKULUMBAN A PiZ egerek A PiZ egerek stresszfehérje szintjei A PiZ egerek redox viszonyai Chaperon komplexek PiZ egerekben A PDI funkciója PiZ egerekben EREDMÉNYEK MEGBESZÉLÉSE A FAD SZEREPE AZ ENDOPLAZMÁS RETIKULUM REDOX FEHÉRJE TEKERÉSÉBEN AZ ALFA1-ANTITRIPSZIN AGGREGÁCIÓ OKOZTA VÁLTOZÁSOK AZ ENDOPLAZMÁS RETIKULUMBAN TÉZISEK KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS IRODALOMJEGYZÉK A DOKTORI ÉRTEKEZÉSHEZ KÖZVETLENÜL KAPCSOLÓDÓ KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE Első szerzős közlemények Társszerzős közlemények A DOKTORI ÉRTEKEZÉSHEZ KÖZVETVE KAPCSOLÓDÓ KÖZLEMÉNYEK: KÖNYVFEJEZETEK

3 Rövidítések jegyzéke AAT alfa1-antitripszin A-beta amiloid béta fehérje ADP adenozin-difoszfát AGE advanced glycation endproduct - fehérjeglikációs végtermék AMS 4-acetamido-4 -maleimidilstilbén-2,2 -diszulfonsav Apaf-1 apoptózis aktiváló fehérje 1 AT antitest ATF activating transcription factor aktiváló transzkripciós faktor ATP adenozin-trifoszfát bzip endoplazmás retikulum stressz esetén indukált transzkripciós faktor BiP immunoglobulin nehézlánckötő fehérje, Grp78 camp ciklikus adenozin-monofoszfát CHOP DNA damage inducible protein proapoptotikus protein CFTR cisztás fibrózis konduktancia regulátor CLN calnexin: glikoprotein kötő endopazmás retikulum chaperon DEAE dietil-amino-etán DHA dehidroaszkorbinsav DIDS 4,4'-Diisothiocyanatostilbene-2,2'-disulfonate di-fitc-inzulin fluoreszcein-tiokarbamil-csoportokkal jelölt inzulin DsbA E. coli protein diszulfid izomeráz DsbB E. coli DsbA oxidáló fehérje DTT D,L-ditiotreitol EDEM ER degradation enhancing alpha mannosidase-like protein ER degradációt segítő alfa mannozidáz szerű fehérje EDTA etiléndiamin-tetraecetsav, kelátor eif-2α eukarióta iniciációs faktor 2α alegysége ER endoplazmás retikulum ERAD endoplasmic reticulum associated degradation endoplazmás retikulumhoz kötött fehérje degradáció ERO1(-L) endoplazmás retikulum oxidáló fehérje (emlős) ERp endoplazmás retikulum fehérje ERSE endoplazmás retikulum stresszválasz elem 2

4 FAD GFP Grp GSH GSH GSSG HSBP1 Hsc HSE HSF Hsp IL-2 IRE1 KDEL NAD(P)H NF-kappaB NF-Y MsrA PCR PDI PERK PIM PIZ PMSF PVDF ROS Sec61 SDS-PAGE SOD TRX UGGT UPR XBP flavin adenin dinukleotid zöld fluoreszcens fehérje glukóz regulált fehérje redukált glutation glutation oxidált glutation hősokkfaktor kötő fehérje konstitutívan expresszálódó hősokkfehérje hősokk-elem hősokkfaktor hősokkfehérje interleukin-2 inositol requiring protein 1, ER stressz transzdukciós faktor endoplazmás retikulum retenciós szignál (Lys-Asp-Glu-Leu) nikotinamid adenin dinukleotid (foszfát) nukleáris faktor kappab, stressz indukálta transzkripciós faktor nukleáris faktor-y, transzkripciós faktorok kötődését elősegítő általános transzkripciós faktor metionin szulfoxid reduktáz A polimeráz láncreakció, DNS szakasz felszaporítására szolgáló eljárás protein diszulfid izomeráz kétszálú RNS aktiválta protein kináz-szerű ER kináz M-típusú, egészséges alfa1-antitripszin Z típusú, mutáns alfa1-antitripszin fenil-metil-szulfonil-fluorid, proteázgátló polivinilidén-difluorid reaktív oxigén szabadgyök endoplazmás retikulum transzlokon nátrium dodecil-szulfát poliakrilamid gélelektroforézis szuperoxid diszmutáz tioredoxin UDP glükóz glikoprotein transzferáz, ER stresszfehérje unfolded protein response betekeretlen fehérje válasz X-domén kötő fehérje, stressz idukálta transzkripciós faktor 3

5 1 Bevezetés Laboratóriumunk Prof. Csermely Péter vezetésével sok éve vizsgálja a stresszfehérjék, illetve a chaperonok tulajdonságait és jelentőségét különböző élettani folyamatok során. A chaperon funkciójú fehérjék köre a kutatások nyomán szinte napról napra bővül, és a már ismert stresszfehérjék illetve chaperonok is mindig újabb tulajdonságokat mutatnak. Bár a stresszfehérjék és a molekuláris chaperonok (vagy más néven dajkafehérjék) családjai jócskán átfednek, mégis szükséges, hogy e két típusú fehérjét megkülönböztessük egymástól. A molekuláris chaperonok általában konstitutívan expresszálódó fehérjék, amelyek a sejt számos funkciójának ellátásában nyújtanak segítséget. A chaperonok az újonnan szintetizált fehérjék betekerése mellett bizonyos fehérjék (pl. receptorok) szerkezetének megtartásában, a szignalizációban és a fehérjék lebontásában is részt vesznek (33). A stresszfehérjék különböző stresszhatásokra indukálódnak. Például a leggyakrabban vizsgált stressz, a hősokk hatására termelődnek a hősokkfehérjék, a Hsp-k (63). A glükóz megvonás hatására egy másik csoport, a glükóz regulálta fehérjék, a Grp-k szintje emelkedik (90, 91). Egy egészen másik csoportja a stresszfehérjéknek az, amely az endoplazmás retikulumban felhalmozódó betekeretlen fehérjék hatására fejeződik ki jobban. A stresszfehérjék és a molekuláris chaperonok funkciója tehát átfed, azonban mégsem egyezik. Molekuláris chaperon lehet olyan fehérje is, amelynek szintje nem változik a beavatkozások hatására, míg a stresszre indukálódó fehérjék nem mindegyike rendelkezik dajkafehérje tulajdonságokkal (101). Ezek a fehérjék azonban mind közösek abban, hogy alkalmasak a stressz okozta károsodásokat megakadályozni, orvosolni vagy legalábbis a következmények súlyosságát enyhíteni. A különböző stressz típusok hatására bekövetkező akut választ számos kutatócsoport vizsgálja, azonban kevés szó esik arról, miként reagál a sejt a krónikusan fennálló stresszre, azaz arról, hogy ha a sejt a stressz ellenére a túlélés mellett dönt, milyen módon kell a rendszerét átállítania, hogy a zavar ellenére a funkcióit minél jobb hatásfokkal elvégezhesse. 4

6 Doktori munkám során elsősorban az endoplazmás retikulum chaperonjaival foglalkoztam. Mivel az endoplazmás retikulum a redox fehérjetekeredés helyszíne, és emiatt igen érzékeny a redox egyensúlyok fenntartására, kikerülhetetlen, hogy ezen organellum redox tulajdonságait is vizsgáljuk. Így munkám egy részében a redox tekeredést befolyásoló, a redox egyensúlyra ható kis molekulákkal foglakoztam, másrészt arra kerestem a választ, hogy a krónikus megbetegedésekben, amelyek modelljeként a mutáns alfa1-antitripszint hordozó transzgén egereket választottuk, milyen szerepe lehet a chaperonoknak, köztük a redox tekeredés résztvevőinek a betegségek tüneteinek kialakulásában. Laboratóriumunkban ezeknek a kutatásoknak már hagyománya van, hiszen Dr. Nardai Gábor munkatársam egy másik krónikus betegség, a diabétesz állatmodelljein bizonyította be, hogy a redox tekeredést szabályozó fehérjéknek komoly szerepe lehet a cukorbetegség patomechanizmusában. A kismolekulák szerepének vizsgálatát a redox tekeredésben Prof. Mandl József és Dr. Bánhegyi Gábor munkacsoportjával közösen végeztük. Ebből a gyümölcsöző együttműködésből igen sokat tanultam. Azok az eredmények, amelyeket e dolgozatban összefoglalok, több, nemzetközi folyóiratban megjelent közlemény alapját alkotják. A kísérletek egy részét laboratóriumunk diákkörösével, Korcsmáros Tamással végeztük közösen. E kísérletekből Tamásnak helyezést érdemlő diákköri munkája született. A kísérletek egy másik csoportja pedig Száraz Péter szakdolgozatának a része volt. Az eredmények ismertetésénél megemlítem majd azokat, akik az adott kísérletcsoport elvégzésében részt vettek. 5

7 2 Irodalmi áttekintés 2.1 Stresszválasz az ER-ben és a citoplazmában Az ER stresszfehérjéi, stresszválasz az endoplazmás retikulumban: rövid távú hatások Az endoplazmás retikulum közege Annak érdekében, hogy az endopazmás retikulumot érintő stressz jelentősége érthetővé váljon, az endoplazmás retikulum sajátosságairól és szerepéről is szeretnék említést tenni. Az endoplazmás retikulum (ER) membránnal határolt sejtorganellum. Határoló membránja a sejtmag membránjával és a mitokondriális membránnal is összeköttetésben van, lumene pedig sok szempontból az extracelluláris térrel mutat rokonságot. Az endoplazmás retikulum eukarióta sejtekben a szekréciós útvonal első kompartimentuma (140). Az endoplazmás retikulum lumenének kémhatása a citoszolhoz hasonlóan közel neutrális. Jelentős különbség van azonban a két közeg között a kálcium koncentrációban. A Ca 2+ koncentráció az endoplazmás retikulumban 5 mm, míg a citoszolban kb. 50 nm, azaz az ER az egyik kálcium raktára a sejtnek. Az ER chaperonok jelentős része erős Ca 2+ -kötő, a Ca 2+ készletek változása így hatással lehet a ER-ben végbemenő fehérjetekeredésre is. Fehérjekoncentráció szempontjából is nagy eltérés mutatkozik az endoplazmás retikulum és a citoplazma között. Az ER lumene rendkívül zsúfolt, 100 mg/ml feletti fehérje koncentrációval. Az ER egy gélszerű protein mátrix, amelyben molekuláris chaperonok és a fehérje tekeredést segítő más enzimek igen jelentős, az újonnan szintetizált szubsztrátokét meghaladó mennyiségben találhatók (84) Fehérjetekeredés az endoplazmás retikulumban Az újonnan szintetizált polipeptidek közül azok, amelyek lánca N-terminálisan egy szignál peptidet (ún. ER targeting signal-t) hordoz, az endoplazmás retikulum lumenébe kerül. Emlős szekréciós és membránproteinek esetében a szintézissel egy 6

8 időben zajlik a transzlokáció az ER membránján keresztül. Ez a riboszóma és a Sec61 transzmembrán pórus-fehérje alkotta transzlációs/transzlokációs komplex segítségével valósul meg. A szintetizálódó polipeptid már a transzláció alatt tekeredni kezd (84). Már a szintézis alatt szükség van a chaperonok általi védelemre, hogy azok a polipeptidlánc már elkészült részeinek önkényes tekeredését kontrollálják, védjék azt az egyéb fehérjéktől, illetve az aggregációtól. Ennek megfelelően a készülő polipeptidlánc azonnal kölcsönhatásba lép az ER chaperonokkal. Az endoplazmás retikulum legtöbb tekeredést segítő faktora minden testi sejtben expresszálódik, de ismertek szövet- és sejtspecifikus alakok is, pl. PDIp a pankreászban (163). Egy másik jellemző szignálszekvencia is ismert endoplazmás retikulum fehérjék esetében: a KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu) szekvencia. Számos olyan fehérje, amely endoplazmás retikulum rezidens, köztük endoplazmás retikulum chaperonok is, C- terminálisukon hordozzák ezt a négy aminosavas egységet. Amennyiben valamely ilyen fehérje vezikuláris transzporttal a Golgi készülékbe jut, ott a KDEL receptorhoz kapcsolódik, receptorával együtt vezikulumba kerül, és retrográd transzporttal visszaszállítódik az endoplazmás retikulumba. Ez folyamatosan zajlik a sejtekben, aminek egyik oka, hogy egyes ER proteinek strukturális éréséhez a Golgi apparátusban zajló átalakulások is elengedhetetlenek (155) Az endoplazmás retikulum chaperonjai Az endoplazmás retikulumnak, mint organellumnak saját jellemző fehérjeállománya van. Ezek közül a kísérleteink szempontjából fontos chaperonokat, folding enzimeket, és azok komplexeit szeretném itt részletesebben bemutatni. A Grp78/BiP Az egyik első eredmény a chaperonok működésével kapcsolatos vizsgálatokban az immunoglobulinok összeállítása kapcsán a Hsp70 családba tartozó Grp78 (gyakran használt elnevezése a BiP, immunoglobulin nehéz lánc kötő fehérje) felfedezése volt (60, 112). Az emlős Grp78/BiP az egyik legnagyobb tömegben előforduló ER chaperon. Bár a kristályszerkezeti vizsgálatok szerint az ER membrán permeabilitását a Sec61 7

9 transzlokon önmagában szabja meg, korábbi adatok az mutatják, hogy a Grp78 zárja a pórust az ER lumene felől (62). Elhelyezkedéséből következően a Grp78 azonnal kölcsönhatásba kerülhet a tekeredetlen polipeptid lánccal, így közreműködik annak ER-ba történő bejutásában. A tekeredetlen fehérjék felismerésében a Grp78 döntő szerepet játszik. A Grp78-nak egy N-terminális ATP-áz és egy C-terminális szubsztrátkötő doménje van. ADP-kötött formája nagy affinitást mutat protein szubtrátokra. A Grp78-hoz kötött szubsztrátok megtartják konformációjukat, és serkentik a Grp78 ATP-áz aktivitását. Affinitás vizsgálatok azt mutatják, hogy rövid hidrofób peptidek, amelyek natív proteinek esetén béta szálakat képeznek mélyen a fehérjék magjában, preferenciálisan kötődnek a Grp78-hoz (47). Az ADP ATP-re cserélődése felszabadítja a fehérjét a Grp78-ról, majd az ATP elhidrolizálásával a Grp78 újra nagy affinitású formába kerül. A Grp78 ATP-függő működése az egyik oka annak, hogy az ATP szint csökkenése a sejtben a szekréciós proteinek szekréciójának a csökkenését okozza. A Sec61 transzlokációs pórussal való kölcsönhatása is ATP-függő folyamat (2). A Grp78 más Hsp70 családba tartozó chaperonokhoz hasonlóan monomer és oligomer fázis között váltakozik. Csak a monomer, módosítatlan Grp78 asszociál a tekeredetlen fehérjékkel. Ez a felismerés sugallta azt a feltételezést, hogy az oligomer Grp78 raktárat képez az ER-ban, amely a tekeredetlen fehérjékkel kölcsönhatásba lépve, monomer, működő formába kerül (54). Grp94 (gp96, endoplazmin) A Grp94 a 90 kda-os stresszfehérje család tagja. Kálciumot és ATP-t köt, ennek segítségével autofoszforilálódhat, de a klasszikus kinázok is foszforilálják. A Grp94 a teljes ER fehérjekészlet akár 5-10 %-át is adhatja. Hidrofób fehérje, széles szubsztrátspecificitással köti az instabil szerkezetű fehérjéket, peptideket. Stresszfehérjékkel alkotott számos komplexében segíti a szekréciós és a plazmamembrán fehérjék érését, a harmad-, negyedleges szerkezetük kialakulását. A Grp94 stressz-indukálható fehérje, és a Grp78-hoz hasonlóan citoprotektív hatású (92). A Grp94 a fehérjetekeredés során a szubsztátfehérjékkel a tekeredés késői fázisában lép kacsolatba (102). A calnexin és a calretikulin E két lektin-típusú chaperonról is említést kell tennem, mivel az olyan 8

10 glikozilált fehérjék tekeredésében, mint amilyen az alfa1-antitripszin is, elengedhetetlen szerepük van. A 65 kda-os calnexin és a 46 kda-os calretikulin lektinszerű kötőhelyekkel rendelkeznek, amelyekkel a félkész fehérjék monoglikozilált részéhez kapcsolódnak (153). E folyamat kálciumot igényel (16). E fehérjék stresszhatásokra szintén indukálódnak. Szubsztrátspecificitásuk eltérő, részben mert kötőhelyük különböző, részben mert lokalizációjuk is eltér: a calnexin a membrán belső oldalához kötött, a calretikulin pedig az ER lumenben szabad formában is megtalálható (39). A calnexin és calretikulin a glikoproteinek ismételt kötésével és elengedésével járulnak hozzá azok tekeredéséhez. Az ún. calnexin-ciklus ATP-t nem igényel, de más stresszfehérjék, például a Grp78 közreműködését igen (105). A calnexin részt vesz az ER minőségellenőrzési funkciójában és transzport folyamataiban is (140). A protein diszulfid izomeráz (PDI) Mint azt már említettem, a szekrécióra kerülő proteineknek az extracelluláris, oxidatív környezetre való felkészítése az ER-ban történik. A fehérjék gyors oxidációja számos inkorrekt diszulfid híd kialakulásához vezethet, amelyek akár intermolekuláris keresztkötéseket is okozhatnak. Ezek kialakulása a fehérjék rossz konformációban történő megrekedéséhez vezethet. Ezért szükséges a fokozatos és kontrollált oxidáció. Az egyik módja ennek a fehérjék redox gradiensen történő átvezetése. A korábbi feltételezést, hogy az ER ilyen közeg, redox szenzitív GFP-vel végzett kísérletek támasztották alá (119). A másik lehetőség a gyorsan, de nem korrektül kialakult diszulfid hidak átalakítása, újraszervezése. Ezen feladat ellátására fejlődtek ki a protein diszulfid izomerázok (PDI-k). E fehérjéket mintegy negyven éve fedezte fel Christian Anfinsen kutatócsoportja (4), és tőlük függetlenül a doktori munkámnak helyt adó intézetben Venetainer Pál és Straub F. Búnó (165). Azóta a PDI család számos tagját azonosították, mint pl. az ERp29, ERp57, ERp59, ERp72 fehérjéket, amelyek szubsztrátspecificitása azonban még csak kevéssé ismert. Az ERp72-ről tudható, hogy főleg glikozilált proteinekkel lép kölcsönhatásba. A diszulfid izomeráz aktivitáson kívül a PDI-k konvencionális chaperonokként is funkcionálnak (55). A PDI két tioredoxin-domént tartalmaz, amelyek a tiol-diszulfid katalízis aktív 9

11 centrumait is tartalmazzák. Az aktív centrum a hasonló aktivitású fehérjék között meglehetősen konzervált CGHC szekvencia (45). Ez a motívum felelős a PDI izomerizáló aktivitásáért. A PDI a diszulfid hidak kialakulását, izomerizációját és redukcióját, redox állapotától függően katalizálja (165). A fokozott fehérjefelhalmozódás az ER-ban a PDI működésére is hat. Ez is stressz-indukálta fehérje, amelyik közvetlenül érintett a rosszul tekeredett fehérjék javításában és felhalmozódásuk csökkentésében. A PDI-ről kimutatták, hogy denaturált lizozim aggregátumok belsejében is megtalálható (143). Érdekes módon, bizonyos fehérjekoncentráció elérésekor ún. anti-chaperon aktivitást tapasztaltak a PDI-nél. Ekkor, valószínűsíthetően a nagy szubsztrátterhelés miatt, a PDI nemcsak egyes molekulákon belül, hanem molekulák között is kialakít diszulfid hidakat, és így aggregátumok képződését segíti elő. Ez alapján feltehető, hogy a PDI működésének zavarai, például a redukáló ágensek hatása hasonló funkcióváltást eredményezhetnek (130). A diszulfid hidak átszervezésén kívül a PDI a szekréciós fehérjék direkt oxidációjában is részt vesz. Ezekben az esetekben a PDI oxidált formája lép kölcsönhatásba a szubsztrát proteinnel. A fehérje oxidált állapotba kerülésekor redukált PDI szabadul fel. (2.1. ábra). Annak újra működőképes állapotba hozását, visszaoxidálását az ER membránjához kapcsolódó redox rendszer végzi. Citoszol ER lumen Ero1 FAD FAD S S PDI S S Szubsztrát S S Ero1 FAD FAD SH SH PDI SH SH Szubsztrát SH SH FAD FAD 2.1. ábra: A PDI redox ciklusa A FAD a citoplazmatikus tér felől lép be az ER-be, ahol kovalansen és nem-kovalansen is köt az Ero1-L-hez, amely így képes a PDI felől az elektronokat továbbítani (a végső elektronakceptor még nem ismert). A PDI ezen a módon képes a szubsztrátfehérjék oxidálására. 10

12 A PDI redox állapota több tényezőtől függ. Faj- és sejtspecifikus eltérések is mutatkoznak, ami a kapcsolódó enzimek különbségeire utalhat, illetve azt jelezheti, hogy a PDI fő funkciója sejttípusonként más és más. Élesztőben főleg oxidált állapotú PDI-t találunk, míg emlős sejtekben a PDI-k többsége inkább redukált. Ez a kisebb méretű oxidált PDI készlet az oxidatív ekvivalensek gyorsabb elszállítását jelentheti, illetve azt, hogy az ER redox gradiens élesztő esetében kevésbé kifejezett, mint magasabb rendű eukariotákban. Saját kísérleteink is azt mutatták, hogy emlős rendszerben a PDI sejttípusonként is eltérő redukáltsági állapotot mutat, feltehetően az adott sejtben betöltött elsődleges szerepétől függően. Több szubsztrát esetében is bizonyították, hogy a PDI redox működéséhez a kitekert állapotú fehérjék felismerésével és szelektív megkötésével a PDI dajkafehérje funkciója is elengedhetetlen. A PDI e működése során a BiP fehérjével áll szoros kölcsönhatásban (100, 178). Amellett, hogy a PDI oxidáló, izomerizáló és redukáló funkciójának aránya a PDI redox állapotával változik, egyre több jel utal arra, hogy a PDI dajkafehérje funkciója is redox szabályozás alatt áll (160). Így pl. a kolera-toxin szubsztrát jobban köt a PDI redukált formájához, és a PDI oxidációja a kolera-toxin disszociációját okozza (159). A PDI specifikus funkciói közé tartozik az is, hogy több enzimkomplexnek (pl. prolil-4-hidroxiláz, triacilglicerol-transzfer fehérjekomplex) tagja, valamint az, hogy hormonokat köt, amelynek jelentősége még nem kellőképpen feltárt (131). Az Ero1 (oxidoreduktin) Az Ero1 (Endoplasmic Reticulum Oxidizing protein 1) fehérje tehát az, amely a PDI-t oxidálva fenntartja annak oxidoreduktáz aktivitását. Ez egy kb. 56 kda-os, glikozilált, lumenális, az ER membránjával asszociált fehérje, amelynek katalitikus centruma az ER lumene felé tekint. Az Ero1 aktív szekvenciája hasonlít a tioredoxindoménhez (CxxCxxC) és a katalitikus aktivitás mellett a fehérje stabilitásához is elengedhetetlen (17). Az Ero1 ma ismert egyetlen funkciója a PDI oxidációja (49, 162). Az Ero1 dajkafehérje tulajdonságot nem mutat, azonban szorosan együttműködik a PDI-vel a szubsztrátfehérjék diszulfid hídjainak formálásában. A 11

13 fehérje a PDI-t oxidált állapotban tartja, azonban az Ero1 más ER oxidoreduktáz stresszfehérjével történő kölcsönhatását nem tudták kimutatni. Emlősben a PDI mellett egyedül az ERp44 kapcsolódik hozzá, amelynek döntő szerepe van az Ero1 visszatartásában az ER-en belül (3). Az Ero1 nem-kovalens módon FAD-ot köt, így feltételezhetően a luminális fehérjék oxidációja során a PDI-re kerülő elektronok az Ero1 FAD-csoportján keresztül érik el a citoplazmát (141, 162). Az Ero1 felfedezése élesztőben történt, de azóta a fehérje emlősökben megtalálható változata is ismertté vált (Ero1-L). Eddig két Ero1-L izoformát azonosítottak, amelyek szöveti megoszlása és indukálhatósága különböző. Az Ero1- Lα konstitutív, míg az Ero1-Lβ az endoplazmás retikulum stressz során indukálódik (120). Ez az endoplazmás retikulum chaperon funkcióinak és az ER oxidatív folyamatai szabályozottságának a kapcsolatát mutatja (103) Chaperon komplexek az endoplazmás retikulumban A chaperonok az endoplazmás retikulumban nagyrészt komplexekbe rendeződve találhatóak meg. Többféle fehérje szintézisét megvizsgálva azt találták, hogy e chaperon komplexek összetétele más és más az alapvető funkciótól és a szubsztrátfehérjétől függően is (85). A szintetizálódó polipeptid lánccal először az ún. foldoszóma (folding komplex) kerül kontaktusba. A tiroglobulin tekerését végző folding komplex a Grp78, Grp94, Grp170, PDI és az ERp72 fehérjékből áll össze (86). Az influenza vírus hemagglutinin a vizsgálatok szerint calnexinnel és calretikulinnal is kötésben volt, a Grp78-at viszont kisebb mértékben kötötte. Fehérje szintézis hiányában is szerveződik komplex az endoplazmás retikulum chaperonjaiból. Ez a komplexet pre-folding komplex -nek szokás nevezni. Ebben a nem működő chaperon komplexben calretikulin, Grp78 és Grp94 vesz rész és a calnexin itt nincs jelen (102, 153). A vizsgált esetek mindegyikére igaz volt, hogy Grp78 és Grp94 megtalálható a folding komplexben, a többi chaperon és folding enzim viszont csak néha fordult elő, ami a Grp78-nak és Grp94-nek az ER-ban történő fehérje tekeredés általános menetében betöltött kulcsfontosságú szerepét hangsúlyozza (104). 12

14 A fehérje tekeredésen túlmenően a chaperonok komplexei két másik, alapvető feladatot is ellátnak az ER-ben: a minőségellenőrzést, (quality control, QC), amely a betekert fehérjék jóságának vizsgálatát jelenti, illetve a fehérje lebontás segítését, ahol a chaperonok a hibásnak ítélt fehérjéket retrográd transzporttal a citoplazmába, proteaszómális lebontásra irányítják. Ezt a folyamatot a szakirodalomban ERasszociált degradációnak, azaz ERAD-nak nevezik. A minőségellenőrzés folyamata során az ER chaperonjai a natív és nem-natív fehérjék között kell, hogy különbséget tegyenek. A károsodott fehérjék felismerése egyrészt a hidrofób felületeik hozzáférhetőségén alapul, ezekhez a fehérje felszínekhez ugyanis a chaperonok nagy affinitással kötnek. Ugyanilyen nagy affinitású kötődés jellemzi a chaperonok asszociációját a párosítatlan ciszteinekhez és a nem teljesen kifejlődött glikán-oldalláncokhoz (85, 144). A hidrofób felszínek detektálásában a Grp78, Grp94 szerepe kiemelkedő, a nem-natív ciszteinpárok a PDI kötődését idézik elő, míg a glikán-oldalláncokat a calnexin, calretikulin és az UGGT (UDP:glükóz-glikoprotein transzferáz) ellenőrzik. A minőségellenőrző rendszer tökéletlen működésének eredményeként előfordul, hogy toxikus fehérjék is kikerülhetnek a rendszerből, ugyanakkor e rendszer túlműködése akadályozza meg, hogy a cisztás fibrózisban érintett pontmutációt hordozó, ám egyébként működőképes CFTR (cisztás fibrózis konduktancia regulátor) nevű kloridcsatorna lebontásra kerüljön (7). Mutáns fehérjék szintézise vagy stressz esetén megnő a tekeredési hibás fehérjék mennyisége az ER-ban. A reménytelenül félretekert fehérjéknek minél előbb lebontásra kell kerülniük. Ekkor az endoplazmás retikulumhoz kötött degradációs útvonal (ERAD) visszairányítja, retrotranszlokálja a rosszul tekeredett fehérjéket a citoszolba, ahol azok proteaszómális lebontásra kerülnek. Az élesztőn végzett vizsgálatok azt mutatták, hogy a Grp78 és PDI kulcsszerepet tölt be az ERAD-ban (84). Az ERAD során a Grp78 valószínűleg a rosszul tekeredett fehérjét reverzibilisen aggregált állapotban tartja, míg a PDI a rosszult tekeredett fehérje irányításában, retrotranszlokációra kerülésében játszik szerepet. (55) Ezen vizsgálatok szerint diszulfid hidakat nem tartalmazó fehérjék retrotranszlokációja is a PDI-hez kötött, ami azt mutatja, hogy a PDI specifikusan 13

15 kötődik a rosszul tekeredett fehérjékhez. Amennyiben a transzlokációs póruson keresztül nem képes távozni a hibás fehérje, akkor a PDI-vel kötésben marad mindaddig, amíg az ER-ban tartózkodik. A kísérletek szerint a PDI és a Grp78 között egyfajta munkamegosztás mutatható ki a rosszul tekerdett fehérje kötését illetően (2.2 ábra). Mutáns, csökkent működőképességű PDI-t tartalmazó sejtek esetében a tekeredetlen fehérje a Grp78-cal marad asszociációban. Ez a működés szoros kapcsolatban lehet a folding mechanizmusánál látott Grp78-PDI kooperációval (100). Mivel a Grp78 és a PDI kapcsolata a fehérjetekeredés és az endoplazmás retikulumhoz kötött degradáció folyamatában is fontos, rajtuk keresztül az ER minőségellenőrzési rendszerének egyik fő lépése valósul meg. A PDI ERAD során mutatkozó szubsztrátkötésére vonatkozóan is vannak már adatok. Egyes kísérletek azt mutatták, hogy a PDI redox karaktere, illetve a hozzá tartozó redox ágensek is Vad típusú fehérje Tekeredési hibás fehérje ER lumen Citoszol 2.2 ábra: A PDI és a Grp78 szerepe a fehérjetekeredésben és az ERAD-ban A PDI és a BiP (Grp78) kooperálva tekerik be a fehérjéket, amelyek végül leválnak a chaperonokról és elhagyják az ER lument. Tekeredési hibás fehérjénél a PDI mindvégig kötésben marad a fehérjével, amíg az a lebontó rendszerbe nem kerül. módosíthatják a PDI fehérjekötését. Az Ero1-L jelenléte, tehát az PDI oxidációja kolera-toxin esetében annak PDI-ről történő felszabadulását idézte elő (159). Fehérje-túltermeltetéses kísérletek azt mutatták, hogy az ERAD kapacitása is 14

16 véges, könnyen telítődhet ER stressz során, ezért UPR során az ERAD egyes komponenseinek indukciója is szükséges a degradációs aktivitás fenntartásához (52). A fentiekben részletezett fehérjekomplexeket a 2.3 ábra foglalja össze: Az endoplazmás retikulum stressz Monoglikozilált N-glikán Diszulfid híd Golgi Tekeredési hibás fehérje Betekert fehérje ERAD Citoszol ER ER kilépési terület Gükozidáz I Calnexin EDEM Grp78 Grp94 COPII/Sar1p Gükozidáz II ERp57 UGGT PDI Grp170 Riboszóma/Sec ábra: Chaperon komplexek az endoplazmás retikulumban (84 alapján) Fehérje tekerő komplex: Grp78, Grp94, PDI, Grp170, glikozilált proteinek esetében calnexin Irányítás, minőségellenőrzési rendszer (quality control): Grp78, Grp94, PDI, glikozilált proteinek esetében calnexin, ERp57, UGGT ERAD (ER-hoz kötött degradáció): Grp78, PDI, glikozilált proteinek esetében calnexin, EDEM (ER degradation enhancing alpha mannosidase-like protein) Az endoplazmás retikulumban a legkülönbözőbb stimulusok, mint például a hipoxia, ischaemia, oxidatív stressz, illetve a kálcium depléció a betekeretlen fehérjék aggregációját okozhatja (81). Az endoplazmás retikulum funkciók károsodhatnak ER stressz hatására, de maguknak az ER-ban zajló folyamatoknak a hibás működése, például az egyszerű túlterhelődés szintén káros hatást jelent (140). Ha az endoplazmás retikulum bármely fukciója zavart szenved, az így előállt helyzet további stresszt jelenthet az ER-ra nézve. E funkcionális zavar lehet a glikoziláció inhibíciója, a diszulfidhidak redukálódása, a kálcium kicsurgása a 15

17 citoplazmába, akadályozott transzport a Golgi-ba, vagy tekeredési hibás fehérjék felhalmozódása az ER-ban. Általánosságban elmondható, hogy a fehérjetekerő és minőségellenőrző rendszer könnyen károsodik ezektől a hatásoktól, így ER stressz alatt tekeredetlen fehérjék halmozódnak fel az ER-ban (52). E fehérjék felhalmozódása megbontja az egyensúlyt a fehérjék szintézise és az ER feldolgozóképessége között, aminek következtében az ER nem képes megbirkózni a fehérjetöbblettel (130). A közelmúlt igen fontos kutatási eredménye volt, hogy mutáns, megfelelően tekeredni nem képes, folding inkompetens fehérjék expressziója endoplazmás retikulum stresszt, és stresszválaszt az ún. tekeredetlen fehérje választ (unfolded protein response, UPR) okoz. Ez a biokémiai háttere sok, az ER kapacitását érintő betegségnek, ahol az említett tekeredés inkompetens fehérjék felhalmozódnak az ER-ban (135). Az ER homeosztázisának megtartásához arra van szükség, hogy ezeket a fehérjéket az ER vagy betekerje, vagy lebontsa. Az eukarióta sejtek három különböző mechanizmussal is rendelkeznek, amelyek az ER-ben felhalmozódó fehérjék esetén aktiválódnak (107), amelyeket összefoglalóan UPR-nek, azaz betekeretlen fehérje válasznak hívunk. Elsőként, a korai fázisban a transzláció felfüggesztésével csökkenti a sejt az ERre nehezedő nyomást, a következő fázisban az ER chaperonok transzkripciójának aktivációja következik be, amelynek eredményeként ER chaperonok termelődnek, hogy fokozzák az ER fehérjetekerő kapacitását, majd egy későbbi fázisban a fehérje degradáció fokozódik, amelynek segítségével az ER megszabadulhat a felhalmozódott fehérjéktől (157). A fehérjék sorsát emlős ER-ben időfüggő tranzíciós mechanizmusok döntik el (181). A fent felsorolt folyamatokért három, eltérő hatásmechanizmusú transzmembrán fehérje segítségével aktiválódó transzkripciós faktor a felelős: az ATF6α és ATF6β, az IRE1α és IRE1β, és a PERK. E folyamatban a transzmembrán fehérjék érzékelik a betekeretlen fehérjék jelenlétét, és a segítségükkel képződő transzkripciós faktorok továbbítják a jelet a sejtmagba, ahol a transzláció felfüggesztése mellett bizonyos speciális gének indukcióját kezdeményezik (69). A transzkripció aktivációjáért egy 16

18 cisz-aktív elem is szükséges, amelyet ER stressz válasz elemnek, ERSE-nek neveztek el (188). A PERK egy gyakori transzmembrán faktor, amely aktiválódva foszforilálja az eif2alfa fehérjét, ezzel leállítva a transzlációt, ugyanakkor bizonyos gének átíródását is fokozza, az ATF4 transzlációjának serkentésével (64). Az IRE1alfa általánosan, míg az IRE1beta a gasztrointesztinális rendszerben lokalizálható. Ezek a membránkötött konzervatív endoribonuklázok képesek spliceoszóma-független mrna hasítást indukálni ER stressz esetén (121). Az XBP1 mrns, amely emlősben a bzip transzkripciós faktort kódolja, az eddig ismert egyetlen szubszrátja ezeknek az endoribonukleázoknak (23). Az XBP1-nek csak a hasított formája aktív transzaktivátor, köt az ERSE-hez az NF-Y általános transzkripciós faktorral közösen, és indukálja a stresszfehérjék szintézisét (183). Az ATF6α és az ATF6β transzmembrán fehérjék olyan transzkripciós faktorokat tartalmaznak, amelyek limitált protelízisüket követően válnak aktívvá: az eredetileg 90 kda-os fehérje egy 50 kda-os termékké hasad, amely így a magba vándorol és ott, szintén a NF-Y transzkripciós faktorral kooperálva az ERSE-hez köt (184). Az ATF6- ról leírták, hogy stressz esetén hasítatlan formájának szintje is csökken, ezzel feltehetőleg a stresszválasz lecsengését téve lehetővé (70, 71). A Grp78-nak fontos feladata van nemcsak a tekeredetlen fehérjék felismerésében, hanem a probléma jelzésében, és a szignál endoplazmás retikulumból történő kijuttatásában is. Ennek kimutatására már számos módszer létezik (92). Inaktív állapotban az IRE1 és PERK lumenális doménjei Grp78-cal asszociáltak. ER stressz esetén a Grp78 disszociál IRE1-ről és PERK-ről, és ez azok oligomerizációjához, proximális transzducerként történő aktivációjához vezet (19). Az ATF6 esetében a Grp78 a Golgi-ba történő transzlokációt befolyásolja. Grp78 hiányában ATF6 a Golgiba jut, és ott hasad aktív termékké (142). Ezen felül az ATF6 a calretikulinhoz kötődik, és ezáltal is ER-ban visszatarva marad. Az ER stressz alatt, az ATF6 alulglikozilált, ez rontja a fehérje kölcsönhatását a calretikulinnal, aminek következtében az ATF6 kevésbé lesz visszatarva ER-ban (70). E folyamatok eredményeképpen alakulhat tehát ki az az integrált stresszválasz, amelyet endoplazmás retikulumot érintő stresszes állapotok esetén láthatunk. Ennek 17

19 komponensei az alábbiakban foglalhatóak össze: Az eif2alfa foszforilálásának következtében a transzláció általános szupressziója, rövid féléletidejű proteinek eltávolítása az ER-ból, Chaperon indukció (elsősorban a Grp78, Grp94, calnexin, PDI, Ero1, de a lista folyamatosan bővül), az ERAD gének indukciója, membrán szintézis, ER expanzió, NRF2 transzkripciós faktor aktiválása, azon keresztül antioxidánsok fokozott expressziója (pl. glutation-s transzferáz) (140) Citoplazmatikus stresszválasz, a citoplazma stresszfehérjéi: rövid távú hatások Mivel az endoplazmás retikulumot és a citoplazmát érintő stressz nem választható el egymástól, fontosnak tartom, hogy a citoplazma stressz-válaszát is röviden ismertessem. A citoplazmatikus stressz-válasz során elsőként leállnak azok a folyamatok, amelyek sok energiát igényelnek, mint például a fehérjeszintézis, vagy a replikáció. Igen fontos a nem véglegesen károsodott struktúrák védelme és őrzése, hogy a stressz múltával ezek helyrehozásra kerülhessenek. Mindkét lépésben részt vesznek a stresszfehérjék, részben a szabályozási szinten, részben pedig a fehérjék és más sejtalkotók védelmének szintjén. Hogy a sejt miként érzékeli a stresszt, ami a stresszfehérjék szintézisét beindítja, még nem ismerjük pontosan. Eukarióta szervezetekben két érzékelő létét feltételezik. A leginkább elfogadott elképzelés szerint a maguk a stressz hatására felszaporodott denaturált kliensfehérjék indítják be a stresszfehérjék expresszióját (109). E folyamatban a hősokkfaktor (HSF) szerepét kell kiemelnünk. Emlősökben a HSF család legfontosabb formája a HSF1 míg a család más tagjai a tartós stresszválasz, az embrionális fejlődés, és a sejtdifferenciálódás folyamataiban játszanak szerepet (109). Normál állapotban a hősokkfaktor a citoplazmában monomerként, a Hsp70-hez illetve Hsp90-hez kötött komplex formájában van jelen. Mivel a stressz hatására a Hsp70 és a Hsp90 a felszaporodó denaturált fehérjéket kötik meg, a hősokkfaktor a komplexből felszabadul, és így beléphet a sejtmagba, ahol trimerizálódik, foszforilálódik és 18

20 kötődik a DNS megfelelő régiójához, az ún. hősokk elemhez (HSE). Ilyen hősokk elem található a stresszfehérjék génjeinek promóter régiójában is. A stresszhatás elmúltával, illetve az újonnan szintetizált stresszfehérjék révén több szabad Hsp70 és Hsp90 lesz a citoplazmában, amelyek a sejtmagba bejutva a hősokkfaktort újra kötésbe vonják, leállítva ezzel a transzkripciót. E folyamatot számos moduláló fehérje, pl. a HSBP1 befolyásolja, de feltételeznek alternatív aktivációs utakat is (136, 151). A másik stressz-szenzor a feltételezések szerint a sejtmembrán. A membrán fluiditását különböző külső hatások megváltoztatják, ez a változás szolgálhat szignálként a stresszfehérjék szintézisének beindításához (167). A stressz esetén elsőként aktiválódó fehérjéket szeretném egy kicsit részletesebben is bemutatni (170). A 70 kda-os stresszfehérjék A család legtöbbet vizsgált és talán legjelentősebb tagja a citoplazmatikus illetve részben magi lokalizációjú, indukálható fehérje, a Hsp70 (30). Ennek konstitutívan expresszálódó változata a Hsc70. Szerkezeti, illetve funkcionális hasonlóságuk miatt e család tagja néhány eltérő molekulatömegű fehérje, mint például a Hsp110. A család tagjai megtalálhatóak a mitokondriumban (mt-hsp70) és az endoplazmás retikulumban (e homológ a már ismeretetett Grp78) is. A Hsp/Hsc70 a citoplazmatikus fehérjetartalom 1-3%-át teszi ki. A fehérje N-terminálisán ATP-t köt, ciklusa a Grp78-nál ismertetett mechanizmushoz igen hasonlóan működik. A Hsp70 a stressztolerancia kialakulásának alapvető eleme (14). A Hsp70 e mellett fontos antiapoptotikus protein is. E funkciójában oly módon működik, hogy köti a proapoptotikus Apaf-1 fehérjét, mely így nem képes a kaszpázok aktiválására (13). 90 kda-os stresszfehérjék A Hsp90 chaperon az emlős sejteken citoplazmatikus fehérjetartalom 1-3 %-át teszi ki. Jelentősége az evolúció során folyamatosan növekedett. Élesztőben csak teljes deléciója, fejlettebb eukariótákban pedig már a szintjének csökkenése is letális. A Hsp90 szubsztrátspecificitása igen széles, újabb megfigyelések szerint azonban aktív szubsztrátjainak döntő többsége a natívhoz közeli, kissé instabil szerkezettel bír (35). E tulajdonságában a Hsp90 eltér a Hsp70-től, ami erősebben denaturált fehérjéket köt (51). A Hsp90 gyakran található fehérjekomplexekben, más 19

21 dajkafehérjékkel és segédfehérjékkel asszociálódva (134). A Hsp90-re is igaz, hogy primer szerkezete az evolúció során erősen konzervált maradt. Az eukarióta citoszólban két izoformája ismert (α és β), ezek 76 %-ban azonosak (115). A két izoforma közül klasszikus stresszhatások (pl. hősokk) hatására csak az α izoforma indukálódik, a β forma konstitutív, de a gyulladásos folyamatoknál és aktivált immunsejtekben expressziója fokozódhat (25, 101). Amennyiben a Hsp90 által kötött fehérjék renaturációja már nem lehetséges vagy nem gazdaságos, a kötött fehérjék a proteaszómális lebontó rendszerek segítségével degradálódnak. Az elmúlt években kimutatták, hogy eukariótákban a Hsp90 szintjének csökkentésével az addig a Hsp90 által elfedett, csendes mutációk a fenotípus szintjén is megjelentek (38). Ezzel összefüggésben a témavezetőm néhány éve közzétett egy elméletet. A chaperon-overload elmélet szerint a chaperonok a felhalmozódó mutációkat elfedik, de ha öregségben az elromlott fehérjék szintjének megnövekedése miatt a kapacitásuk csökken, a sejtekben felhalmozott mutációk aktívakká válnak, és a hirtelen megjelenő fenotípus diverzitás hozzájárulhat a poligenikus betegségek kifejlődéséhez (34). 2.2 Redox szabályozás és stressz az ER-ben és a citoplazmában Az intracelluláris homeosztázis fenntartásához szorosan hozzátartozik az adott sejtkompartimentum redox egyensúlyának fenntartása is. Ennek felborulása súlyos következményekkel jár a sejt életére vonatkozóan. Az oxidatív károsodás, vagyis az oxidatív stressz egyike a leggyakoribb környezeti terheléseknek, ugyanakkor kísérője más eredű stresszfajtáknak is, és így jelentősége a kutatások előrehaladtával egyre nő. E fejezetben a redox érzékeny elemek két fő típusát szeretném bemutatni. Egyrészt azokkal a rendszerekkel fogok foglalkozni, amelyek a redox homeosztázis fenntartásáért felelősek, másrészt azokkal az elemekkel, amelyek oxidatív károsodás hatására aktiválódnak. Oxidáló ekvivalensek, reaktív oxigén szabadgyökök (ROS) a sejt normális működése során is keletkeznek, például a mitokondriális légzési lánc működése során, vagy a citokróm P450 enzimrendszereken. 20

22 Oxidatív stresszről akkor beszélünk, ha a termelődő szabadgyökök mennyisége hirtelen megnő, pl. ischaemiás-reperfúziós károsodásban, immunsejtek működésekor, szepszisben vagy diabéteszben (46). Az oxidáló ágensek irreverzibilisen károsíthatják a legtöbb aminosav oldalláncot, ezáltal esetleg megváltoztatva a fehérjék működését (18, 129). A szabadgyökök elleni védekezés egyik módja az antioxidáns természetű kismolekulák, pl. a glutation, aszkorbát, bilirubin, vagy a koenzim Q pufferhatásának kihasználása, ezek fokozott szintézisével kiegészítve (59, 94). Emellett fontos szerep jut az antioxidáns kismolekulák regenerációját végző enzimek termelésének. Itt példaként a tioredoxint, tioredoxin reduktázt, a glutation-reduktázt és a glutationperoxidázt említeném meg (116) Redox rendszerek és redox stressz az ER-ben: rövid távú hatások Az ER redox potenciálja jelentősen eltér a citoplazmáétól. A redukált glutation mennyisége a citoplazmában az oxidáltnak (GSSG) szorosa. Ez a reduktív környezet nem kedvez a diszulfid hidak kalakulásának. Ezért a citoplazmatikus fehérjék össz-tiolcsoport tartalmának csak mintegy 0,1%-a képez tartósan molekulán belüli, vagy vegyes diszulfid hidat. Ebből következik, hogy a szekrécióra kerülő, valamint membránokban lokalizálódó fehérjék, melyek általában számos diszulfid hidat tartalmaznak annak érdekében, hogy harmad- és negyedleges szerkezetüket megőrizzék, nem tudják natív konformációjukat felvenni a citoplazmában. Az endoplazmás retikulum redox potenciálja -160 mv körüli érték, azaz a citoplazmánál lényegesen oxidálóbb közeg, amely már kedvez ezen fehérjék tekeredésnek. A redox potenciálért ebben a sejtkompartimentumban a GSH/GSSG arány a felelős, ami 1-3 körüli érték. A glutation koncentrációja az endoplazmás retikulumban 1-2 mm. A glutation rendszer a legalapvetőbb résztvevője a redox egyensúly kialakításának emlős sejtekben. Amellett, hogy redukált és oxidált változatának arányával beállítja a redox potenciált az endoplazmás retikulumban és a citoplazmában, vegyes diszulfidok alkotására is képes a legkülönfélébb fehérjékkel (138). A glutation rendszer e tulajdonsága révén képes a kötött fehérjéket megvédeni az oxidatív károsodástól, illetve módosítani azok enzimaktivitását, aktívan befolyásolva ezzel az oxidatív stresszre adott választ. Az oxidatív stressz során 21

23 glutationilálódott fehérjék között megtaláltak sejtváz fehérjéket, mint például a vimentin, a miozin és az aktin, enzimeket, mint például az enoláz, az ubikvitinkonjugáló enzim vagy az adenilát cikláz, emellett redox enzimeket, peroxiredoxinokat, PDI-t, és végül többféle stresszfehérjét is, például a Hsp70-nek mind a konstitutív, mind pedig az indukálható formáját, valamint a Hsp60-at. Az enzimek aktivitását a glutationiláció különbözőképpen befolyásolta (50). Maga a tioredoxin is glutationilálódik, és ennek következtében inaktiválódik (27). Érdekes megjegyezni, hogy a 20S proteaszóma is rendelkezik redox aktív ciszteinekkel, és funkciója ezeken keresztül glutationiláció által befolyásolható (41). Még kevéssé körvonalazott az, hogy milyen folyamatok játszódnak le az endoplazmás retikulumban oxidatív stressz esetén. Fokozott szabadgyök-termelődés hatására a klasszikus UPR útvonal aktiválódását tapasztalták fibroblasztokon, ugyanakkor ezt nem sikerült kiváltani hidrogénperoxid adásával. Az UPR megelőző indukiója azonban képes volt csökkenteni a ROS indukálta károsodásokat (177). Erős redukáló hatás, DTT kezelés eredményeként a cisztein tartalmú fehérjék tekeredése szelektíven gátlódott mind élesztőben mind humán hepatóma sejtekben (78, 95). Élesztőben a Grp78 komplexet képezett a betekeretlen fehérjékkel (78). DTT hatására megnőtt az endoplazmás retikulumban a Grp78 szintézise, indukálódott a glutatione-s-transzferáz és a citkróm p450 CYP2A5 (56) Kis molekulák szerepe a redox fehérje tekeredésben A redox egyensúly fenntartásához a glutation rendszer működése elengethetetlen, ezen felül azonban még számos kis molekula részt vehet a redox egyensúly kialakításában és a redox fehérjetekredés szabályozásában. Az aszkorbát millimólos koncentrációban van jelen az endoplazmás retikulumban (94), transzportjának részleteit Dr. Bánhegyi Gábor és munkacsoportja tisztázta (11, 31). Az aszkorbát/dehidroaszkorbát redox ciklusának a fehérjetekeredésre gyakorolt hatása még teljes egészében nem egyértelmű, az azonban bizonyos, hogy aszkorbát jelenlétében az endoplazmás retikulum tioljai oxidálódnak (113). A K-vitamin redox ciklusa is szerepet játszik az endoplazmás retikulum redox rendszerében és bizonyos fehérjék betekerésében (118). Ezek mellett a rendszerek mellett egyre növekvő jelentőségűnek látszik a 22

24 riboflavin származékok szerepe az oxidatív tekeredés kialakításában. Az Ero1 fehérje, amely a szubsztát-fehérjék oxidációjának iniciátora, FAD-ot köt nem-kovalens módon (141). Riboflavin megvonására az élesztő sejtekben az oxidatív tekeredés gátolt volt (161), ugyanakkor FAD hatására fokozódott a fehérjék oxidációja (162). Jurkat sejtekben a flavin-hiány az IL-2 fehérje csökkent szekrécióját és intracelluláris felhalmozódását idézte elő (24). A legfrissebb eredmények azt mutatják, hogy HepG2 humán hepatóma sejteken a riboflavin megvonás rövid időn belül a szekréciós útvonalak gátlásához és az ER-stresszválasz kialakulásához vezet (172). Mindezek az eredmények azt sugallják, hogy a riboflavin származékok, elsősorban a FAD, szerepet játszanak a szekréciós fehérjék redox tekeredésének szabályozásában. Felmerült a piridin nukleotidok szerepe is a redox tekeredés szabályozásában, minthogy számos enzim, így pl. a 11β-hidroxiszteroid dehidrogenáz-1 (11βHDH1) NADPH-t köt (98). Bakteriális rendszeren az ubiquinont alkalmasnak találták, hogy az eukarióta Ero1/PDI rendszernek megfelelő DsbB/DsbA rendszer elektronakceptoraként viselkedjen (10) Redox rendszerek és oxidatív stressz a citoplazmában: rövid távú hatások A citoplazmatikus redox potenciál -230 mv körül van, ami nagyrészt a magas redukált glutation (GSH) szintnek köszönhető. A citoplazma redox egyensúlyának fenntartása több, egymástól többé-kevésbé függetlenül működő rendszer feladata. Az ezekben a rendszerekben található oxidált és redukált állapotú molekulák aránya meghatározza a sejtkompartimentum végső redox potenciálját. A három legfontosabb ilyen redox rendszer a citoplazmában a NADPH/NADP pár, a tioredoxin (TRXred/TRXox) pár és a glutation (GSH/GSSG) pár. A redox állapot meghatározásában a glutation rendszer ezek közül kiemelkedő jelentőséggel bír, hiszen a glutation koncentrációja mintegy szerese a másik két molekuláénak, így a GSH/GSSG pár arányának meghatározása már önmagában is meglehetősen hű képet nyújt az adott sejtkompartimentum redox viszonyairól. A NADPH jelentőségét e rendszerben az adja, hogy amellett, hogy hidrogén anion donorként funkcionál számos enzimatikus reakcióban, mint például a GSSG redukcója, a NADPH közvetlen antioxidáns is, hiszen a molekula gyökfogó 23

25 képességét bizonyították, igaz, elsősorban a mitokondriumban (125, 83). Ezen túlmenően fontos szerep jut az oxidatív stressz okozta károsodások kivédésében a stresszfehérjéknek. A stresszfehérjék a sérült fehérjékhez asszociálva azok aggregációját megakadályozzák, lehetővé téve renaturációjukat. A két legfontosabb antioxidáns stresszfehérje-család a kis hősokkfehérjék (8, 93) és a 70 kda-os stresszfehérjék családja, ezek között is kiemelkedő jelentősége van a Hsp70- nek. Mindkét család indukálódik oxidatív stressz esetén, termelődésük hatékony oxidatív stressztolerancia kialakulásához vezet (12, 73). A kis hősokkfehérjék családjába tartozó krisztallinok a szemlencse mellett más szövetekben is védenek az oxidatív károsodástól, illetve az oxidatívan károsodott fehérjék jó szubsztrátjai az α- krisztallinnak (72, 79). A glutation-reduktáz és glutation-transzferáz enzimeket, amelyek a GSH regenerációját végzik, a Hsp27 védi és aktiválja (9, 22). A Hsp27 maga is redox szabályozás alatt áll, egyetlen ciszteinjének oxidációja a homooligomer szétesését okozza monomerekké (171, 73). Az élesztő Hsp33 stresszfehérjéjének magasabb eukarióta megfelelője nem ismert, mégis érdemes egy pár szót ejteni róla, mert ez az elsőként megismert olyan stresszfehérje, amelynek dajkafehérje-aktivitása redox szabályozás alatt áll (76). Oxidáló környezetben néhány kitüntetett ciszteinje diszulfid hídban kapcsolódik össze. Kötőfelszínei így válnak hozzáférhetővé, és a fehérje csak ekkor aktív (77). Oxidatív stresszben a legfontosabb citoplazmatikus stresszfehérje a Hsp70 (74). A Hsp70 segédfehérjéjével, a Hsp40-nel együtt köti és stabilizálja a citoplazmatikus NADPH:kinon oxidoreduktázt, amely szükséges ahhoz, hogy ez az antioxidáns fehérje ne kerüljön lebontásra (6). Bizonyították, hogy a Hsp70 expressziója szükséges egy szuperoxid diszmutáz, a Cu/Zn SOD fehérje szintjének fenntartásához is (29). A Hsp90 szintén indukálódik oxidatív stresszben. Legfontosabb szerepe valószinűleg a proteaszóma védelme az oxidatív károsodástól és funkcióvesztéstől (36) ugyanakkor a Hsp90-nek specifikus szerepe van az oxidált fehérjék lebontásában is (173). A stresszfehérjék szintéziséért felelős transzkripciós faktor, a HSF1 is redox 24

26 reguláció alatt áll. Oxidálószerek gátolják a HSF1 trimerizációját és DNS kötését (75), ugyanakkor azt találták, a HSF1 oxidációja szükséges lehet a stresszválasz kialakításához (1). A citoplazmatikus GSH/GSSG arány változásai is hatnak a HSF1 aktivációjára és így stresszfehérjék transzkripciójára, és viszont: a HSF1 feltehetőleg közvetett módon, de befolyásolja a redox egyensúly kialakulását (177). HSF1 hiányos egerekben a Hsp25 és Hsp90 szintje alacsonyabb, a GSH/GSSG arány csökkent, ugyanakkor a mitokondriális szuperoxid-termelés nőtt (179). A tioredoxin egy 12 kda-os fehérje, amely oxidoreduktáz aktivitással rendelkezik, számos úton befolyásolja a redox egyensúlyt, és speciális szerepet tölt be oxidatív stressz esetén (68). A tioredoxin család legtöbbet vizsgált tagja, a TRX-1 citoplazmatikus lokalizációt mutat, a TRX-2 a mitokondriumban található, az sptrx névre hallgató izoenzim pedig csak a spermatozoákban van jelen. Közös tulajdonságuk, hogy mindegyikük tartalmazza az igen konzervatív tioredoxinmotívumot, amely Cys-Gly-Pro-Cys aminosavakból épül fel. E fehérjeszakasz a felelős a tioredoxin oxidoreduktáz aktivitásáért. A tioredoxin enzimatikusan redukál számos transzkripciós faktort, például a p53-at, és az NFκB-t is (82). A tioredoxin számos peroxiredoxin elektrondonorja, emellett direkt gyökfogó kapacitását is bizonyították (158). A tioredoxin számos stressztípusban indukálódik, és bizonyos estekben fokozott szekrécióját is megfigyelték (69, 116). A fehérje az extracelluláris térbe kerülve citokinként működik (123). A tioredoxinnak nemcsak oxidatív, de reduktív stresszben is védő szerepe van. A tioredoxin mentes élesztő sejtekben rendre magasabb redukált glutation arányt találtak, amely valószínűleg összefüggésben van azzal, hogy ezen sejtek érzékenyebbek voltak DTT-vel kiváltott reduktív stresszre is (158). Számos aminosav érzékeny az oxidatív reakciókra. Ilyen például a cisztein, a hisztidin, a triptofán, a tirozin és a metionin, amelyek közül ez utóbbi a legérzékenyebb. A metionin oxidáció egyik terméke, a metionin szulfoxid, (MetSO) a metionin szulfoxid reduktázok (Msr-ek) segítségével redukálható vissza (110). E fehérjéknek ma két típusát, az MsrA-t és az MsrB-t különítjük el, amelyek az S és az R metionin szulfoxid enantiomerek redukálásáért felelősek (111). Az Msr fehérjék védenek oxidatív stresszben az oxidált fehérjék felhalmozódásától és ez által a sejthaláltól (146, 148). 25

27 A metionin szulfoxidáció nemcsak mint oxidatív károsodás, hanem mint poszttranszlációs módosítás is szerepelhet a sejtek életében. Ezen keresztül a Msr fehérjék regulációs szerepet is betöltenek, például a kalmodulin esetében (152, 168). Számos proteáz, közöttük az alfa1-antitripszin fehérje és a HIV-2 proteáz is tartalmaz könnyen oxidálódó metioninokat. E metioninok oxidációja az enzimek inaktiválódásához vezet. Emellett a metionin szulfoxidációt felelősnek találták többféle neurodegenerációs betegség kialakulásában, mivel a megváltozott hidrofobicitású aminosav hajlamosabbá teheti a fehérjéket az aggregációra (111) Stresszfehérjék és redox változások krónikus megbetegedésekben: hosszú távú hatások A fentiekben részletezett folyamatok mind a stressz akut formájára vonatkoztak. Mivel az élő szervezetben nem minden, krónikusan fennálló betegség vezet sejthalálhoz, lézetnie kell egy krónikus stresszválasznak is, amely részleteiben, vagy egészében eltér az akut választól, hiszen például a fehérjeszintézis szüneteltetése csak átmeneti megoldást jelenthet, mert hosszabb távon szükség van a stressz-szignál lecsengésére és alternatív útvonalak aktiválódására is. A hosszú távú stressz hatásaival kapcsolatosan azonban még igen kevés és szórványos adat áll csak rendelkezésünkre. Krónikus stressz modellként szolgálhat néhány tartósan fennálló betegség, mint pl. a diabétesz, vagy egyes neurodegenerációs betegségek, mint az Alzheimer-kór, a Parkinson-kór, bizonyos mértékben az öregedés (147) és az általunk is vizsgált alfa1- antitripszin deficiencia is. Öregedés során kimutatták az oxidatív stressz fokozódását (117), a tioredoxin aktivitás csökkenését (185) és azt is, hogy az oxidatív károsodásokkal párhuzamosan a proteaszóma aktivitása csökken (126). Az Alzheimer-kórban a normálisan szolubilis béta-amiloid (A-beta) protein tekeredési hibája és aggregációja okozza a betegséget. A béta-lemezekben gazdag oligomerek neurotoxikus hatásúak és felhalmozódnak az agyban, oldhatatlan partikulumokat formálva. Alzheimer-kór modellekben az UPR indukciójának hiányát figyelték meg (80), ugyanakkor a citoplazmatikus antioxidáns enzimek (hem-oxigenáz 1) és Hsp90 aktivációja volt megfigyelhető (5). 26

28 A Hsp70 szintje is emelkedett Alzheimer-kórban szenvedő betegek agyában (180). A Hsp70 az A-beta aggregátumokkal asszociálódott (48). A tioredoxin és a metionin szulfoxid reduktázok (Msr-ek) szintjének csökkenését is felelősnek találták az Alzheimer-kór kialakulásában (97, 149). Az amiloid lerakódások maguk is szabadgyökök fokozott keletkezését idézték elő (15). A Parkinson-kór esetében a dopaminerg neuronok pusztulásán kívül ubiquitinált fehérjék felhalmozódását figyelték meg a neuronok sejttestjeinek citoplazmájában és protein zárványokat a neuritokban. Ezek alfa-szinuklein aggregátumok, melyek gyakran mutáns fehérjéből állnak össze (135). Drosophila modellben és egérben ezen aggregátumok, illetve az általuk okozott neuronpusztulás is megelőzhető volt Hsp70 túltermeltetéssel (42). Az oxidatív stressz és fokozott metionin-oxidáció ez esetben alapvető jellemzője a megbetegedésnek (57). Diabéteszben az oxidatív stressz kialakulása közismert tény, annak hosszú távú hatásai között szerepel a fehérjék és lipidek fokozott oxidációja, bizonyos antioxidáns fehérjék szintje pedig hosszú távon csökken (124). A Hsp70-nek mind a szintje, mind pedig indukálhatósága csökkent, a PDI és Grp78 esetén viszont indukciót tapasztaltak (154). Diabéteszben az endoplazmás retikulum redox egyensúlya felborul, redukáltabb állapot felé tolódik, és ez a változás a redox tekeredésben részt vevő stresszfehérjék funkcióját is érinti. (114) Az alfa-1-antitripszin deficiencia, mint a krónikus stressz egyik modellje E dolgozatban ismertetett kísérletekben a mutáns alfa1-antitripszin intracelluláris felhalmozódásán, mint krónikus stressz modellen keresztül vizsgáltam az endoplazmás retikulum chaperonjainak, illetve chaperon-komplexeinek viselkedését, ezért e betegségről részletesebben szeretnék szólni. Az alfa1-antitripszin a májsejtekben szintetizálódó fehérje. A szintézist követően normális esetben szekretálódik, és a véráramba kerül. Funkcióját tekintve az egyik fő szerin-proteáz inhibitor. Számos szerin proteáz gátlásában fontos (tripszin kimotripszin, elasztáz, thrombin), ezáltal védi a tüdő alveolusok elasztikus rostjait a neutrofil elasztáz károsító hatásától. Az alfa1-antitripszin génje emberben a 14-es kromoszómán található, lokuszát Pi-vel jelölik. Az emberben a PiM-mel jelölt allél gyakorisága a legmagasabb, 95%, ez egyben a működő, egészséges fehérje allélja 27

29 (53). A PiZ allél által kódolt alfa1-antitripszin hibás, tekeredési problémás. A PiZ allélra homozigóta emberekben a plazma alfa1-antitripszin szintje az egészségesre jellemzőnek mindössze 10-15%-a. Az ilyen betegeknél az emfizéma (tüdőtágulat) gyakori tünet. Az alacsony plazmakoncentráció a Z típusú alfa1-antitripszin csökkent szekréciójából adódik. A Z formát érintő mutáció, a 342-es pozíciójú glutaminsav lizinre cserélődése konformációváltozáshoz és egy tekeredési köztitermék aggregációjához vezet (186). Hidrofób kölcsönhatások következtében, loop-sheet polmerizációval nem kovalens antitripszin dimerek, majd polimerek alakulnak ki (96). Az aggregátumok igen nagy méretűek, fénymikroszkóposan is láthatóak (187). A hepatocitákon belüli antitripszin globulusok önmagukban nem toxikusak. Ennek ellenére már a magzati élet huszadik hetében megjelennek az alfa1-antitripszin felhalmozódás tünetei, az alfa1-antitripszin deficiens újszülöttek pedig általában kisebb súlyúak. Az ilyen újszülöttek felénél alacsonyabb májenzim szinteket mértek, és a májgyulladás is gyakori (43). A korai, szisztémás tünetek is arra utalnak, hogy a máj funkcióját nagyban befolyásolja a felhalmozódó alfa1-antitripszin. Az életkor és a betegség előrehaladtával számos más szisztémás tünet és májzsugorodás is kialakulhat, ezen kívül fontos megemlíteni, hogy tumoros, rákos elváltozásokra is igen hajlamosak a Z típusú alfa1-antitripszin deficienciában szenvedők (53, 187). Arra, hogy ezeket a tüneteket milyen módon váltja ki az alfa1-antitripszin fehalmozódása, még nincs kielégítő magyarázat. Sejtvonalba transzfektált PiZ fehérje aggregációja az NFκB transzkripciós faktor aktivációját idézte elő, azonban az UPR előidézéséhez egy további stresszhatásra is szükség volt. Megfigyelték továbbá, hogy az UPR kombinált stressz esetén erősebb a PiZ sejtvonalakon, mint akár a kontroll, akár az egészséges, PiM alfa1-antitripszinnel transzfektált sejteken (89). Egy másik kutatócsoport szerint a PiZ-génnel transzfektált sejteken végzett kísérletek azt mutatják, hogy a humán alfa1-antitripszin ER-ban visszamaradó mutáns Z formájához számos chaperon kötődik (138). E vizsgálatokban a Grp78, a Grp94, Grp170 és az UDP-glukóz: glikoprotein glükoziltranszferáz (UGGT) chaperonokat találták az antitripszinnel komplexben. A kémiai keresztkötéses és ülepítéses eljárások 28

30 szerint a mutáns antitripszin 85%-a chaperonokkal közös komplexben található meg az endoplazmás retikulumban. Az idő előrehaladtával a chaperonok, például Grp78 kötődése az antitripszinhez csökkent. Az általunk is használt, PiZ fehérjét hordozó egér törzset régóta alkalmazzák a humán alfa1-antitripszin deficiencia vizsgálatára (53). Ezek az állatok az emberi fehérjét expresszálják a májukban. Az emberi Z, azaz mutáns allél kódolta fehérje felhalmozódik a májsejtek endoplazmás retikulumában, és onnan nem jut ki. Szérumbeli szintje ilyenkor a normálisnak egytizede is lehet az M, nem mutáns allél fehérjetermékéhez képest. Mutáns Z allélt hordozó egereknél alacsonyabb születési súlyt is tapasztaltak (156). A Z allélt magas szinten expresszáló egerek esetében hasonló fenotípusos tüneteket figyeltek meg, mint az embereknél tapasztalható alfa1-antitripszin deficienciánál, például újszülöttkori hepatitiszt (43). A mutáns alfa1-antitripszin a humán betegekben tapasztalható állapothoz hasonlóan halmozódik fel. A májkárosodás mértéke korrelál az akkumulálódott Z forma százalékos arányával (26). Ezek az egerek, bár élethosszuk körülbelül azonos vad típusú társaikéval, különböző behatásokra, mint pl. az éhezés (156), vagy tumorindukció (53) sokkal érzékenyebben reagálnak. A sejtes rendszereken talált eredményeknek részben ellentmondó adat, hogy a Grp78-at nem találták emelkedett szintűnek PiZ transzgén egerekben (58), sem pedig PiZ hordozó emberekben (37). Ennek magyarázata az lehet, hogy a sejtes rendszereken a fehérje szintetizálódása után igen rövid idővel, még a stressz akut szakaszában vizsgálták az ER chaperonjait, míg a transzgénikus egértörzsek és a humán minták a krónikussá vált stresszről nyújtanak képet. A legfrissebb kutatások szerint sem transzfektált sejtek, sem pedig a PiZ gént hordozó egerek által szintetizált és felhalmozódott PiZ fehérje nem idézi elő a betekeretlen fehérje választ, azaz az UPR-t, azonban kaszpáz-mediálta apoptózist indukál (67). Ezek az adatok tehát azt valószínűsítik, hogy az alfa1-antitripszin, bár önmagában nem toxikus, mégis kivált olyan reakciókat, amelyek a sejt bizonyos funkcióit gátolják. Mivel a betekeretlen fehérjék a chaperonok kötődését idézik elő, 29

31 valószínűnek tűnik, hogy a chaperonok tartós AAT-kötöttsége és emiatt kapacitásuk csökkenése, vagyis a chaperon-overload (34) jelenség szerepet játszik a betegség patomechanizmusában. Fontosnak találom megjegyezni, hogy a PiZ egértörzshöz hasonlóan létrehoztak egészséges AAT-t kódoló, azaz a PiM gént hordozó egereket is. Ezek az állatok a PiZ transzgénikus egerekhez hasonlóan magas szinten expresszálják a humánt AAT-t, amely azonban végigjut a szekréciós útvonalon és nem halmozódik fel az endoplazmás retikulumban (43). Ezek az egerek semmilyen, a PiZ transzgén egerekre jellemző tünetet nem mutatnak. Ezek alapján kimondhatjuk, hogy a PiZ transzgénikus egerekben csakúgy, mint az alfa1-antitripszin deficienciában szenvedő betegeknél nem a fokozott fehérjeszintézis, hanem a lumenális aggregáció idézi elő a betegség tüneteit. 30

32 3 Célkitűzések Doktori munkám alapját az endoplazmás retikulum stresszfehérjéinek és redox egyensúlyának vizsgálata képezte. 1. Munkám egyik célkitűzése az volt, hogy megvizsgáljam, mely, fiziológiásan is előforduló kismolekulák játszanak szerepet az endoplazmás retikulum fehérjetekerő rendszerének működtetésében, továbbá, hogy e molekulák hatásmechanizmusát feltárjam. 2. Tisztázni kívántam továbbá, hogy a mutáns alfa1-antitripszin felhalmozódása transzgénikus egerek májában milyen következményekkel jár. E munkámban elsősorban az endoplazmás retikulum chaperonjainak indukcióját és azok kölcsönhatásait illetve funkcionális aktivitását kívántam megvizsgálni. E mellett, mivel a endoplazmás retikulum redox egyensúlya kardinális kérdés a sejtorganellum működése során, és annak megváltozása más krónikus stresszmodellben is bizonyított, az endoplazmás retikulum redox viszonyait is szükségesnek láttam felmérni. 3. E méréseket a citoplazma stresszfehérjéinek és redox paramétereinek vizsgálatával kívántam kiegészíteni, hogy a PiZ fehérjeaggregáció patomechanizmusáról kompexebb képet kaphassunk. 31

33 4 Anyagok és módszerek 4.1 Anyagok Vegyszerek A kísérletek során használt vegyszerek a Sigma, illetve Fluka cégektől származnak, a gélelektroforézishez használt anyagokat a Bio-Rad-tól szereztük be. A Bacitracint a Calbiochem-től, az AMS-t a Molecular Probes-tól szereztük be. A PVDF membránokat és az elektorforézishez használt anyagokat a Bio- Rad-tól vásároltuk. Antitestek A felhasznált elsődleges antitestek (AT) a következők voltak: PDI anti-nyúl PDI poliklonális AT (StressGen, SPA-890) illetve anti-egér monoklonális AT (StressGen, SPA-891). ERp72 anti-egér ERp72 C-terminális poliklonális AT (StressGen, SPA-720). ERO1-Lα (A29) anti-humán ERO1-L C-terminális monoklonális egér AT (Ineke Braakman ajándéka, 17). Grp94 anti-patkány Grp94 poliklonális AT (StressGen, SPA-850). Grp78 poliklonális nyúl anti-humán Grp78 (Stressgen SPA-826). Calnexin anti-nyúl calnexin C-terminális poliklonális AT (StressGen, SPA-860). KDEL anti-nyúl KDEL poliklonális antipeptid AT (Affinity BioReagents, PA1-013). Tioredoxin anti-egér monoklonális AT (StressGen, MSA- 150E). Hsp90 anti-egér Hsp90 (Affinity Bioreagents, PA3-012). Hsp70 (Affinity Bioreagents, MA3-007). MsrA poliklonális anti-nyúl MsrA AT (Bertand Friguet ajándéka, 127). Alfa1-antitripszin kecske anti-humán AAT AT (StressGen, SBA- 155) és peroxidáz-konjugált kecske anti-humán AAT AT (ICN, SKU ). Sejtek Emberi hepatóma HepG2 sejtvonalakat tenyésztettünk DMEM médiumban, amely 10% fötális szarvasmarha szérumot tartalmazott. A kísérletek elvégzéséhez 90%-os konfluenciájú sejttenyészeteket használtam. Kezelésük során 18 órán keresztül 3 mm-os végkoncentrációjú bacitracinban inkubáltam a sejteket 10 cm átmérőjű petricsészékben, majd mikroszómát izoláltam belőlük a májszövetnél leírt módszer szerint. Fontos megjegyeznem, hogy a mikroszóma izolálás, különös tekintettel a sejtek feltárására (amihez sem detergenst, sem ultrahangos előkezelést nem alkalmazhattam), igen rossz hatásfokú sejttenyészetekből, mivel ilyen enyhe körülmények között a potteres homogenizálás ellenére a sejtek jó része intakt marad. 32

34 Állatok A John Rodgers (Baylor College, Houston, Texas) laboratóriumából származó, speciális patogén-mentes C57BL/6J genetikai hátterű, PiZ génre heterozigóta PIZ11.03 jelű állatokat (61) a Semmelweis Egyetem Orvosi Vegytani, Patobiokémiai és Molekuláris Biológiai intézetének steril állatházában tartottuk. Az állatokat 14 napos korukban választottuk el, genetikai analízisüket 4 hetes korukban farok-dns mintavétellel végeztük el. Az állatokat a Magyarországon érvényes állatvédelmi szabályok betartása mellett a /3/2002-es engedély alapján tenyészettük és vizsgáltuk. 4.2 Módszerek Fehérjekoncentráció meghatározása A fehérjekoncentráció meghatározásához Bradford módszerét alkalmaztam (20), Bio-Rad reagens segítségével, marha szérumalbumin (BSA) standard felhasználásával. Fehérje elválasztás Fehérjék elválasztására diszkontinuus poliakrilamid gélt használtam Laemmli módszere szerint (86), az elektroforézis körülményeit, a minták előkészítését, a gélméretet azonban az adott kísérlet követelményei szerint alakítottam ki. Nem-redukáló SDS-PAGE esetén sem a mintapuffer, sem a futtató közeg nem tartalmazott redukálószert. Western blot Azokban a kísérletekben, ahol a gélelektroforézissel elválasztott fehérjéket immunoblottal detektáltam, a fehérjéket először félszáraz blotkészülék segítségével nitrocellulóz (Schleicher&Schuell, Protran) vagy PVDF (ImmunBlot, Bio-Rad) membránra transzferáltam (4 C, 1,5 ma/cm 2, min, a gélmérettől és pórusnagyságtól függően). A membrán aspecifikus kötőhelyeinek blokkolása TBS-T (20 mm Tris.HCl, 137 mm NaCl, 0,1 % Tween 20, ph 7,6) pufferben feloldott 5% zsírmentes tejporral történt 60 percig szobahőmérsékleten vagy egy éjszakán át 4 Con. Az elsődleges antitesteket a gyártók utasításai szerinti hígításban alkalmaztam 60 percig, majd a membránt 3x10 percig mostam TBS-T pufferben oldott 1 %-os tejporral. A peroxidáz-konjugált másodlagos antitesteket (DAKO) 1:2000 1:10000 közötti hígításban 30 percig inkubáltam együtt a membránnal, majd 4x10 percig mostam, és a jelölődő fehérjéket kemilumineszcens eljárással detektáltam betartva a gyártók utasításait (New England Nuclear). DNS izolálás A transzgén egerek farkából nyert szövetmintákat azonnal 33

35 jéghideg foszfát pufferbe helyeztem és mostam. A folyékony nitrogénnel történő fagyasztás után a mintákat mozsárban homogenizáltam, majd 1 ml SE (75 mm NaCl, 25 mm EDTA, 1% SDS, ph 8,0) pufferben oldottam fel. A mintákat proteináz K-val inkubáltam 50 µg/ml végkoncentrációban 55 C-on 60 percig rázatva a fehérjeszennyezések felszámolására. A mintákhoz NaCl-ot adtam 1,5 M-os végkoncentrációban, majd a mintákat azonos mennyiségű tömény kloroform hozzáadása után centrifugáltam (2000 rpm, 10 perc). A felülúszóhoz azonos térfogatú izopropanolt adtam, majd -20 C-ra hűtöttem. Centrifugálás után (12000 rpm, 10 perc) a csapadékot kétszer 70% EtOH-ban mostam, majd 25 µl TE8-ban (10 mm Tris.HCl, 1 mm EDTA, ph 8,0) oldottam fel. RNS izolálás és reverz transzkripció Máj szövet darabkákat (1-3 g) 500 μl TRI reagensben homogenizáltam, majd 200 μl kloroformot adva centrifugáltam 10,000 g-n, 4 C-on. A felülúszót 500 μl izopropanollal elegyítve 30 percig jégen inkubáltam, majd g-n, 4 C-on 10 percig centrifugáltam. Az üledéket 70%-os etanollal mostam, (12000 g-n, 4 C-on, 5 percig), majd steril desztillált vízben oldottam fel. A reverz transzkripciót MBI Fermentas nagytisztaságú vegyszerek segítségével készítettem, betartva a gyártó utasításait. A termékből 1-2 μl-t használam a PCR-hoz. PCR A PCR-t J. Rodgers laboratóriumának előírásai szerint végeztem, (95 C 1 perc után 64,5 C 2 perc, majd 72 C 1 perc, 40 cikluson keresztül) a szükséges nagy tisztaságú vegyszerek MBI Fermentas termékek voltak. A primereket J. Rodgers és munkatársai által megadott szekvenciákra készíttettük el. A PCR eljárásnál mindíg humán szérumot, vad típusú (CD1) egeret és DNS mentes mintát is használtam kontrollként. Standardként aktin gén amplifikációt alkalmaztam. DNS elválasztás A PCR eredményének vizsgálatához 1μl PCR termék és 3 μl TAE puffer (10 mm Tris bázis, 5.7% jégecet 0,5 M EDTA, ph 8,5) és 1 μl 5x tömény DNS futtatópuffer keverékét vittem fel 2%-os agaróz gélre. A futtatás Bio-Rad horizontális futtatókádban és TAE pufferben történt. A megjelenítést etídiumbromidos jelöléssel végeztem. Mikroszóma izolálás A transzgén, illetve kontroll egerekből a gerincvelő megszakítása után a máj mikroszómális frakcióját Lambert és Freedman eljárásának 34

36 adaptációjával végeztem (88). A májat jéghideg TKM-pufferben (50 mm Tris.HCl, 25 mm KCl, 5 mm MgCl 2, ph 7,0) ollóval aprítottam, üvegszűrőn mostam, majd 2x-es mennyiségű jéghideg, gáztalanított S-TKM-pufferbe (TKM-puffer mm szukróz, μg/ml aprotinin és leupeptin, 1 mm PMSF, ph 7,0) vettem föl és ötszöri potteres eljárással homogenizáltam. A mintát lecentrifugálva (700xg, 12 perc, 4 C) a felülúszót jégen tartottam, míg az üledéket potterrel tovább homogenizáltam és centrifugáltam a hatékonyabb kinyerés érdekében. A felülúszót tovább centrifugálva (12000xg, 10 perc, 4 C) megkaptam a posztmitokondriális felülúszót, melyből ultracentrifugálással (100000xg, 60 perc, 4 C) választottam el a citoplazmatikus frakciót (felülúszó) és a mikroszómális frakciót (üledék). Ez utóbbit 10x térfogatú S- TKM-pufferben reszuszpendáltam, leválasztottam a glikogént tartalmazó üledékről és újra ultracentrifugáltam (100000xg, 60 perc, 4 C). Az így kapott mosott mikroszómát 0,15 M Tris/HCl-pufferbe (ph 7,0) fölvéve -80 C-on tároltam. A mikroszómák intaktságát mikroszóma impermeábilis szubsztrát (szaharóz) jelenlétében kialakuló fényszórásjel növekedés megtartottságával (21) ellenőriztem. Tiol tartalom meghatározása A tiol-tartalom meghatározása Ellman módszerével történt μg fehérjetartalmú mikroszómális illetve citoplazmatikus minta felhasználásával. A fehérje-tiolok méréséhez a mintákat 5 %-os végkoncentrációjú triklórecetsavval precipitáltam, 3x70 %-os acetonos mosás után reszuszpendáltam (50 mm Tris.HCl, ph 6.8, 8 M ureát és 2% SDS-t tartalmazó pufferben) és a fehérjekoncentráció ellenőrzése után végeztem el a meghatározást. A méréshez Hitachi U-1500 UV-VIS spektrofotométert használtam, Ellman módszere szerint 412 nm-en, moláris extinkciós koefficiensként et használtam a 2-nitro- 5-thiobenzál savhoz. Az összes GSH szint meghatározása Mivel a szabad tiolcsoportok döntő többsége a kis molekulák mérésénél a glutationból származik, ezért a tiolcsoportok meghatározása gyakorlatilag a glutation-szint meghatározásának felel meg. Ellman módszere szerint (44) csak a redukált tiolok mérhetőek, ezért az össz-glutation meghatározásához a mintákat először redukálni kell GSH-reduktáz segítségével. Ennek érdekében mintánként 100 μg fehérjét inkubáltam 2 µl NADPH-t tartalmazó 240 μl 50 mm Tris.HCl (ph 7.2) pufferben, 1 U aktivitású glutation reduktáz jelenlétében 30 percig 37 C-on. A reakciót 5% triklór ecetsav adásával állítottam meg, 35

37 majd a centrifugáltam (3,000Xg, 3 perc). A felülúszóból 500 μl-es aliquotot 80 µl 400 mm Tris.HCl (ph 7.2)-lel és 150 μm DTNB-vel kevertem. A GSH meghatározáshoz Hitachi U-1500 UV-VIS spektrofotométert használtam, 412 nm-en, moláris extinkciós koefficiensként et használtam a 2-nitro-5-thiobenzál savhoz. Redukált glutation meghatározás 40 µg fehérjét a kívánt mintákból 400 μl 400 mm Tris.HCl (ph 7.2) pufferben vettem fel, 5%-os triklórecetsavval csaptam ki, centrifugáltam 3000xg-n 3 percig. A felülúszókból 200 µl-es aliquotot vettem, és a fent leírt módon végeztem rajta a GSH meghatározást. ER stresszfehérjék oxidatív állapotának meghatározása A luminális stresszfehérjék redox állapotának meghatározásához a mikroszóma mintát 50 mm Tris.HCl (ph 6,8) pufferben hígítottam, és a fehérjéket 5 % triklórecetsavval precipitáltam. Egyes kísérletekben a mikroszómákat különböző redox reagensekkel inkubáltam a kísérletben meghatározott ideig, majd ezután precipitáltam. Centrifugálás után (10000xg, 10 perc) az üledéket 70 % acetonnal kétszer mostam, végül detergens jelenlétében reszuszpendáltam (50 mm Tris.HCl, 2 % SDS, 4 M urea, ph 6,8). A fehérje-tiol csoportokat a reszuszpendáló pufferbe adott 20 mm AMS-sel (4-acetamido-4 -maleimidilstilbén-2,2 -diszulfonsav, Molecular Probes, A-485) jelöltem 15 perc, 0 C-on és 15 perc, 37 C-on végzett inkubációval (49). A mintákat nem-redukáló SDS-PAGE és szekvenciális Western blot segítségével analizáltam. Immunoprecipitáció Mikroszóma mintákat inkubáltam azonos térfogatú protein-a Sepharose-zal precipitációs pufferben (200 mm Tris, 150 mm NaCl, 1% NP40, ph 7,2) 30 percig 40 C-on a mintában található egér IgG eltávolítására. 20 µl protein-a Sepharose-t és 1-2 µl IgG-t összemértem, inkubáltam precipitációs pufferben, 100 µl össztérfogatban 40 C-on 60 percig. Az egér IgG-től megtisztított mintából 50 µg fehérjetartalmú adagot a Sepharose-antitest elegy mosott precipitátumával mértem össze, és tovább inkubáltam legalább 2 óráig. A felülúszó eltávolítása után a precipitátumot többször mostam precipitációs pufferrel. A precipitátumot és a felülúszót külön-külön denaturáló mintafelvivő oldattal kevertem, forraltam, majd gélelektroforézisre vittem a fent leírt módon. FiTC-inzulin szintézis Heuck és Wolosiuk (66) szerint 30 mg fluoreszcein izotiocianátot (FiTC-ot) kevés vízmentes DMSO-ban feloldottam, majd 3 ml NaHCO 3 36

38 pufferbe (ph = 9,0) mértem. Ehhez 21 mg inzulint adtam. A reagáló elegyet 24 órán át inkubáltam 4 C-on. Kizárásos kromatográfiával Sephadex G25 töltettel 1x48 cm-es oszlopon választottam el a FiTC-inzulint a szabad FiTC-től és a jelöletlen inzulintól. Az elúciós puffer azonos volt a reakciópufferrel. Az elsőként eluálódó színes frakciók tartalmazták a FiTC-cel jelölődött inzulint. A FiTC-inzulin tartalmú frakciókhoz ureát adtam 6M végkoncentrációban. A mintákat desztillált vízzel dializáltam, majd 10 mm-os Tris pufferbe (ph 7,6) vittem át. Protein diszulfid oxidoreduktáz (PDOR) aktivitás mérése FiTC-inzulinnal A módszer lényege, hogy az inzulin mindkét peptidszála FiTC csoporttal jelölt, ez a csoport vizes közegben alig fluoreszkál, ám a B-lánc aggregációjával az FiTCcsoportok egy része apoláros környezetbe kerül, és így fluoreszcenciája megnő. A kísérletek 25 C-on, 0,8 ml Tris.HCl (5 mm, ph 7,2) pufferben zajlottak 1:5 arányú GSH:GSSG puffer (összes GSH koncentráció 2 mm) jelenlétében, 1 μm FiTCinzulinnal. A fluoreszcencia-növekedést Hitachi F-4500-as spektrofluoriméteren követtük 495/520 nm-es excitációs/emissziós hullámhosszpárt használva. A pozitív kontroll 50 nm rekombináns tioredoxin (Promega, Z7051) volt. Statisztikai analízis Az itt bemutatott eredmények mindegyike legalább 3 független kísérlet eredményét reprezentálja. Statisztikai analízishez Student-féle t- próbát alkalmaztam, csak a p<0,05 megbízhatóságú eltéréseket fogadtam el szignifikánsan eltérőnek. 37

39 5 Eredmények 5.1 A FAD szerepe az endoplazmás retikulum redox fehérje tekerésében Kis molekulák hatása a mikroszómális tiolok redox állapotára Amint azt az irodalmi áttekintésben bemutattam, a FAD és a piridin nukleotidok is szerepelhetnek, mint elektronakceptorok a fehérjék oxidatív tekeredése során bekövetkező elektron-áramlásban. Ezt a lehetőséget vizsgáltam meg kísérleteim során. Elsőként nagy mennyiségben adtam FAD-ot, FADH-t, NAD-ot, NADH-t, NADP-t és NADPH-t a mikroszómákhoz, hogy megvizsgálhassam, molekulák milyen hatással vannak a mikroszómális tiolcsoportok redox állapotára Fehérje tiol oxidáció a kontroll %-ában * 0 kontroll FAD NAD NADH NADP NADPH ábra. Különböző kis molekulák hatása a fehérje oxidációra 300 μg fehérjének megfelelő patkány máj mikroszómát inkubáltam 37 C-on, az ábrán jelzett kis molekulákkal, 500μM koncentrációban. A 30 perces inkubálási idő letelte után a fehérjéket kicsaptam 5% perklórsav segítségével, és a fehérjék tiol-tartalmát megmértem az Anyagok és módszerek fejezetben ismertetett módon, az Ellman reakció felhasználásával. Az ábra három független kísérlet átlagát mutatja. A csillag a szignifikáns eltérést jelöli (p < 0.05). 38

40 A es ábráról leolvasható, hogy a megvizsgált molekulák közül csak a FAD volt képes a mikroszómális fehérjéket oxidálni. A nikotinsavamid-származékok hatását, illetve hatástalanságát Dr. Bánhegyi Gábor munkacsoportja tovább vizsgálta, ebből közlemény is született (127) A FAD hatása a mikroszómális tiolok oxidálására Ahogy azt Dr. Bánhegyi Gábor munkacsoportjával közösen kimutattuk, a FADdal való inkubálás eredményeképpen FAD halmozódik föl intraluminális térben (164). Ez a folyamat gátolható anion-csatorna gátlószerekkel, ami az aktív transzporter jelenlétét valószínűsíti. Az én kísérleteim ezután arra irányultak, hogy megtudjam, a FAD felvétele az endoplazmás retikulum lumenébe milyen módon okoz változást a fehérjék oxidatív állapotában. A mikroszómákat növekvő koncentrációjú FAD-dal inkubáltam, majd megvizsgáltam a mikroszómális fehérjék oxidáltsági állapotát. Ennek megvizsgálására az Ellman-reakciót használtam. A ábrán mutatom be e kísérletek eredményét: 60 Fehérje tiol tartalom Fehérje tiol tartalom pmol SH/mg fehérje (pmol SH/mg fehérje) * * * FAD koncentráció (μ M) ábra. A FAD indukálta fehérje-oxidáció koncentráció függése 300 μg fehérjének megfelelő patkány máj mikroszómát inkubáltam 37 C-on, az ábrán jelzett FAD koncentrációkkal. A 30 perces inkubálási idő letelte után a fehérjéket 5% perklórsav segítségével kicsaptam, és a fehérjék tiol-tartalmát megmértem az Anyagok és módszerek fejezetben ismertetett módon, az Ellman reakció felhasználásával. A szabad tiolcsoportok csökkenése a FAD-indukálta oxidáció mértékét jelenti. Az ábra három független kísérlet átlagát mutatja. A csillag a szignifikáns eltérést jelöli (p < 0,05). 39

41 Az ábrán látható, hogy a FAD koncentrációfüggő módon képes a mikroszómális fehérjéket oxidálni, a maximális oxidáló hatást kb. 100 μm-os koncentrációnál éri el. Ezt a FAD koncentrációt választottam a további kísérleteimhez. Először a FAD oxidáló hatásának időbeli lefutását vizsgáltam meg. Ezen kísérletek eredménye látható a ábrán: 60 Fehérje tiol tartalom pmol SH/mg fehérje * * * * Idő (min) ábra. A FAD indukálta fehérje-oxidáció időfüggése 300 μg fehérjének megfelelő patkány máj mikroszómát 37 C-on, az ábrán jelzett ideig, 100 μm FAD jelenlétében inkubáltam. A megfelelő inkubálási idők letelte után a fehérjéket 5% perklórsav segítségével kicsaptam, és a fehérjék tiol-tartalmát megmértem az Anyagok és módszerek fejezetben ismertetett módon, az Ellman reakció felhasználásával. A szabad tiolcsoportok csökkenése a FAD-indukálta oxidáció mértékét jelenti. Az ábra három független kísérlet átlagát mutatja. A csillag a szignifikáns eltérést jelöli (p < 0,05). 100 μm FAD már kb. 15 perc után eloxidálja az összes hozzáférhető tiolcsoportot, az oxidáció mértéke hosszabb idő elteltével sem fokozódik. A kísérletet megismételem 4 C-on, illetve 500 μm FAD jelenlétében, az eredmények egészen hasonló képet mutattak, így ezeket az ábrákat itt nem mutatom be. Miután megvizsgáltam a FAD kiváltotta fehérje oxidáció kinetikáját, kíváncsi voltam, hogy a mikroszóma membrán jelenléte mennyire gátolja a FAD hatását, azaz, ha szabad hozzáférést engedünk a FAD számára, a fehérjék oxidációja tovább 40

42 fokozódik-e. Ennek érdekében olyan kísérleteket terveztem, amelyben a mikroszómák membránját kilyukasztottam, és vizsgáltam, hogy az ER fehérjéinek oxidációja hogyan nő. Ehhez az alábbi módszereket választottam: A mikroszómákat detergens (DOCA) kezelésnek tettem ki, illetve egy pórusképző ágenst, az alamethicint adtam hozzá, amely a membránstuktúra viszonylagos megőrzésével a kismolekulák számára átjárhatóvá teszi a membránokat. A FAD-tól eltérő oxidálószerek jelenlétében is megvizsgáltam az adott kezelések hatását. A ábrán e kísérletek eredménye látható: 60 Fehérje tiol tartalom pmol SH/mg fehérje * * * * * * * * * 10 0 Kontroll FAD 5 mm GSSG 50mM GSSG DEH ábra. Különböző oxidálószerek hatása az ER fehérje oxidációjára 300 μg fehérjének megfelelő patkány máj mikroszómákat inkubáltam 15 percig üres pufferben (fehér oszlopok) illetve 10 mm alamethicin (szürke oszlopok) vagy 50 mm DOCA (fekete oszlopok) jelenlétében 37 C-on. E kezlések után a mintákat inkubáltam üres puffer (kontroll), 100 μm FAD, 5 illetve 50 mm GSSG vagy 50 mm dehidroaszkorbát (DEH) jelenlétében további 30 percig 37 C-on, majd a fehérjéket kicsaptam, és a fehérje tiolok mennyiségét az Anyagok és módszerek fejezetben ismertetett módon mértem. Az ábra három független kísérlet eredményét mutatja, a csillag a szignifikáns eltéréseket jelöli (p < 0.05). Meglepetésünkre a FAD oxidáló hatása a várakozással ellentétben egyáltalán nem érvényesült, hogyha az ER membrán épségét megzavartuk. Az oxidált glutationnál koncentráció-függő eltéréseket találtam: kis, 5 mm-os mennyiségben a 41

43 GSSG nem volt képes oxidálni a lumenális fehérjéket, csak akkor, ha a membrán integritását megzavartuk. Igen nagy, 50 mm-os koncentrációban azonban a GSSG minden körülmények között oxidálni képes volt a fehérjék oxidációjára. A továbbiakban ezt a maximálisan oxidált kontrollok előállításához használtam fel. A dehidroaszkorbát oxidáló hatása a membránok épségétől függetlenül érvényesült. Ez után a kísérletsorozat után további méréseket végeztem, amelyekkel tovább vizsgáltam a membránok szerepét a FAD előidézte fehérje oxidációban. Ekkor az anion transzporter gátló szerrel, DIDS-sel, amely a transzportot. Varsányi és mtsai (164) által bizonyított módon gátolja, illetve ultrahangos kezeléssel próbáltam a FAD bejutását a mikroszómákba gátolni illetve előmozdítani. Ahogy az a ábráról kitűnik, a transzport felfüggesztése, illetve a membrán Fehérje tiol tartalom pmol SH/mg fehérje kontroll DIDS ultrahang ábra. FAD transzport gátlószer illetve ultrahangos kezelés hatása a mikroszómális fehérjék oxidációjára 300 μg fehérjének megfelelő mikroszómát inkubáltam 15 percig 37 C-on anion transzport inhibitor, DIDS (100 μm) jelenlétében vagy anékül, illetve ultrahangos kezelésnek tettem ki 30 másodpercre (35 W-on Sonic 300 dismembrator Farmingdale NY, USA berendezéssel) jégen. E kezlések után a mintákat üres puffer (fehér oszlopok), 50 mm GSSG (szürke oszlopok) vagy 100 μm FAD (fekete oszlopok) jelenlétében inkubáltam további 30 percig. A kezelés végén a fehérjéket kicsaptam és a fehérje tiolok mennyiségét az Anyagok és módszerek fejezetben ismertetett módon mértem. Az eredmények 3 független kísérlet eredményét mutatják, a csillag a szignifikáns eltéréseket jelöli (p < 0,05). 42

44 integritás mechanikai megtörése egyaránt a FAD hatásának megszűnését vonta maga után. Felmerült a kérdés, vajon nem az akadályozza-e a fehérjék oxidációját ez esetben, hogy a mikroszómákban esetleg fennmaradó iongrádiensek, amelyek a folyamatok lejátszódásához szükségesek, kiegyenlítődnek a membránok feldarabolódása nyomán. Ennek megvizsgálására különböző ionofórok hatását teszteltem a FAD fehérje-oxidációs képességére vonatkozóan. Az eredményeket táblázatosan foglaltam össze: kontroll FAD 100 μm nmol SH/mg fehérje kontroll 52,4±3,2 33,6±2,8(*) ionomycin, 10 μm 55,5±3,5 32,1±2,8(*) valinomycin, 2mM 53,7±3,0 33,2±3,4(*) monensin, 50 μm 46,2±5,3 30,2±2,5(*) táblázat Különböző ionofórok hatása a FAD fehérje oxidációjára A kálcium ionofór, ionomycin (10 μm), a kálium ionofór, valinomycin, (2 mm) és a protonionofór, monensin (50 μm) jelenétében inkubáltam a mikroszómákat 15 percig, majd 100 μm FAD jelenlétében vagy anélkül további 30 percig. A kezelés végén a fehérjéket kicsaptam, és a fehérje tiolok mennyiségét az Anyagok és módszerek fejezetben ismertetett módon mértem. Az eredmények három független kísérlet eredményét mutatják, a csillag a szignifikáns eltéréseket jelöli (p < 0,05). Ezek alapján kimondható, hogy a FAD mikroszómális fehérjékre gyakorolt hatása a membrán integritásától függ, annak hiányában az oxidációs folyamat nem megy végbe. Ugyanakkor azt is kimutattam, hogy az oxidáció a mikroszómákban esetlegesen meglévő iongrádiensektől függetlenül zajlik le A FAD hatása az oxidatív fehérjetekerő apparátus elemeire A későbbiekben arra kerestem a választ, mely fehérjék érintettek a korábbi kísérletek során kimért tiol-oxidációban. Az Ero1-L és PDI alkotta redox tekerő komplex tagjai voltak az elsődleges célpontok ebből a szempontból, de megvizsgáltam további, PDI családba tartozó fehérjéket és más ER chaperonokat is, vajon tiolcsoportjaik oxidációt szenvednek-e a FAD hatására. Ennek megvizsgálására a FAD-dal való inkubálás után a fehérjéket egy tiol-specifikus jelölővel, a 4-acetamido-4 -maleimidilstilbén-2,2 -diszulfonsavval (AMS-sel) inkubáltam, amely a szabad tiolcsoportokhoz köt. Ennek a molekulának a kötődése kb. 43

45 0,5 kda-nal növeli a molekula látszólagos méretét és így lassítja a fehérje futását az SDS-PAGE során. Így a redukált fehérje nagyobb, lassabban futó csíkként jelenik meg. A ábrán egy-egy tipikus kísérlet eredménye látható. kontroll FAD DIDS DIDS +FAD Alamethicin Alam. +FAD GSH GSSG Ero1-L PDI ERp72 Redukált Oxidált Redukált Oxidált Redukált Oxidált ábra. FAD hatása az ER fehérjéinek oxidációjára 40 μg fehérjét tartalmazó mikroszómát inkubáltam 15 percig 100 μl 15 mm-os Tris.HCl pufferben (ph 7,2) 37 C-on üres puffer, 100 μm DIDS, vagy 10 mm alamethicin jelenlétében. Ez után 100 μm FAD-ot adtam a mintákhoz, és további 30 percig inkubáltam őket 37 C-on. A mintákat ezután kicsaptam, és mostam az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint. Kontrollként olyan mintákat használtam, amelyekhez 50 mm GSH-t vagy GSSG-t adtam, amely képes a fehérjéket maximálisan redukált, illetve oxidált állapotba hozni. Az AMS-jelölést, a gélelektroforézist és a Western blot vizsgálatot az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint végeztem el. A képek öt kísérlet egyik tipikus képét mutatják. Az ábráról leolvasható, hogy az Ero1-L fehérje a mikroszómákban alapvetően redukált formában található meg. Ezen állapoton 100 μm FAD változtatni képes, az Ero1-L oxidáltabb lesz. Sem az alamethicines, sem a DIDS-sel történő kezelés önmagában nem befolyásolta az Ero1-L oxidációjának mértékét, ugyanakkor a FAD hatását mindkét kezelés felfüggesztette. Hasonló képet láthatunk a PDI esetén is. A PDI családba tartozó ERp72 fehérjére ugyanakkor a FAD kezelés hatástalannak bizonyult. Hasonló képet találtunk calnexinnél, amely egy, a redox tekerésben nem részvevő ER chaperon, amely azonban számos tiolcsoportot tartalmaz. E kísérletekben a kontrollként használt GSHval és GSSG-vel kezelt minták közötti eltérés mutatja a kezelés sikerességét. Ezzel a 44

46 módszerrel tehát kimutattam, hogy a FAD hatása specifikus, és csak bizonyos fehérjéket érintő módon zajlik. A FAD által oxidálódó fehérjék, az Ero1-L és a PDI a szekréciós fehérjék redox tekerésében résztvevő enzimek. Ezáltal valószínűsíthető volt, hogy a FAD nemcsak mint általános oxidálószer, hanem mint a redox tekeredésben részt vevő elektronakceptor is szerepel A PDI gátlásának hatása a FAD előidézte tiol-oxidációra Ennek bebizonyítására olyan kísérleteket terveztem, amelyek a redox tekeredés gátlása mellett vizsgálják a FAD hatását. Mivel az Ero1-L-re nem ismerünk gátlószert, a PDI gátlásához folyamodtunk. A legismertebb és széles körben használt gátlószer a bacitracin. E sokgyűrűs molekula azonban nem membrán-permeábilis, így kezdeti kísérleteim, amelyek során mikroszómát bacitracinnal inkubáltam, majd a FAD hatását mértem, nem vezettek eredményre. A kísérletek egy következő csoportjában a membránok enyhe ultrahangos kezelésével tettem a membránokat átjárhatóvá a bacitracin számára, majd több órás hegedés után FAD-ot adtam a mintákhoz, és vizsgáltam a fehérjék oxidációjának mértékét. A FAD ezúttal is hatott a fehérje oxidációra, ugyanakkor a bacitracinnal kezelt mikroszómákban csökkent mértékű volt a FAD hatása (nem bemutatott adatok). Ezen kísérletek, bár bacitracin hatására csökkent mértékű oxidációt mutattak FAD kezelés után, nem tűntek elég megbízhatónak, lévén az ultrahangos kezelés után nem egyértelmű, hogy a mikroszómák mekkora hányada nyerte vissza eredeti funkcióját. Ezért humán limfóma Jurkat sejteket tenyésztettem, és kezeltem 3 mm bacitracinnal 18 órán keresztül. Ez az időtartam az irodalom szerint elégséges, hogy a sejtek a bacitracint felvegyék, és az eljusson az endoplazmás retikulumig is. Ez után a sejtekből mikroszómát izoláltam az Anyagok és módszerek fejezetben ismertetettek szerint. A mikroszómákat ezek után FAD kezelésnek vetettem alá, és megvizsgáltam az érintett fehérjék oxidáltsági állapotát. Eredményeim azt mutatták, hogy a PDI eleve maximálisan oxidált állapotban van jelen a Jurkat sejtekben. Ezen állapoton FAD adásával sem sikerült változtatni (nem bemutatott eredmények) Ezeket a kísérleteket nem folytattam tehát, és egy újabb modellt állítottam fel, amelyben humán hepatóma HepG2 sejteket kezeltem hasonló módon, remélve, hogy eltérő sejttípusoknál eltérő PDI redox állapot fordulhat elő, és 45

47 hogy a PDI redukáltsági állapota hepatóma sejtekben jobban emlékeztet majd a májsejtben található helyzetre, mint Jurkat limfóma sejtek esetében találtam. A 18 órás bacitracin kezelés hatására a HepG2 sejtek megnyúlt alakot vettek fel, némely sejt felszínen kitüremkedő ( bleb -es) képződmények látszottak, azonban a Trypán-kék kizáráson alapuló életképesség-becsléssel a kezelt és kezeletlen tenyészetek között számottevő eltérés nem volt kimutatható. A HepG2 sejtekből is mikroszómát izoláltam az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint, és kezeltem őket FAD-dal. E sejtekből már sikerült olyan mennyiségű mikroszómát előállítani, hogy a fehérje tiol mérések is elvégezhetőek voltak belőle. A ábrán e kísérletek eredménye látható. Ezeknél a kísérleteknél azért tértem el a szokásos kontrolloktól, mert felmerült a lehetősége annak, hogy a bacitracin kezelés esetleg a glutation hatását is befolyásolja, hiszen a redukált glutation, mint az Ero1-L hatását limitáló ágens merült fel (106). Ezért itt a kémiai módosításhoz, a DTT, illetve a tiol specifikus oxidálószer, a diamid használatához folyamodtam. Az eredményekből kitűnik, hogy a bacitracin kezelés önmagában okozott egy Fehérje tiol tartalom (pmol SH/mg fehérje) * * * 10 0 kontroll FAD diamid DTT ábra. Bacitracin kezelés hatása a FAD okozta tiol oxidációra HepG2 sejteken 200 μg fehérjét tartalmazó, bacitracin nélkül (fehér oszlopok) illetve 3 mm bacitracin jelenlétében (fekete oszlopok) inkubált HepG2 mikroszómát inkubáltam 100 μm FADjelenlétében, vagy anélkül, 30 percig 37 C-on. A mintákat ezután kicsaptam, és mostam az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint. Kontrollként 5 mm DTT-t vagy 5 mm diamidot adtam. Az inkubáció végén a fehérjéket kicsaptam és a szabad tioltartalmat mértem az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint. A csillag a szignifikáns eltérést jelöli (p<0,05). 46

48 kis eltolódást a redukált tiolcsoportok irányába, (feltehetően a 18 órás inkubáció alatt a szintetizált fehérjék egy része nem tudott betekeredni), illetve, hogy a bacitracin kezelt sejtekből származó mikroszómán a FAD hatástalan maradt. Ez a kísérlet tehát azt mutatja, a FAD az Ero1-L/PDI-komplexen keresztül fejti ki hatását. Mivel a FAD hatását a bacitracinos kezelés teljesen visszaszorította, úgy tűnik, a FAD hatása kizárólag a PDI-n azaz az Ero1-L/PDI rendszeren keresztül érvényesül. Ezután azt szerettem volna látni, mi történik a fent említett redox tekerésben részt vevő fehérjék oxidáltsági állapotával bacitracin és FAD kombinált kezelés hatására. Ennek érdekében a mikroszómális fehérjéket AMS-jelöléssel láttam el az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint, hogy a két legfontosabb redox tekerő fehérjét, az Ero1-L-et és a PDI-t megvizsgáljam, hogyan változott redox állapotuk a kezelések alatt. kontroll FAD DIDS + FAD kontroll FAD DIDS+ FAD DTT diamid kontroll sejtek bacitracin kezelt sejtek Ero1-L PDI Redukált Oxidált Redukált Oxidált ábra. Bacitracin kezelés hatása a FAD okozta fehérje oxidációra HepG2 sejteken 40 μg fehérjét tartalmazó, bacitracin nélkül, illetve 3 mm bacitracin jelenlétében inkubált HepG2 mikroszómát-inkubáltam 100 μm FAD, 100 μm FAD és DIDS-jelenlétében vagy anélkül, 30 percig 37 C-on. A mintákat ezután kicsaptam, és mostam az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint. Kontrollként 5 mm DTT-t illetve 5 mm diamidot adtam. Az AMS jelölést, a gélelektroforézist és a Western blot vizsgálatot az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint végeztem el. A anti-ero1-l, illetve anti-pdi antitesttel jelöltem. A képek három hasonló kísérlet egyikének képét mutatják. 47

49 A ábra azt mutatja be, milyen redox változások történtek a specifikus fehérjék szintjén. Ahogy az ábráról leolvasható, Ero1-L esetén a FAD oxidáló hatása a bacitracin kezelt sejteken éppúgy érvényesült, mint a kontroll sejteken. Ezt a hatást mindkét sejtpopuláción a DIDS felfüggesztette. A PDI esetén már más képet látunk: a bacitracin kezelés hatására felhalmozódott a redukált PDI mennyisége. Itt a bacitracinos kezelés a FAD oxidáló hatását kivédte, így ezeken a sejteken a DIDS-sel való gátlás már további csökkenést nem eredményezett. A bacitracin kezelés tehát nem akadályozza meg, hogy a FAD az Ero1-L-től elektronokat vegyen át, azonban gátolja azt, hogy az elektonok a PDI-ről az Ero1-L-re vándoroljanak, ezen a módon megakadályozva a PDI visszaoxidálódását, és ennek következtében a lumenális fehérjék oxidálódását. 48

50 5.2 Az alfa1-antitripszin aggregáció okozta változások az endoplazmás retikulumban 2002 őszén kaptuk meg azt a hat PIZ11.03 egeret Houstonból (John Rodgers laboratóriumából), amelyek leszármazottai későbbi kísérleteink alanyait képezték. Ezek az egerek heterozigóta hordozói voltak a humán Z mutációjú alfa1- antitripszinnek, amelyet PiZ néven (Z típusú proteináz inhibitor) is gyakran találunk meg a szakirodalomban. Én is ezt a rövidítést fogom használni, csak abban az esetben térek el ettől, ha a vizsgált fehérje mutáns vagy nem mutáns volta nem tisztázott, ilyenkor a normál fehérjére használt, AAT jelölést fogom használni A PiZ egerek A PiZ-expresszáló egerekkel való kísérleteim első lépése az utódok genetikai jellemzése volt. Ezt 5 hetes korban, farok DNS minta vizsgálatával végeztem, humán AAT-re specifikus primerek használatával. Ez a konstrukció a humán AAT gén egy 300 bázispár hosszúságú szakaszát sokszorosítja. Egy tipikus kísérlet eredményét mutatom be a ábrán. Transzgén Transzgén Transzgén Kontroll Humán Deszt. víz Marker ábra. haat PCR eredménye 1 pg DNS-t tartalmazó mintát amplifikáltunk az Anyagok és módszerek fejezetben feltüntetett módon, majd 2%-os agaróz gélben futtattuk. Etídium-bromidos festés után a láthatóvá vált csíkokat Gel-Doc rendszeren rögzítettük. A Transzgén megjelöléssel a PiZ expresszáló egerekből származó mintákat, Kontrollal a kontroll egerekből származó, Humánnal a humán pozitív kontroll mintát jelöltem. Deszt. víz a DNS mintát nem, csak desztillált vizet tartalmazó kontrollt, Marker a molekulasúly-markert jelöli. A PCR eredményét 2%-os agaróz gélen futtattam meg, és etídium-bromiddal tettem láthatóvá. A kísérletet minden állaton elvégeztem, itt egy tipikus képet mutatok be. 49

51 Mint látható, az amplifikáció sikeres volt, és a PiZ gént hordozó és nem hordozó állatok elkülöníthetőek voltak, mivel a primerek nem kötöttek az egerek AAT génjéhez. Mivel ez a módszer nem alkalmas arra, hogy a homo-és heterozigóta transzgén egereket elkülönítsük, az mrns és a fehérjeszinteket is megvizsgáltuk az állatokból. A reverz-transzkripciót követően a mintákat amplifikáltam, és az eredményt Southern blot-on tettem láthatóvá. Egy ilyen kísérlet eredménye látható a ábrán. Marker 1. aktin 2. aktin 3. aktin Deszt.víz 1. AAT 2. AAT 3. AAT Vad típus Marker ábra. PiZ mrns szintek meghatározása egerekből Az egerek májából RNS-t izoláltam az Anyagok és módszerek fejezetben leírtaknak megfelelően, majd reverz transzkripcióval cdns-t készítettem belőlük. A mintákat PCR segítségével amplifikáltam, és az eredményt 2%-os agaróz gélben megfuttatva etídiumbromidos festéssel tettem láthatóvá. Az ábrán aktin primerrel (2.-4. sáv), illetve AAT primerrel (6.-8. sáv) történő amplifikáció eredménye látható, desztillált víz és vad típusú egér kontrollja mellett. A kísérletet minden állaton elvégeztem, az itt bemutatott kép tipikusnak tekinthető. Az aktin primerekkel történő amplifikáció mutatta az RNS izolálás, illetve a reverz transzkripció sikerességét. Az itt bemutatott ábrán az 1. számmal jelölt egér nem hordozója, míg a 2 és 3. számmal jelölt egér hordozója a humán AAT génnek. A 2. mintában egy aspecifikus termék is látható 600 bázispár magasságban, amely több mintában is előfordult, magyarázata nem ismert, érdekemes azonban megjegyezni, hogy ez a termék csak transzgénikus állatokban található meg. 50

52 Az RNS szintekben nem találtam eltérést homo-és heterozigóta állatok között, megvizsgáltam tehát a jelenséget a fehérjék szintjén is Western blottal: e kísérlet eredménye látható a ábrán. Vad típus Kontroll Kontroll Transzgén Transzgén Transzgén AAT ábra. haat fehérje szintje egerekben A vizsgált egerekből származó, 40 μg összfehérjét tartalmazó májhomogenátum mintákat vittem fel 9 %-os redukáló SDS PAGE-ra, amelyet az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint készítettem. Kontrollként fehér egérből származó mintát és humán szérumot használtam. A Western blot vizsgálatot az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint végeztem el. A képek 3 hasonló kísérlet egyikének képét mutatják. Az ábra tanúsága szerint az általunk használt, humán AAT antitest nem specifikus, a normál egerekben is jelet ad. Az ábrán jól látható, hogy transzgén egerekben az AAT mennyisége jóval nagyobb, mint kontroll egerekben. Az ábra szerint az általunk használt antitest (és az általunk kipróbált összes, haat-ellen szintetizált elsődleges antitest) felismeri az egerek saját alfa1-antitripszinjét is. Ezt a tényt, hogy a specifikusnak állított antitest mégis felismeri az egérből származó fehérjét is, később az immunprecipitációs kísérleteink során előnyünkre fordítottuk. Az mrns és fehérje szintekkel végzett kísérleteim azt mutatták, hogy a homoés heterozigóta PiZ hordozó egerek expressziós szintjeiben nincs lényeges eltérés. Ezután minden, PiZ gént hordozó egeret transzgén -ként vontam be a kísérletekbe A PiZ egerek stresszfehérje szintjei A betegség hátterének feltárásához első lépésben a stresszfehérjék indukciójára voltam kíváncsi. Mivel a PiZ fehérje az irodalmi adatok tanúsága szerint az endoplazmás retikulumban halmozódik fel, elsősorban az ER stresszfehérjéinek szintjére voltam kíváncsi. Elsőként egy olyan antitestet használtam, amely a KDEL szekvenciára specifikus. Ez a szekvencia az ER fehérjéinek C terminálisán 51

53 elhelyezkedő szignál, amely a fehérje ER-beli retenciójáért felelős. Az antitest, amelyet használtam, a Grp94, Grp78 és PDI fehérjéket ismeri fel. A kísérletek eredménye a ábrán látható. Ktr Ktr PiZ PiZ Grp94 Grp78 PDI ábra. KDEL antitesttel történő Western blot eredménye A vizsgált egerekből származó, 40 μg összfehérjét tartalmazó mikroszóma mintákat vittem fel 9%-os redukáló SDS PAGE-ra, amelyet az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint készítettem. A Western blot vizsgálatot az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint végeztem el, elsődleges antitestként anti-kdel antitestet használtam. Ktr: PiZ-n nem expresszáló kontroll egér, PiZ: transzgén egér. A képek 3 hasonló kísérlet egyikének képét mutatják. Az ábráról leolvasható, hogy a KDEL-antitesttel előhívódó három fehérje (Grp94, Grp78 és PDI) szintjében a kontroll és transzgén egerek között nincs különbség. A meglepő eredmény miatt a kísérleteket megismételtem az egyes fehérjékre specifikus antitestek segítségével is, ennek eredménye a ábrán látható. A különböző genetikai hátterű egerek alap-szintézise egy-egy fehérjére nagymértékben eltérő lehet, ezért ezekben az ismételt kísérletekben egy eltérő genetikai hátterű, kültenyésztett CD1 típusú egérből származó mintát is használtam kontrollként. Az ábrán látható, hogy ezek az antitestek is hasonló mintázatot mutatnak, mint a KDEL-el történő előhívás. Az ábráról kitűnik, hogy az általunk vizsgált, beltenyésztett BL/C5 egerek és a kültenyésztett CD1 egerek között nincs eltérés a vizsgált fehérjék szintjét illetően. Az anti-grp78 antitesttel történő előhívás többszörös sávokat eredményezett. Ezt a jelenséget mások is megfigyelték ennél az antitestnél (68), az aspecifikus 52

54 Grp94 Grp78 PDI ábra. Endoplazmás retikulum chaperonok szintje A vizsgált egerekből származó, 40 μg összfehérjét tartalmazó májhomogenátum mintákat vittem fel 9%-os redukáló SDS PAGE-ra, amelyet az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint készítettem. A Western blot vizsgálatot az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint végeztem el, a fehérjék jelölésére anti-grp94, anti-grp78 és anti-pdi antitestet használtam Ktr a kontroll, PiZ a transzgénikus egerekből származó mintákat jelöli, a CD1 az eltérő genetikai hátterű, kültenyésztett egérből származó mintákat jelzi. Az ábra 3 hasonló, független kísérlet egyikének képét mutatja. jel beazonosítása további vizsgálatokat igényel. Mivel az AAT tekeredése során glikozilálódik, érdemesnek tűnt megvizsgálni a glikozilált fehérjék tekerésének kulcs-chaperonja, a calnexin szintjét is. A fenti módon elkészített membránt tehát előhívtam calnexin antitesttel is, ennek eredményét mutatja a ábra. Az ábra azt bizonyítja, hogy calnexin esetén sem tapasztalható indukció PiZ transzgén egerekben a kontroll egerekhez képest, továbbá, hogy az általunk használt és a CD1 egerek calnexin szintje között észlelhető eltérés nincs. Ktr Ktr PiZ PiZ CD1 Ktr Ktr PiZ PiZ CD1 Calnexin ábra. A calnexin mennyisége kontroll és PiZ egerekben A vizsgált egerekből származó, 40 μg összfehérjét tartalmazó májhomogenátum mintákat vittem fel 9%-os redukáló SDS PAGE-ra, amelyet az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint készítettem. A Western blot vizsgálatot az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint végeztem el, a fehérjék jelölésésre anti-calnexin antitestet használtam. Ktr a kontroll, PiZ a transzgénikus egerekből származó mintákat jelöli, a CD1 az eltérő genetikai hátterű, kültenyésztett egérből származó mintákat jelzi. Az ábra 3 hasonló de független kísérlet egyikének a képét mutatja. 53

55 Ezek alapján tehát úgy tűnt, a mutáns AAT felhalmozódása az egerekben nem okoz stresszválaszt az endoplazmás retikulumban. Hogy a fehérje aggregáció mégis befolyásolja a máj működését, nyilvánvaló volt abból, hogy az egerek mája, hasonlóképpen az emberben megjelenő tünetekhez, elfajul, könnyebben válik daganatos elváltozások alanyává (53), illetve, hogy az egerek kevésbé bírják az éhezést, mint vad típusú társaik (156). Ezért tovább kerestük a stressz jeleit a májsejteken. A citoplazmatikus chaperonok vizsgálata volt a következő lépés, lévén, hogy számos, fehérjeaggregációs betegségben ezen chaperonok valamelyike indukáltnak bizonyult (5, 42). Első lépésként megvizsgáltuk a két legfontosabb citoplazmatikus chaperon, a Hsp90 és a Hsp70 szintjét az egerekből származó májhomogenátum mintákon. A kísérletek eredményét a ábrán mutatom be. Ktr Ktr PiZ PiZ CD1 Hsp90 Hsp ábra. Citoplazmatikus chaperonok szintje A vizsgált egerekből származó, 10 μg összfehérjét tartalmazó májhomogenátum mintákat vittem fel 6%-os redukáló SDS PAGE-ra, amelyet az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint készítettem. A Western blot vizsgálatot az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint végeztem el, a fehérjék jelölésésre anti-hsp90 és anti-hsp70 antitestet használtam. Ktr a kontroll, PiZ a transzgénikus egerekből származó mintákat jelöli, a CD1 az eltérő genetikai hátterű, kültenyésztett egérből származó mintákat jelzi. Az ábra 3 hasonló de független kísérlet egyikének képét mutatja. Vizsgálataim azt bizonyították, hogy az endoplazmás retikulum chaperonjaival szemben, a citoplazma két legfontosabb chaperonja indukálódott PiZ transzgén egerekben. A Hsp90 szintje megemelkedett, és a Hsp70 indukálható formája (Hsp72, alsó sáv az ábrán) is magasabb. A PiZ transzgén egerekben tehát, annak ellenére, hogy a mutáns fehérje az endoplazmás retikulumban halmozódik fel, a stresszfehérjék indukciója a citoplazmában fedezhető fel. 54

56 5.2.3 A PiZ egerek redox viszonyai Mivel diabéteszben és az AAT-től eltérő fehérjeaggregációs betegségekben is számos adat mutat arra, hogy oxidatív elváltozások, és oxidatív stressz is közrejátszik a betegségek kialakulásában (114, 135), érdemesnek tűnt megvizsgálni, milyen redox állapotok uralkodnak az adott sejtkompartimentumokban. Ennek vizsgálatára olyan méréseket végeztem, amelyben az endoplazmás retikulum és a citoplazma redox paramétereit külön-külön vizsgáltam. A mérésekhez szükséges módszerek elsajátításáért Dr. Jakus Juditnak és Dr. Stadler Krisztiánnak tartozom köszönettel. Elsőként a mikroszóma preparátumokat vizsgáltam meg: A redox paraméterek közül a leggyakrabban vizsgált és legegyszerűbben mérhető a szabad tiolcsoportok mennyisége. A redox egyensúly fontos indikátorának tartják továbbá a glutation mennyiségét, amely számos stresszes állapotban megemelkedik. A redukált és oxidált glutation aránya pedig alapvető mutatója az adott sejtkompartimentum redox állapotának. Ezeknek a méréseknek az eredményét a es táblázatban foglaltam össze: kontroll PiZ nmol/mg protein fehérje tiol 122 ± 17,7 156 ± 34,6 össz GSH 16,3 ± 2,5 32 ± 1,5 (*) GSH/GSSG 1,22 ± 0, ± 0,1 (*) táblázat. Az ER redox paraméterei A szabad tiol tartalom méréséhez a 300 ug fehérjét tartalmazó mikroszóma mintákat 50 mm Tris.HCl-ben vettem fel, (ph 7,2), majd 10% TCA-val kicsaptam, háromszori acetonos mosás után visszaoldottam 50 mm Tris.HCl pufferben, amely 8 M ureát és 2% SDS-t tartalmazott (ph 6,8). A szabad tiolcsoportok mennyiségét Ellman módszere szerint mértem az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint. Az összes glutation (GSH) meghatározásához a 100 μg fehérjét tartalmazó mintákat inkubáltam 30 percig 37 C-on 24 µl 50 mm Tris.HCl pufferben (ph 7,2), amely 2 µl NADPH oldatot és 1 U glutation reduktázt tartalmazott. Az inkubáció végén 5% TCA-val kicsaptam a fehérjéket, majd centrifugálás után a felülúszóból Ellman módszere szerint határoztam meg a redukált tiol mennyiségét. GSH/GSSG arányt a redukált és az összes GSH mennyiségéből kalkuláltam. Az adatok 3 független kísérlet eredményének átlagát és szórását mutatják, 3-3 egér felhasználásával. A csillag a szignifikánsan eltérő adatokat jelöli (p < 0,05). 55

57 Ahogy az a táblázatból kitűnik, annak ellenére, hogy stresszfehérje indukciót nem találtam az endoplazmás retikulumban, a redox paraméterek eltolódást mutatnak PiZ transzgén egerekben a kontroll egerekhez képest. Bár a szabad tiolcsoportok menyisége közötti eltérés nem mutatkozott szignifikánsnak, a megemelkedett glutation mennyiség, és a redukált irányba eltolódott, emelkedett GSH/GSSG arány is azt mutatja, hogy a redox státusza a transzgén egerek májából származó mikroszómáknak megváltozott. Ez hasonló képet mutat a streptozotocin indukálta diabéteszben találtakkal (114). Ez után megvizsgáltam a citoplazma hasonló redox mutatóit, hogy megtudjam, van-e oxidatív stressz, avagy redox eltolódás ebben a sejtkompartimentumban is. A táblázat foglalja össze a mérések eredményeit: kontroll PiZ nmol/mg protein Protein tiol 122 ± 12,5 118 ± 19,7 össz GSH 103 ± 17,7 114 ± 34,6 GSH/GSSG 72 ± ± táblázat A citoplazma redox paraméterei A szabad tiol tartalom méréséhez a 150 µg fehérjét tartalmazó citoplazma mintákat 50 mm Tris.HCl-ben vettem fel, (ph 7,2), majd 10% TCA-val kicsaptam, háromszori acetonos mosás után visszaoldottam 50 mm Tris.HCl pufferben, amely 8 M ureát és 2% SDS-t tartalmazott (ph 6,8). A szabad tiolcsoportok mennyiségét Ellman módszere szerint mértem az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint. Az összes glutation (GSH) meghatározásához a 100 μg fehérjét tartalmazó mintákat inkubáltam 30 percig 37 C-on 24 µl 50 mm Tris.HCl pufferben (ph 7,2), amely 2 µl NADPH oldatot és 1 U glutathion reduktázt tartalmazott. Az inkubáció végén 5% TCA-val kicsaptam a fehérjéket, majd centrifugálás után a felülúszóból Ellman módszere szerint határoztam meg a redukált tiol mennyiségét. GSH/GSSG arányt a redukált és az összes GSH mennyiségéből kalkuláltam. Az adatok három független kísérlet eredményének átlagát és szórását mutatják, 3-3 egér felhasználásával. Mint látható, a redox eltérések nem voltak kimutathatóak a citoplazmatikus környezetből. Ugyanakkor a glutation mennyiségének nem szignifikáns emelkedése és a GSH/GSSG arány nem szignifikáns mértékű, oxidáltabb irányba való elmozdulása arra utal, hogy a citoplazma redox állapota, ha gyengén is, de érintve van az AAT aggregációja által okozott stresszben. Ez a tendencia jellegű változás egybecseng a korábban talált stresszfehérje-indukcióval is. 56

58 Mivel a redox mérések nem adtak egyértelmű választ a citoplazma redox állapotát illetően, megvizsgáltam néhány, a redox egyensúly kialakításában, illetve helyrehozásában fontos citoplazmatikus enzim szintjét is. A tioredoxin szerepe összetett és kulcsfontosságú mind a redox egyensúly, mind a stresszválasz kialakítása és összehangolása tekintetében, indukciója a legkülönbözőbb stressztípusok esetén észlelhető (68), ezért ezen enzim vizsgálata tűnt a leginkább indokoltnak. A másik enzim, amelyet vizsgálatom tárgyául választottam, a MsrA, a metionin szulfoxid reduktáz A, amely a szulfonsavvá oxidálódott, denaturálódott metioninokat képes visszaalakítani, helyrehozva ezzel az oxidatív stressz okozta károkat (168). Mindkét fehérjét Western blot segítségével azonosítottam. A kísérletek eredményét a ábrán mutatom be: Ktr Ktr PiZ PiZ CD1 Trx MsrA ábra. A citoplazmatikus redox enzimek szintje A vizsgált egerekből származó, 20 μg összfehérjét tartalmazó májhomogenátum mintákat 12%-os redukáló SDS PAGE-ra vittem fel. A Western blot vizsgálatot az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint végeztem el, a fehérjék jelölésére anti-tioredoxin és anti- MsrA antitestet használtam. Ktr a kontroll, PiZ a transzgénikus egerekből származó mintákat jelöli, a CD1 vad típusú egérből származó mintákat jelzi. Trx : tioredoxin, MsrA : methionin-szulfoxid reduktáz A fehérje. Az ábra öt hasonló, de független kísérlet egyikének képét mutatja. Mindkét enzim esetén markáns emelkedést találtunk a PiZ transzgén egerek májából származó citoplazmában a kontroll egerekéhez képest. Ez az indukáltság arra utal, hogy a citoplazma olyan stressznek van kitéve a PiZ egerek májában, amely a redox rendszereket is érinti. Itt szeretném megemlíteni, hogy a citoplazmatikus redox enzimek, illetve redox egyensúlyok mérésében laborunk diákkörös hallgatója, Korcsmáros Tamás is részt vett. Az ő mérései alapján a citoplazmatikus tioredoxin reduktáz aktivitás csökkent mértékű a transzgén állatokban a kontroll állatokhoz képest, hasonlóképpen a diabétesz esetén talált eltérésekhez (nem bemutatott adatok). 57

59 5.2.4 Chaperon komplexek PiZ egerekben A következőkben arra voltam kíváncsi, hogy a mutáns AAT a chaperonok szelekív elvonásával, kicsapdázásával idézi-e elő azokat a káros következményeket, amelyek mechanizmusára a választ kerestük. Ennek felderítésére immunprecipitációs módszert állítottunk be Száraz Péter szakdolgozómmal közösen, amelynek segítségével az AAT illetve a chaperonok kölcsönhatásait vizsgáltuk meg. A módszer lényege, hogy különböző antitestek segítségével a mikroszómából kihalásszuk a keresett fehérjét és megvizsgáljuk, milyen további fehérjéket hoz magával, tehát melyekkel áll olyan szoros kölcsönhatásban, hogy a precipitáció lépései során sem bomlik fel a kapcsolatuk. Az első lépés a módszer beállításában az volt, hogy lássuk, az immunprecipitáció hatékonyan működik-e és szelektív módon emeli ki az AAT-t és a vele kölcsönható fehérjéket. Ennek érdekében az immunprecipitáció eredményét AAT-re hívtuk elő. Ezek eredménye látható a ábrán. PiZ prec PiZ sup Ktr prec Ktr sup AAT ábra. Alfa1- antitripszin (AAT) immunprecipitáció hatékonyságának ellenőrzése Az Anyagok és módszerek fejezetben leírt módon egér IgG-től megtisztított mikroszóma mintákból 50 µg fehérjetartalmú adagot a Sepharose-A gyöngy és anti-aat antitest elegy mosott precipitátumával mértünk össze, és tovább inkubáltuk 2 órán keresztül. A felülúszót eltávolítottuk, a precipitátumot mostuk, majd a kapott mintákat denaturáló mintafelvivő oldattal kevertük, forraltuk, majd gélelektroforézisre vittük az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint. A membránt HRP-vel jelölt anti-humán AAT elsődleges antitesttel hívtuk elő. PiZ prec : AAT immunprecipitátum transzgén egerekből, PiZ sup az immunprecipitátum felülúszója transzgén egerekből. Ktr prec : AAT immunprecipitátum kontroll egerekből, Ktr sup az immunprecipitátum felülúszója kontroll egerekből. Az ábra öt hasonló de független kísérlet egyikének eredményét mutatja be. 58

60 Az ábrán megjelenő 55 kda-os fehérje csík a mutáns AAT-t jelenti, amely markánsan jelentkezik a transzgén állatokból származó mintákban. Kontroll kísérleteink azt is bizonyították, hogy a Sepharose-A önmagában, antitest nélkül nem kötötte az AAT-t, így az általunk kiemelt fehérje specifikus antigén-antitest kölcsönhatás eredménye (nem bemutatott eredmények). További kísérleteinkben a precipitáció eredményeként kapott mintákat minden alkalommal megvizsgáltuk AATre hogy meggyőződjünk, a precipitáció sikeres és specifikus volt-e. Az első kísérletek során arra kerestük a választ, mely chaperonokkal együttesen fordul elő a mutáns AAT. A precipitálás és elektroforézis után ezért különböző antitestekkel végeztünk Western blot vizsgálatot. Kezdetként ismét az ER retenciós szignál ellenes anti-kdel antitestet választottuk, hogy egyszerre több ER chaperont tudjuk vizsgálni. Ennek a kísérletnek az eredménye látható a ábrán. Ktr sup Ktr prec Piz sup PiZ prec Grp94 Grp78 PDI ábra. Anti humán AAT antitesttel történő immunoprecipitáció eredménye anti-kdel antitesttel előhívva A mikroszóma mintákat a ábra aláírásában leírt módon kezeltük, humán AAT elleni antitesttel dekorált Sepharose-A gyöngyökkel inkubáltuk az Anyagok és módszerek fejezetben ismertetett módon, a mintákat mostuk, majd a felülúszó eltávolítása után a gyöngyökről a precipitátumot leoldottuk. A precipitátumot és a felülúszót külön-külön denaturáló mintafelvivő oldattal kevertük, forraltuk, majd gélelektroforézisre vittük az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint. A nitrocellulóz membránra transzferált fehérjéket anti-kdel antitesttel jelöltük. sup a szupernatánst, prec az immunoprecipitátumot jelöli ugyanabból a mintából. Az ábra három hasonló, de független kísérlet egyikének eredményét mutatja be. 59

61 Az ábráról kitűnik, hogy a KDEL antitesttel csak egyetlen fehérje, a PDI volt kimutatható a precipitátumból. Sem a Grp94, sem a Grp78 nem mutatott kötődést az AAT fehérjékhez. A PDI viszont mindkét mintában, a kontroll és a transzgén egerekből származó mikroszómák precipitátumából is kimutatható volt. A transzgén egerekből nagyobb mennyiségben lehetett PDI-t találni az AAT-vel közös komplexben. Ez arra utal, hogy a PDI az egészséges egér AAT fehérjéjének betekerésében is részt vesz. Ez érdekes megfigyelés, hiszen a PDI elsődleges funkciója az oxidoreduktáz aktivitás, viszont az AAT fehérjében nincsenek diszulfidhidak. Tudjuk azonban, hogy a PDI chaperon funkciója is igen jelentős az endoplazmás retikulumban, a monomerek oldható formában tartása és a tekeredési hibás fehérjék retrográd transzportra majd proteaszómális lebontásra kerülése is a feladatai közé tartozik (55). A kísérletet megismételtük anti-pdi antitesttel is, ennek az eredményét mutatom be a ábrán. PiZ sup PiZ prec Ktr prec Ktr sup PDI ábra. Anti-humán AAT antitesttel történő immunoprecipitáció eredménye anti-pdi antitesttel előhívva A mikroszóma mintákat a ábra aláírásában leírt módon kezeltük, humán AAT elleni antitesttel dekorált Sepharose-A gyöngyökkel inkubáltuk az Anyagok és módszerek fejezetben ismertetett módon, a mintákat mostuk, majd a felülúszó eltávolítása után a gyöngyökről a precipitátumot leoldottuk. A precipitátumot és a felülúszót külön-külön denaturáló mintafelvivő oldattal kevertük, forraltuk, majd gélelektroforézisre vittük az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint. A nitrocellulóz membránra transzferált fehérjéket anti-pdi antitesttel jelöltük. sup a szupernatánst, prec az immunoprecipitátumot jelöli ugyanabból a mintából. Az ábra három hasonló, de független kísérlet egyikének eredményét mutatja be. Amint az az ábrán látható, a specifikus, PDI antitesttel történő előhívás is hasonló eredményt produkált. A precipitátumokban itt is (2. és 3. sáv) megjelenik a 60

62 PDI. Itt az előző kísérletnél még sokkal markánsabban megmutatkozik, hogy a PDI jóval nagyobb mértékben van jelen a PiZ transzgén egérből származó minták precipitátumában. Ez tehát azt jelentheti, hogy a PDI, mivel indukciója nem volt kimutatható PiZ transzgén egerekben, kisebb arányban köt a normál fehérjékhez PiZ transzgén egerekben, mint kontroll társaikban. A ábrán látható, hogy a PDI futásában eltérés mutatkozott a szupernatáns és a precipitátum esetén. Ez több kísérletben is megmutatkozott. Az eltérés magyarázata talán a nagyban eltérő fehérjekoncentráció lehet, hiszen a szupernatáns majdnem a teljes mikroszóma tartalmát jelenti, míg a precipitátum csak néhány fehérjét tartalmaz. Hasonló kísérleteket végeztünk specifikus Grp78 és Grp94 antitestek felhasználásával is, amelyek, a KDEL antitesttel előhívott képekhez hasonlóan, nem mutattak kötődést a minták precipitátumában (nem bemutatott eredmények). Megvizsgáltuk a PDI családba tartozó ERp72-t és a glikozilált fehérjék tekeredésében részt vevő calnexin-t is, hogy kimutathatóak-e a PiZ fehérjeaggregátumokkal kölcsönhatásban. E kísérletek eredménye látható a ábrán. PiZ Sup PiZ Prec Ktr Sup Ktr Prec calnexin ERp ábra. Anti humán AAT antitesttel történő immunoprecipitáció eredménye anti-erp72 illetve anti-calnexin antitesttel előhívva A mikroszóma mintákat a fent leírt módon kezeltük, humán AAT elleni antitesttel dekorált Sepharose-A gyöngyökkel inkubáltuk az Anyagok és módszerek fejezetben ismertetett módon, a mintákat mostuk, majd a felülúszó eltávolítása után a gyöngyökről a precipitátumot leoldottuk. A precipitátumot és a felülúszót külön-külön denaturáló mintafelvivő oldattal kevertük, forraltuk, majd gélelektroforézisre vittük az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint. A nitrocellulóz membránra transzferált fehérjéket anti- Erp72 illetve anti-calnexin antitesttel jelöltük. sup a szupernatánst, prec az immunoprecipitátumot jelöli ugyanabból a mintából Az ábra három hasonló, de független kísérlet egyikének az eredményét mutatja be. 61

63 Sem az ERp72, sem a calnexin nem volt kimutatható a precipitátumokból, akár a PiZ transzgén, akár a kontroll mintákat tekintve. Mivel az AAT fehérjével kötésben csak a PDI-t tudtuk kimutatni (megjegyzendő azonban, ez nem jelenti azt, hogy a többi chaperon nem köt hozzá, csupán a kötés esetleg nem elég erős affinitású ahhoz, hogy ezen a módon kimutatható legyen), továbbléptünk, és azt vizsgáltuk, hogyan érinti ez a kötődés a PDI más fehérjékkel való kapcsolatát. Mivel a PDI szubsztrátspecificitása nagyon széles, ugyanakkor affinitása az egyes fehérjékhez alacsony, annak vizsgálata, hogy milyen mértékben kötődik egyegy fehérjéhez egyelőre megoldatlan probléma. Ezért azt vizsgáltuk meg, hogy a más chaperonokkal való kölcsönhatása hogyan alakul. Tudvalevő, hogy a chaperonok komplexeket alkotnak, amelyek összetétele eltérő annak funkciójától függően. A Sepharose-A gyöngyöket ezért ezúttal anti-pdi antitesttel dekoráltuk, és az immunprecipitációt így végeztük el. A ábrán azt mutatom be, hogy milyen fehérjék kötődtek a PDI-hez: Ktr sup Ktr prec PiZ sup PiZ prec AAT Grp ábra. Anti-PDI antitesttel történő immunoprecipitáció eredménye anti-aat és anti-grp94 antitesttel előhívva A mikroszóma mintákat a ábra aláírásában leírt módon kezeltük, egér PDI elleni antitesttel dekorált Sepharose-A gyöngyökkel inkubáltuk az Anyagok és módszerek fejezetben ismertetett módon, a mintákat mostuk, majd a felülúszó eltávolítása után a gyöngyökről a precipitátumot leoldottuk. A precipitátumot és a felülúszót külön-külön denaturáló mintafelvivő oldattal kevertük, forraltuk, majd gélelektroforézisre vittük az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint. A nitrocellulóz membránra transzferált fehérjéket anti-grp94 illetve anti-aat antitesttel jelöltük. sup a szupernatánst, prec az immunoprecipitátumot jelöli ugyanabból a mintából. Az ábra 3 hasonló, de független kísérlet egyikének eredményét mutatja be. 62

64 Először ellenőrzésként azt néztük meg, ha PDI antitestet használunk a precipitációra, kimutatható-e az alfa1-antitripszin vele kölcsönhatásban. A precipitátumokban, a várakozásnak megfelelően, nagy mennyiségben találtunk a PDIhez kötött AAT fehérjét. Ez tehát azt jelentette, hogy a PDI valóban köt az AAT-hez, továbbá azt is, hogy legalább részben úgy helyezkedik el az AAT-vel alkotott komplexben, hogy a PDI antitest számára hozzáférhető marad. E megfigyelés azért fontos, mert az AAT jelentős része aggregált formában lehet jelen, ahol a PDI felszíni megjelenése nem nyilvánvaló. A második előhívás Grp94 antitesttel történt, amely mind a felülúszóban, mind a precipitátumban kimutatható volt. Ez tehát azt mutatja, hogy a Grp94 egy része a PDI-hez kötött állapotban van. Azonban nem mutatkozott különbség a kontroll és a transzgén egerek Grp94 eloszlása között, ami azt sugallja, hogy a PDI-vel kiemelhető Grp94, tehát a PDI-Grp94 komplex csak az egér saját alfa1-antitripszinjével van kölcsönhatásban. Ezért újabb szemszögből vettük vizsgálat alá a mintáinkat: Grp94 fehérjére immunoprecipitáltunk, hogy a Grp94 kölcsönhatásait és partnereit vizsgáljuk meg. A chaperonok detektálására elsőként ismét az anti-kdel antitestet használtunk. PiZ sup PiZ prec Ktr sup Ktr prec Grp94 Grp78 PDI ábra. Anti -Grp94 antitesttel történő immunoprecipitáció eredménye anti- KDEL antitesttel előhívva A mikroszóma mintákat a ábra aláírásában leírt módon kezeltük, egér Grp94 elleni antitesttel dekorált Sepharose-A gyöngyökkel inkubáltuk az Anyagok és módszerek fejezetben ismertetett módon, a mintákat mostuk, majd a felülúszó eltávolítása után a gyöngyökről a precipitátumot leoldottuk. A precipitátumot és a felülúszót külön-külön denaturáló mintafelvivő oldattal kevertük, forraltuk, majd gélelektroforézisre vittük az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint. A nitrocellulóz membránra transzferált fehérjéket anti-aat antitesttel jelöltük. sup a felülúszót, prec a precipitált mintákat jelöli. Az ábra 3 hasonló, de független kísérlet egyikének eredményét mutatja be. 63