Gyógyszerhatástani és Biofarmáciai Intézet, Szegedi Tudományegyetem, Gyógyszerésztudományi Kar Kísérletes diabetes mellitus hatása a patkány uterus adrenerg funkcióira Ph.D. tézis öszefoglaló Spiegl Gábor Témavezető: Prof. Falkay György Szeged 21 1
TARTALOMJEGYZÉK BEVEZETÉS 3 CÉLKITŰZÉSEK 4 ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 4 Kísérleti állatok 4 [ 3 H]noradrenalin felszabadulás 5 Izolált szervi kísérletek 5 RT-PCR 6 EREDMÉNYEK 6 Hiperglikémia 6 Szöveti radioaktivitási értékek: 7 Elektromos stimulációra történő [ 3 H]noradrenalin felszabadulás 7 Agonista által indukált kontrakció és relaxáció 7 Az oxitocin hatása 9 Az elektromos térerőingerlés hatása 9 RT-PCR vizsgálatok 9 DISZKUSSZIÓ 1 2
BEVEZETÉS A terhesség olyan diabetogén állapot, mely emelkedett inzulin rezisztenciával és ennek hatására bekövetkező fokozott β-sejt válasz miatti hiperinzulinémiával jellemezhető. A szénhidrát- és lipidmetabolizmusban bekövetkező változások célja a fejlődő magzat tápanyagellátásának folyamatos biztosítása a szakaszos anyai táplálékfelvétel mellett is. Gesztációs diabetes mellitus (GDM) akkor következik be, amikor az anyai β-sejt funkciók elégtelen mivoltából fakadóan az inzulin szekréció nem képes kompenzálni a megnövekedett inzulin rezisztenciát. A GDM tehát egy olyan szénhidrát intolerancia, mely terhesség alatt jelentkezik először, vagy akkor detektálják. Egy metabolikus kompenzációs elégtelenség, melyet relatív inzulin hiány és fokozott inzulin rezisztencia jellemez és a terhességek körülbelül 7%-át érinti. Oka heterogén, a kor, elhízás és a genetikai hajlam egyaránt szerepet játszanak a kialakulásában, a szülés után pedig gyakran spontán elmúlik. A GDM az anyára és a magzatra nézve is kockázati tényezőt jelent. Az anya szempontjából a legfontosabbak a szülés közbeni komplikációk úgy, mint a pre-eclampsia, vagy a posztpartum vérzések kockázata, de fokozottabb a veszélye a respirációs distress szindrómának is. Hosszútávú következményként II. típusú diabetes is kifejlődhet. A magzat szempontjából a legfontosabb kockázati tényező a macrosomia, illetve az ebből fakadó egyéb, szülés közbeni komplikációk, traumák. Az ilyen gyermekeknél a későbbi élet során nagyobb eséllyel jelentkezik glükóz intolerancia, obezitás, vagy II. típusú diabetes. A kezelés célja a normoglikémia fenntartása és a ketózis kivédése. Az első lépés általában diéta, de ha ezzel nem érhető el a kívánt vércukorszint, akkor inzulin terápia következik. Az aspart, illetve lispro inzulin analógok nagy biztonsággal alkalmazhatók, mivel a humán inzulinhoz hasonlóan nem jutnak át a placentán. Orális antidiabetikumok használata jelenleg nem javasolt, bár a szulfanilureákkal kapcsolatban néhány tanulmány bíztató eredményekről számol be. A GDM pontos hatása a terhes uterus kontraktilitására nem teljesen ismert. A kontraktilitás két fő meghatározó tényezője a hormonális rendszer, illetve a beidegzés. Terhesség alatt mindkettő jelentősen megváltozik, az emelkedett progeszteron koncentráció konstans uterinális vérátáramlást tart fenn, míg a fellépő adrenerg denerváció a spontán kontrakciók gátoltságához vezet. Ebben az érzékeny rendszerben egy esetlegesen fellépő GDM pedig még mindezeken felüli újabb változásokat indukálhat. Az adrenerg rendszer mindemellett fontos célpontja a tokolitikus terápiának is. Diabetes alatt bekövetkező adrenerg 3
változások ezért nem kívánt hatásmódosulásokhoz vezethetnek, és mindenképp figyelmet érdemelnek a terápia szempontjából. CÉLKITŰZÉSEK A bevezetésben összefoglaltak alapján a következő kísérleti célokat határoztuk meg: Kísérletes állatmodell létrehozása GDM vizsgálatához. Az uterin adrenerg szabályozás preszinaptikus oldalának vizsgálata szuperfúziós kísérletekkel GDM alatt. Az uterus transzmitter felvevő képességének és az elektromos stimulációra történő leadásának változása a terhességi idő függvényében, különbséget téve az implantáció helyéről, illetve az interimplantációs helyekről származó szövetminták között. Az myometriális adrenerg szabályozás posztszinaptikus oldalának vizsgálata szelektív α- és β-adrenerg agonistákkal, illetve elektromosan végzett ingerléssel izolált szervi körülmények között, a terhességi idő függvényében, GDM mellett. Az oxitocinnal kiváltható kontrakciós válaszok vizsgálata izolált szervi körülmények között GDM során. Az α- és β-agonistákkal, valamint az oxitocinnal kiváltott ingerlésre kapott eredmények igazolása RT-PCR technikával. A befolyásolt receptorok mrns-szintű expressziójának mérése a szövetmintákból annak eldöntésére, hogy a kapott kontraktilitásbeli változások mutatnak-e összefüggést az adott receptorstátuszok változásával. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK Kísérleti állatok A kísérleteket nőstény Sprague-Dawley patkányokkal (2-25 g) végeztük. A megtermékenyülés detektálására a natív vaginális kenetet vizsgálatuk mikroszkóp alatt. A fogantatás napját tekintettük ezek után a terhesség első napjának. A streptozotocin egy olyan diabetogén ágens, mely szelektíven felhalmozódik a hasnyálmirigy β-sejtjeiben és DNS alkilációval, valamint reaktív oxigéngyökök képzésével károsítja azokat. A diabetest az állatokban 6 mg/kg intravénás streptozotocin injekcióval indukáltuk. A nem terhes kontroll vizsgálatokat a diabetes indukció után 12 nappal végeztük. A vércukorszintet, a kezelést követően enzimatikus kolorimetriás kit segítségével mértük. A 4
terhes állatok esetében a 7. 14. és 21. terhességi napokat vizsgáltuk. A diabetes indukció a terhesség 5. napján történt, kivéve a 7 napos terhes csoportnál. Ebben az esetben a terhesség második napján alkalmaztuk a streptozotcin kezelést. [ 3 H]noradrenalin felszabadulás Az állatokat széndioxid kamrában túlaltattuk, majd az uterusból szövetmintákat metszettünk (2-3 mg). Terhes állatok esetében különbséget tettünk az implantációs és az interimplantációs helyekről származó minták között. A kötőszövettől és endometriumtól megtisztított mintákat felaprítottuk és 1-7 M [ 3 H]noradrenalinnal 37 C-on 6 percig inkubáltuk. Ezután de Jongh pufferrel mostuk, majd szuperfúziós kamrába helyeztük őket, ahol 1 ml/perces folyamatos áramoltatás mellett monoamin oxidáz inhibitort, noradrenalin reuptake inhibitort és extraneuronális reuptake inhibitort tartalmazó puffert áramoltattunk keresztül rajtuk 6 percen keresztül. Végül 22 darab 3 perces frakciót gyűjtöttünk, az 5. és a 15. frakció alatt elektromos erőtéringerlést alkalmaztunk. A frakciók [ 3 H] tartalmát folyadék szcintillációs spektrométer segítségével határoztunk meg. Izolált szervi kísérletek Az állatokat széndioxid kamrában túlaltattuk, majd az uterusból gyűrűket metszettünk, melyeket 37 C-os, oxigenizált de Jongh puffert tartalmazó szervfürdőbe helyeztünk. A gyűrűket 1,5g-s kezdeti feszüléssel feszülésmérők közé rögzítettük és 9 percig inkubáltuk. A kísérletek során a szövetfürdőbe adagolt α- és β-adrenerg agonisták, illetve oxitocin jelenlétében rögzítettünk 5 perces regisztrátum szakaszokat, melyek görbe alatti területéből (AUC) dózis-hatás görbéket szerkesztettünk. Az α-adrenerg funkciók diabetes alatt bekövetkező változásainak vizsgálatához kumulatív dózis-hatás görbét vettünk fel noradrenalinra, propranolol (1-6 M) jelenlétében. A kísérlet végén 5 perces KCl-al (7mM) kiváltott tónusos kontrakció AUC értékét tekintettük 1 %-nak. A β-adrenerg funkciók diabetes alatt bekövetkező változásainak vizsgálatához terbutalinnal vettünk fel kumulatív dózis-hatás görbét. Ebben az esetben a kísérlet elején váltottunk ki tartós kontrakciót KCl segítségével (5mM), majd regisztráltuk a terbutalinra bekövetkező relaxációt. A KCl-al kiváltott kontrakciót tekintettük a motoros aktivitás 1 %- ának. 5
Az oxitocin esetében nem kumulatív dózis-hatás görbéket vettünk fel 1-9 1-6 M tartományban. A dózis-hatás görbék hatásmaximumát és EC 5 értékét minden esetben Graphpad Prism 4-es szoftverrel számoltuk. Izoláltszervi körülmények között elektromos erőtéringerlést is alkalmaztunk. A kísérletek során a szövetet háromszor ingereltük 3 percen keresztül, 4 V feszültségű,,6 ms jelszélességű és 5 ms periódusidejű elektromos impulzussal, majd végül KCl (7mM) segítségével maximális kontrakciót indukáltunk. Minden 3 perces stimulált periódushoz 3 perc ingermentes periódust is regisztráltunk, majd a szövetek elektromos ingerelhetőségét az ezekhez tartozó AUC-k hányadosával jellemeztük. RT-PCR Az RT-PCR kísérletek során csak azokat a terhességi napokat vizsgáltuk, melyek során az izolált szervi kísérletek a legnagyobb különbséget mutatták a diabeteses és a kontroll szövetminták viselkedésében. Az α 1 és β 2 adrenerg receptorok mrns szintjének méréséhez a nem terhes mintákat használtuk, míg az oxitocin receptor esetében a 15 napos terhes állatokból vett szövetminták receptorstátuszának meghatározása nyújtotta a legtöbb információt. A szövetmintákból Chomczynski és Sacchi szerint RNS-t extraháltunk, amit denaturáltuk 7 C-on 5 percig, majd lehűtés után reverz transzkriptáz és ribonukleáz inhibitor mellett inkubáltuk. Az RT-PCR során 5 µl cdns-t, 25 µl ReadyMix REDTaq PCR reakciós elegyet, az α and β adrenerg receptorok, valamint az oxitocin receptor 2 µl 5 pm-os sense és antisense primerét, illetve 16 µl DN-áz és RN-áz mentes desztillált vizet használtunk. Belső kontrollként minden mintánál patkány β-aktin próbát alkalmaztunk (GeneID: 81822). Az RT-PCR termékeket 2%-os agaróz gélen választottuk szét, etidium-bromiddal festettük és UV-transzilluminátor alatt fényképeztük, mérésük fluorimetriás esszével történt. A szemi-kvantitatív analízist a gél denzitometriás szkennelésével végeztük. EREDMÉNYEK Hiperglikémia A hiperglikémiát 12 mm-nál nagyobb plazma vércukorként definiáltuk. Nem terhes állatokon végzett kísérletek alapján a vércukorszint ezt már a STZ kezelést követő 4. napon meghaladta, a kezelést követő 7. naptól pedig már állandósult a hiperglikémia. 6
Szöveti radioaktivitási értékek: A szöveti aktivitás (dpm/mg szövetben kifejezve) a szövet [ 3 H]noradrenalin felvevő képességét írja le. A nem terhes állatok myometriumának ezen paramétere a diabetes hatására szignifikánsan csökkent. A terhesség előrehaladtával további csökkenést figyeltünk meg, szignifikáns különbségekkel az implantációs és az interimplantációs helyekről származó minták között (1. ábra). 9 7. nap 14. nap 21. nap Szöveti aktivitás (dpm/mg) ± SEM 6 3 * # ** ## ** # ** ** Nem-terhes Implantáció Interimplantáció Implantáció Interimplantáció Implantáció Interimplantáció 1. ábra. A myometrium [ 3 H]noradrenalin-felvevő kapacitása a terhességi idő és a STZ-kezelés függvényében. A világos és a sötét oszlopok a kontroll, illetve a STZ-kezelt állatok értékeket mutatják. * és ** p<,5 és p<,1 jelentenek a megfelelő kontroll értékekhez viszonyítva. # és ## p<,5 és p<,1 szignifikancia értékeket jelentenek ugyanazon kezelés különböző implantációs és interimplantációs helyei között. Elektromos stimulációra történő [ 3 H]noradrenalin felszabadulás Az alkalmazott elektromos térerő stimulusok közül a második (15. frakció) mindig kisebb transzmitter felszabadulást okozott, mint az első (5. frakció). Nem terhes esetben a diabetes szingifikáns csökkenést okozott az elektromos stimulus hatására bekövetkező transzmitter felszabadulásban (2. ábra). A 7. 14. és 21. terhességi napokon szintén megfigyelhető a tendencia a transzmitter felszabadulás csökkenésének irányában, diabetes mellett, azonban ezek a különbségek csak a 14. terhességi nap esetében voltak szignifikánsak. Agonista által indukált kontrakció és relaxáció A myometrium motoros funkcióinak változásait α- illetve β-adrenerg receptor agonisták jelenlétében felvett kumulatív dózis-hatás görbéken vizsgáltuk. Nem terhes esetben a diabetes fokozta a noradrenalinra adott kontrakciós választ. Ugyanakkor a β-adrenerg 7
receptor agonista terbutalin hatására szingifikánsan alacsonyabb relaxáló hatást tapasztaltunk diabeteses állatokból származó mintákon (3. ábra). Terhesség 7. 14. illetve 21. napját megvizsgálva azonban nem kaptunk szignifikáns kontraktilitásbeli különbséget a diabeteses és az intakt uterusgyűrűt összehasonlítva. Transzmitter felszabadulás (%) ± SEM 1.5 1..5 ** ***. 5 1 15 2 25 Frakciók 2. ábra. Elektromos tér ingerlés által kiváltott [ 3 H]noradrenalin felszabadulás nem terhes, kontroll ( ) és diabeteses ( ) patkányok myometriális mintáiból. ** és *** p<,1 és p<,1 szignifikancia értékeket jelentenek, a nem kezelt kontroll értékekhez viszonyítva. Kontrakció (%) ± SEM 2 15 1 5-11 -1-9 -8-7 -6-5 -4 Log NA (M) Relaxáció (%) ± SEM 1 75 5 25-9 -8-7 -6-5 -4 Log Terbutalin (M) 3 ábra. A noradrenalin (NA) és terbutalin hatása nem terhes kontroll ( ) és diabeteses ( ) állatok uterus gyűrűinek motor-aktivitására. 8
Az oxitocin hatása Az oxitocin hatásait csak a terhesség harmadik trimeszterében vizsgáltuk, mivel az első két trimeszterben a patkány uterus oxitocin receptor expresziója minimális. Diabetes mellett a 3. trimeszter elején (15. terhességi nap) az oxitocin szignifikánsan erőteljesebb uterotonikus hatást fejtett ki a nem diabeteses állapothoz képest, ugyanakkor ez a különbség terminusra megszűnt (4. ábra). Kontraktilitás (%) ± SEM 8 6 4 2 15. nap p<,1-11 -1-9 -8-7 -6 Log Oxytocin (M) Kontraktilitás (%) ± SEM 8 6 4 2 21. nap p<,1-11 -1-9 -8-7 -6 Log Oxytocin (M) Kontraktilitás (%) ± SEM 8 6 4 2 22. nap -11-1 -9-8 -7-6 Log Oxytocin (M) 4. ábra. Az oxytocin hatása STZ-kezelt és kontroll állatok myometriális kontraktilitására. Az elektromos térerőingerlés hatása Diabetes hatására mind a nem terhes, mind a terhes állatokból származó minták elektromos ingerelhetősége is szignifikánsan csökkent. Terminusra a csökkenés mérséklődött, ugyanakkor terminusban már az egészséges állatok myometriális kontraktilitása is minimális szintre csökken az adrenerg denerváció miatt, a kísérletes diabetes ezt már nem volt képes tovább befolyásolni. RT-PCR vizsgálatok Az α 1 -adrenerg receptor altípusok, valamint a β 2 -receptor mrns-szintű expresszióját nem terhes myometriumból, az oxytocin-receptorét 15 napos terhes uterusból határoztuk meg. 9
A nem terhes uterusban az α 1A - és a β 2 -receptor esetében nem találtunk diabetesfüggő eltérést, míg az α 1B -altípusra emelkedett, az α 1D -altípusra pedig csökkent mrns mennyiséget regisztráltunk a diabeteses állatok mintáiban. A 15 napos terhes diabeteses állatokból nyert mintákban magasabb volt az oxytocin-receptor PCR termék mennyisége a kontrollhoz viszonyítva (5. ábra). PCR termék µg/ml 25 2 15 1 5 α 1B -receptor * PCR termék µg/ml 5 4 3 2 1 α 1D -receptor * PCR termék µg/ml 1. 7.5 5. 2.5 Oxytocin receptor * Kontroll 31 bp α 1B AR 313 bp β-actin DM 4 bp 3 bp 4 bp 3 bp Kontroll 34 bp α 1D AR 313 bp β-actin DM 4 bp 3 bp 4 bp 3 bp. 375 bp OTR 313 bp β-actin Kontroll DM 4 bp 3 bp 4 bp 3 bp 5. ábra. A diabetes hatása a myometriális α 1B -, α 1D -adrenerg receptorok és az oxytocin-receptor mrns-szintű expressziójára patkányban. *: p<,5 a kontrollhoz viszonyítva. A grafikonok alatt reprezentatív gélfotók láthatók. DISZKUSSZIÓ A terhes myometrium kontraktilitását meghatározó három fő fiziológiás faktor az oxitocin, a prosztaglandinok és a szimpatikus idegrendszer. Mindhárom tényező fontos célpontja a klinikumban használt tokolitikus szereknek. Az oxitocin és a prosztaglandinok diabetes alatti hatásmódosulásáról terjedelmes irodalmi adat áll rendelkezésre, ezért munkám során a myometrium adrenerg rendszerében experimentális diabetes hatására bekövetkező funkcionális változásokra fókuszáltam. Terhesség alatt az uterus mélyreható változásokon megy keresztül, mely magában foglalja a myometriumot és vaszkulatúráját ellátó idegrostok fokozatos degenerációját. Ezen terhességi denervációnak feltételezett fiziológiás jelentősége a fötoplacentáris egység funkcionális izolálása, védelme. Terminusra az uterus gyakorlatilag denervált szervnek tekinthető, mely azonban a szülés után reinnerválódik, bár az innerváció szinje a kezdeti állapotét nem fogja elérni. Jelen kísérletsorozat feltárta, hogy a diabetes jelentősen befolyásolja a myometrium adrenerg transzmissziójának preszinaptikus oldalát, azaz a transzmitter felvételt és annak stimulációra történő felszabadítását. A GDM egy kifejezettebb adrenerg denervációt okoz, 1
mintegy felgyorsítva annak folyamatát. Ezen eredményeknek metodikai jelentőséget is tulajdonítunk, az idegkutatásban rutinszerűen használt szuperfúziós technikát sikerült a myometrium funkcionális vizsgálatára optimalizálni. Az elektromos térerő ingerléses kísérletek során, az ingerelhetőség diabetes mellett észlelt csökkenés is az idegi funkciók károsodására enged következtetni. A transzmisszó posztszinaptikus oldalán bekövetkező változások az adrenerg agonisták hatásain keresztül jól jellemezhetőek. Nem terhes esetben a diabetes fokozta a noradrenalinnal kiváltható kontrakciókat és csökkentette a terbutalin relaxáló hatását, ezzel a kontraktilitás fokozódás irányába mutató eredő hatást váltott ki. A terhesség során nem észleltünk hasonlóan markáns diabetesüggő eltéréseket az adrenerg agonistákra adott kontrakciós válaszokban. Diabetes hatására az uterus oxitocinnal szembeni érzékenysége korábban megmutatkozott, ami alátámasztható volt a receptorexpresszió mrns-szintű emelkedésével is. Eredményeinket összegezve azt találtuk, hogy streptozotocinnal kiváltott diabetes mintegy felgyorsítja a terhesség indukálta uterinális változásokat, mind az adrenerg, mind az oxitocin rendszer tekintetében. Ez egyben azt is jelenti, hogy hasonló humán viszonyok esetén diabetessel szövődött terhességek fokozott koraszülési kockázatának elhárítására az oxitocin rendszer tűnik alkalmasabbnak. 11
FÜGGELÉK Az értekezés alapját képező közlemények: 1. Falkay G, Spiegl G, Csonka D, Zupkó I: Effects of streptozotocin-induced diabetes on the uterine adrenergic nerve function in pregnant rats A superfusion study. Neurochem Int 51: 36-1 (27) IF 27 : 2.975 2. Spiegl G, Minorics R, Csík G, Zupkó I, Falkay G: A kísérletes diabetes hatása a patkány uterusának terhesség által indukált adrenerg denervációjára és farmakológiai reaktivitására. Magy Nőorv L 71: 253-6 (28) 3. Spiegl G, Zupkó I, Minorics R, Csík G, Csonka D, Falkay G: Effects of experimentally induced diabetes mellitus on pharmacologically and electrically elicited myometrial contractility. Clin Exp Pharmacol Physiol 36: 884-91 (29) IF 28 : 2.196 Az értekezéshez kapcsolódó előadások, prezentációk: 1. Spiegl G, Csonka D, Zupkó I, Falkay G: A gesztációs diabetes myometriális hatásainak vizsgálata patkányban. Gyógyszerkutatási Szimpózium 25, Pécs, 25. XI. 4-5. 2. Spiegl G, Zupkó I, Falkay G: Experimental gestational diabetes decreases noradrenaline release in the myometrium of the rat. 15th World Congress of Pharmacology, Beijing, China, 26. VII. 2-7. [Acta Pharmacol Sin 27 Suppl 1: P2874 (26)] 3. Zupkó I, Spiegl G, Falkay G: Effects of streptozotocin-induced diabetes on the contractility of the uterus in the rat. 8th Congress of the European Association for Clinical Pharmacology and Therapeutics, Amsterdam, The Netherlands, 27. VIII. 29.-IX. 1. [Basic Clin Pharmacol Toxicol 11 Suppl 1: P48 (27)] 4. Gáspár R, Zupkó I, Gál A, Spiegl G, Csík G, Falkay G: Effects of streptozotocininduced diabetes on the uterine denervation and contractility in pregnant rats. 5th International Symposium on Diabetes and Pregnancy, Sorrento, Italy, 29. III. 26-28. 5. Minorics R, Zupkó I, Spiegl G, Falkay G: Az uterus adrenerg funkciói kísérletes diabetes modellben 6. Congressus Pharmaceuticus Hungaricus XIV., Budapest, 29. XI. 13-15. [Gyógyszerészet 53 Suppl 1: S51 (29)] 7. Zupkó I, Minorics R, Spiegl G, Falkay G: Effects of streptozotocin-induced experimental diabetes on pharmacological action of drugs affecting myometrial contractility of the rat. 5th International Symposium on Diabetes and Pregnancy, Sorrento, Italy, 29. III. 26-28. 12