PhD-TÉZISEK A neutrophil granulocyták szuperoxid-anion termelése egészséges és praeeclampsiás terhességben Lampé Rudolf dr. Debreceni Egyetem, Orvos- és Egészségtudományi Centrum, Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika és Megelőző Orovostani Intézet, Debrecen Egészséges és praeeclampsiás terhességben a neutrophil granulocyták reaktív oxigéngyökök termeléséről szóló adatok ellentmondásosak. Céljuk volt a szuperoxid-anionnak a praeeclampsia etiológiájában betöltött szerepét tovább vizsgálni, ezért forbol-dibutiráttal és n-formil-metionil-leucil-fenilalaninnal stimulálták az egészséges nem terhesekből, egészséges terhesekből és praeeclampsiás terhesekből származó granulocytákat. Vizsgálták az említett három csoport hő által inaktivált és nem inaktivált vérplazmájának hatását a granulocyták szuperoxid-termelésére. A szuperoxid termelődését a ferricitokróm c redukciójaként mérték spektrofotometriás módszerrel. Mind a forbol-dibutirát, mind az n-formil-metionil-leucil-fenilalanin indukálta szuperoxid-termelés szignifikánsan csökkent egészséges terhesekből származó granulocyták esetében. A nem terhesekből és praeeclampsiás terhesekből származó granulocyták forbol-dibutirát stimulálta ˉ -termelődését az egészséges terhesektől nyert inaktivált és nem inaktivált vérplazma is gátolta. Az n-formil-metionil-leucil-fenilalaninnal stimulált nem terhesek és praeeclampsiás terhesek granulocytáinak ˉ -termelését csak az egészséges terhesek nem inaktivált vérplazmája tudta gátolni. Az egészséges terhesek granulocytáinak forbol-dibutirát stimulálta ˉ -termelését szignifikánsan növelte mind a nem terhesek, mind a praeeclampsiás terhesek plazmája inaktivált és nem inaktivált formában is. Az egészséges terhesek neutrophiljeinek n-formil-metionil-leucil-fenilalaninnal indukált ˉ -termelése szignifikánsan növekedett a nem terhesek és praeeclampsiások nem inaktivált plazmáinak hatására. Feltételezik, hogy az egészséges terhességben megfigyelhető csökkent ˉ -termelés anyai immunszuppresszív faktoroknak köszönhető. Ezen faktorok hiánya valószínűsíthető praeeclampsiában, így magyarázható az egészséges terhességben bekövetkező ˉ -termelődés csökkenésének elmaradása, ami a praeeclampsiában megfigyelhető endothelsejt-károsodásért is felelős lehet. Orv. Hetil., 22, 53, 425 434. Kulcsszavak: praeeclampsia, terhesség, oxidatív stressz, szuperoxid-anion Superoxide-anion production of neutrophil granulocytes in healthy and preeclamptic pregnant women Data on respiratory burst activity of granulocytes from healthy and preeclamptic pregnant women are contradictory. To further investigate a possible role of reactive oxygen species in the etiology of preeclampsia, the induced superoxide-anion generation by granulocytes from non-pregnant, healthy pregnant and preeclamptic pregnant women were measured. The reciprocal effects of heat-inactivated and non-inactivated plasma on superoxide production by neutrophils from non-pregnant, healthy pregnant and preeclamptic pregnant subjects were also examined. Superoxide generation was measured by ferricytochrome c reduction. Both phorbol-2.3-dibutirate- and N-formyl-methionylleucyl-phenylalanine-induced superoxide production was significantly decreased in normal pregnancy compared to results obtained in non-pregnant and preeclamptic pregnant women. Phorbol-2.3-dibutirate-induced superoxide generation by non-pregnant and preeclamptic neutrophils was significantly inhibited by heat-inactivated and noninactivated healthy pregnant plasma. N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine-stimulated superoxide production by non-pregnant and preeclamptic granulocytes was suppressed only by non-inactivated healthy pregnant plasma. Phorbol-2.3-dibutirate-induced superoxide generation of healthy pregnant neutrophils was significantly increased by inactivated and non-inactivated non-pregnant and preeclamptic plasma. N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalaninestimulated superoxide production by healthy pregnant granulocytes was significantly enhanced following treatment DOI:.556/OH.22.29322 425 22 53. évfolyam,. szám 425 434.
of the cells with non-inactivated non-pregnant and preeclamptic pregnant plasma. Deficient superoxide generation in normal pregnancy may be caused by maternal immunosuppressive factors. The failure of reduction in superoxide production in preeclampsia may be partly responsible for endothelial dysfunction. Apart from oxidative stress, a possible role of inefficient maternal immunosuppression should also be considered in the pathogenesis of preeclampsia. Orv. Hetil., 22, 53, 425 434. Keywords: preeclampsia, pregnancy, oxidative stress, superoxide-anion (Beérkezett: 22. január 7.; elfogadva: 22. február 9.) Rövidítések BMI = testtömegindex; DAG = diacilglicerol; EDTA = etiléndiamintetraacetát; FMLP = n-formil-metionil-leucil-fenilalanin; Hgmm = higanymilliméter; = inaktivált plazma; LDL = alacsony sűrűségű lipoprotein; ml = milliliter; NADPH = nikotinamid-adenin-dinukleotid; NE = nem értelmezhető; = nem inaktivált plazma; ˉ = szuperoxid-anion; PDBu = forbol-dibutirát; PKC = proteinkináz-c; SD = standard deviáció A praeeclampsia egy terhességspecifikus megbetegedés, aminek vezető tünete a terhesség 2. hete után újonnan kialakuló magas vérnyomás és proteinuria. Bár a betegség pontos etiológiája ismeretlen, a placenta hipoperfúziója és a diffúz endothelsejt-károsodás központi szerepet tölt be. A praeeclampsiának enyhe és súlyos formái lehetnek, elhanyagolt esetben pedig veseés májelégtelenséghez, disszeminált intravascularis koagulációhoz és központi idegrendszeri tünetekhez vezethet []. Mivel a kórkép definitív terápiája a magzat világra segítése, a praeeclampsia magas anyai és magzati morbiditással és mortalitással jár. Az Amerikai Egyesült Államokban a koraszülések 5%-áért és az anyai halálozás 7,6%-áért felelős. Világszerte a praeeclampsia és az eclampsia (azaz a praeeclampsiás terheseknél kialakuló görcsrohamok, amelyeknek más kiváltó oka nem ismert) évente az anyai halálesetek körülbelül 4%-áért felelős, ami 5 75 nőt érint [2, 3]. Az általánosan elfogadott konszenzus a praeeclampsia patogenezisét illetően az, hogy egy endothelsejtrendellenesség, ami az enyhétől a súlyosig terjedő microangiopathiához vezet a célszervekben, azaz az agyban, a vesékben, a májban és a placentában [4]. Bár a hipertenzió tűnik a leggyakoribb tünetnek, az nem tekinthető az elsődleges patogenetikai folyamatnak. Nem ritka, hogy más szervek is érintetté válnak mielőtt a magas vérnyomás manifesztálódik. A kórkép tüneteinek kialakulása előtt a praeeclampsiás terhesekben az endothelsejt-károsodás keringő markereinek emelkedett szintje mutatható ki. Ezen markerek az endotelin, a celluláris fibronektin, a plazminogénaktivátor inhibitor- és a megváltozott prosztaciklin/tromboxán arány [5]. A reaktív oxigéngyökök elsődleges támadási pontjai a sejtmembránok és lipoproteinek. A többszörösen telítetlen zsírsavak és a koleszterin károsításával reaktív elsődleges termékek keletkeznek, amiket lipid-hidroperoxidoknak nevezünk, a folyamatot pedig lipidperoxidációnak hívjuk [6]. A lipid-hidroperoxidok a szervezet fiziológiás működéséhez szükségesek, ám kontrollálatlan termelődésük a sejtek diszfunkciójához és károsodásához vezethet. A praeeclampsia esetében széles körűen vizsgált jelenség a lipidperoxidáció. Kísérletes körülmények között lipidperoxidációval a praeeclampsiában is megfigyelhető endothelsejt-károsodás, illetve annak következményeit figyelték meg. A legfontosabbakat megemlítve: hidrogén-peroxid intrarenalis injektálásával állatkísérletben reverzíbilis proteinuria jött létre [7]. Az artériákban létrejövő endothelsejtfüggő vasodilatatio károsodását lehet kimutatni in vitro, amelynek oka a lipidperoxidáció során keletkező oxidált LDL megnövekedett mennyisége [8]. Eclampsiához hasonló görcsrohamokat és intravascularis thrombosist sikerült kiváltani terhes kísérleti állatokban E-vitamin-szegény és lipid-peroxidokat tartalmazó diétával [9]. A granulocyták termelte szuperoxid-anionnal (ˉ ) kapcsolatban a rendelkezésre álló szakirodalom számos ellentmondást tartalmaz. Az bizonyos, hogy az aktivált neutrophilek által termelt ˉ a sejtmembrán lipidperoxidációját okozza, ami megnövekedett vascularis permeabilitással és reaktivitással jár []. Az ellentmondásokat szemléltetve megemlítjük, hogy egy munkacsoport vizsgálatai szerint n-formil-metionilleucil-fenilalanin- (FMLP-) stimulációval harmadik trimeszterben lévő egészséges terheseknél szignifikánsan magasabb neutrophilszabadgyök-termelést mért a nem terhes kontrollokkal összehasonlítva [], míg egy másik munkacsoport hasonló kísérletben a terheseknél mért szignifikánsan alacsonyabb ˉ -termelést a nem terhesekhez képest [2]. Sacks és mtsai normálterhességben és praeeclampsiában is magasabb ˉ -termelést mértek FMLP-stimuláció hatására a nem terhesek értékeihez képest [3], míg Crocker és mtsai egészséges terhességben a nem terhesekhez és praeeclampsiás terhesekhez képest csökkent ˉ -termelést mértek [4]. 22 53. évfolyam,. szám 426
Célkitűzések Munkánk során az alábbi problémák megoldását és kérdések megválaszolását tűztük ki célul: I. Egészséges terhesek és praeeclampsiás terhesek vérmintáiból szeparált perifériás neutrophil gra nulocyták ˉ -termelésének megfigyelése, tisztázása:. Hogyan változik meg a granulocyták ˉ -termelése egészséges terhességben és praeeclampsiában a nem terhes kontrollok eredményéhez viszonyítva PDBu- és FMLP-stimuláció hatására? II. Egészséges terhesek és praeeclampsiás terhesek vérében a granulocytafunkciót befolyásoló plazmafaktorok jelenlétének vagy hiányának igazo lása:. Milyen hatással van az egészséges nem terhes, egészséges terhes és praeeclampsiás nők vérplazmája az egészséges terhesekből, egészséges nem terhesekből és praeeclampsiás terhesekből izolált granulocyták ˉ -termelésére? 2. A fenti változások hogyan alakulnak inaktivált és nem inaktivált vérplazma alkalmazása esetén? 3. Befolyásolja-e a granulocyták ˉ -termelését az idegen immunológiai környezet, tehát a nem saját, de ugyanazon vizsgálati csoportból származó vérplazma? Betegek és módszerek Tájékozott beleegyezést követően, terhességük harmadik trimeszterében járó 3 egészséges terhes és 39 praeeclampsiás nő perifériás vérmintáit gyűjtöttük össze. A vérvételek a 26 38. terhességi héten történtek. Kontrollként 35 hasonló életkorú, egészséges, nem terhes nő vérmintáit használtuk. A praeeclampsiát a terhesség 2. hete után kialakuló magas vérnyomás ( 4/9 Hgmm két különböző mérés eredményeként, legalább hat óra különbséggel) és proteinuria (24 órás vizeletgyűjtésből a fehérje mennyisége több mint 3 mg/nap) együttes fennállása esetén diagnosztizáltuk. A praeeclampsiások a kórkép súlyosságát illetően az enyhe (4/9 Hgmm 49/99 Hgmm) és közepesen súlyos (5/ Hgmm 59/9 Hgmm) csoportból kerültek ki, a súlyos praeeclampsiásokat nem válogattuk be. Minden vérvétel a gyógyszeres kezelés előtt történt, a beválogatott egyének nem szedtek rendszeresen gyógyszert, nem szenvedtek cukorbetegségben vagy egyéb belgyógyászati megbetegedésben, előzményükben nem volt nagyobb sebészeti beavatkozás. A perifériás vér levétele EDTA- (Becton-Dickinson, Cedex, Franciaország) tartalmú, vákuumelven működő, zárt vérvételi csövekbe (Becton-Dickinson, Cedex, Franciaország) történt mindhárom vizsgálati csoport esetében. A vérmintákat egyenként Ficoll-ol datra (,77 g/ml) rétegeztük, G-vel centrifugáltuk 4 6 percig szobahőmérsékleten. Az így különválasztott plazmában és fehérvérsejtekben gazdag felülúszót leszívtuk és a Ficoll-gradiens (,9 g/ml és,77 g/ml) tetejére rétegeztük, majd 35 g-n, 2 C-on 3 percig centrifugáltuk. A két eltérő sűrűségű Ficoll-réteg közé kivált neutrophil granulocytákat összegyűjtöttük és 7,4-es ph-ra beállított Hank s-pufferben egymás után kétszer mostuk 2 C-on [5]. A sejtek életképességét tripánkék kizárásos teszttel ellenőriztük, ami 98%-os volt. A granulocytaszuszpenzió tisztasága mikroszkópos vizsgálat alapján 94 98%-os volt. A vörösvértestek hipotóniás lízisére nem volt szükség, tekintettel az erythrocytakontamináció hiányára. A ˉ -termelésért felelős NADPH-oxidáz stimulálása mind az intracelluláris PK-C útvonalon, mind a formil-peptid receptor útvonalon keresztül történt a PDBu, illetve az FMLP segítségével. A ˉ -termelést a ferricitokróm-c megkötésének szuperoxid-dizmutázzal gátolható csökkenéseként mértük [6]. A granulocytákat (3 5 ) Hank s-oldatban (ph 7,4) inkubáltuk forbol-2,3-dibutiráttal (PDBu) és FMLP-vel 5 percig 37 C-on. A minták végső térfogata,5 ml, a PDBu és FMLP koncentrációja - nmol/l, a ferricitokróm-c koncentrációja pedig 5 μmol/l volt. A megkötődés változását 55 nm-en mértük kettős sugarú Shimadzu UV-6A spektrofotométerrel (Shimadzu Seisakusho Ltd, Kiotó, Japán) 25 C-on. Az oldatba kiválasztott ˉ mennyiségét a redukált ferricitokróm-c moláris extinkciós koefficiense (2, 4 M cm ) alapján számítottuk ki [7]. A plazmafrakciókat az egészséges nem terhesek, egészséges terhesek és praeeclampsiás terhesek perifériás vérmintáiból nyertük azok 2 C-on percig 8 G-n történő centrifugálása után, majd minden egyes plazmamintát két egyenlő részre osztottuk. Plazmakísérleteink során hat egészséges terhes, hat nem terhes és hat praeeclampsiás nő plazmamintáit izoláltuk, illetve ugyanezen vizsgálati alanyok granulocytáit szeparáltuk. A plazmaminták egyik részét 3 perc alatt 56 C-os vízfürdőben inaktiváltuk, a komplementrendszer feltételezett granulocytafunkciót befolyásoló hatásának kizárása céljából (Rossi, 986). A plazmaminták másik részét nem inaktiváltuk. A vizsgált személyektől nyert plazmamintákat nem kevertük össze, azokat felhasználásig 86 C-on tároltuk. Minden plazmakísérletet inaktivált és nem inaktivált plazmával végeztünk el. Az egészséges nem terhes nők granulocytáit (3 6 ) egészséges terhesek és praeeclampsiás terhesek plazmamintáiban (,5 ml) inkubáltuk. Ennek analógiájára az egészséges terhesek granulocytáit egészséges nem terhes nők és praeeclampsiás terhesek inaktivált és nem inaktivált plazmamintáival kezeltük, illetve a praeeclampsiás terhesek granulocytáit egészséges nem terhesek és egészséges terhesek plazmamintáiban inkubáltuk. Annak érdekében, hogy megfigyeljük az idegen plazma immunmediálta hatását a granulocyták ˉ termelésére, az egészséges nem terhesek, egészséges terhesek és praeeclampsiás terhesek véréből nyert sejteket (3 6 ) saját plazmájukkal (,5 ml) (autológ) és saját csoportjából származó, de másik egyén plazmájával 427 22 53. évfolyam,. szám
. táblázat A vizsgálatokban részt vevők klinikai tulajdonságai Nem terhesek (n = 35) Egészséges terhesek (n = 3) Praeeclampsiás terhesek (n = 39) P-érték Életkor 3±2,2 3,±4,5 3,7±4,4 >,5 Gesztációs kor a vérvételkor (hét) NÉ 3,5±3,3 3,4±3,7 >,5 Gesztációs kor a szüléskor (hét) NÉ 39,4±,7 37,6±2,6 <,5* Terhesség előtti BMI (kg/m 2 ) NÉ 24,3±,4 24,6±,6 >,5 BMI a szüléskor (kg/m 2 ) NÉ 27,6±4, 3,6±4,6 <,5* Paritás a ( ) ( 2) ( ) >,5 Szisztolés vérnyomás vérvételkor (Hgmm) 22±5,5 2±6,6 57±9,8 <,5* Diasztolés vérnyomás vérvételkor (Hgmm) 78±4,5 77±6,2 3±4,2 <,5* Újszülött súlya (gramm) NÉ 3578±526,5 33±7, <,5* Proteinuria a vérvételkor (gyorsteszt) ( ) ( ) 3 ( 3) <,5* a Az értékek átlagot jelölnek (tartomány). BMI: testtömegindex (kg/m 2 ); NÉ: nem értelmezhető. *Szignifikáns eltérés az egészséges terhesek és praeeclampsiás terhesek között. (,5 ml) (heterológ) kezeltük. A granulocyták inaktivált és nem inaktivált plazmában történő inkubációja 37 C-on 6 percig tartott, majd Hank s-oldatban mostuk és a fent leírt módon mértük a ˉ -termelésüket. A minta eloszlását a Kolmogorov Smirnov-teszttel ellenőriztük, amelynek során az normáleloszlásúnak bizonyult. A vizsgált populáció klinikai paramétereinek, az egészséges nem terhesekből, egészséges terhesekből és praeeclampsiás terhesekből származó granulocyták ˉ -termelésének, csakúgy, mint az előzetesen plazmamintában inkubált neutrophilek ˉ -termelésének különbségeit egy szempontú varianciaanalízissel (ANOVA), illetve Newman Keuls-féle post-hoc teszttel vizsgáltuk. Szignifikánsnak a p<,5 különbséget tekintettük. Eredmények Az. táblázat az egészséges nem terhesek, egészséges terhesek és praeeclampsiás terhesek klinikai tulajdonságait mutatja. Az általunk vizsgált betegeknél is megfigyelhetők a szakirodalomból ismert, praeeclampsiában bekövetkező változások. Eredményeinkből látható, hogy a praeeclampsiás terhesek körében a szüléskori magasabb testtömegindex és alacsonyabb gesztációs kor, az alacsonyabb újszülöttsúly, illetve a magasabb szisztolés és diasztolés vérnyomás, valamint proteinuria szignifikáns változást mutat az egészséges terhesek eredményeihez képest. Az. a) ábrán láthatjuk, hogy az egészséges terhes nőkből származó granulocyták átlagos ˉ -termelése a nem terhesek és praeeclampsiás terhesek hasonló eredményéhez képest szignifikánsan csökkent PDBustimuláció hatására. Nem volt szignifikáns különbség a nem terhes kontrollok és a praeeclampsiás terhesek granulocytáinak ˉ -termelésében. A praeeclampsiások granulocytái szignifikánsan nagyobb mennyiségben termelték a ˉ -t, mint az egészséges terheseké. Az. b) ábra a vizsgált csoportokban FMLP-stimuláció hatására mutatja a neutrophilek ˉ -termelését. Az egészséges terhesek átlagos ˉ -termelése szignifikánsan csökkent, összehasonlítva a nem terhesek és praeeclampsiás terhesek eredményeivel. Nem volt szignifikáns különbség a nem terhesekből és praeeclampsiás terhesekből származó granulocyták átlagos ˉ -termelése között. A praeeclampsiás terhesekből származó granulocyták ˉ -termelése szignifikáns növekedést mutatott az egészséges terhesek hasonló eredményével összehasonlítva. A 2. a) ábrán látható, hogy az egészséges terhesből származó inaktivált () és nem inaktivált () vérplazma szignifikánsan (mindkét esetben p<,) gátolja a nem terhesek granulocytáinak PDBu indukálta ˉ -termelését, összehasonlítva azzal a ˉ -termeléssel, amikor a vizsgált sejteket az egészséges nem terhes nők inaktivált és nem inaktivált, autológ és heterológ plazmájában vagy a praeeclampsiás terhes nők plazmájában inkubáljuk. Nem volt szignifikáns különbség a PDBustimulált, nem terhes kontrollok granulocytáinak ˉ -termelésében, ha azokat autológ és nem terhes heterológ, vagy praeeclampsiás terhes plazmájában inkubáltuk. A 2. b) ábrán az látható, ha a nem terhesek granulocytáit inaktivált heterológ plazmamintában, egészséges terhes vagy praeeclampsiás terhes inaktivált plazmájában inkubáljuk, az FMLP stimulálta ˉ -termelés mértékében nincs szignifikáns különbség a csoportok között. A nem inaktivált minták esetében az egészséges terhes plazmája szignifikánsan (p<,) gátolja a nem terhesek granulocytáinak ˉ -termelését, nem terhesek autológ és heterológ, valamint praeeclampsiás terhesek plazmájának hatásával összehasonlítva. A 3. a) ábrán látható, hogy az egészséges nem terhes és praeeclampsiás terhes nők inaktivált és nem inaktivált vérplazmája is szignifikánsan (mindkét eset- 22 53. évfolyam,. szám 428
a),8 6 sejt],6,4,2,6,2 egészséges nem terhes egészséges terhes Praeeclampsiás terhes b),8 5 sejt],6,4,2,6,2 egészséges nem terhes egészséges terhes Praeeclampsiás terhes. ábra a) Egészséges nem terhes (n = 35), egészséges terhes (n = 3) és praeeclampsiás terhes (n = 39) nők granulocytáinak átlagos szuperoxid-aniontermelése PDBu-stimuláció hatására. A szuperoxid-anion-termelést a szövegben leírtak szerint mértük. Az átlagértékeket (±SD) tüntettük fel. *p<, egészséges terhes és egészséges nem terhes, valamint praeeclampsiás nők eredményei között b) Egészséges nem terhes (n = 35), egészséges terhes (n = 3) és praeeclampsiás terhes (n = 39) nők granulocytáinak átlagos szuperoxid-aniontermelése FMLP-stimuláció hatására. A szuperoxid-anion-termelést a szövegben leírtak szerint mértük. Az átlagértékeket (±SD) tüntettük fel. *p<, egészséges terhes és egészséges nem terhes, valamint praeeclampsiás nők eredményei között ben p<,) növeli az egészséges terhesek véréből izolált granulocytáinak PDBu-stimulált ˉ -termelését, összehasonlítva azzal az esettel, ha a fent említett sejteket saját autológ és heterológ inaktivált és nem inaktivált plazmával kezeljük. Nem volt szignifikáns különbség az autológ és heterológ plazmakísérletek eredményeit tekintve. A 3. b) ábra azt mutatja, hogy az egészséges nem terhes és praeeclampsiás terhes nők inaktivált vérplazmája, csakúgy, mint a heterológ egészséges terhes vérplazmája, nem befolyásolja szignifikánsan az egészséges terhes nők véréből nyert neutrophil granulocyták FMLP stimulálta ˉ -termelését az autológ inaktivált értékhez képest. Amennyiben az említett sejteket nem terhes és praeeclampsiás terhes nők nem inaktivált vérplazmájával kezeljük, azok FMLP-stimulált ˉ termelése szignifikánsan (mindkét esetben p<,) nő a nem inaktivált autológ és heterológ plazmákkal történő kezelés utáni eredményekkel összehasonlítva. Ahogy azt a 4. a) ábra is mutatja, ha egészséges terhes nők inaktivált és nem inaktivált plazmamintáival kezeljük a praeeclampsiás terhesek granulocytáit, a PDBu indukálta ˉ -termelésük szignifikánsan (: p<,5; : p<,) csökken, összehasonlítva a praeeclampsiások autológ és heterológ, és nem terhesek inaktivált és nem inaktivált plazmájában történő inkubáció után mért eredményekkel. Nem volt szignifikáns eltérés a praeeclampsiás terhesek granulocytáinak PDBu indukálta ˉ -termelésében autológ, heterológ és nem terhes inaktivált és nem inaktivált plazmamintákban történt kezelése után. A 4. b) ábrán látható, hogy a praeeclampsiás terhesekből származó granulocyták átlagos ˉ -termelése FMLP-stimuláció hatására szignifikánsan nem különbözik, ha azokat egészséges terhes, nem terhes és praeeclampsiás terhes autológ és heterológ inaktivált plazmájában inkubáljuk. Ha a praeeclampsiás nők granulocytáit egészséges terhes nem inaktivált plazmájával kezeljük, 429 22 53. évfolyam,. szám
a),8 b) -termelés [nmol/perc/3 5 sejt] -termelés [nmol/perc/3 5 sejt],6,4,2,6,2,8,6,4,2,6,2 autológ plazma heterológ plazma egészséges terhes plazma Praeeclampsiás terhes plazma autológ plazma heterológ plazma egészséges terhes Praeeclampsiás plazma terhes plazma 2. ábra a) Plazmaminták hatása a nem terhes nők granulocytáinak PDBu indukálta átlagos szuperoxid-anion-termelésére. A granulocytákat egészséges terhes, praeeclampsiás terhes, valamint autológ és heterológ nem terhes nőkből izolált inaktivált () és nem inaktivált () plazmamintákban inkubáltuk. A szuperoxid-anion-termelést a szövegben leírtak szerint mértük. Az átlagértékeket (±SD) hat egymástól független mérés alapján számoltuk ki. A granulocytákat és a plazmamintákat csoportonként hat nő perifériás vérmintáiból izoláltuk. A szignifikanciaszint jelöléseinek magyarázatai: ***p<, autológ és egészséges terhes eredményei között. ###p<, autológ és egészséges terhes között b) Plazmaminták hatása a nem terhes nők granulocytáinak FMLP indukálta átlagos szuperoxid-anion-termelésére. A granulocytákat egészséges terhes, praeeclampsiás terhes, valamint autológ és heterológ nem terhes nőkből izolált inaktivált () és nem inaktivált plazmamintákban inkubáltuk. A szuperoxid-anion-termelést a szövegben leírtak szerint mértük. Az átlagértékeket (±SD) hat egymástól független mérés alapján számoltuk ki. A granulocytákat és a plazmamintákat csoportonként hat nő perifériás vérmintáiból izoláltuk. A szignifikanciaszint jelölésének magyarázata: ##p<, autológ és egészséges terhes között úgy a sejtek átlagos FMLP-indukált ˉ -termelése szignifikánsan (p<,) csökken, összehasonlítva az egészséges nem terhesek és praeeclampsiás terhesek autológ és heterológ nem inaktivált plazmájával történt kezelés utáni eredményekkel. Megbeszélés A neutrophil granulocyták oxidatív anyagcseréjét vizsgáló tanulmányok egészséges és praeeclampsiás terhesek esetében számos ellentmondást tartalmaznak. Egyes szerzők kimutatták, hogy a granulocyták stimulált ˉ termelése között nem terhesek és egészséges terhesek esetében nincs különbség [8, 9]. Ugyanakkor arról is vannak adatok, hogy egészséges terhességben csökkent a granulocyták ˉ -termelése a nem terhesek hasonló eredményéhez viszonyítva [2, 2, 22, 23]. Ezen ellentmondásos adatok miatt vizsgáltuk a granulocyták termelte szabad gyökök szerepét, és ezért mértük a neutrophilek ˉ -termelését nem terhes nőkben, egészséges terhesekben és praeeclampsiás terhesekben. Eredményeink azt mutatták, hogy a granulocyták egyik legfontosabb funkciója, nevezetesen a reaktívoxigén-intermedierek termelése a nem terhes kontrollokhoz képest csökken egészséges terhességben mind a PDBu, mind az FMLP indukálta, a ˉ -termelést kiváltó útvonalon keresztül. Ez része lehet a sejt mediálta immunitás általános szuppressziójának, ami egészséges terhességben ismerten bekövetkezik [24]. A ˉ -termelés csökkenése egészséges terhességben egy védelmi 22 53. évfolyam,. szám 43
a),8 b) -termelés [nmol/perc/3 5 sejt] -termelés [nmol/perc/3 5 sejt],6,4,2,6,2,8,6,4,2,6,2 autológ plazma heterológ plazma egészséges nem terhes plazma Praeeclampsiás terhes plazma autológ plazma heterológ plazma egészséges Praeeclampsiás nem terhes plazma plazma 3. ábra a) Plazmaminták hatása az egészséges terhes nők granulocytáinak PDBu indukálta átlagos szuperoxid-anion-termelésére. A granulocytákat nem terhes, praeeclampsiás terhes, valamint autológ és heterológ egészséges terhes nőkből izolált inaktivált () és nem inaktivált () plazmamintákban inkubáltuk. A szuperoxid-anion-termelést a szövegben leírtak szerint mértük. Az átlagértékeket (±SD) hat egymástól független mérés alapján számoltuk ki. A granulocytákat és a plazmamintákat csoportonként hat nő perifériás vérmintáiból izoláltuk. A szignifikanciaszint jelöléseinek magyarázatai: ***p<, autológ és egészséges terhes eredményei között. ###p<, autológ és egészséges terhes között b) Plazmaminták hatása az egészséges terhes nők granulocytáinak FMLP indukálta átlagos szuperoxid-anion-termelésére. A granulocytákat nem terhes, praeeclampsiás terhes, valamint autológ és heterológ egészséges terhes nőkből izolált inaktivált () és nem inaktivált () plazmamintákban inkubáltuk. A szuperoxid-anion-termelést a szövegben leírtak szerint mértük. Az átlagértékeket (±SD) hat egymástól független mérés alapján számoltuk ki. A granulocytákat és a plazmamintákat csoportonként hat nő perifériás vérmintáiból izoláltuk. A szignifikanciaszint jelöléseinek magyarázata: ###p<, autológ és egészséges terhes között mechanizmus része lehet, amely védelmi mechanizmus a magzati és anyai sejteket védi az oxidatív stressz okozta ártalmaktól. Hasonló csökkenést a ˉ -produkcióban nem figyeltünk meg praeeclampsiás terhesek esetében, így arra következtethetünk, hogy praeeclampsiás terhesek esetében az anyai immunrendszer károsodott, és a granulocytafunkció csökkenésének elmaradása szerepet játszhat a praeeclampsiások endothelsejt-károsodásának kiváltásában. Egészséges terhességben a csökkent ˉ -termelésen kívül más granulocytafunkció is csökken, nevezetesen a kemotaxis, a kitapadás, az úgynevezett killing funkció és a fagocitózis [25, 26, 27, 28]. Ezentúl epidemiológiai tanulmányokból ismert a bakteriális és virális infekciók incidenciájának emelkedése terhes nőknél [29, 3]. Az epidemiológiai adatokkal összhangban vannak az általunk ismertetett eredmények, tekintettel arra, hogy a neutrophilek termelte reaktívoxigén-intermedierek elsődleges szerepet játszanak a patogén mikroorganizmusok eradikálásában [3]. Mindezeken túl vannak adatok arra vonatkozóan, hogy az egészséges terhes nők vérplazmája a nem terhesek kontrollként használt granulocytáinak fagocitózisát és ölő funkcióját is gátolja [28, 32]. Ezzel összhangban mi is kimutattuk a szupprimáló hatását az egészséges terhesek inaktivált és nem inaktivált plazmájának a nem terhesek és praeeclampsiás terhesek granulocytáinak PDBu stimulálta ˉ -termelésére. Ezzel szemben FMLP-stimuláció hatására hasonló, ˉ termelésbeli csökkenés nem következett be, amikor az egészséges terhesek inaktivált plazmájában inkubáltuk a 43 22 53. évfolyam,. szám
a),8 -termelés [nmol/perc/3 5 sejt],6,4,2,6,2 b),8 autológ plazma heterológ plazma egészséges egészséges nem terhes plazma terhes plazma -termelés [nmol/perc/3 5 sejt],6,4,2,6,2 autológ plazma heterológ plazma egészséges egészséges terhes nem terhes plazma plazma 4. ábra a) Plazmaminták hatása a praeeclampsiás terhes nők granulocytáinak átlagos PDBu indukálta szuperoxid-anion-termelésére. A granulocytákat nem terhes, egészséges terhes, valamint autológ és heterológ praeeclampsiás terhes nőkből izolált inaktivált () és nem inaktivált () plazmamintákban inkubáltuk. A szuperoxid-anion-termelést a szövegben leírtak szerint mértük. Az átlagértékeket (±SD) hat egymástól független mérés alapján számoltuk ki. A granulocytákat és a plazmamintákat csoportonként hat nő perifériás vérmintáiból izoláltuk. A szignifikanciaszint jelöléseinek magyarázatai: *p<,5 autológ és egészséges terhes eredményei között. ###p<, autológ és egészséges terhes között b) Plazmaminták hatása a praeeclampsiás terhes nők granulocytáinak átlagos FMLP indukálta szuperoxid-anion-termelésére. A granulocytákat inaktivált nem terhes, egészséges terhes, valamint autológ és heterológ praeeclampsiás terhes nőkből izolált inaktivált () és nem inaktivált () plazmamintákban inkubáltuk. A szuperoxid-anion-termelést a szövegben leírtak szerint mértük. Az átlagértékeket (±SD) hat egymástól független mérés alapján számoltuk ki. A granulocytákat és a plazmamintákat csoportonként hat nő perifériás vérmintáiból izoláltuk. A szignifikanciaszint jelölésének magyarázata: ###p<, autológ és egészséges terhes között praeeclampsiás vagy nem terhes nőkből származó granulocytákat. Ebből arra következtetünk, hogy az FMLP indukálta ˉ -termelés gátlásáért felelős plazmafaktor hőérzékeny és az inaktiválás során denaturálódik. Ezen következtetés ellenőrzésére a nem terhesek és praeeclampsiás terhesek granulocytáit egészséges terhes nem inaktivált vérplazmájával is kezeltük. Az így született eredmények azt mutatták, hogy az egészséges terhes nem inaktivált vérplazmája már képes arra, hogy a nem terhes és praeeclampsiás terhes nők granulocytáinak FMLP indukálta ˉ -termelését csökkentse. A kapott eredményekben nagy valószínűséggel nem játszik szerepet az idegen plazma, azaz az idegen immunológiai környezet, hiszen nem volt szignifikáns különbség sem a PDBu, sem az FMLP stimulálta ˉ -termelésben, amikor a nem terhesek és praeeclampsiás terhesek granulocytáit autológ és heterológ plazmamintákkal kezeltük. Vizsgálataink azt is kimutatták, hogy a praeeclampsiás nők vérplazmája nem növeli a nem terhes nők granulocytáinak ˉ -termelését sem PDBu-, sem FMLP-stimuláció hatására. Annak érdekében, hogy bebizonyítsuk, hogy a ˉ termelés csökkenését az egészséges terhesek vérplazmája okozza, egészséges terhesek granulocytáit inkubáltuk nem terhesek és praeeclampsiás terhesek plazmájában. Ezen kísérleteink eredményei azt mutatták, hogy az egészséges terhesek granulocytáinak csökkent ˉ -termelését fokozza a nem terhes és praeeclampsiás terhes plazmája. PDBu-val történő stimuláció esetén mind az inaktivált, mind a nem inaktivált plazmaminták képesek 22 53. évfolyam,. szám 432
voltak a ˉ -termelés fokozására. Az FMPL-indukció hatására, amennyiben az egészséges terhesek granulocytáit a nem terhesek és a praeeclampsiás terhesek nem inaktivált plazmamintáival kezeltük, úgy a ˉ -termelés emelkedett az autológ és heterológ nem inaktivált plazmával való kezeléshez hasonlítva, míg ez utóbbi két plazma hatása között nem volt szignifikáns eltérés. Azonban FMLP-stimuláció hatására, ha az egészséges terhesek granulocytáit inaktivált autológ és heterológ plazmamintákkal kezeljük, akkor nem kapunk szignifikáns eltérést azzal összehasonlítva, mikor ezeket a sejteket nem terhesek és praeeclampsiás terhesek inaktivált plazmáival kezeltük. Ezen eredmények arra utalnak, hogy az egészséges terhesekben az FMLP indukálta ˉ -termelés gátlásáért felelős plazmafaktor inaktiválódott a hőkezelés hatására, így a ˉ -termelést nem volt képes csökkenteni. Mindeddig nem volt tudományos eredmény arról, hogy az egészséges terhesek vérében keringő plazmafaktor gátolni képes a nem terhes és praeeclampsiás terhes nők granulocytáinak ˉ -termelését. Eredményeinkből arra lehet következtetni, hogy a kérdéses faktor a PKC aktivációját, illetve a citoszolból a sejtmembránba történő transzlokációját zavarja meg. Kísérletes adatok bebizonyították, hogy a terhesség és a praeeclampsia során a komplementrendszer aktiválódik [33], de azon eredményünk kapcsán, hogy inaktivált és nem inaktivált plazmamintákkal is hasonló eredményeket kaptunk PDBu-stimuláció esetén, valószínűtlennek tűnik, hogy a hőre inaktiválódó komplementrendszer szerepet játszana a granulocytafunkció módosulásában terhesség, illetve praeeclampsia esetében. Ismert, hogy a NADPHoxidáz citoszolban elhelyezkedő komponenseinek sejtmembránba történő transzlokációja és aktivációja szükséges ahhoz, hogy az így összeállt enzimrendszer ˉ -t termeljen [34]. Azon indukálószerek, amiket kísérleteinkben használtunk, a PKC-t aktiválják különböző útvonalakon keresztül. Az FMLP-formil peptidreceptoraihoz kapcsolódása után a foszfatidil-inozitol-4,5-biszfoszfát hidrolízisét indukálva inozitol-,4,5-trifoszfát és diacilglicerol (DAG) képződéséhez vezet, ami a PKC-t aktiválja [35]. A PDBu-nak nincs sejtfelszíni receptora, hanem átjutva a sejtmembránon a DAG hatásmechanizmusát utánozva direkt módon aktiválja a PKC-t [36]. Azt feltételezzük, hogy a nem inaktivált plazmafaktorok a formil-peptid receptorokkal lépnek interakcióba és azok ligandkötő kapacitását csökkentik, ami ahhoz vezet, hogy ezen receptorok kevésbé lesznek képesek a ˉ -termeléshez vezető útvonal aktiválására. Hőkezelés hatására ez a plazmafaktor olyan konformációbeli átalakuláson mehet keresztül, hogy elveszíti a képességét arra, hogy a receptor mediálta útvonalat befolyásolni tudja. A PDBu esetében a hőkezelés hatására bekövetkező, PKC-útvonalon ható plazmafaktor konformációváltozása nem befolyásolja a ˉ -termelés csökkentését. Egy lehetséges magyarázata a PDBu stimu lálta ˉ -termelés egészséges terhesekben bekövetkező csökkenésének az, hogy mind az inaktivált, mind a nem inaktivált plazmafaktorok képesek gátolni a PKC akti vációját vagy annak transzlokációját a sejtmembránba. Új eredményeinket összefoglalva megállapíthatjuk, hogy egészséges terhességben a neutrophil granulocyták ˉ -termelése csökken nem terhesek hasonló eredményeihez képest, ami a hemiallograft magzat érdekében egy protektív mechanizmus lehet. Az említett csökkenés nem következik be praeeclampsiás terhességben, amit valószínűleg az immunreguláció károsodása okoz. Praeeclampsiás terhességben a ˉ -termelés csökkenésének elmaradása endothelkárosodáshoz vezethet. Az egészséges terhességben megfigyelhető ˉ -termelés csökkenését a vérplazmában keringő, egyelőre ismeretlen, anyai vagy magzati sejtek által termelt, granulocytafunkciót csökkentő faktor okozhatja, amely faktor hiányzik a praeeclampsiás terhességben. Eredményeink tehát nem támasztják alá a korábban praeeclampsiában megfigyelt, ˉ -termelést stimuláló plazmafaktor létezését. A plazmakísérleteink kapcsán megállapíthatjuk, hogy valószínűtlen a komplementrendszer granulocyták ˉ -termelését befolyásoló hatása. Az említett plazmafaktor azonosítása, illetve kora terhességben a ˉ -termelés-csökkenés elmaradásának kimutatása kiegészítő vizsgálatok esetén alkalmas lehet a praeeclampsia előrejelzésére, ezzel a terhesgondozás költséghatékonyabbá tételére egy magas rizikójú csoport kiszűrésével, esetleg farmakológiai prevencióban történő előrelépésre. Köszönetnyilvánítás A szerző köszönetét fejezi ki témavezetőinek, Prof. Dr. Póka Róbertnek és Dr. Szűcs Sándornak kitartó segítségükért, valamint Dr. Tóth Zoltán és Dr. Ádány Róza professzoroknak, amiért lehetővé tették intézetükben a munka elvégzését. Irodalom [] Sibai, B. M., Dekker, G., Kupferminc, M.: Pre-eclampsia. Lancet, 25, 365, 785 799. [2] Goldenberg, R. L., Rouse, D. J.: Prevention of premature birth. N. Engl. J. Med., 998, 339, 33 32. [3] Berg, C. J., Chang, J., Callaghan, W. M., et al.: Pregnancy-related mortality in the United States, 99 997. Obstet. Gynecol., 23,, 287 296. [4] Lain, K. Y., Roberts, J. M.: Contemporary concepts of the pathogenesis and management of preeclampsia. JAMA, 22, 287, 383 386. [5] Mutter, W. P., Karumanchi, S. A.: Molecular mechanisms of preeclampsia. Microvasc. Res., 28, 75, 8. [6] Hubel, C. A.: Oxidative stress in the pathogenesis of preeclampsia. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 999, 222, 222 235. [7] Yoshioka, T., Ichikawa, L., Fogo, A.: Reactive oxygen metabolites cause massive, reversible proteinuria and glomerular sieving defect without apparent ultrastructural abnormality. J. Am. Soc. Nephrol., 99, 2, 92 92. 433 22 53. évfolyam,. szám
[8] Galle, J., Ochslen, M., Schollmeyer, P., et al.: Oxidized lipoproteins inhibit endothelium-dependent vasodilation. Hypertension, 994, 23, 556 564. [9] Stamler, F. W.: Fatal eclamptic disease of pregnant rats fed antivitamin E stress diet. Am. J. Pathol., 959, 35, 27 23. [] Harlan, J. M.: Neutrophil-mediated vascular injury. Acta Med. Scand. Suppl., 987, 75, 23 29. [] Selvaraj, R. J., Sbarra, A. J., Thomas, G. B., et al.: A microtechnique for studying chemiluminescence response of phagocytes using whole blood and its application to the evaluation of phagocytes in pregnancy. J. Reticuloendothel. Soc., 982, 3, 3 6. [2] Crouch, S. P. M., Crocker, I. P., Fletcher, J.: The effect of pregnancy on polymorphonuclear leukocyte function. J. Immunol., 995, 55, 5436 5443. [3] Sacks, G. P., Studena, K., Sargent, K., et al.: Normal pregnancy and preeclampsia both produce inflammatory changes in peripheral blood leukocytes akin to those of sepsis. Am. J. Obstet. Gynecol., 998, 79, 8 86. [4] Crocker, I. P., Wellings, R. P., Fletcher, J., et al.: Neutrophil function in women with pre-eclampsia. Br. J. Obstet. Gynaecol., 999, 6, 822 828. [5] English, D., Andersen, B. R.: Single-step separation of red blood cells. Granulocytes and mononuclear leukocytes on discontinuous density gradients of Ficoll-Hypaque. J. Immunol. Methods, 974, 5, 249 252. [6] Babior, B. M., Curnutte, J. T., Kipnes, R. S.: Biological defense mechanisms. Evidence for the participation of superoxide in bacterial killing by xanthine oxidase. J. Lab. Clin. Med., 975, 85, 235 244. [7] Pick, E., Keisari, Y.: Superoxide anion and hydrogen peroxide production by chemically elicited peritoneal macrophages Induction by multiple nonphagocytic stimuli. Cell. Immunol., 98, 59, 3 38. [8] Tsukimori, K., Nakano, H., Wake, N.: Difference in neutrophil superoxide generation during pregnancy between preeclampsia and essential hypertension. Hypertension, 27, 49, 436 44. [9] Tsukimori, K., Tsushima, A., Fukushima, K., et al.: Neutrophilderived reactive oxygen species can modulate neutrophil adhesion to endothelial cells in preeclampsia. Am. J. Hypertens., 28, 2, 587 59. [2] Miller, C., Russell, A. S.: Polymorphonuclear leukocyte response to stimulation in vitro during pregnancy. Inflammation, 986,, 25 222. [2] Crouch, S. P. M., Crocker, I. P., Fletcher, J.: The effect of pregnancy on polymorphonuclear leukocyte function. J. Immunol., 995, 55, 5436 5443. [22] Kindzelskii, A. L., Huang, J. B., Chaiworapongsa, T., et al.: Pregnancy alters glucose-6-phosphate dehydrogenase trafficking, cell metabolism, and oxidant release of maternal neutrophils. J. Clin. Invest., 22,, 8 8. [23] Kindzelskii, A. L., Ueki, T., Michibata, H., et al.: 6-phosphogluconate dehydrogenase and glucose-6-phosphate dehydrogenase form a supramolecular complex in human neutrophils that undergoes retrograde trafficking during pregnancy. J. Immunol., 24, 72, 6373 638. [24] Terness, P., Kallikourdis, M., Betz, A. G., et al.: Tolerance signaling molecules and pregnancy: IDO, galectins, and the renaissance of regulatory T cells. Am. J. Reprod. Immunol., 27, 58, 238 254. [25] Krause, P. J., Ingardia, C. J., Pontius, L. T., et al.: Host defense during pregnancy: neutrophil chemotaxis and adherence. Am. J. Obstet. Gynecol., 987, 57, 274 28. [26] Björksten, B., Söderström, T., Damber, M. G., et al.: Polymorphonuclear leukocyte function during pregnancy. Scand. J. Immunol., 978, 8, 257 262. [27] El-Maallem, H., Fletcher, J.: Impaired neutrophil function and myeloperoxidase deficiency in pregnancy. Br. J. Haematol., 98, 44, 375 38. [28] Persellin, R. H., Thoi, L. L.: Human polymorphonuclear leukocyte phagocytosis in pregnancy: development of inhibition during gestation and recovery in the post partum period. Am. J. Obstet. Gynecol., 979, 34, 25 255. [29] Brabin, B. J.: Epidemiology of infection in pregnancy. Rev. Infect. Dis., 985, 7, 579 63. [3] Jamieson, D. J., Theiler, R. N., Rasmussen, S. A.: Emerging infections and pregnancy. Emerg. Infect. Dis., 26, 2, 638 643. [3] Witko-Sarsat, V., Rieu, P., Descamps-Latscha, B., et al.: Neutrophils: molecules, functions and pathophysiological aspects. Lab. Invest., 2, 8, 67 653. [32] Persellin, R. H., Thoi, L. L.: Human polymorphonuclear leukocyte phagocytosis in pregnancy: development of inhibition during gestation and recovery in the post partum period. Am. J. Obstet. Gynecol., 979, 34, 25 255. [33] Derzsy, Z., Prohászka, Z., Rigó, J. Jr.: Activation of the complement system in normal pregnancy and preeclampsia. Mol. Immunol., 2, 47, 5 56. [34] Nauseef, W. M., Volpp, B. D., McCormick, S.: Assembly of the neutrophil respiratory burst oxidase. J. Biol. Chem., 99, 266, 59 597. [35] Panaro, M. A., Acquafredda, A., Sisto, M., et al.: Biological role of the N-formyl peptide receptors. Immunopharmacol. Immunotoxicol., 26, 28, 3 27. [36] Goel, G., Makkar, H. P., Francis, G., et al.: Phorbol esters: structure, biological activity, and toxicity in animals. Int. J. Toxicol., 27, 26, 279 288. (Lampé Rudolf dr., Debrecen, Nagyerdei krt 98., 432 e-mail: rudolflampe@msn.com) 22 53. évfolyam,. szám 434