1. A nitrogén körforgása 2. Fehérjék lebontása Táplálékfehérjék lebontása aminosavakká Saját fehérjék lebontása Féléletidő szabályozása Ubikvitin konjugáció Proteaszómális lebontás 3. Aminosavak lebontása Transzaminálás: aminocsoport eltávolítása glutamátra transzamináz-plp segítségével Glutamát oxidatív dezaminálása (glutamát dehidrogenáz) Ammónia beépítése ureába: karbamoil-foszfát szintézis, urea ciklus Aminosavak szénláncának lebontása 4. Nitrogénfixáció 5. Ammónia-asszimiláció Glutamát dehidrogenáz, sztereokémiai kontroll Glutamin szintetáz Karbamoil-foszfát szintézis 6. Aminosavak szintézise, esszenciális és nem-esszenciális aminosavak 7. Nukleotid-szintézis: de novo és salvage útvonalak Pirimidin nukleotidok szintézise Tetrahidrofólsav koenzim, C1 intermedierek Purin nukleotidok szintézise Dezoxiribonukleotidok szintézise Timidilát szintézis
A nitrogén körforgása Az aminosavak N-tartalma ammóniából, ez pedig végső soron légköri N 2 -ből származik. (diazotrófok) Aminosavak felhasználása: - fehérjeszintézis - N-forrás nukleotidok, neurotranszmitterek, porfirin-vegyületek számára
N 2 fixáció A pillangósok gyökerén szimbiózisben élő Rhizobium baktériumok a legfontosabb nitrogénfixálók. Az bioszféra éves produkciója 10 11 kg N 2 megkötése. (A Nif géncsoport 18 gént tartalmaz.) N 2 -fixáció globális megoszlása 60 % biológiai N 2 fixáció 15 % villámlás, UV-sugárzás 25 % ipari folyamatok N 2 + 3H 2 -> 2NH 3 G 0 = -33,5 kj/mol Az ammónia képződése termodinamikailag kedvező. A N 2 -fixáció során történő ATP-felhasználás az igen magas kinetikai gát leküzdéséhez szükséges. Azote (Lavoisier): élettelen (inert sajátság) N N kötési energia 942 kj/mol Haber-Bosch ipari ammónia-szintézis: 500 C, 300 atm, Fe katalizátor
A nitrogenáz komplex dinitrogenáz-reduktázból és dinitrogenázból áll és az alábbi reakciót katalizálja. N 2 + 8 e - + 8 H + +16 ATP + 16 H 2 O 2 NH 3 + H 2 + 16 ADP +16 P i (fotoszintézis, oxidatív folyamatok) O 2 -szint alacsonyan tartása: leghemoglobin
A dinitrogenáz-reduktáz két azonos alegységből álló, vas-kén centrummal összekapcsolt P-loop NTPáz fehérje. A dinitrogenáz-reduktáz szerepe az, hogy az erősen negatív redoxpotenciálú ferredoxinról elektronokat szállítson a dinitrogenáz komponensre. Az ATP-hidrolízis okozta konformáció-változás elősegíti az elektrontranszfert a dinitogenázra.
A dinitrogenáz egység 2 2 tetramer, amely két FeS és két FeMo centrumot tartalmaz. Az elektronok a P cluster FeS centrumára érkeznek és tevődnek át a különleges FeMo redox centrumra, ahol a nitrogén fixálása játszódik le. két 4Fe-3S részklaszter + 1 központi szulfidion két M-3Fe-3S részklaszter + 3 központi szulfidion Homocitrát
A FeMo centrum köti a nitrogént és fellazítja az N 2 molekula kötésrendszerét.
1. A nitrogén körforgása 2. Fehérjék lebontása Táplálékfehérjék lebontása aminosavakká Saját fehérjék lebontása Féléletidő szabályozása Ubikvitin konjugáció Proteaszómális lebontás 3. Aminosavak lebontása Transzaminálás: aminocsoport eltávolítása glutamátra transzamináz-plp segítségével Glutamát oxidatív dezaminálása (glutamát dehidrogenáz) Ammónia beépítése ureába: karbamoil-foszfát szintézis, urea ciklus Aminosavak szénláncának lebontása 4. Nitrogénfixáció 5. Ammónia-asszimiláció Glutamát dehidrogenáz, sztereokémiai kontroll Glutamin szintetáz Karbamoil-foszfát szintézis 6. Aminosavak szintézise, esszenciális és nem-esszenciális aminosavak 7. Nukleotid-szintézis: de novo és salvage útvonalak Pirimidin nukleotidok szintézise Tetrahidrofólsav koenzim, C1 intermedierek Purin nukleotidok szintézise Dezoxiribonukleotidok szintézise Timidilát szintézis
Az ammónia asszimilációja A glutamát dehidrogenáz baktériumokban és növényekben NADPH koenzim jelenlétében az -ketoglutarát glutamát reakcióval hasznosítja az ammóniát. A gerincesek májában található enzim nem tesz különbséget NADH és NADPH között. Schiff-bázis királis!
Sztereokémiai kontroll A glutamát dehidrogenáz aktívhelye sztereospecifikusan az akirális -ketoglutarátból az L konfigurációjú glutamátot szintetizálja. A többi aminosav szintézisekor a szereokémiai kontroll (azaz a megfelelő kiralitású vegyületek szintézisének biztosítása) PLP által közvetített transzaminációs reakciókban valósul meg.
1. A nitrogén körforgása 2. Fehérjék lebontása Táplálékfehérjék lebontása aminosavakká Saját fehérjék lebontása Féléletidő szabályozása Ubikvitin konjugáció Proteaszómális lebontás 3. Aminosavak lebontása Transzaminálás: aminocsoport eltávolítása glutamátra transzamináz-plp segítségével Glutamát oxidatív dezaminálása (glutamát dehidrogenáz) Ammónia beépítése ureába: karbamoil-foszfát szintézis, urea ciklus Aminosavak szénláncának lebontása 4. Nitrogénfixáció 5. Ammónia-asszimiláció Glutamát dehidrogenáz, sztereokémiai kontroll Glutamin szintetáz Karbamoil-foszfát szintézis 6. Aminosavak szintézise, esszenciális és nem-esszenciális aminosavak 7. Nukleotid-szintézis: de novo és salvage útvonalak Pirimidin nukleotidok szintézise Tetrahidrofólsav koenzim, C1 intermedierek Purin nukleotidok szintézise Dezoxiribonukleotidok szintézise Timidilát szintézis
Az ammónia hasznosításában és szállításában a glutamin amid nitrogénnek fontos szerepe van. A glutaminsavba a glutamin szintetáz épít be újabb ammóniumiont acilfoszfát intermedieren keresztül. A glutamin szintetáz minden organizmusban megtalálható. Baktériumokban és növényekben primer szerepe az ammónia asszimilációja. Heterotróf élőlényekben a glutamin központi szerepet játszik a nitrogéntartalmú vegyületek anyagcseréjében.
A glutamin szintetáz (E. coli) szerkezete Az enzim 12 azonos alegységből áll, melyek két hexagonális gyűrűbe rendeződnek. Az enzim többszörös reguláció alatt áll, működését egyrészt kumulatív allosztérikus visszacsatolás (feedback), másrészt reverzibilis kovalens módosítás szabályozza.
A glutamin szintetáz kumulatív alloszterikus feedback regulációja Az enzimet a gutaminból kiinduló szintézisek különböző végtermékei részlegesen gátolják - ezek gátló hatása összeadódik. A glicin és az alanin az aminosavanyagcsere általános állapotának indikátoraiként szabályozzák az ammónia belépését a nitrogéntartalmú vegyületek anyagcseréjébe.
A glutamin szintetáz szabályozása reverzibilis kémiai módosítással Az enzim minden alegységén egy specifikus tirozin oldallánc reverzibilisen adenilálható. Az adenilált enzim kevésbé aktív, és fokozott érzékenységet mutat a kumulatív allosztérikus inhibitorokra. Az adenilálást és deadenilálást ugyanaz az adeniltranszferáz (AT) enzim végzi a hozzá kapcsolódó P regulátor fehérje állapotától függően.
A regulátor fehérje két alakjának átalakítását az uridiltranszferáz végzi, melynek működését metabolitok szabályozzák. (Kaszkád reakció)
1. A nitrogén körforgása 2. Fehérjék lebontása Táplálékfehérjék lebontása aminosavakká Saját fehérjék lebontása Féléletidő szabályozása Ubikvitin konjugáció Proteaszómális lebontás 3. Aminosavak lebontása Transzaminálás: aminocsoport eltávolítása glutamátra transzamináz-plp segítségével Glutamát oxidatív dezaminálása (glutamát dehidrogenáz) Ammónia beépítése ureába: karbamoil-foszfát szintézis, urea ciklus Aminosavak szénláncának lebontása 4. Nitrogénfixáció 5. Ammónia-asszimiláció Glutamát dehidrogenáz, sztereokémiai kontroll Glutamin szintetáz Karbamoil-foszfát szintézis 6. Aminosavak szintézise, esszenciális és nem-esszenciális aminosavak 7. Nukleotid-szintézis: de novo és salvage útvonalak Pirimidin nukleotidok szintézise Tetrahidrofólsav koenzim, C1 intermedierek Purin nukleotidok szintézise Dezoxiribonukleotidok szintézise Timidilát szintézis
Az ammónia asszimilációjának harmadik lehetséges módja a karbamoilfoszfát szintézise
1. A nitrogén körforgása 2. Fehérjék lebontása Táplálékfehérjék lebontása aminosavakká Saját fehérjék lebontása Féléletidő szabályozása Ubikvitin konjugáció Proteaszómális lebontás 3. Aminosavak lebontása Transzaminálás: aminocsoport eltávolítása glutamátra transzamináz-plp segítségével Glutamát oxidatív dezaminálása (glutamát dehidrogenáz) Ammónia beépítése ureába: karbamoil-foszfát szintézis, urea ciklus Aminosavak szénláncának lebontása 4. Nitrogénfixáció 5. Ammónia-asszimiláció Glutamát dehidrogenáz, sztereokémiai kontroll Glutamin szintetáz Karbamoil-foszfát szintézis 6. Aminosavak szintézise, esszenciális és nem-esszenciális aminosavak 7. Nukleotid-szintézis: de novo és salvage útvonalak Pirimidin nukleotidok szintézise Tetrahidrofólsav koenzim, C1 intermedierek Purin nukleotidok szintézise Dezoxiribonukleotidok szintézise Timidilát szintézis
E. coli mind a 20 aminosavat képes szintetizálni, az ember csak 11-et.
A sok szintetikus lépést igénylő aminosavak váltak esszenciálissá, mert az evolúció során valamelyik szintetikus részlépés kiesett. Aminosav(ak) deficienciája -> Negatív nitrogén mérleg: a fehérje-lebontás mértéke meghaladja a fehérje-szintézisét -> a nitrogén a táplálékkal elfogyaszottnál nagyobb mennyiségben ürül.
Az aminosav szintézisek a prekurzor alapján családokba rendezhetők. (vastag betű = esszenciális aminosav) 1 lépés Az aminosavak széntartalma a glikolízis, a pentózfoszfát útvonal és a citromsavciklus intermediereiből származik. 1 lépés 1 lépés de novo 10 lépés, fenilalaninból 1 lépés de novo 10 lépés, ornitinből 3 lépés az urea ciklusban
1. A nitrogén körforgása 2. Fehérjék lebontása Táplálékfehérjék lebontása aminosavakká Saját fehérjék lebontása Féléletidő szabályozása Ubikvitin konjugáció Proteaszómális lebontás 3. Aminosavak lebontása Transzaminálás: aminocsoport eltávolítása glutamátra transzamináz-plp segítségével Glutamát oxidatív dezaminálása (glutamát dehidrogenáz) Ammónia beépítése ureába: karbamoil-foszfát szintézis, urea ciklus Aminosavak szénláncának lebontása 4. Nitrogénfixáció 5. Ammónia-asszimiláció Glutamát dehidrogenáz, sztereokémiai kontroll Glutamin szintetáz Karbamoil-foszfát szintézis 6. Aminosavak szintézise, esszenciális és nem-esszenciális aminosavak 7. Nukleotid-szintézis: de novo és salvage útvonalak Pirimidin nukleotidok szintézise Tetrahidrofólsav koenzim, C1 intermedierek Purin nukleotidok szintézise Dezoxiribonukleotidok szintézise Timidilát szintézis
Nukleotidok biológiai szerepei Nukleinsav szintézis (DNS, RNS) Energiaforgalom (ATP, GTP, NAD, FAD) Bioszintetikus folyamatok (UDP-glükóz, glikogén) Jelátvitel (camp, cgmp, GTP, ATP/kinázok) Nukleotid szintézis enzimek: terápiás célpontok (rák)
Nukleotid szintézis de novo és salvage útvonalai De novo: egyszerűbb vegyületekből - pirimidin nukleotidok: bázis szintézise, ezután ribózra kapcsolás - purin nukleotidok: ribózalapú szerkezetre Salvage: kész bázisok ribózra kapcsolása (PRPP: 5-foszforibozil-1-pirofoszfát) A dezoxiribonukleotidok a ribonukleotidokból szintetizálódnak.
1. A nitrogén körforgása 2. Fehérjék lebontása Táplálékfehérjék lebontása aminosavakká Saját fehérjék lebontása Féléletidő szabályozása Ubikvitin konjugáció Proteaszómális lebontás 3. Aminosavak lebontása Transzaminálás: aminocsoport eltávolítása glutamátra transzamináz-plp segítségével Glutamát oxidatív dezaminálása (glutamát dehidrogenáz) Ammónia beépítése ureába: karbamoil-foszfát szintézis, urea ciklus Aminosavak szénláncának lebontása 4. Nitrogénfixáció 5. Ammónia-asszimiláció Glutamát dehidrogenáz, sztereokémiai kontroll Glutamin szintetáz Karbamoil-foszfát szintézis 6. Aminosavak szintézise, esszenciális és nem-esszenciális aminosavak 7. Nukleotid-szintézis: de novo és salvage útvonalak Pirimidin nukleotidok szintézise Tetrahidrofólsav koenzim, C1 intermedierek Purin nukleotidok szintézise Dezoxiribonukleotidok szintézise Timidilát szintézis
Pirimidin nukleotidok de novo szintézise (Gln oldalláncból) CPS (karbamoilfoszfát szintetáz)
Pirimidingyűrű szintézise: Orotát szintézise karbamoil-foszfátból és aszpartátból aszpartát transzkarbamoiláz kondenzáció, gyűrűképződés oxidáció
Orotát ribózra kapcsolása (ribóz-5-foszfát (pentózfoszfát útvonal) + ATP --> ) pirimidin foszforibozil-transzferáz
Orotidilát dekarboxilezése, UMP képződése Orotidilát dekarboxiláz: 1/78 M év -> 1/s (10 17 -szeres sebességfokozás)
Nukleozid mono-, di- és trifoszfátok átalakulásai A specifikus nukleozid monofoszfát kinázok ATP-t használnak foszfátdonorként: UMP + ATP = UDP + ADP (UMP kináz) A széles specificitású nukleozid difoszfát kinázok az NDP-NTP átalakulást katalizálják: XDP + YTP = XTP + YDP
CTP keletkezése UTP aminációjával A reakció a karbamoil-foszfát szintézishez hasonlóan játszódik le.
Pirimidin nukleotidok szintézisének összefoglalása
1. A nitrogén körforgása 2. Fehérjék lebontása Táplálékfehérjék lebontása aminosavakká Saját fehérjék lebontása Féléletidő szabályozása Ubikvitin konjugáció Proteaszómális lebontás 3. Aminosavak lebontása Transzaminálás: aminocsoport eltávolítása glutamátra transzamináz-plp segítségével Glutamát oxidatív dezaminálása (glutamát dehidrogenáz) Ammónia beépítése ureába: karbamoil-foszfát szintézis, urea ciklus Aminosavak szénláncának lebontása 4. Nitrogénfixáció 5. Ammónia-asszimiláció Glutamát dehidrogenáz, sztereokémiai kontroll Glutamin szintetáz Karbamoil-foszfát szintézis 6. Aminosavak szintézise, esszenciális és nem-esszenciális aminosavak 7. Nukleotid-szintézis: de novo és salvage útvonalak Pirimidin nukleotidok szintézise Tetrahidrofólsav koenzim, C1 intermedierek Purin nukleotidok szintézise Dezoxiribonukleotidok szintézise Timidilát szintézis
Az egyszénatomos, ún. C 1 intermedierek transzferében a tetrahidrofólsav koenzim játszik fontos szerepet Emlősökben nem szintetizálódik: tápanyagból vagy bélflórából kerül felvételre
A tetrahidrofolsavhoz kapcsolódó C 1 intermedierek átalakulásai =>timin => metionin =>purin nukleotidok
1. A nitrogén körforgása 2. Fehérjék lebontása Táplálékfehérjék lebontása aminosavakká Saját fehérjék lebontása Féléletidő szabályozása Ubikvitin konjugáció Proteaszómális lebontás 3. Aminosavak lebontása Transzaminálás: aminocsoport eltávolítása glutamátra transzamináz-plp segítségével Glutamát oxidatív dezaminálása (glutamát dehidrogenáz) Ammónia beépítése ureába: karbamoil-foszfát szintézis, urea ciklus Aminosavak szénláncának lebontása 4. Nitrogénfixáció 5. Ammónia-asszimiláció Glutamát dehidrogenáz, sztereokémiai kontroll Glutamin szintetáz Karbamoil-foszfát szintézis 6. Aminosavak szintézise, esszenciális és nem-esszenciális aminosavak 7. Nukleotid-szintézis: de novo és salvage útvonalak Pirimidin nukleotidok szintézise Tetrahidrofólsav koenzim, C1 intermedierek Purin nukleotidok szintézise Dezoxiribonukleotidok szintézise Timidilát szintézis
A purinváz atomjainak eredete 8 az Asp-nak csak az aminocsoportja marad a vázban, fumarát távozik 6-7 karboxil kapcsolódás (hidrogénkarbonátból) és transzfer (N3-ról C4-re) 2 9 N10-formil-THF-ról 4 1 PRPP-ből 5Pribozilamin 3 N10-formil-THF-ról 10 gyűrűzáródás, IMP képződés 5 imidazolgyűrű záródása
AMP és GMP keletkezése IMP-ből
1. A nitrogén körforgása 2. Fehérjék lebontása Táplálékfehérjék lebontása aminosavakká Saját fehérjék lebontása Féléletidő szabályozása Ubikvitin konjugáció Proteaszómális lebontás 3. Aminosavak lebontása Transzaminálás: aminocsoport eltávolítása glutamátra transzamináz-plp segítségével Glutamát oxidatív dezaminálása (glutamát dehidrogenáz) Ammónia beépítése ureába: karbamoil-foszfát szintézis, urea ciklus Aminosavak szénláncának lebontása 4. Nitrogénfixáció 5. Ammónia-asszimiláció Glutamát dehidrogenáz, sztereokémiai kontroll Glutamin szintetáz Karbamoil-foszfát szintézis 6. Aminosavak szintézise, esszenciális és nem-esszenciális aminosavak 7. Nukleotid-szintézis: de novo és salvage útvonalak Pirimidin nukleotidok szintézise Tetrahidrofólsav koenzim, C1 intermedierek Purin nukleotidok szintézise Dezoxiribonukleotidok szintézise Timidilát szintézis
A dezoxinukleotidok a ribonukleotidok redukciója során szintetizálódnak. Ribonukleotid reduktáz: A ribóz C2 atomját redukálja (OH csoportot H-ra cseréli) Szubsztrátok: NDP-k Végső redukálószer: NADPH (több köztes lépésen keresztül)
A ribonukleotid reduktáz szerkezete, katalitikus és alloszterikus kötőhelyei Regulates substrate specificity Regulates overall activity
A ribonukleotid reduktáz regulációja A katalizis általános sebességét meghatározó kötőhely ATP-t (aktivátor) vagy datp-t (gátlózer) tud kötni A szubsztrát-specifitást meghatározó allosztérikus hely biztosítja, hogy a képződő dezoxinukleotidok megfelelő arányban keletkezzenek.
1. A nitrogén körforgása 2. Fehérjék lebontása Táplálékfehérjék lebontása aminosavakká Saját fehérjék lebontása Féléletidő szabályozása Ubikvitin konjugáció Proteaszómális lebontás 3. Aminosavak lebontása Transzaminálás: aminocsoport eltávolítása glutamátra transzamináz-plp segítségével Glutamát oxidatív dezaminálása (glutamát dehidrogenáz) Ammónia beépítése ureába: karbamoil-foszfát szintézis, urea ciklus Aminosavak szénláncának lebontása 4. Nitrogénfixáció 5. Ammónia-asszimiláció Glutamát dehidrogenáz, sztereokémiai kontroll Glutamin szintetáz Karbamoil-foszfát szintézis 6. Aminosavak szintézise, esszenciális és nem-esszenciális aminosavak 7. Nukleotid-szintézis: de novo és salvage útvonalak Pirimidin nukleotidok szintézise Tetrahidrofólsav koenzim, C1 intermedierek Purin nukleotidok szintézise Dezoxiribonukleotidok szintézise Timidilát szintézis
dtmp szintézise dump-ből Timidilát szintáz Metildonor: N,N-metilén-tetrahidrofolát Uracil C5 nem jó nukleofil; enzim tiolát csoportja segíti elő a támadást az N5,N10-metilén szénatomra Hidridion transzfer a tetrahidrofolátról -> metiléncsoport metillé alakul Protonelvonás a C5 atomról -> SH felszabadulás
A timidilát szintézis számos sejtosztódásra ható kemoterápia célpontja dihidrofolát analóg
A fluorodezoxiuridilát öngyilkos inhibitor mechanizmusa Uracil C5 deprotonációt a H-F szubsztitúció megakadályozza Stabil kovalens enzim-adduktum képződik