Az NMR spektroszkópia a fehérjék szolgálatában Bodor Andrea ELTE Szerkezeti Kémia és Biológia Laboratórium 2011.01.18. Visegrád
Nobel díjak tükrében 1952 Fizika: Módszer és elméleti alapok Felix Bloch Edward Mills Purcell 1991 Kémia: Nagy felbontású NMR spektroszkópia Fourier transzformáció, 2D technika Richard Ernst 2002 Kémia (megosztott, ½): Biológiai makromolekulák 3D szerkezete Kurt Wüthrich 2003 Orvosi: MRI (Magnetic Resonance Imaging) felfedezése Paul C. Lauterbur Sir Peter Mansfield
NMR = Nuclear Magnetic Resonance Mágneses magrezonancia spektroszkópia rádiófrekvenciás tartomány Mennyire könnyű egy adott NMR magot mérni? Befolyásoló tényezők: Spinkvantumszám (pld. 1/2, 1, 3/2, 5/2) Természetes előfordulás ~ 100% 1 H, 19 F, 31 P, 27 Al Nagy giromágneses állandó
Melyek az NMR aktív magok?
Mivel mérünk? 500 MHz, ELTE 700 MHz, ELTE
A műszer felépítése Szupravezető mágnes, mérőfej, Rádió adó, rádió vevő, analóg-digitál konverter (ADC) Számítógép
Csövek 5mm 10 mm normál Shigemi nagynyomású
A jelenség Makroszkópikus kép M 0 eredő mágnesezettség β α Alacsony energiájú állapot Magas energiájú állapot B 0
Gerjesztés (π/2) x egyensúlyi állapot M 0 =M z gerjesztett állapot M 0 =M y z y x
Transzverz relaxáció (T 2 ) z B 0 y y y x y M y x x x z B 0 y y y z z z x y 1 Megszűnik az xy síkban a fáziskoherencia 0-1 0 4 8 12 M x = M 0 sin(ω 0 t) exp( t/t 2 ) M y = M 0 cos(ω 0 t) exp( t/t 2 )
A longitudinális relaxáció (T 1 ) x y Visszaépül a z irányú mágnesezettség Lassúbb mint a transzverz relaxáció A kvantitatív NMR lényeges eleme y y y z z z 1 0.8 0.6 szabad lecsengési jel (FID, Free Induction Decay) 0.4 0.2 0 0 20 40 60 80-0.2-0.4-0.6-0.8-1
1 jel-idő görbe (FID) 0 0 4 8 12-1 Fourier transzformáció FT jel-frekvencia változás spektrum 6.0 5.6 5.2 4.8 4.4 4.0 3.6 3.2 2.8 2.4 2.0 1.6 (ppm)
1. Kémiai eltolódás Spinek közötti kölcsönhatások B 0 Indirekt mágneses kölcsönhatás a külső mágneses mező és a magspinek között, az elektronfelhőn keresztül. elektronok 2. J csatolás Magspinek között, az őket körülvevő elektronfelhő közreműködésével megjelenő indirekt mágneses kölcsönhatás. 3. Közvetlen (direkt) dipól-dipól csatolás Magspinek közötti közvetlen mágneses kölcsönhatás.
1. Kémiai eltolódás Spektrumból nyerhető információk 2. Csatolási állandó 1D, 2D, 3D, nd mérések 3. noe 4. Dinamika, cserefolyamatok csatolási állandó (J érték) félértékszélesség multiplicitás terület kémiai eltolódás δ=[(υ M -υ R )/ υ R ]10 6
Fehérje NMR: szerkezet, dinamika, kölcsönhatás, mechanizmus másodlagos szerkezettel rendezetlen membránfehérje rendelkező fehérje IUP fehérje W cat rendezetlen lánc és homodimer kölcsönhatás mechanizmus
A fehérjék szerkezete
A fehérjék belső dinamikája 10-12 ps 10-9 ns 10-6 µs 10-3 ms 10 0 s 10 2 ~min sec feltekeredés kötések mozgásai T1, T2, NOE domének, nagyobb szerkezeti egységek mozgásai T1ρ, CPMG, zz exch,...
dutpase Beáta Vértessy Calpastatin Péter Tompa MASP-2 Péter Gál CCP Péter Gál APPase László Polgár Peptides and miniproteins Gábor Tóth Homeodomains Botond Penke P DLC László Nyitray Calmodulin Ovádi Judit Inhibitors László Gráf
S100A,MIIA Nyitrai László PAF Batta Gyula RSK Reményi Attila ERD, in-cell Tompa Péter TPPP25 Ovádi Judit
Membránfehérjék az NMR-ben A sejtmembrán szerkezete: Ilyen összetétel mellett NMR mérésekre alkalmatlan
A membránfehérjék típusai
Micellák Membrán mimetikumok Bicellák Vezikulák, liposzómák Detergensek: SDS, DPC,DHPC NMR-ben jól mérhetők cca 40Ǻ (DPC) Hátrány: gömb alak Kettős réteg: Lipid + detergens DMPC+ DHPC DMPG + DHPC cca 80Ǻ, q=0.5 q = [lipid]/[deterg] DMPC Legjobb mimetikum Nagy mérete miatt NMR mérésekhez nem megfelelő
Ioncsatornák: a K + csatorna N + 1 2 3 4 5 6 + C homotetramer Milyen módon nyit-zár az S3B-S4 pórus? FRAGMENSEK TANULMÁNYOZÁSA a linker szerkezete DPC micellában
Fehérje elhelyezkedése a membránban K + csatorna fragmens 13 C relaxációs mérések nehézkes Megoldás: 31 P mérések Biverståhl, 2009
TERVEK Receptorok: GLP-1R (glucanon like peptide receptor) nglp-1r A 7TM rész kismolekulákat, peptideket köt(het) 7TM 2-3 hélix fragmens mimetikumban való jellemzése mimetikum típusa körülmények megállapítása (ph, puffer, hőmérséklet) cglp-1r A GPCR B1-es családjába tartozik, kötőpartnerek: peptidhormonok, neuropeptidek A ligandum kötésében, az aktiválásban: Az extracelluláris domain vesz részt Szerepe van az első extracelluláris loop 206-219- es szegmensének
KÖSZÖNET Perczel András Rohonczy János Minden közreműködő munkatársnak TÁMOP