KÖLCSÖNHATÁS ÉS DINAMIKA. az NMR spektroszkópia, mint a modern szem. Bodor Andrea

Méret: px

Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "KÖLCSÖNHATÁS ÉS DINAMIKA. az NMR spektroszkópia, mint a modern szem. Bodor Andrea"

Adél Varga
5 évvel ezelőtt
Látták:

1 KÖLCSÖNHATÁS ÉS DINAMIKA az NMR spektroszkópia, mint a modern szem Bodor Andrea ELTE Szerkezeti Kémiai és Biológiai Laboratórium A Magyar Tudomány Ünnepe,

2 Edvard Munch: A Nap ( )

3 AZ ELEKTROMÁGNESES SUGÁRZÁS hullámhossz: 1nm 1μm 1mm 1m 1km 1GHz 1MHz frekvencia: energia: γ- sugarak X- sugarak UV IR távoli IR mikrohullámok rádióhullámok mag átmenetek belső elektronok külső elektronok rezgések forgások e - - mágneses átmenetek mag - mágneses átmenetek Mössbauer Optikai spektroszkópia ESR NMR

4 AZ NMR SPEKTROSZKÓPIA ÉS A PERIÓDUSOS RENDSZER

5 Kémia: szerkezet, konformáció ALKALMAZÁSI TERÜLETEK Gyógyszer kutatás -omika: metabolomika Analitika: eredet, minőség Szerkezeti biológia dinamika MRI

6 AZ NMR SPEKTROSZKÓPIA A BIOLÓGIAI RENDSZEREK SZOLGÁLATÁBAN OLDAT fiziológiás körülmények ph, ionkoncentráció, (NaCl, Mg 2+, Ca 2+ ) hőmérséklet,... nem invazív módon: atomi szintű információ Fehérje szerkezet: feltekeredés letekeredés denaturáló közegek (8M urea, 6M GdCl) FUNKCIÓ Fehérje dinamika: ps 10 3 s skálán szerteágazó mozgások

7 AZ NMR MINTA A maximális mérettartomány: kb. 255 kda Izotóp jelölés: fehérje expresszió 13 C, 15 N, 2 D jelölés Térerő: 11,7 23,5 T 500 MHz 1GHz Egyéb NMR aktív magok: 31 P, 19 F szelektív jelölés,... Mérések: 2D, 3D, nd

8 AZ NMR IDŐSKÁLA vibráció rotáció diffúzió domén mozgás, kinetika feltekeredés ps ns μs ms s 10 3 s NOE, R 1,R 2 R 1ρ,CPMG ZZ, STD, csere

9 Zotter, Bodor et al. FEBS Lett, (2011), Biochemistry (2011) I) KÉMIAI KINETIKA Enzim-katalizált foszfoészter kötés hidrolízise R O GTP GDP P i O P O O - O P O - O TPPP/P25 O P OH + H 2 O R O O - O P O O - O P OH + H 2 PO 4 O - - ahol R= N N O OH OH O N NH NH 2 TPPP/p25: p20 (2JRF.pdb) - Tubulin Polimerization Promoting Protein aminosav - rendezett és rendezetlen részek - Zn 2+ kötő helyek - GTP kötő helyek - GTPáz aktivitás

10 reakcióidő 31 P{ 1 H} NMR, 250 MHz I) KÉMIAI KINETIKA R O O α P O O - O P O - β O O γ P OH O - GMP Pi γ GDP GDP α β 200 μm TPPP/p25; 1,36 mm GTP; 4,0 mm Mg 2+ ; 50 mm Tris; ph= 7,0; 300 K

11 koncentráció (mm) I) KÉMIAI KINETIKA átlag reakció idő (h) GTP k 1 GDP + P i k 1 = ± mm h -1 GDP k 2 GMP + P i k 2 = ± mm h -1 GMP k 3 GMP koord. k 3 = ± mm h -1

12 I) KÉMIAI KINETIKA KÖLCSÖNHATÁS - FUNKCIÓ Fehérje k cat (min -1 ) Rac1 H-Ras Rap1A Ran TPPP/p NMR malachitzöld -a TPPP/p25 GTPáz aktivitása: a kis G fehérjék aktivitásához hasonló - 31 P NMR mérések: a reakció teljes útvonala sebességi állandók meghatározása

13 II) TRANSZLÁCIÓS DIFFÚZIÓ

14 Intenzitás II) TRANSZLÁCIÓS DIFFÚZIÓ I = I(0) exp[-d (2 π γ G i δ) 2 (Δ δ/3)] Gradiens (G/cm) Stokes Einstein: r H = kt/6 π η D

15 II) TRANSZLÁCIÓS DIFFÚZIÓ Rendezetlen fehérjék (IUP, IDP) Más módszerekkel nehezen tanulmányozhatók Szerkezeti vonások: NMR - kémiai eltolódás - hidrodinamikai sugár RENDEZETLEN DENATURÁLT FELTEKEREDETT FEHÉRJÉK HIDRODINAMIKAI SUGARA? Tompa et al. FEBS Lett, (2005), Uversky et al. Annu. Rev. Biophys. (2008), Jensen et al. Structure (2009)

16 D (m 2 /s) II) TRANSZLÁCIÓS DIFFÚZIÓ 2.00E-10 TC5B mutánsok rendezetlen 1.70E E-10 MPK szubsztrátok AnTx feltekeredett 8M urea 1.10E E-11 MIIA fragmens Tb Molekula tömeg (g/mol)

17 II) TRANSZLÁCIÓS DIFFÚZIÓ rh (Å) MPK szubsztrátok MIIA fragmens TC5B mutánsok AnTx Tb4 rendezetlen feltekeredett 8M urea Molekula tömeg (g/mol) 1 H NMR: r H denaturált > r H rendezetlen > r H feltekeredett

18 III) A PEPTID GERINC DINAMIKÁJA H 2 O 15 N: R 1, R 2, hetnoe -NH H 2 O csere

19 A molekulák oldatbeli ún. bukdácsoló mozgása τ c rotációs korrelációs idővel jellemezhető. 1/τ c rotációs frekvencia J(ω) - spektrális sűrűség függvény: J(ω) = 2 τ c / [1 + (ωτ c ) 2 ] Mért dinamikai paraméterek: R 1, R 2, hetnoe = f [J(0), J(ω N ), J(ω H )]

20 HETNOE cleanex III) A PEPTID GERINC DINAMIKÁJA R1 (s -1 ) R2 (s -1 ) MIIA: 45 aminosav hosszú IUP ms 10ms

21 III) A PEPTID GERINC DINAMIKÁJA 0.5 Redukált spektrális sűrűség analízis J(ωN) / ns rad J(0) / ns rad -1 Középső régió: legkevésbé mozgékony, inherens helicitás N-terminus:K3-D11 C-terminus: D33-K45 Krisova et al. J. Biomol. NMR (2006), Lefèvre et al., Biochemistry (1996)

22 KÖLCSÖNHATÁS - SZERKEZET homodimer G50 T42 G27 E44 N71 E26 S47 S17 S23 L8 F30 V73 N33 L32 E91 K29 D74 1 H- 15 N HSQC, 300 K 15 N:S100A4d - Ca 2+ Gingras et al. FEBS Lett, (2008)

23 KÖLCSÖNHATÁS - SZERKEZET G50 T42 G27 E44 N71 E26 S47 S17 S23 L8 F30 N33 V73 L32 E91 D74 15 N: S100A4d - Ca 2+ K29 MIIA 15 N: S100A4d - Ca 2+ a két monomer nem egyenértékű Kiss et al. PNAS, (2012), Elliot et al. Structure (2012)

24 KÖLCSÖNHATÁS - SZERKEZET D74 Ca 2+ - S100A4 Ca 2+ - S100A4 - MIIA- A Ca 2+ - S100A4 Ca 2+ - S100A4 - MIIA- A Ca 2+ - S100A4

25 KÖLCSÖNHATÁS - SZERKEZET átlagolt kémiai eltolódás: 2 ( HN ) 0.17( N ) Δδ(ppm) A Δδ(ppm) B G SH M AC P LE K AL D VM V ST F HK Y SG K EG D KF K LN K SE L KE L LT R EL P SF L GK R TD E AA F QK L MS N LD S NR D NE V DF Q EY C VF L SC I A MM C NE

26 KÖLCSÖNHATÁS - SZERKEZET - FUNKCIÓ MIIA: 1894 YRKLQRELEDATETADAMNREVSSLKNKLR RGDLPFVVPR RMARK 1937 Komplex: filamentum bontó

27 SZERKEZET DINAMIKA NMR FUNKCIÓ KÖLCSÖNHATÁS

28 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS SZKBL: Hudáky Ilona Végh Ádám Taricska Nóra Stráner Pál Náray-Szabó Gábor Zsoldosné Mády Virág Dudás Erika Perczel András Papp Dóra Láng András Kovács Bertalan Pálfy Gyula Pintér István Rovó Petra Jákli Imre Farkas Viktor Kiss-Szemán Anna Felméry Anna Vajda Tamás Csordás Barbara Karancsiné Menyhárd Dóra Harmat Veronika Ángyán Annamária GTP: Ovádi Judit (MTA/Enzimológiai Intézet) Bányai István (Debreceni Egyetem) MIIA/S100A: Nyitray László (ELTE, Biokémiai Tszk)

29 Edvard Munch:Önarckép - fotó KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Hasonló dokumentumok

FEHÉRJÉK A MÁGNESEKBEN. Bodor Andrea ELTE, Szerkezeti Kémiai és Biológiai Laboratórium. Alkímia Ma, Budapest,

FEHÉRJÉK A MÁGNESEKBEN. Bodor Andrea ELTE, Szerkezeti Kémiai és Biológiai Laboratórium. Alkímia Ma, Budapest, FEHÉRJÉK A MÁGNESEKBEN Bodor Andrea ELTE, Szerkezeti Kémiai és Biológiai Laboratórium Alkímia Ma, Budapest, 2013.02.28. I. FEHÉRJÉK: L-α aminosavakból felépülő lineáris polimerek α H 2 N CH COOH amino