S121463, EGY VAZPESSZI V 2 ATAGISTA MÉETÖVELET SZITÉZISE Ph.D. értekezés Készítette: Sántáné Csutor Andrea CII Gyógyszer- és Vegyészeti Termékek Gyára Témavezet : Dr. ermecz István a kémiai tudományok doktora Tanszéki konzulens: Dr. Keglevich György egyetemi tanár Budapesti M szaki és Gazdaságtudományi Egyetem Szerves Kémiai Technológia Tanszék 2005.
Köszönetnyilvánítás Köszönet illeti a Chinoin t. vezet it, hogy lehet vé tették számomra a doktori értekezés elkészítését. szinte köszönettel tartozom témavezet mnek, Dr. ermecz Istvánnak a témaválasztásban, a publikációk elkészítésében és az értekezés megírásában nyújtott segítségéért, szakmai és erkölcsi támogatásáért. Köszönöm a Chinoin Szintetikus Fejlesztési Laboratórium III. korábbi és jelenlegi vezet inek és minden munkatársának támogatásukat és a fejlesztés során végzett munkájukat, külön köszönöm Dr Gönczi Csabának, mind a kísérleti munkában, mind az értekezés megírásában nyújtott hasznos tanácsait, ötleteit. Köszönöm az Analitika munkatársainak a kémiai fejlesztés támogatatását, kiemelve Dr. alász Juditot és Dr. Podányi Benjámint az M vizsgálatokért és a molekula térszerkezetének felderítése érdekében végzett munkájukért. Külön köszönet illeti dr. Mucsi Zoltánt, aki az ab initio kvantumkémiai számításokkal nagymértékben hozzájárult, hogy a technológia tárgyú értekezés elméleleti eredményekkel b vülhessen. álás köszönetemet fejezem ki Filep Erika és Kis László technikusoknak a preparatív munkában nyújtott segítségüket.
Tartalomjegyzék 1. Bevezetés... 3 2. Irodalmi el zmények... 4 2.1. A gyógyszerfejlesztés kulcselemei... 4 2.2. Biológiai háttér... 5 2.2.1. Az antidiuretikus hormon... 5 2.2.2. Arginin vazopresszin (AVP) receptorok... 6 2.2.3. Vazopresszin antagonisták... 9 2.2. Kémiai el zmények... 12 2.2.1. S121463 szintézis - a Felfedez kutatás eljárása... 12 2.2.2. S121463 szintézis alternatív út... 15 2.2.3. Alternatív eljárások spiro[ciklohexán-1,3 -indolin]-2,4 -dion származékok el állítására... 17 2.2.3.1. Spiroketon el állítás 3-szubsztituált oxindolokból... 18 2.2.3.2. Gyökös ciklizáció... 19 3. Kísérleti rész...21 3.1. Szintézisstratégiák az S121463 kulcsintermedierek el állítására... 21 3.2. U44 spiroindolinon el állítása... 24 3.2.1. U15 el állítás... 24 3.2.2. U35 el állítás... 27 3.2.2.1. A triészterképz dés vizsgálata, javaslat a mechanizmusra... 33 3.2.2.1.1. Analitikai módszerek... 35 3.2.2.1.2. Kvantumkémiai számítások... 37 3.2.3. U42 szintézis... 41 3.2.3.1. eduktív gy r felnyitási kísérletek... 42 3.2.3.2. Konformáció analízis... 47 3.2.3.3. eakciómechanizmus vizsgálat... 52 3.2.3.4. Kísérlettervezés... 59 3.2.4. U43, U44 el állítás... 61 3.3. U25 szintézis... 62 3.4. S121463, a szintézis zárólépése... 64 3.4.1. S121463 bázis el állítása... 64 3.4.2. Sókiválasztás... 65 3.5. A kísérletek értékelése, eljárások összehasonlítása... 67 4. A kísérletek részletes leírása...70 4.1. U15 és intermedierei... 70 4.1.1. U15 el állítása 2-nitro-fenilecetsavon át... 70 4.1.2. U15 szintézis izatin intermedieren keresztül... 72 4.2. U35 és intermedierei... 73 4.2.1. U35 szintézis TP véd csoport alkalmazásával... 73 4.2.2. Monoészter el állítás... 74 4.2.3. Diészter el állítás... 75 4.2.4. Triészter el állítás és Dieckmann kondenzáció... 76 4.2.5. U35 spiroindolinon, one-pot eljárás... 76 4.3. U44 és intermedierei, f szennyez i... 77 4.3.1. Dioxolán el állítása és reduktív gy r felnyitási kísérletek... 77 4.3.2. Tozilezés és U44 morfolino vegyület el állítása... 78 4.3.3. Transz izomerek (U42, U43, U44) el állítása... 79
4.3.4. U35 redukciója... 81 4.4. U25 és intermedierei... 81 4.5. S121463 el állítás... 83 4.5.1. Eljárások cisz végtermék el állítására, sóképzés... 83 4.5.2. Transz izomer el állítása, sóképzés... 84 5. Összefoglalás...86 6. Irodalomjegyzék...88 2
1. Bevezetés Jól ismert az arginin vazopresszin (AVP) jelent sége a vérnyomás és a szervezet víz és elektrolit háztartás egyensúlyának kontrollálásában. Mint antidiuretikus hormon, a renális V 2 receptorokkal specifikus kölcsönhatásban fontos szerepet játszik a vese vízés sókiválasztásának szabályozásában. Jelent s terápiás értékük lehet azoknak a receptorspecifikus antagonistáknak, melyek képesek blokkolni az AVP hatását és a vízkiválasztás el segítésével alkalmasak lehetnek számos vízretenciót okozó betegség kezelésére. Azért van klinikai jelent sége hatékony V 2 antagonisták kifejlesztésének, mert e vegyületek specifikus akvaretikus potenciálja révén elkerülhet a klasszikus diuretikumok súlyos mellékhatása, a fokozott sóürítés (a + és K + ionvesztés). Korábban már szintetizáltak néhány hatásos peptid V 2 antagonista származékot, de nem kielégít biohasznosíthatóságuk, fajspecifikusságuk, nem kell szelektivitásuk (agonista hatás) gátolta terápiás használhatóságukat. Az 1990-es évek kezdetén jelentek meg a nem peptid típusú vazopresszin receptor antagonista gyógyszerjelöltek kutatására vonatkozó els közlemények. A Sanofi kutatói is bekapcsolódtak az ezen a területen folyó gyógyszerkutatásba. 1995 végén szabadalmaztatták az S121463 jel molekulát, mely egy nagyon hatékony, orálisan aktív, nem peptid típusú szelektív vazopresszin V 2 receptor antagonista, szerkezetét tekintve egy spiroindol származék (1): 3 C S C 3 1 S121463 (satavaptan) C 3 C 3 C 3 spiro[cisz-4-(morfolinoetiloxi)ciklohexán-1,3 -{1 -(2 -metoxi-4 -tercbutilaminokarbonilbenzoszulfonil)-5 -etoxi}-[3]indol]-2 [1 ]-on A vegyületet további fejlesztése, a méretnövelésre alkalmas szintézisút kidolgozása volt a feladatom a Chinoin Preklinikai Fejlesztés laboratóriumában, ahol a méretnövelés után a klinikai minták is készültek. Jelenleg a molekulát a klinikai vizsgálatok Fázis III szakaszában tesztelik. A dolgozatban a Felfedez kutatás által kidolgozott szintézisútból kiindulva a kémiai fejlesztés során az eljáráskutatástól az eljárásfejlesztésen át a méretnövelésig végzett munkát kívánom összefoglalni, a kritikus lépések részletesebb ismertetésével. 1 3
2. Irodalmi el zmények 2.1. A gyógyszerfejlesztés kulcselemei 2 Új, eredeti gyógyszermolekulák kifejlesztése és piacra kerülése 2-5 éves kutató és 8-15 évig tartó fejlesztési munkát igényel, költségei többszáz millió dollárt tesznek ki. Ez a munka két f részre, a fejlesztés korai és kés i szakaszára osztható. A kezdeti tevékenység maga a felfedez kutatás, a kés i fázis két fontos eleme a preklinikai és a klinikai fejlesztés. Fontos követelmény a kutatás és fejlesztés idejének és a költségeknek a minimalizálása, ehhez új stratégiák bevezetése vált szükségessé. A korábbi in vivo alapú kutatás helyett lehet leg humán receptorokat és enzimeket alkalmazó in vitro modelleket vizsgálnak. Els lépésként kiválasztják a biológiai célpontot, azonosítják, validálják, ami a terápiás jelent ség becslését jelenti. agyszámú molekula automatizált biokémiai sz r vizsgálatával választják ki az adott receptorral vagy enzimmel kölcsönhatásba lép, elég nagy affinitással rendelkez vegyületeket. Fontos, hogy minél eltér bb szerkezet és fizikai-kémiai tulajdonsággal rendelkez molekulák kerüljenek vizsgálatra, ehhez nagyszámú molekulát tartalmazó, széles diverzitással rendelkez vegyülettárak állnak a gyógyszercégek rendelkezésére. Meghatározzák a teszteken aktív úgynevezett vezérmolekulák szerkezetét, agonista vagy antagonista hatásukat, szelektivitásukat. A hatás-szerkezet összefüggések vizsgálatával a szerkezetet optimalizálva jutnak el a megfelel kémiai és metabolikus stabilitást, oldhatóságot és lipofilitást mutató gyógyszer jelölt molekulához, mely rendelkezik a várt farmakokinetikai tulajdonságokkal, jól felszívódik és toxicitása kell en alacsony, így alkalmas preklinikai fejlesztésre történ kiválasztásra. 3 A preklinikai fejlesztés meghatározó eleme a kémiai fejlesztés. Ennek els lépése az eljáráskutatás, melynek során egy méretnövelésre alkalmas, a környezetvédelmi szempontokat is figyelembe vev, kereskedelmi forgalomban megtalálható kiindulási anyagokat alkalmazó, a toxikus intermediereket lehet leg elkerül szintézisút kidolgozása a feladat. Mivel az utóbbi id k gyógyszerjelölt molekuláira a nagyobb molekulatömeg és hidrofób tulajdonság jellemz, megnövekedett a sóképzés jelent sége. Megfelel stabilitású, nem toxikus sók el állításával próbálják a vízoldékonyságot növelni. Jelent s a kristályosítás és a polimorfia vizsgálat szerepe, mivel elvárás, hogy a gyógyszerjelölt egységes polimorf forma legyen, ugyanis a különböz polimorfok fizikai tulajdonságai és oldódási kinetikája is eltér. Ezért jól meghatározott és szabályozott kristályosítási eljárás kidolgozása szükséges. A fejlesztés e szakaszában történik az intermedierek élettani hatásának vizsgálata, valamint a reakciók kockázatelemzése irodalmi adatok és a felhasznált anyagok termikus stabilitásának és a reakciók h színezetének mérése alapján. A kapott eredmények figyelembevételével történik az eljárásfejlesztés, mely után sor kerül a méretnövelésre, ahol a GMP körülményeknek megfelel en történik a további vizsgálatokhoz szükséges hatóanyag mennyiség legyártása. Ezzel párhuzamosan folyik az analitikai, valamint a formulációs fejlesztés. A preklinikai fázis részei az általános farmakológiai, toxikológiai, metabolizmus és farmakokinetikai vizsgálatok is. A kés i fejlesztés másik nagy területét a klinikai vizsgálatok jelentik. A gyógyszerjelölt molekulák a klinikai fázis I, II és III vizsgálatok során bizonyított terápiás hatékonyságuk és megfelel ártalmatlanságuk alapján kerülhetnek bevezetésre a gyógyászatban. 4
2.2. Biológiai háttér 2.2.1. Az antidiuretikus hormon A szervezet optimális m ködéséhez elengedhetetlen a só és vízháztartás egyensúlya, a testfolyadékok összetételének állandósága, az állandó ozmotikus nyomás, ionkoncentráció arány és vér p érték, valamint az extracelluláris víztér állandósága. E bels mili állandóságát idegrendszeri és hormonális irányítás alatt álló kiválasztó szervek biztosítják. A kiválasztásban a f szerepet a vese játssza. A vese funkcionális egysége a nefron, melynek minden szegmensében jól definiálható a vízpermeabilitás. A proximális tubulus és a enle-kacs leszálló vékony szára magas vízátereszt képességgel rendelkezik, emberben mintegy 150 l naponta a víz reabszorpció mértéke, míg a vékony és vastag felszálló szárak relatíve impermeabilisak, és a gy jt csatornába ürülnek. A gy jt csatorna permeabilitását az antidiuretikus hormon szabályozza. A hipotalamusz-neurohipofízis rendszer két hormont termel, az antidiuretikus hormont (2) (AD vagy vazopresszin) és az oxitocint (3) (T). Mindkét, szerkezetüket tekintve csak két aminosavban eltér hormon ciklikus nonapeptid, mely specifikus G- proteinhez kapcsolt receptorok stimulálásával fejti ki hatását. A legtöbb magasabb rend eml s és az emberi szervezet arginin-vazopresszint (AVP) (2) termel, míg ismeretes a sertésben található lizin-vazopresszin is, mely hatása azonos, de arginin helyett lizint tartalmaz. -Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly- 2 S S 2 Arginin vazopresszin -Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly- 2 S 3 xitocin S A testnedvek ozmotikus koncentrációjának változását érzékelve a hipotalamusz ozmoreceptor sejtjei stimulálják vagy gátolják a vazopresszin szekréciót. 5
2.2.2. Arginin vazopresszin (AVP) receptorok Az AVP hormon számos fiziológiás folyamatban játszik szerepet, így a szervezet ozmoregulációjában, gátolja a víz diurézist a vesében a disztális tubulusok és a gy jt csatornák vízpermeabilitásának növelése révén, szabályozza a vér mennyiségét, az erek tónusát, a vérnyomást, a sejt proliferációt és az adrenokortikotrop hormon (ACT) kiválasztást. Az AVP specifikus membránreceptorokhoz köt dik, melyek a G- proteinekhez kapcsolódó receptorok családjába tartoznak. Jelenleg három altípusba osztályozzuk az AVP receptorokat els dleges szerkezetük, kapcsolódási mechanizmusuk, szöveti megoszlásuk és farmakológiai tulajdonságaik alapján: V 1a érrendszeri receptor, V 2 vese receptor és a V 3 vagy V 1b -nek nevezett agyalapi receptor. Újabb közlemények 4 említést tesznek AVP agonista hatást javasolva egy még nem pontosan definiált új AVP receptorról, melyet V 1c vagy V 2b receptorként osztályoznak: V 1a receptor: a foszfolipáz C aktiválásában és az intracelluláris Ca mobilizációjában van szerepe. F ként a vaszkuláris simaizomban, a hepatocitákban és vérlemezkékben található, ér simaizom kontrakciót és proliferációt, vérlemezke aggregációt, koagulációs faktor kibocsátást és máj glikogenezist okoz. V 1b vagy V 3 receptor: az agyalapi mirigy elüls lebenyében található, az ACT és -endorfin kibocsátást kontrollálja, de endokrin szerepe van más szervekben is, mint a hasnyálmirigyben vagy a mellékvesékben. V 2 receptor: a vese tubulusokban, a gy jt csatorna principális sejtjeiben fordul el. Szerkezetét az 1. ábra mutatja. extracelluláris intracelluláris 1. ábra. V 2 receptor sematikus ábra 5 371 aminosavból álló polipeptid, 7 transzmembrán területtel A vazopresszin antidiuretikus hatását a V 2 receptor aktiválásával fejti ki, szabályozza a vese vízkiválasztását a vese gy jt csatornák ozmotikus víz permeabilitásának növelésével. asonlóan a más G fehérjékhez kapcsolt receptorok m ködéséhez, a rendszer az AVP receptorhoz való köt désével aktiválódik A 2. ábra az AVP-t dokkoló V 2 receptor 3 dimenziós modelljét mutatja. Az ábra fels része felel meg az extracelluláris térnek. Ebb l az irányból tekintve a 7 transzmembrán terület (1-7) elhelyezkedése az óramutató járásával ellentétes. 6
2. ábra. Az AVP hormont dokkoló humán AVP V 2 receptor 3-D modellje. A transzmembrán hélixek pirossal, az intracelluláris és extracelluláris hurkok kékkel jelölve. Az AVP a G protein-adenilcikláz rendszert stimulálja, a G protein átalakul aktív formájába, disszociál G s és alegységekre. A G s alegység aktiválja az adenilciklázt (AC), az aktivált AC katalizálja az adenozin-trifoszfátból (ATP) a ciklikus adenozinmonofoszfát (camp) képz dést. A megnövekedett intracelluláris camp szint aktiválja a protein kináz A-t (PKA), fokozza a fehérje foszforilálást, ami stimulálja a sejtmembránban a vízcsatorna fehérjék (AQP, akvaporin) szintézisét (3. ábra). Ennek végeredménye a membrán permeabilitás növekedése és ezáltal a szabad víz reabszorpció fokozódása, a plazma ozmolalitás csökkenése. 6 Az AQP2 egyrészt kiválasztódik, másrészt AVP hiányában a vízcsatornák endocitózis révén lebomlanak vagy visszakerülnek a citoplazmába és a vízátereszt -képesség visszaáll az eredeti szintre. Prosztaglandinok (PGE 2 ) szintén befolyásolhatják az AVP m ködését azáltal, hogy a camp szint csökkentésével gátolják az AQP2 szintézist. 3. ábra. A vazopresszin hatása a vese gy jt csatorna principális sejtjeiben, az AQP2 forgalom és szintézis szabályozása 7 7
Az akvaporinok kisméret membránfehérjék, amelyek a vízpermeabilitást biztosítják a sejtekben. 8,9 Az AQP fehérjecsalád szövetspecifikus. Eml sökben ezidáig legkevesebb 10 különböz AQP-t határoztak meg expresszálódásuk helye szerint (AQP0-AQP9), a szervezet szinte valamennyi sejtjében megtalálhatók. Ezek közül a vese különböz részein legalább 6 akvaporin altípus fordul el, a nefronban az ábrán jelöltek vannak jelen (4. ábra). 4. ábra. Akvaporinok a nefronban és a gy jt csatorna rendszerben 10 Az AQP2 (5. ábra), az els dleges vazopresszin által szabályozott vízcsatorna, a gy jt csatorna principális sejtjeiben választódik ki. A plazma AVP szint növekedésével n az AQP2 expresszió, maximális vízpermeabilitást engedve a renális gy jt csatornában. 5. ábra. AQP2 sematikus rajza, 271 aminosavból álló fehérje 6 transzmembrán hélixszel 8
2.2.3. Vazopresszin antagonisták 11,12 Magas plazma vazopresszin szint mérhet számos kórképben, mint a nem megfelel AVP szekréció kiváltotta tünetek (Syndrome of Inappropriate Antidiuretic ormone secretion, SIAD), kongesztív szívmegbetegedés (Congestive eart Failure, CF), májcirrózis, központi idegrendszeri sérülések, ödémák, magas vérnyomás és nefrotikus szindrómák esetén. Ez az abnormálisan megemelkedett AVP szint vízretenciót okoz. A kezelésre alkalmazott hagyományos diuretikumok, mint a furosemid vagy a hidroklorotiazid, lecsökkentik az esszenciális kationok, így a a + és K + mennyiségét hiponatremiát okozva, ami a leggyakoribb elektrolit rendellenesség. Többféle terápiás stratégia képzelhet el, melyek hasonlóak a más, hormon felesleg kiváltotta endokrin megbetegedések esetén alkalmazottakhoz: a kezelés célja lehet a hormonkiválasztás vagy a hormon hatásának csökkentése a célszövetekben, illetve a megnövekedett hormonszekréció következményeinek kompenzálása. Az AVP hatás receptor szinten való gátlása jelentheti a logikus és specifikus kezelését a vazopresszin által befolyásolt megbetegedésekben. Bár már az 1980-as években leírtak néhány ciklikus és lineáris peptid típusú, a természetes hormonból származtatható AVP receptor agonista és antagonista, illetve V 2 receptor antagonista vegyületet, de ezek nem váltották be a hozzájuk f zött reményt. észleges agonista tulajdonságot is mutattak, fajspecifikusak, alacsony receptor altípus szelektivitással rendelkeztek, rövid volt a biológiai hatásuk és alacsony volt az orális biohasznosíthatóságuk. Ezért a 90-es évek elejét l megindult a nem peptid típusú AVP receptor antagonisták fejlesztése. Már számos V 1a és V 2, illetve kevert V 1a / V 2 nem-peptid antagonista vegyület áll fejlesztés alatt, és 2002-ben megjelent az els specifikus V 1b antagonista a klinikai kipróbálás els fázisában. Az 1. táblázat 12 összefoglalja az AVP receptor antagonisták lehetséges f klinikai alkalmazási területeit: 1.táblázat. Klinikai kórképek kezelése AVP receptor antagonistákkal V 1a antagonisták V 2 antagonisták V 1a / V 2 antagonisták V 1b antagonisták Menstruációs zavarok, koraszülés aynaud betegség ipertenzió CF Agyödéma Mozgászavar nkológiai betegségek CS rendellenességek CF SIAD iponatrémia Májcirrózis hasvízkórral és vízretencióval efrotikus tünetek Agyödéma Glaukóma ipertenzió Diabetikus nefropátia Méniére betegség CF ipertenzió Agyödéma Stressz okozta rendellenességek, szorongás, depresszió Cushing szindróma ACT-t kiválasztó tumorok Az els V 1a antagonistát, egy tetrahidrokinolinon származékot, a japán tsuka Pharmaceuticals kutatói állították el (PC-21268). 13 A vegyület patkányban szelektív V 1a antagonistaként blokkolta az exogén AVP indukálta vazokontrakciót és kálcium mobilizációt, de humán kísérletekben gyenge hatást mutatott. 14 Egy másik molekula, a Sanofi által kifejlesztett antagonista indolkarbonsavamid származék, az S-49059 jel vegyület 15 már valóban hatékony és szelektív humán 9
szövetekben is. Klinikai kísérletek folytak magas vérnyomás és CF kezelésére (6. ábra). Cl Cl S C 2 C 3 C 3 PC-21268 S-49059 6. ábra. em-peptid V 1a antagonisták A receptorspecifikus V 2 antagonisták 16 a diuretikus hatású gyógyszerek egy új típusát képviselik: ezeket a molekulákat akvaretikus szereknek nevezzük, ami azt jelenti, hogy e vegyületek képesek gátolni az AVP hatását a vese gy jt csatornájának sejtjeiben. Ezzel szignifikánsan megnövelik a szabad víz kiválasztást, miközben nem befolyásolják a vizelettel történ a + és K + kiválasztást, nincs hatásuk a szervezet elektrolit egyensúlyára. (C 3 ) 2 Cl C 3 3 C C 3 PC-31260 mozavaptan PC-41061 tolvaptan C 2 5 S C 3 Cl C 3 S-121463 satavaptan C(C 3 ) 3 VPA-985 lixivaptan F 7. ábra. em-peptid V 2 inhibitorok Igen jelent s terápiás értékük lehet számos vízretencióval járó betegség kezelésében, melyekben abnormálisan megnövekedett plazma AVP szint figyelhet meg. Több igen hatékony és szelektív nem-peptid V 2 antagonista áll fejlesztés alatt, melyek orálisan is aktív vegyületek (7. ábra). 10
E vegyületek potenciális hátránya lehet, hogy a vér-agy gáton áthatolva központi idegrendszeri mellékhatást fejthetnek ki. A Yamamura és munkatársai által kifejlesztett PC benzazepin származékok dózisfügg módon gátolják az AVP antidiuretikus hatását, blokkolják az AVP indukálta camp és AQP 2 szintézist. 17 A Sanofi kutatói 1996-ban állították el az S121463 jel indolinon származékot, amely jelenleg a leghatékonyabb és specifikusabb V 2 antagonista hatással rendelkezik 18. A vegyület már nanomólos koncentrációban is aktív. A Wyeth-Ayerst esearch kutatói fejlesztették ki a VPA-985 jel benzodiazepin vegyületet, 19 mely hasonlóan gátolja az AVP köt dését a membrán V 2 receptoraihoz. A Yamanouchi Pharmaceutical egy kett s hatású, V 1a / V 2 receptor antagonista fejlesztésér l számolt be. 20 Az YM-807 jel molekula szerkezetét tekintve az PC és VPA vegyületekhez áll közel, hatása szerint a V 2 receptor gátlás a hangsúlyosabb (8. ábra). A két antagonista hatás megfelel aránya elvezethet egy ideális vérnyomáscsökkent kifejlesztéséhez. C 3 YM-807 conivaptan 8. ábra. Kett s hatású,v 1a / V 2 receptor antagonista Az utóbbi évek kutatási eredménye az els szelektív, orálisan aktív, nem peptid típusú vazopresszin V 1b receptor antagonista hatású molekula, melyet ugyancsak a Sanofi kutatói szintetizáltak 21 (9. ábra). Állatkísérletes modelleken vizsgálták a vegyület antidepresszáns, szorongásoldó hatását. Az anyag biokémiai és farmakológiai jellemz i alapján egy ígéretes gyógyszerjelölt lehet, a megjelölt terápiás terület a szorongásos és stressz kiváltotta rendellenességek kezelése. 22 Cl C 3 C 3 S C 3 C 3 C 3 S-149415 9. ábra. em-peptid V 1b antagonista 11
2.2. Kémiai el zmények Az S121463 jel vegyület totálszintézisére az irodalom két utat ismertet. Az alapeljárás a Sanofi Felfedez kutatása által szabadalmaztatott módszer 23, mely révén el állított anyag alkalmas volt a fejlesztésre való kiválasztás el tti szerkezetazonosítási és biológiai vizsgálatok céljára. 2001-ben, már kémiai munkánk érdemi részének lezárása után jelent meg amerikai szerz k egy közleménye, 24 melyben az alapeljárást kritizálva egy új, sztereoszelektív szintézisút kidolgozásáról számolnak be. Az S121463 a 3`-as helyzetben egy spiro-ciklohexil egységet tartalmazó 2-indolinon származék. A molekula sztereocentrumot nem tartalmaz, de geometriája mégis meghatározott a biológiai hatás szempontjából. A kívánt termékben a ciklohexán gy r C-1 szenéhez kapcsolódó ekvatoriális állású csoport ( = morfolino-etil) az oxindol gy r 2`-es karbonil csoportjához képest cisz helyzet, amin azt értjük, hogy e két szubsztituens a hattagú gy r azonos oldalán helyezkedik el. Ezért minden szintézisút egyik kulcslépése a spiro-ciklohexil egység megfelel térszekezetének kialakítása. 9' 8' 6' 7' 5' 7a' 4' 3a' 3 3' 2' 2 1 2.2.1. S121463 szintézis - a Felfedez kutatás eljárása A Sanofi Felfedez kutatás által szabadalmaztatott eljárás 23 befejez lépése egy -acilezési reakció, melyben egy megfelel en szubsztituált benzo-szulfonilklorid származékkal (5) reagáltatják a 2-indolinont (4) KtBu jelenlétében tetrahidrofuránban, igen alacsony h mérsékleten. Et + Cl 2 S Me 4 5 Et tbu KtBu / TF -60 - -20 C S Me tbu S121463 Az 5 szulfonilklorid származékot 3-metoxi-4-nitro-benzoesavból (6) kiindulva állítják el. Els lépésben tionilkloriddal savkloridot (7) képeznek, melyet t-butilaminnal reagáltatva kapják a 8 benzamid származékot. Ezt követi a nitrocsoport redukciója 9 aminná, hidrogéntanszfer reakcióban Pd/C katalizátor mellett hidrogénforrásnak ciklohexént alkalmazva. Egy Sandmeyer típusú reakcióban 12
diazotálás után a 10 diazóniumsót nagy feleslegben alkalmazott S 2 -dal, ecetsavas közegben reagáltatva jutottak az 5 intermedierhez. 2 Me SCl 2 tbu Cl 2 piridin C 2 Cl 2 2 2-40 C Me Me 6 7 8 tbu ciklohexén Pd/C / Et Cl 2 S Me 5 S tbu 2 CuCl 2-25 C, 24h - + Me 10 tbu a 2 cc Cl/Ac 2 Me 9 tbu A 4 2-indolinon származék el állítására a Fischer indolszintézist alkalmazták. Az eljárás els lépése a 4-etoxi-anilin (11) diazotálása. A diazóniumsót ón(ii)-kloriddal redukálva nyerték a 12 aril-hidrazin származékot. 4-hidroxi-ciklohexánkarbonsavetilésztert (13) piridinium-klorokromáttal (PCC) oxidálva bázikus Al 2 3 -on nyerték a 14 ciklohexanon származékot. Etilénglikollal p-toluolszulfonsav jelenlétében képezték a 15 dioxolán származékot, melyet lúgos hidrolízis után a savat a sója formájában preparáltak ki. Ezt a vegyületet klórhangyasav-i-butilészterrel reagáltatva egy vegyes anhidridet állítottak el, melyb l 12 hidrazinnal a 16 hidrazid származékot kapták. A ciklohexil-karbohidrazid vegyületet Brunner reakcióban alakították át a 17 2-indolinon származékká, a hidrazidból butil-lítiummal TF-ben 70 C-on képzett lítiumsót oldószercsere után tetralinban 180 C-on hevítve végbemegy a gy r zárás. Et 1. a 2 / cc Cl Et 2. SnCl 2 / 2 2 11 12 2 EtC PCC/Al 2 3 EtAc EtC 13 1. C 2 C 2 - a + C C 2 Cl 2 / pts 2. a / Et 14 15 ClCiBu Et 3 / TF Et Et 16 1. BuLi / TF -70 C 2. tetralin 180 C 17 13
A 17 spirodioxolán gy r sztereoszelektív felnyitására cink-borohidridet alkalmaztak trimetil-klórszilán jelenlétében, dietil-éterben. A 18 hidroxietil származékot 85 : 15 arányú cisz-transz izomer keverék formájában kapták, melyb l oszlopkromatográfiás tisztítás és átkristályosítás után nyerték ki a megfelel tisztaságú cisz izomert. A hidroxietil csoportot tozilkloriddal reagáltatták és a 19 vegyület tozil csoportját morfolinra cserélve kapták a befejez acilezési lépés másik komponensét (4). Et 17 Zn(B 4 ) 2 Me 3 SiCl Et 2 - C 2 Cl 2 Et 18 ptscl piridin 4 C, 2h Et 4 morfolin / MeC a 2 C 3 reflux, 6h Et 19 Ts A teljes szintézist tekintve, mintegy 5%-os hozamot értek el a kiindulási p-fenetidinre vonatkoztatva. Az alacsony össztermelés mellett számos olyan lépést tartalmaz a szintézis, melyek miatt az eljárás további fejlesztésre nem alkalmas: Az 5 intermedierben a szulfonilklorid csoport kiépítése egy diazóniumsón keresztül történik nagy feleslegben alkalmazott kéndioxiddal, nehezen reprodukálható és kontrollálható reakcióban, mely számos mellékreakciót, a termelés csökkenését (~50%) és a termék szennyezettségét okozza. A 12 fenilhidrazin származékot szintén egy diazotálási lépésben alakítják ki, a diazónium só ón(ii)kloridos redukciójával. A reakciót nagy térfogatban végzik, a hozam alacsony, mintegy 55%, a hidrazinvegyület 15% szervetlen szennyezést tartalmaz, nehezen tisztítható, instabil. A Brunner reakcióban történ indolinon szintézis az ipari fejlesztésben extrémnek számító körülményeket igényel, a Li só el állítása 70 C-on butillítiummal TF-ban történik, majd oldószercsere után, 180 C-on tetralinban végzik a gy r zárást. Az eljárás laboratóriumban is a mérett l függ változó hozammal volt csak megvalósítható. A 17 dioxolán származék sztereoszelektív gy r felnyitására használt cinkborohidrid rendkívül érzékeny nedvességre és leveg re, el állítása in situ történik dietil-éteres oldatban, inert körülmények szükségesek mind a redukálószer el állításához, mind a redukcióhoz. A reakcióid igen hosszú (16 óra + 18 óra a cink-borohidrid el állítása). A szintézis befejez acilezési lépését 60 C-on, TF-ban végezték. A 13 ciklohexánkarboxilát származék ára igen magas, a 6 3-metoxi-4-nitrobenzoesav kereskedelmi forgalomban nem kapható. 14
2.2.2. S121463 szintézis alternatív út Venkatesan és munkatársai 2001-es közleményükben 24 az S121463 totálszintézisére egy új, konvergens sztereoszelektív utat írnak le, melyben a Sanofi módszer hátrányait próbálják elkerülni. A szintézis befejez lépése megegyezik az eredeti szintézisúttal, de a 4 és az 5 intermedierek el állítására új eljárást dolgoztak ki. Et + Cl 2 S Me 4 5 Et tbu KtBu/TF -78-20 C S Me S121463 tbu Kiindulási anyagként szintén 11 p-fenetidint használtak, mely vegyület aminocsoportját benzilcsoporttal védték. A benzilezést reduktív kondenzációs reakcióban hajtották végre, benzaldehiddel Schiff-bázist képeztek, amit nátriumborohidriddel redukáltak. A 21 vegyületet a Doyle eljárás 25 szerint állították el, a 20 -benzil-fenetidint el ször diketénnel, majd metánszulfonil-aziddal reagáltatva jutottak 21 diazo származékhoz. Ezt kálium-hidroxiddal dezacetilezve, majd a kapott 22 diazovegyületet ródium(ii)-acetát katalizátor mellett megbontva nyerték a 23 gy r zárt -benzil-indolinon intermediert. Et Et 1. PhC/Et Et 1. diketén/et 3 /TF + C 3 2. ab 4 /Me 2 11 20 2. MeS 2 3 /Et 3 /TF Ph 21 Ph K/C 3 C Et h 2 Ac 4 /C 2 Cl 2 Et + 23 Ph 22 Ph A spiro-ciklohexil egység kiépítéséhez 1,3-dioxolánnal védett 1,5-dibrómpentán-3-on vegyületet (27) használtak. Bróm-propionsav-metilészterb l (24) Grignard reakcióban állították el a 25 ciklopropil-hidroxi-propil-bromidot, mely brómozása a 26 dibrómszármazékhoz vezetett. A dioxolán véd csoportot 26-ot etilénglikollal reagáltatva sav katalizátor (PPTS = piridinium p-toluolszulfonát) jelenlétében alakították ki. A 23 -benzil-indolinon 27 dibróm vegyülettel történ, bázikus közegben végzett 3-as helyzet alkilezésével nyerték a 28 spiro-ciklohexil származékot. A véd csoportot savas hidrolízissel eltávolítva kapták a 29 -benzil-spiroketont. A 15
vegyület ab 4 -es redukciója csak 2:1 arányban eredményezte a várt cisz izomert, azonban redukálószerként L-Selectridet (LiB[C(C 3 )C 2 C 3 ] 3 ) alkalmazva már 66:1 arányú szelektivitást értek el. A regioszelektivitást a nagy térkitöltés csoport és a Li + kation együttes hatásával magyarázták. A ciklohexanon és az amid C= is kölcsönhatásba lép a Li + kationnal, ami még két TF molekulával is koordinálódik, stabilizálva a ciklohexán gy r csavart kád konformációját. Ez energetikailag és sztérikusan is kedvez nukleofil támadással szemben, amit az er sen polarizált karbonil is gyorsít. A 30 spiro-ciklohexanol származékot klóretil-morfolinnal reagáltatták, majd eltávolították az -benzil véd csoportot. A debenzilezés csak extrém körülmények között volt megvalósítható. Br Ti(iPr) 4 BS/CCl 4 Br Me EtMgBr Br Br 24 25 26 C 2 C 2 PPTS C(Et) 3 Et Br Br 27 a/dme Et PPTS aceton/víz Et 23 Ph 28 Ph 29 Ph Et 4 1. Klóretil-morfolin a/toluol 2. Li/ 3, -78 C Et 30 L-Selectride TF, -78 C Ph Az 5 szulfonilklorid komponens el állítása m-hidroxi-benzoesavból kiindulva történt. Az els lépés egy szulfonálási reakció volt, melyet 3% S 3 tartalmú kénsavban hajtottak végre. A 32 benzolszulfonsav származék fenilhidroxicsoportját sikerült 16
szelektív módon metilezni dimetil-szulfáttal er sen lúgos közegben, szigorúan kontrollált reakciókörülmények között. A 33 káliumsót PCl 5 -dal kezelve képz dött a 34 disavklorid, mely t-butil-aminnal 78 C-on reagáltatva a várt 5 savamid származékot szolgáltatta, míg a szulfonsavklorid csoport intakt maradt. S 3 2 S 4 Me 2 S 4 S 3 K Me 3% S 3 K 31 32 33 PCl 5 S 2 Cl Me tbu 2 /Et 3-78 C S 2 Cl Me 5 tbu Cl 34 Az eljárás ipari alkalmazhatósága több ponton is kétséges: Az eljárás hozama a kiindulási p-fenetidinre (11) nézve ugyan 25%, de az 5 benzo-szulfokloridot csak 25%-os termeléssel állították el, míg a 27 dibróm származék esetében nem közölnek adatokat a hozamról. Az indolinon Doyle szerinti szintézise nem ipari eljárás (diketén, azid származék, ródium-acetát alkalmazása, többszöri kromatográfiás elválasztás) A 29 oxovegyület redukciójára kiváló sztereoszelektivitást biztosító módszert dolgoztak ki, de ezt csak mmólos méretben valósították meg, extrém körülmények között, -78 C-on, inert atmoszférában. A redukálószerként alkalmazott L-Selectride ára igen magas. A morfolinoetil csoport bevitelére használt klóretil-morfolin er sen toxikus. A 30 indolinon származék debenzilezését a szokásos körülmények közt nem, csak 78 C-on cseppfolyós ammóniában, fém lítiummal tudták megoldani. 2.2.3. Alternatív eljárások spiro[ciklohexán-1,3 -indolin]-2,4 -dion származékok el állítására Az el z ekben bemutatott S121463-hez vezet két eljárás közös kulcsfontosságú intermediere a 35 spiro(4-oxo-ciklohexil)-indolinon származék, mely el állítása több különböz stratégia szerint valósítható meg. Et 35 17
Az els esetben Fischer indolszintézist alkalmazva Brunner reakcióban egy védett 4-oxo-ciklohexil-karbohidrazid származékból kiindulva, a második eljárásban pedig a megfelel oxindol 3-as szénatomján kiépítve a ciklohexán gy r t, jutnak a kívánt termékhez. Az utóbbi két évben két új szintézismódszert 26,27 is ismertet az irodalom, melyeket az S121463 jel vegyület el állítására javasolnak. Mindkét eljárás a 35 spiro-ciklohexanon származékon keresztül jut a végtermékhez, azonban eltér úton valósítja meg a 35 közös intermedier szintézisét. 2.2.3.1. Spiroketon el állítás 3-szubsztituált oxindolokból lasz szerz k 26 közleményükben egy új stratégiát mutatnak be a 35 spiroketon el állítására. Kiindulási anyagként 3-szubsztituált oxindolokat használtak. A reaktív 36 3-klórmetilén-2-indolinon származék és 37 Danishefsky-dién cikloaddíciós reakciójával több lépésen keresztül a 2-indolinon 3-as helyzetben spiro(4-oxo-ciklohexil) csoportot tartalmazó 42 származékát állították el. SiMe 3 Cl 2 C SiMe 3 36 C 2 Et 37 + Me toluol reflux Cl Me pts reflux C 2 Et 38 39 C 2 Et 2 /Pd/C EtAc Me 42 1. kromatográfia 2. a/et 0 C 40 C 2 Et + 41 C 2 Et ~ 4 : 1 = vagy C 2 Me A mellékreakciók elkerülésére egy one-pot eljárást dolgoztak ki. A szintézist bombacs ben végezték, a cikloaddíciós reakciót toluolban, reflux h mérsékleten hajtották végre. Folyamatos melegítés közben katalitikus mennyiség p-toluolszulfonsavat adtak a reakcióelegyhez, ami a 39 szemi-kinon származék képz déséhez vezetett. A termék izolálása nélkül a reakcióelegy katalitikus hidrogénezésével kapták a 40 spiroketont, mely kb. 20%-ban 41 bifenil származékok keverékét tartalmazta. A spiroketont szilikagélen kromatografálva elválasztották a minor komponenst l, így 57%-os termelést értek el. A szintézis utolsó lépése az indolinon nitrogén véd csoportjának eltávolítása 88%-os termeléssel. 18