PLATELIA ASPERGILLUS EIA 62796 96 TESZT

PLATELIA ASPERGILLUS EIA 62796 96 TESZT A PLATELIA ASPERGILLUS EIA IMMUNO-ENZIMATIKUS SZENDVICS MIKROLEMEZ VIZSGÁLAT AZ ASPERGILLUS GALACTOMANNAN ANTIGÉN KIMUTATÁSÁRA SZÉRUMBAN. 1 RENDELTETÉS A Platelia Aspergillus EIA immunenzimes szendvics mikrolemez vizsgálat az Aspergillus galactomannan antigén kimutatására szérummintákban. 2 HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ A Platelia Aspergillus EIA olyan vizsgálat, amely egyéb diagnosztikai eljárásokkal együtt alkalmazva - pl. mikrobiológiai tenyészet, biopszia minták szövettani vizsgálata, röntgenvizsgálatok - az invazív Aspergillosis diagnózisára használható. 3 ÖSSZEFOGLALÁS ÉS MAGYARÁZAT Aspergillus fertőzések általában a környezetben jelenlévő Aspergillus spórák belégzése következtében alakulnak ki. A legkomolyabb fertőzéseket jelentő invazív formák megjelenése egyre gyakoribbá vált az utóbbi 10 évben. Ezek elsősorban neutropéniás betegeknél (rákellenes kezelés után), immunszupresszánsokkal (szervátültetés, különösen csontvelő átültetés), vagy kortikoszteroiddal kezelt betegeknél 7 fordulnak elő. Az Aspergillus ritkán iziolálható hemokultúrából. A diagnózis gyakran nem-specifikus diagnosztikára vagy radiológiai adatokra alapoz (klinikai tünetek, CT letapogatás, mellkasi röntgen, stb.). Jelenleg az oldható galactomannan antigén jelenlétének vizsgálata a szérumban olyan szerológiai módszernek tűnik, amely segíthet az invazív Aspergillosis diagnózisában 6, 9, 14, 34, 39. 4 A MÉRÉS ELVE 27 A Platelia Aspergillus EIA, egylépéses immunoenzimatikus szendvics mikrolemez vizsgálat a galactomannan kimutatására humán szérumban. A vizsgálat EBA-2 monoklonális patkány antitesteket használ, amelyek az Aspergillus galactomannan ellen irányulnak, és jellemzésük már megjelent a szakirodalomban 16, 28. Ez a monoklonális antitest használatos egyrészt (1) a mikrolemez tesztlyukainak bevonására és az antigén megkötésére, másrészt (2) az érzékenyített mikrolemezhez kötődő antigén (konjugátum-reagens: peroxidázzal jelzett monoklonális antitestek) kimutatására. A vizsgálatot esetleg zavaró immunkomplexek disszociálása és a szérum fehérjék kicsapása érdekében, a szérum mintákat EDTA jelenlétében hőkezeljük 15. A kezelt szérum mintákat és konjugátumot a monoklonális antitestekkel bevont tesztlyukakba mérjük, majd inkubáljuk. A galactomannan antigén jelenlétében monoklonális antitest - galactomannan - monoklonális antitest/peroxidáz komplex jön létre. A csíkokról mosással eltávolítjuk a nem kötődött anyagot. Ezután szubsztrátum oldatot adunk hozzá, amely kék színreakciót ad a tesztlyukakban megkötött kompexekkel. Az enzimreakciót sav hozzáadásával állítjuk le, amely kékről, sárgára változtatja a színt. A minták és kontrollok optikai abszorbanciáját 450 és 620nm hullámhosszra állított spektrofotométerrel mérjük. 5 REAGENSEK Platelia Aspergillus: cikkszám 62796 (96 teszt) A készletet 2-8 C hőmérsékleten tároljuk. Használat előtt a reagenseket szobahőmérsékletre kell melegíteni (18-25 C). Használat után, a kontrollok kivételével minden reagenst helyezzünk vissza 2-8 C-ra. Feloldás után a használatlan negatív kontrollt, a cut-off kontrollt és a pozitív kontrollt -20 C hőmérsékleten lefagyasszuk le. A felhasználatlan csíkokat/lemezeket helyezzük vissza a tasakba és zárjuk vissza. Ne távolítsuk el a szárítószert. A tasak felnyitása és visszazárása után a csíkokat 5 héten belül fel kell használni. Hígítás után a mosóoldat 14 napig tárolható 2-8 C hőmérsékleten. Felnyitás után, minden egyéb reagens stabil a lejárat időpontjáig. A reagensek mennyisége elegendő 96 vizsgálat, maximum 9 menetben végzett elvégzéséhez. 1

R1 R2 R3 R4 R5 Concentrated Washing Solution Negative Control Serum Cut-off Control Serum Positive Control Serum Komponens Tartalom Mennyiség Microwell Strip Mikrolemez: 1 lemez / Plate - 96 tesztlyukú (12 csík, egyenként 8 tesztlyuk) bevonva anti- 12 8 tesztlyuk galactomannan monoklonális antitestekkel Tömény mosóoldat (10X): -Tris NaCl puffer -1% Tween 20-0,01% tiomerzál Negatív kontrollszérum: - Liofilizált humán szérum, galactomannan negatív - Negatív anti-hiv-1, anti-hiv-2, anti-hcv antitestekre és HBs antigénre Cut-Off kontrollszérum: - Liofilizált humán szérum, galactomannan pozitív - Negatív anti-hiv-1, anti-hiv-2, anti-hcv antitestekre és HBs antigénre Pozitív kontrollszérum: - Liofilizált humán szérum, galactomannan pozitív - Negatív anti-hiv-1, anti-hiv-2, anti-hcv antitestekre és HBs antigénre R6 Conjugate Konjugátum (használatra kész): - Anti-galactomannan monoklonális antitest/peroxidázzal jelölve - Tartósítószer: 0,01% tiomerzál R7 R8 R9 Serum Treatment Solution TMB Substrate Buffer Chromogen: TMB Solution Szérum kezelő oldat (használatra kész): - Savas EDTA oldat TMB szubsztrát puffer (használatra kész): - Citromsav és nátrium-acetát oldat - 0,009% hidrogén-peroxid - 4% dimetil-szulfoxid (DMSO) Kromogén TMB oldat (tömény): - 90% dimetil-szulfoxid (DMSO) oldat, 0,6% tetrametilbenzidinnel (TMB) Leállító oldat (használatra kész): 1 100 ml 3 qs*1 ml 3 qs*1ml 3 qs*1 ml 1 8 ml 1 10,5 ml 1 60 ml 1 1 ml R10 Stopping 1 12 ml Solution - 1,5 N kénsav (H 2 SO 4 ) Plate sealers - Öntapadós fóliák a mikrolemezekhez 1 8 lap Megjegyzés: A TMB (tetrametil-benzidin) a peroxidáz nem rákkeltő és nem mutagén kromogénje. *Megjegyzés: qs = Quantum satis (elegendő mennyiség) 6 FIGYELMEZTETÉSEK A FELHASZNÁLÓK SZÁMÁRA 1. In vitro diagnosztikai felhasználásra. 2. Kizárólag professzionális használatra. 3. Nem ajánlott a humán szérumtól eltérő mintákat tartalmazó vizsgálati készlettel való használata. 4. A Positive Control, a Cut-off COntrol és a Negative Control olyan humán szérumból készül, amelyet teszteltek, és nem találtak negatívnak HBsAG, illetve HIV-1, HIV-2 és HCV antitestek esetében a CE jelzésű teszteknél. Ennek ellenére az összes reagenst úgy kell kezelni, mintha fertőzést tudna átvinni. Az összes tesztet az OSHA vérrel továbbított kórokozókra vonatkozó szabványának 2. biológiai biztonsági szintjével vagy más megfelelő biológiai biztonsági gyakorlattal összhangban kell elvégezni. 5. Viseljen védőruházatot, köztük laboratóriumi köpenyt, szem-/arcvédőt és egyszer használatos kesztyűt (szintetikus, latexmentes kesztyű használata ajánlott), és kezelje a készlet reagenseit és a páciensek mintáit a kötelező helyes laboratóriumi gyakorlatoknak megfelelően. A vizsgálat elvégzése után mosson alaposan kezet. 6. Ne szívjon fel semmit szájjal. 7. Ne dohányozzon, igyon vagy egyen olyan helyeken, ahol a mintákat vagy a kit reagenseit kezelik. 8. Kerülje a minták vagy az oldatok kifröccsenését. 9. A savat tartalmazó biológiai kifröccsenéseket alaposan le kell törölni hatékony fertőtlenítő szerrel. A használható fertőtlenítő szerek közé tartozik (nem kizárólagosan) a 10%-os fehérítő oldat (0,5%-os nátriumhipokolorit oldat), a 70%-os etanol vagy a 0,5%-os Wescodyne Plus. Lehet, hogy a kiömlött anyag feltörlésére használt anyagot biológiailag veszélyes hulladékként kell kezelni. VIGYÁZAT! A fehérítő tartalmazó oldatot ne helyezze autoklávba! 2

10. A savakat tartalmazó kiömlött anyagot megfelelően kell felitatni (feltörölni) vagy nátrium-bikarbonáttal semlegesíteni, és a területet le kell öblíteni és szárazra kell törölni; ha biológiailag veszélyes anyagot tartalmazott, törölje le területet az egyik vegyi fertőtlenítő szerrel. 11. Úgy kezelje hulladékként a vizsgálat elvégzésére használt összes próbadarabot és anyagot, mintha fertőző lenne. A laboratóriumi vegyi és a biológiailag veszélyes hulladékot az összes helyi, regionális és nemzeti előírás betartásával kell kezelni és ártalmatlanítani. 12. VIGYÁZAT! Alábbtalálható a készelt egyes elemeiben található potenciálisan veszélyes vegyszerek listája (lásd: 5- REAGENSEK): 1.5 N kénsav (7,2% H 2 SO 4 ) lassító oldat: Korrozív, és égési sérüléseket okozhat a szemen és a bőrön, lenyelve vagy bőrrel érintkezve káros lehet, súlyos szemsérülést, köztük maradandó látáskárosodást és vakságot okozhat. Tartsa távol az erős lúgoktól és a redukálószerektől. C-Maró R43-41: Égési sérülést okoz. Fennáll a súlyos szemsérülés kockázata. S24/25-26-30-36/37/39-60. Szembe és bőrre ne kerüljön. Ha szembe kerül, azonnal öblítse ki bő vízzel, és forduljon orvoshoz. Soha ne adjon hozzá vizet a termékhez. Viseljen megfelelő védőruházatot, védőkesztyűt és szem/arcvédőt. Az anyagot és annak tartályát veszélyes hulladékként kell kezelni. Az anyag hulladéka veszélyes savas hulladéknak számít, ha azonban a helyi, regionális és nemzeti előírások megengedik, 6-8 ph értékre semlegesíthető a nem veszélyes hulladékkezeléshez, ha erre képzett és fel van szerelve. 0,01% Thimerosal (mertiolátos nátrium) egy szerves, higanyt tartalmazó biocid tartósítószer, amely a központi idegrendszert támadja meg, mérgezi a szaporítószerveket és jelentős allergén; a hosszan tartó vagy ismételt behatás allergiás reakciókat okozhat az arra érzékenyeknél; nagyon sok allergiás eset van, amelynek oka a Thimerosal-oldattal való érintkezés. Ne hagyja, hogy a környezetbe jusson a kumulatív hatás veszélye miatt. Az USA szövetségi erőforrás-megőrzési és helyreállítási törvénye (RCRA) szerint a 0,2 ppm-nál nagyobb koncentrációjú higanytartalmú oldatokat veszélyes hulladékként (D009) kell kezelni, és az összes hulladékot a helyi, regionális és nemzeti előírások szerint kell ártalmatlanítani. (Megjegyzés: a higany (Hg) a Thimerosal molekula 49,55%-át alkotja, így egy 0,01% Thimerosalt tartalmazó vegyület kb. 0,005 w/v% (50 ppm) higanyt tartalmaz. Amennyiben a bőrre kerül, azonnal mossa le bő vízzel. Figyelmeztetés: Kalifornia Állam szerint a Thimerosal mérgezi a szaporítószerveket. 13. Kérésre rendelkezésre áll az anyagbiztonsági adatlap. 7 ÓVINTÉZKEDÉSEK A FELHASZNÁLÓK SZÁMÁRA 1. AZ ISMERETELEN KÖRÜLMÉNYEK KÖZÖTT TÁROLT FAGYASZTOTT SZÉRUMMINTÁK TÉVES POZITÍV EREDMÉNYEKRE VEZETHETNEK, GOMBÁKKAL, ILLETVE BAKTÉRIUMOKKAL VALÓ FERTŐZÉS LEHETŐSÉGE MIATT. 2. Ne használjuk a készletet vagy reagenseit a megadott lejárati dátum után. 3. A tömény mosóoldat (R2) és a leállító oldat (R10) kivételével ne keverjünk más készletekből származó, más gyártási számú reagenseket. 4. Használat előtt, legalább 15 percig kell hagyni szobahőmérsékletre melegedni a reagenseket. 5. Feloldás során alaposan keverjük a reagenseket, különösen vigyázva a mikrobás szennyeződés elkerülésére. 6. Ne végezzük a vizsgálatot reaktív gőzök (savak, lúgok, aldehidek) vagy por jelenlétében, mivel ezek befolyásolhatják a konjugátum enzimaktivitását. 7. A kromogén-szubsztrát reakcióoldat elkészítéséhez használjunk tiszta, eldobható, polipropilén műanyag edényeket. Amennyiben üvegedényeket használunk, ezeket először 1N sósavban el kell mosni, majd desztillált vízzel öblíteni és megszárítani. 8. A kontrollok és minták kézi pipettázásakor az átvitel megelőzése érdekében minden mintához külön pipettahegyet használjunk. 9. A tesztlyukak megfelelő mosásának a biztosításához tartsuk tiszteletben az ajánlott mosási ciklusok számát, és biztosítsuk minden tesztlyuk teljes feltöltését, majd teljes ürítését. A mosást kézzel, mosóflakonnal nem szabad végezni. 10. Ne hagyjuk kiszáradni a mikrolemezt a mosási ciklus befejezése és a reagensek bemérése között. 11. Ne használjuk ugyanazt a flakont a konjugátum és szubsztrátum oldatokhoz. 12. Ne hagyjuk, hogy a konjugátum vagy kromogén- szubsztrát reakcióoldatok fémekkel, vagy fémes ionokkal érintkezzenek. 13. Ne tegyük ki a kromogén-szubsztrát reakcióoldatot erős fény hatásának a tárolás vagy inkubálás ideje alatt. Ne hagyjuk, hogy a kromogén oldat oxidálószerrel érintkezzen. 14. Kerüljük a leállító oldat érintkezését bármilyen oxidálószerrel. Ne hagyjuk, hogy a leállító oldat fémekkel, vagy fémes ionokkal érintkezzen. 3

15. Használjunk tiszta, pormentes anyagokat (csövek, hegyek, flakonok, stb.), hogy minimalizáljuk a környezeti Aspergillus spórákkal való befertőződés lehetőségét. Mivel a galactomannan termostabil, az anyag sterilizálása nem szavatolja a szennyező antigéntől való mentességet. Legelőnyösebb a pirogénmentes anyagok használata, de megfelelő óvintézkedések mellett szokványos anyagok alkalmazhatók. 16. Az oldatokat (szérumok, kezelőoldat, konjugátum) és nyitott edényeket (lemezek, csövek, pipetták) csak a lehető legrövidebb ideig hagyjuk szabad levegőn. 17. Ne öntsük vissza az eredeti flakonba a felhasználatlan konjugátumot. 18. A kromogén-szubsztrát reakcióoldatnak színtelennek kell lennie. Kék szín megjelenése a hígítás után azt jelzi, hogy a reagens szennyezett és nem szabad felhasználni. Dobjuk ki és készítsünk friss reagenst. 8 A REAGENSEK ELKÉSZÍTÉSE ÉS TÁROLÁSA Tesztlyuk-csíkokat tartalmazó lemez (R1) A lemezt tartalmazó tasak felnyitása után a teszlyuk-csíkok +2-8 C hőmérsékleten tárolva, a szárítószert tartalmazó eredeti csomagolásba gondosan visszazárva 5 hétig stabilak. Tömény mosóoldat (R2) Készítsük el a mosóoldatot, egy rész tömény mosóoldatot 9 rész steril ioncserélt vagy desztillált vízhez adva. Az elkészített mosóoldatot 14 napig lehet tárolni 2-8 C hőmérsékleten. Készítsünk a teljes vizsgálathoz elegendő mosóoldatot (80 ml egy csíkhoz: 8 ml R2 + 72 ml desztillált víz). Felnyitás után a tömény mosóoldatot +2-25 C hőmérsékleten kell tárolni, védve a fertőződéstől, így stabil marad a címkén látható lejárati dátumig. Negatív kontrollszérum (R3) Oldjuk fel egy flakon kontroll tartalmát 1000 µl (1 ml) steril, tisztított vízzel (lehetőleg pirogénmentes vízzel). A szérumokat közvetlenül a vizsgálat elvégzése előtt kell feloldani. Hagyjuk oldódni a szérumot 2-3 percig, majd keverjük meg alaposan. Osszuk szét 300 µl-es aliquot részekre 3 polipropilén mikrocentrifuga csőbe. Azokat a polipropilén centrifuga csöveket, amelyeket nem használunk fel, azonnal fagyasszuk le -20 C hőmérsékleten. Megjegyzés: Az előzetesen feloldott, majd azonnal -20 C hőmérsékleten lefagyasztott kontrollszérumok esetében kiengedés után nincs szükség további hidratálásra. A feloldott, majd lefagyasztott kontrollok -20 C hőmérsékleten legfeljebb öt hétig tárolhatók. A kontrollszérumokat ugyanúgy kell kezelni, mint a betegmintákat (300µl szérum + 100µl kezelőoldat, stb.). Cut-Off kontrollszérum (R4) és pozitív kontrollszérum (R5) A fentiekkel azonos módon, a negatív kontrollszérum esetében leírtak szerint kell elkészíteni. Kromogén-szubsztrát reakcióoldat (R8 + R9) Készítsük el a kromogén-szubsztrát reakcióoldatot, egy rész tömény kromogén TMB oldatot (R9) adjunk 50 rész TMB szubsztrátum pufferhez (R8). Készítsünk csíkonként 2 ml kromogén-szubsztrát reakcióoldatot: 40 µl R9 + 2 ml R8. Az oldat 6 órán keresztül stabil, sötétben és szobahőmérsékleten (+18-25 C) tárolva. Felnyitás után a +2-8 C hőmérsékleten tárolt R8 és R9 befertőződés hiányában stabil marad a címkén látható lejárati dátumig. Konjugátum (R6), szérumkezelő oldat (R7) és leállító oldat (R10) Felnyitás után a +2-8 C hőmérsékleten tárolt R6, R7, és R10 reagensek befertőződés hiányában stabilak maradnak a címkén látható lejárati dátumig. 9 MINTAVÉTELEZÉS Vegyük le a vérmintákat a szabvány laboratóriumi eljárásoknak megfelelően. A vizsgálatot szérumon végezzük. A szérumminták nem lehetnek gombaspórákkal, illetve baktériumokkal fertőzöttek. A mintákat lezárt csövekben, a levegőtől védve kell szállítani és tárolni. A felbontatlan mintákat a vizsgálat előtt 2-8 C hőmérsékleten legfeljebb 5 napig lehet tárolni. Az első felbontás után a minták a vizsgálat előtt 2-8 C hőmérsékleten 48 órát tárolhatók. Hosszabb tárolás esetén a szérumot -70 C hőmérsékletre kell fagyasztani. A szérummintákat maximum 4 fagyasztási / kiolvasztási ciklusnak lehet alávetni. Az előzőleg lefagyasztott mintákat alaposan meg kell keverni a kiolvasztás után és a vizsgálat előtt. Az eredményeket nem befolyásolják a 20mg/l bilirubin tartalmú minták, lipémiás minták, amelyek 2g/l triolein (triglicerid) egyenértékét tartalmazzák vagy olyan hemolizált minták, amelyek 165 mg/l hemoglobint tartalmaznak. Nem vizsgáltuk az albuminfelesleg kölcsönhatásait. Ne távolítsuk el a komplementet a szérumokból. 4

10 ELJÁRÁS A készlettel szállított reagensek Lásd a REAGENSEK fejezetet. Szükséges de nem szállított anyagok 1. Steril desztillált vagy ioncserélt víz, a mosóoldat hígításához. 2. Steril tisztított víz a kontrollszérumok beoldására. 3. Papírtörlő. 4. Eldobható védőkesztyű. 5. Védőszemüvegek. 6. Nátrium-hipoklorit (hypo) és nátrium-bikarbonát. 7. Pipetták vagy multipipetták, állítható vagy fix térfogatú, amelyek 50 µl, 100 µl, 300 µl, és 1000 µl térfogatok bemérésére alkalmasak. 8. 1,5ml polipropilén mikrocentrifuga csövek, légmentesen záró dugóval, amelyek elviselik a 120 C (fűtő) vagy 100 C (forrásban lévő vízfürdő) hőmérsékletet. a. Csavaros kupakú csövek: 1,5 ml kúpos csövek, Bio-Rad kat. sz. 224-0100 vagy egyenértékű. b. Pattintós kupakú csövek: EZ Micro Test Tubes, 1,5 ml, Bio-Rad kat. sz. 223-9480 vagy egyenértékű. 9. Mikro-cső kupakzárak (VWR kat. sz. 6054001 vagy egyenértékű). Ezek a zárak biztonságosan lezárják a bekattanó kupakos csöveket, megelőzve a kupakok felnyílását a hőmérséklet és nyomásjellemzők változása során, és a csöveket könnyen kiemelhetővé teszik a blokkfűtőből vagy forrásban lévő vízfürdőből. 10. Laboratóriumi asztali centrifuga polipropilén 1,5 ml csövekhez, maximális gyorsulás 10 000g. 11. Kerek, lebegő mikro-centrifuga állvány 1 L űrtartalmú főzőpohárnak. 12. Vortex-keverő. 13. Fűtőblokk. A következő fűtőblokk modellek ajánlottak: a. 1 blokk modell: Grant Cat. # QBD1 (VWR kat. # 460-0074) b. 2 blokk modell: Grant Cat. # QBD2 (VWR kat. # 460-0076) 14. Blokk a fűtőblokkhoz: mindkét fűtőblokkot a Grant blokk Cat# QB-E1 (VWR kat. # 460-8517)-al kell használni. 15. Vízfürdő 100 C hőmérsékleten 16. Mikrolemez inkubátor 37 ± 1 C hőmérsékleten. 17. Félautomata vagy automata mikrolemez mosó. 18. Mikrolemez leolvasó, 450nm és 620nm szűrőkkel felszerelve. Megjegyzések az eljárással kapcsolatban A vizsgálat eredményének validálásához, minden tesztsorozatban vizsgálni kell a negatív, pozitív, és Cut-Off kontrollokat. Szérumok kezelése Minden kontrollszérumnál: a vizsgált mintákkal egyszerre kell tesztelni a negatív(r3), Cut-Off(R4) és pozitív(r5) kontrollokat: 1. Pipettázzunk 300 µ térfogatot minden teszt és kontrollszérumból külön 1,5 ml polipropilén csövekbe. 2. Adjunk 100 µl szérumkezelő oldatot (R7) minden csőhöz. 3. Alaposan keverjük meg a csöveket rázással vagy vortex keverővel. Szorosan zárjuk le a csövet, hogy ne nyíljon ki melegítés közben. Pattintós kupakú csövek esetében használjunk kupakrögzítőt. Ne szúrjuk át a dugót. 4. Hőblokkos változat: Melegítsük a csöveket 6 percig fűtőblokkban 120 o C hőmérsékleten. A csöveket csak akkor kell a blokkba helyezni, amikor ez már elérte az ajánlott hőmérsékletet.(*) VAGY Vizes fürdős változat: Vízfürdő használata esetén: melegítsük a csöveket 3 percig fűtőblokkban 100 o C hőmérsékleten. (*) 5. Óvatosan távolítsuk el a forró csöveket a fűtőblokkból vagy forrásban lévő vízfürdőből, és helyezzük a centrifugába. Centrifugáljuk a csöveket 10 000g gyorsuláson 10 percig. 6. A felülúszót használjuk a galactomannan antigén kimutatására. 7. A felülúszó vizsgálatához a következő eljárást kell alkalmazni. Elkészítés után a felülúszót el lehet távolítani és 2-8 C hőmérsékleten lehet tárolni legfeljebb 48 órát a vizsgálat előtt. Ha az eredmények a vizsgálat megismétlését igénylik, új szérum mintát kell kezelni a vizsgálathoz. (*) A vizsgálat sikere érdekében, szigorúan tiszteletben kell tartani az előírt hőmérsékletet, időhatárokat és ajánlott anyagok alkalmazását. Ne alapozzunk a készülék által kijelzett hőmérsékletre, ásványolajjal töltött centrifugacsőbe illeszett kalibrált hőmérővel ellenőrizzük, hogy a hőmérséklet kielégíti a követelményeket: vízfürdő esetében 100 Cnak, fűtőblokk esetében 120 Cnak kell lennie a cső belsejében. 5

EIA eljárás Szigorúan tartsuk tiszteletben az ajánlott protokollt. Tartsuk tiszteletben a Helyes Laboratóriumi Gyakorlat irányelveit. 1. Használat előtt, legalább 15 percet kell hagyni szobahőmérsékletre (18-25 C) melegedni a reagenseket. 2. Készítsük el a mosóoldatot, kromogén-szubsztrát reakcióoldatot, valamint a negatív, pozitív, és Cut-Off kontrollokat. 3. Készítsünk diagramot a tesztszérumok és kontrollok azonosítására a mikrolemezen. Használjunk egy tesztlyukat a negatív kontrollszérumhoz (R3), két tesztlyukat a Cut-Off kontrollszérumhoz (R4), és egy tesztlyukat a pozitív kontrollszérumhoz (R5). 4. Távolítsuk el a lemeztartót és a tesztlyuk-csíkokat (R1) a lemez tasakjából. A felhasználatlan csíkokat helyezzük vissza a szárítószeres tasakba, és zárjuk vissza a tasakot. 5. Használat előtt, felfordítással keverjük meg a konjugátum flakont (R6). Mérjünk 50 µl konjugátumot (R6) minden tesztlyukba. Ezután mérjünk minden tesztlyukba 50 µl kezelt szérum felülúszót, a fentiekben leírtaknak megfelelően. Ne mérjük be a tesztlyukakba a szérummintákat a konjugátum előtt. 6. A párolgás megelőzése érdekében fedjük le a lemezt öntapadós fóliával, vagy mással, biztosítva a teljes felület vízhatlan lefedését. 7. Inkubáljuk a mikrolemezt száraz mikrolemez inkubátorban 90 ± 5 percig 37 C (± 1 C) hőmérsékleten. 8. Távolítsuk el a fóliát. Szívassuk tesztlyuk tartalmát hulladéktartályba (amely nátrium-hipokloritot tartalmaz). Mossuk a lemezt 5x, legalább 370 µl mosóoldattal. Az utolsó mosás után fordítsuk meg a mikrolemezt és az ottmaradt folyadék eltávolításához gyengéden ütögessük papírtörlőhöz. 9. Gyorsan mérjünk 200 µl kromogén-szubsztrát reakcióoldatot (R8 + R9) minden tesztlyukba, kerülve az erős fényt. 10. Inkubáljuk a mikrolemezt 30 ± 5 percig sötétben és szobahőmérsékleten (18-25 C). Ennek az inkubációs lépésnek az ideje alatt ne használjunk tapadófóliát. 11. Mérjünk 100 µl leállító oldatot (R10) minden tesztlyukba, ugyanabban a sorrendben, amelyet a szubsztrátum oldatnál alkalmaztunk. Jól keverjük össze. 12. Alaposan töröljük le minden lemez alját. 13. Olvassuk le minden tesztlyuk optikai sűrűségét (abszorbancia) 450nm hullámhosszon (referenciaszűrő: 620nm). A mikrolemezeket a leállító oldat bemérése után 30 percen belül kell leolvasni. 11 MINŐSÉG-ELLENŐRZÉS (ÉRVÉNYESSÉGI SZEMPONTOK) Cut-Off kontroll: Minden Cut-Off kontrollszérum OD értéke legyen 0,300 és 0,800 Pozitív kontroll: A pozitív kontrollszérum indexe nagyobb kell legyen, mint 2,00. Pozitív kontroll (R5) OD I = > 2,00 Cut-Off kontroll átlag OD Negatív kontroll: A negatív kontrollszérum indexe kisebb kell legyen, mint 0,40. Negatív kontroll (R5) OD I = < 0,40 Cut-Off kontroll OD átlag Amennyiben valamelyik kontroll nem felel meg a fenti érvényességi szempontoknak, a vizsgálat érvénytelen, és a betegminta eredményeket nem szabad kiadni. Az eljárás áttekintése után a kezelő dönthet a vizsgálat megismétléséről, vagy segítségért kapcsolatba léphet a gyártóval. A vizsgálat megismétlése esetén ugyanazon mintából új aliquot részt kell használni. Számítási példa: Minta Abszorbancia (OD) Negatív kontroll (R3) OD 0,117 Cut-Off kontroll (R4) OD 0,596 0,576 Pozitív kontroll (5) OD 2,602 Számítások Cut-Off átlagának kontrollértéke Az Cut-Off kontroll (R4) átlagabszorbanciájának kiszámításához, adjuk össze a Cut-Off kontroll replikátumok OD értékeit és osszuk el az eredményt kettővel: (0,596 + 0,576) 2 = 0,586 6

Negatív kontroll index A negatív kontroll indexének kiszámításához osszuk el a negatív kontroll abszorbanciáját a Cut-Off kontroll átlagabszorbanciájával: 0,117 I = = 0,20 0,586 Pozitív kontroll index A pozitív kontroll indexének kiszámításához, osszák el a pozitív kontroll abszorbanciáját a Cut-Off kontroll átlagabszorbanciájával: 2,602 I = = 4,44 0,586 Érvényesség A fenti példában: Minden Cut-Off kontroll abszorbanciája 0,300 és 0,800, ami azt jelenti, hogy a Cut-Off kontroll érvényes. A negatív kontroll indexe < 0,40, ami a negatív kontroll érvényességét jelenti. A pozitív kontroll indexe > 2,00, ami a pozitív kontroll érvényességét jelenti. Az ebben a példában szereplő vizsgálatsorozat érvényes, mivel az eredmények megfelelnek az érvényességi szempontoknak minden kontroll esetében. 12 AZ EREDMÉNYEK ÉRTELMEZÉSE A galactomannan antigén jelenlétét vagy hiányát a vizsgált mintában minden betegminta esetében az index számításával határozzuk meg. Az index (I), a minta abszorbanciája, osztva a Cut-Off kontrollszérumot tartalmazó tesztlyukak átlagabszorbanciájával. Az Cut-Off kontroll átlagos abszorbanciájának kiszámítása: Adjuk össze a két Cut-Off kontrollszérumot tartalmazó tesztlyuk (R4) abszorbanciáját és az eredményt osszák el kettővel. A vizsgált szérumok indexének (I) kiszámítása: Számítsuk ki a következő arányt a minden vizsgált szérum esetében: minta OD I = Cut-Off kontroll átlag OD A < 0,50 alatti indexű szérumokat galactomannan antigénre nézve negatívnak tekintjük. Megjegyzés: A negatív eredmény azt is jelentheti, hogy a beteg eredménye a vizsgálat kimutatási határ alatt van. Megjegyzés: A negatív eredmények nem zárják ki az invazív Aspergillosis diagnózisát. A vizsgálat megismétlése javallott, ha az eredmény negatív, de gyanítható a betegség fennállása. A 0,50 indexű szérumokat galactomannan antigénre nézve pozitívnak tekintjük. Az összes pozitív páciens esetében ajánlott megismételni ugyanannak a mintának egy új egyenlő felosztását, valamint új mintát gyűjteni a pácienstől a további vizsgálathoz. Megjegyzés: A 0,000 alatti abszorbencia érték hibás eljárásra vagy a műszerre utalhat, amit ki kell értékelni. Az eredmény érvénytelen, és a mintát újra meg kell vizsgálni. A magas rizikófaktorú páciensek esetében rendszeresen (hetente kétszer) szűrést kell végezni a vizsgálat érzékenységének növelése és a korai pozitivitás felismerése érdekében. Megjegyzés: A Platelia Aspergillus EIA célja az invazív aspergillosis diagnózisának elősegítése. A Platelia Aspergillus EIA alkalmazása esetén előforduló pozitív eredményeket más diagnosztikai eljárásokkal, például biopsziás minták mikrobiológiai tenyésztésével vagy hisztológiai vizsgálatával és röntgenfelvétellel együtt kell vizsgálni. Számítási példa: Minta Abszorbancia (OD) Negatív kontroll (R3) OD 0,117 Cut-Off kontroll (R4) OD 0,596 0,576 Pozitív kontroll (R5) OD 2,602 Betegminta #1 0,134 Betegminta #2 0,436 Betegminta #3 1,196 7

Számítások Lásd a minőség-ellenőrzés (érvényességi szempontok) fejezetben a számítási példát a vizsgálatban alkalmazott kontrollok érvényességének megállapításához. Cut-Off átlagának kontrollértéke Az Cut-Off kontroll (R4) átlagabszorbanciájának kiszámításához adjuk össze a Cut-Off kontroll replikátumok abszorbanciaértékeit és osszuk el az eredményt kettővel: (0,596 + 0,576) 2 = 0,586 Betegminta #1 A betegminta #1 indexének kiszámításához, osszuk el a betegminta #1 abszorbanciáját a Cut-Off kontroll átlagabszorbanciájával: I = 0,134 0,586 = 0,23 Ebben a példában, a betegminta #1 negatív, mivel a 0,23 indexe < 0,50. Betegminta #2 A betegminta #2 indexének kiszámításához, osszuk el a betegminta #2 abszorbanciáját a Cut-Off kontroll átlagabszorbanciájával: I = 0,436 0,586 = 0,74 Ebben a példában, a betegminta #2 pozitív, mivel a 0,74 indexe 0,50. Betegminta #3 A betegminta #3 indexének kiszámításához, osszuk el a betegminta #3 abszorbanciáját a Cut-Off kontroll átlagabszorbanciájával: I = 1,196 0,586 = 2,04 Ebben a példában, a betegminta #3 pozitív, mivel a 2,04 indexe 0,50. 13 AZ ELJÁRÁS KORLÁTAI 1. A negatív eredmény nem zárja ki az invazív Aspergillosis diagnózist. Az invazív Aspergillosis veszélyének kitett betegeket hetente kétszer kell vizsgálni. 2. A Platelia Aspergillus eljárást és az eredmények értékelési módját szigorúan tartsuk be a galactomannan antigén jelenlétének vizsgálatakor. Vizsgálatok elvégzése előtt, a készlet felhasználója olvassa el a csomagban elhelyezett utasítást. Gondosan tartsuk tiszteletben a minta és reagens pipettázására, a lemezmosásra, és az inkubációs lépések idejére vonatkozó vizsgálati előírásokat. 3. Amennyiben elmulasztjuk a mintának vagy valamely reagensnek az eljárás utasításai szerinti bemérését, ez téves negatív eredményhez vezethet. Aspergillosis jelenlétének klinikai gyanúja, vagy vélhető eljárási hiba esetén meg kell fontolni újabb minták ismételt vizsgálatát. 4. A negatív betegminták tesztlyukainak keresztszennyeződése pozitív kontroll/betegminta tesztlyukak által akkor fordulhat elő, amikor a reagensek bemérése közben valamely tesztlyuk tartalma átömlik másik tesztlyukba a mikrolemez durva kezelése vagy szabálytalan pipettázási eljárás miatt. 5. A Platelia Aspergillus EIA vizsgálat teljesítményét nem vizsgálták újszülött vagy gyermek szérumminták esetében. 6. A Platelia Aspergillus EIA nehezebben érzékeli a galactomannan jelenlétét az idült granulomatózisban szenvedő betegeknél (CGD) és Jób-szindrómás betegeknél (hyper-ige szindróma) 36, 37. 7. A penészgombák elleni huzamos anti-funális kezelés egyes invazív Aspergillosisos betegeknél csökkent érzékenységet okozhat a Platelia Aspergillus EIA vizsgálatban 20. 8. A Platelia Aspergillus EIA vizsgálatot nem vizsgálták plazma, vagy egyéb mintafajták esetében, pl. vizelet, BAL vagy liquor. 9. A Platelia Aspergillus EIA teljesítményét nem vizsgálták a manuális leolvasás, illetve vizuális eredmény-meghatározás esetében. 10. Más gombanemek, például a Penicillium, az Alternaria, a Paecilomyces, a Geotrichum és a Histoplasma reaktivitást mutatott a patkány EBA-2 egyklónos antitestek esetében az Aspergillus galactomannan észlelését célzó vizsgálatban. A histoplasmosist endemikus területnek kell tekinteni, ideértve az USA részét 23, 32, 38. 8

11. Pozitív reakciók klinikai jelek nélkül: Mivel a galactomannan antigént ki lehet mutatni a szérumban a klinikai, illetve röntgenvizsgálatban való megjelenés előtt is, pozitív reakciót tapasztalhatunk klinikai jelek nélkül is: ezek valódi pozitív eredményeknek felelnek meg olyan betegeknél, akiknél a későbbiekben bizonyított vagy valószínű invazív Aspergillosis diagnózisát állapítják meg. Mindazonáltal, egyes egyedi esetekben, figyelembe kell venni bizonyos tényezőket a vizsgálat eredményeinek értékelése során: a. Pozitív reakciókról számoltak be klinikai jelek nélkül, különösen fiatal gyermekeknél 26. Ámbár egyes esetek valóban Aspergillus antigének keringésével 5 lehetnek kapcsolatosak, legtöbbször ezek téves pozitív eredménynek tekinthetők. b. Galaktofuranózt mutattak ki különböző élelmiszerekben, különösen gabonaneműekben és krémes desszertekben 1,17. Az emberi tejtől eltérően, a humanizált tejek gyakran magas galactomannan tartalmúak 10. Ennek következtében, fiatal gyermekek anigenemiája esetében számolni kell az étrendi tényezővel is, de ez érvényes általában minden megváltozott bél-felszívódású betegre 4, 10. Klinikai jelek nélküli pozitív antigenemia esetében még óvatosabban kell az ilyen populáció eredményeit értelmezni 17. c. Pozitív galactomannan vizsgálati eredményekről számoltak be olyan betegeknél, akik piperacillin/tazobactam kezelést kaptak. Beszámoltak továbbá olyan piperacillin/tazobactam gyártási tételekről vagy sarzsokról is, melyek galactomannan antigénre pozitívnak bizonyultak. Ennek következtében, a pozitív vizsgálati eredményt piperacillin/ tazobactam kezelésben részesülő betegeknél óvatosan kell értelmezni, és egyéb diagnosztikai módszerekkel is igazolni kell. Galactomannan kimutatásáról számoltak be egyes amoxicillint és klavulánsavat tartalmazó parenterális készítmények gyártási tételeiben is. Ennek következtében, a félszintetikus β-laktám kezelésekkel számolni kell, a vizsgálati eredmények értelmezése során 1, 21. Mindazonáltal, mivel a Platelia Aspergillus EIA kimutatja a galactomannan antigént jóval a klinikai vagy röntgen jelek megjelenése előtt, az invazív Aspergillosis előfordulása nem zárható ki. Ennek következtében, gondosan kell figyelni azokat a piperacillin/tazobactam kezelést kapó betegeket, akiknél pozitív a vizsgálati eredmény. d. Klinikai tünetek nélküli pozitív reakciók figyelhetők meg azokon a pácienseken, akik galactomannant tartalmazó terméket kapnak parenterálisan vagy orálisan (a bél-barrier megváltoztatásával). A galactomannan ilyen termékekben való jelenlétének gyakori oka a gombás mikroorganiz musokra alapuló erjesztési eljárás. A páciensek esetében azonban nem figyelhető meg pozitív eredmény, amennyiben az exogén galactomannan szérumkoncentrációja eléri vagy meghaladja a vizsgálat észlelési küszöbét. Így ha gyanús pozitív eredmények vannak egyéb tünetek hiányában, javasoljuk a páciens által szedett termék vizsgálatát, különös tekintettel a gyártási folyamatára és a felhasznált alapanyagok eredetére 11, 24, 31. 14 VÁRHATÓ ÉRTÉKEK Az invazív Aspergillosis várt előfordulása a betegpopuláció függvényében változik; 5-20% arányokról számoltak be 7, 13. Klinikai tanulmányt végeztek két európai vizsgálati központban 4873 szérummintával 239 eseményből (203 beteg) akiknél rosszindulatú hematológiai folyamat, vagy vérsejtképző őssejt transzplantáció mellett invazív Aspergillosist diagnosztizáltak vagy nem diagnosztizáltak, hogy meghatározzák a Platelia Aspergillus EIA teljesítményjellemzőit. Mivel egy beteget a tanulmányba többször bevehettek, az elemzést kezelésenkénti események alapján végezték. Egy eseménynek tekintenek a klinikai esemény (pl. transzplantáció, GVHD stb.) körüli időszakot. Ennek eredményeképpen egyetlen beteg esetében több eseményt figyeltek meg. Az átlagos gyakoriság ebben a tanulmányban 16% volt (38/239). Az indexértékek eloszlását ezeknél a populációknál a következő diagram szemlélteti. 9

Invazív Aspergillosis nélküli diagnosztizált betegek (kontroll populáció) Összesen 3691 szérummintát vettek 201 esemény során (168 beteg) a két európai vizsgálati központban, majd a Platelia Aspergillus EIA teszttel vizsgáltak. Az indexértékek eloszlása a következő diagramon látható. Ez a szórási grafikon mutatja a galactomannan vizsgálat eredményeit a 3691 szérumminta esetében, a 201 esemény során (168 kontrollbeteg) ebben a tanulmányban (vérsejtképző őssejt átültetés miatt immunelnyomásos kezelés, vagy rosszindulatú vérképváltozások kezelése). KONTROLLPOPULÁCIÓ: INDEXELOSZLÁS / ESEMÉNY (N= 201 esemény, 168 beteg) 2 1,5 Index 1 0,5 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 Esemény száma 10

Invazív Aspergillosis betegséggel diagnosztizált betegek Ez a szórási grafikon mutatja a galactomannan vizsgálat eredményeit a 1182 szérummintával, 38 esemény során (35 beteg) ebben a tanulmányban, bizonyított vagy valószínűsített invazív Aspergillosis betegséggel, az EORTC/NIAID definíciók értelmében. Nem várható, hogy minden beteg minden szérummintája pozitív. Az invazív Aspergillosis várt előfordulása a betegpopuláció függvényében változik; 5-20% arányokról számoltak be 7, 13. A gyakoriság ebben a tanulmányban 16% volt. BIZONYÍTOTT / VALÓSZÍNŰ INVAZÍV ASPERGILLOSIS: INDEX / ESEM ÉNY ELOSZLÁSA (N=38 esemény, 35 beteg) 10,0 8,0 Index 6,0 4,0 2,0 0,0 0 10 20 30 40 Esemény száma Cut-Off 0,5 A következő grafikonokon egy olyan beteg szerepel, akinél nincsenek az invazív Aspergillosisnak klinikai jelei vagy tünetei (negatív Aspergillus), valamint egy bizonyítottan invazív Aspergillosisban szenvedő beteg (pozitív Aspergillus). Negatív beteg: KONTROLLBETEG index 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 10 20 30 40 50 60 nap 11

Pozitív beteg BIZONYÍTOTT INVAZÍV ASPERGILLOSIS BETEG index 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 10 20 30 40 50 60 nap 15 A TESZT JELLEMZŐ TELJESÍTMÉNYPARAMÉTEREI A Reprodukálhatósági tanulmányok A vizsgálatok közötti és vizsgálaton belüli Platelia Aspergillus EIA varianciáját tanulmányban határozták meg, 6 kevert betegszérum mintával (egy negatív, egy gyenge pozitív, két pozitív, és két magas pozitív), amelyek három klinikai kísérlet helyszínéről származtak Észak-Amerikából. Mind a 6 kevert mintát háromszor vizsgálták (x3) három különböző napon, azonos gyártási számú kittel, két helyszínen (ismétlések száma minden helyszínen = 9). Mind a 6 kevert mintát kétszer vizsgálták (x2) három különböző napon, azonos gyártási számú kittel, a harmadik helyszínen (ismétlések száma a harmadik helyszínen = 6). Egy (1) dolgozó végzett el minden pontossági vizsgálatot, minden helyszínen. Az adatokat az Országos Klinikai Laboratórium Szabványbizottság (NCCLS) előírásai szerint elemezték. Az átlag optikai sűrűség (OD) és az átlag index érték, szórás (SD), százalékos variációs koefficiens (%CV), egy vizsgálaton belül pontosság (intraassay) és a vizsgálatok közti (inter-assay) pontosság minden kevert mintára, minden helyszínen, a következő táblázatokban látható. N/A= nem értelmezhető 1 NCCLS EP5-A, Vol. 19, No 2, 24. oldal, (C2) egyenlet ²NCCLS EP5-A, Vol. 19, No 2, 25. oldal, (C3) és (C4) egyenletek 12

B Keresztreaktivitás A Platelia Aspergillus EIA készlet egy gyártási tételével tanulmányt végeztek, hogy felmérjék az olyan potenciálisan zavaró orvosi körülmények hatását, melyek nincsenek kapcsolatban az invazív Aspergillosis betegséggel. A következő szérummintákat vizsgálták keresztreaktivitás szempontjából a Platelia Aspergillus EIA készlettel. Összesen 151 szérumot vizsgáltak. Kórtan Vizsgált minták száma Pozitív Rheumatoid faktor 10 0 ANA pozitív 10 0 IgG hypergammaglobulinemia 10 0 IgM hypergammaglobulinemia 10 0 Rák* 11 0 Nem vírusos májzsugorodás (epe-eredetű; alkohol okozta; gyógyszer okozta) 10 0 Többszörös vérátömlesztés 10 0 Többször szült nők 10 0 HAV 10 0 HCV 10 0 Rubeola 10 0 CMV 10 0 Szifilisz (RPR+) 10 0 Toxoplazmózis 10 0 Mikoplazma 10 0 *Egy-egy az alábbiakból: húgyhólyag, mell (2), végbél, endometriális, tüdő, dülmirigy, vese, és pikkelyes hám (3). C Klinikai vizsgálatok: Két helyszínen (Belgium és Hollandia) klinikai vizsgálatokat végeztek a Platelia Aspergillus vizsgálatok érzékenységének, specifikusságának és predikciós képességének meghatározására. A tanulmányt visszamenőlegesen végezték összesen 4873 szérummintával, amelyet 203 betegtől vettek, a következő populációkból*: az invazív Aspergillosis jeleit nem mutató betegek (kontroll betegek) betegek vélhető invazív Aspergillosis betegséggel betegek bizonyított invazív Aspergillosis betegséggel * Az Invazív Gombás Fertőzés Együttműködési Csoport (Fungal Infection Cooperative Group - IFICG) amely az Európai Rákkutatási és Kezelési Szervezet (European Organization for Research and Treatment of Cancer - EORTC) tagja, és a Mycosis Tanulmány Csoport (az MSG - Mycosis Study Group - az Országos Allergológiai és Fertőző Betegségek Intézete [National Institute of Allergy and Infectious Diseases - NIAID] tagja) definiálták az invazív Aspergillosis (IA) diagnózisának szempontjait rosszindulatú hematológiás vagy vérsejtképző őssejt transzplantációs betegeknél 2. A bizonyított invazív Aspergillosist pozitív mikrobiológiai tenyészettel határozzák meg, amelyet steril eljárással nyernek az érintett helyről, valamint a megfelelő morfológiai formák kórszövettani bizonyításával, a gombás fertőzésnek tulajdonított tüneteket mutató gazdaszervezetben. A valószínű invazív Aspergillosist úgy definiálják, mint legalább egy mikrobiológiai szempont, és egy fő, vagy két kevésbé fontos klinikai szempont teljesülése a fertőzés szempontjából releváns anatómiai hely esetében, a gombás fertőzésnek tulajdonított tüneteket mutató gazdaszervezetben. A lehetséges invazív Aspergillosist úgy definiálják, mint legalább egy mikrobiológiai szempont, vagy egy fő vagy két kevésbé fontos klinikai szempont teljesülése a fertőzés szempontjából releváns anatómiai hely esetében, a gombás fertőzésnek tulajdonított tüneteket mutató gazdaszervezetben. Mivel a valószínű és bizonyított invazív Aspergillosis viszonylag ritka, jelen tanulmány céljára a következő definíciót javasoljuk a klinikai érzékenység és specifikusság tekintetében. ÉRZÉKENYSÉG Jelen tanulmány eredményeit a betegérzékenység szempontjából elemeztük. Az érzékenységvizsgálatot a Platelia Aspergillus készlettel végeztük két helyszínen, 38 eseten, 35 csontvelő átültetéses (BMT) és leukémiás betegen, akiket bizonyított vagy valószínű invazív Aspergillosissal diagnosztizáltak. 13

1. Bizonyított Aspergillosis (az IFICG / EORTC definíciója szerint; lásd fenn) Kombinált helyszínek N = 19 eset, 16 betegtől Érzékenység: 100% (19/19). Megjegyzés: A 95% konfidenciaintervallumot az elégtelen mintaméret miatt nem lehetett kiszámítani. 2. Valószínű Aspergillosis (az IFICG / EORTC definíciója szerint; lásd fenn) Kombinált helyszínek: N = 19 eset, 19 betegtől Érzékenység: 94,7% (18/19). Megjegyzés: A 95% konfidenciaintervallumot az elégtelen mintaméret miatt nem lehetett kiszámítani. 3. Kombinált bizonyított és valószínű Aspergillosis (az IFICG / EORTC definíciója szerint; lásd fenn) Kombinált helyszínek: N = 38 eset, 35 betegtől Érzékenység: 97,4% (37/38). A 95% konfidenciaintervallum 86,2 99,9%. SPECIFICITÁS A specificitás vizsgálatát a Platelia Aspergillus készlettel végeztük két helyszínen, 3691 mintával, 201 eseten (168 beteg), akiknél nem jelentkeztek az invazív Aspergillosis jelei (kontrollbetegek). 1. helyszín: N = 3060 minta, 103 esetből (70 beteg) Specifikusság: 92,2% (95/103) A 95% konfidenciaintervallum 85,3 96,6%. 2. helyszín: N = 631 minta, 98 esetből (98 beteg) Specifikusság: 88,8% (87/98) A 95% konfidenciaintervallum 80,8 94,3%. Kombinált helyszínek N = 3691 eset, 201 eset (168 beteg) Specifikusság: 90,5% (182/201) A 95% konfidenciaintervallum 85,6 94,2%. PREDIKTÍV ÉRTÉK Pozitív és negatív prediktív értékeket (PPV, NPV) elemeztünk a tanulmány betegpopulációja esetében, a tanulmányban tapasztalt tulajdonképpeni 16% átlaggyakoriság alapján. PPV 66,1% (37/56) NPV 99,4% (182/183) Elemeztük azt az esetet is, amikor 2 egymás utáni minta indexértéke nagyobb vagy egyenlő volt, mint 0,5. A teljesítményt a következő táblázatban foglaltuk össze: Érzékenység* Specificitás PPV NPV Kombinált helyszínek, 1 minta 0,5 97,4% (37/38) 90,5% (182/201) 66,1% (37/56) Kombinált helyszínek, 92,1% 97,5% 87,5% 2 egymást követő (35/38) (196/201) (35/40) minta 0,5 *: az érzékenységet a bizonyított és valószínű invazív Aspergillosisra számítottuk 99,4% (182/183) 98,5% (196/199) 16 A GYÁRTÓ MINŐSÉGELLENŐRZÉSE Minden gyártott reagenst minőségi rendszerünknek megfelelően készítünk, a nyersanyag átvételétől kezdve a végső termék forgalmazásáig. Minden gyártási tételt minőségellenőrzésnek vetnek alá, és csak akkor szabadítják fel forgalmazásra, ha megfelel az előre meghatározott elfogadhatósági szempontoknak. Minden egyes tétel gyártásával és ellenőrzésével kapcsolatos feljegyzéseket a Bio-Rad cégen belül őrizzük. 14

17 HIVATKOZÁSOK 1. Ansorg, R., R. Van Den Boom, and P.M. Rath. 1997. Detection of Aspergillus galactomannan antigen in foods and antibiotics. Mycoses 40: p. 353-7. 2. Ascioglu, S., J. H. Rex, B. De Pauw, J. E. Bennett, J. Bille, F. Crokaert, D. W. Denning, J. P. Donnelly, J. E. Edwards, Z. Erjavec, D. Fiere, O. Lortholary, J. Maertens, J. F. Meis, T. F. Patterson, J. Ritter, D. Selleslag, P. M. Shah, D. A. Stevens and T. J. Walsh. 2002. Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus. Clin. Infect. Dis. 34: p. 7-14. 3. Aubry, A., R. Porcher, J. Bottero, S. Touratier, T. Leblanc, B. Brethon, P. Rousselot, E. Raffoux, J. Menotti, F. Derouin, P. Ribaud and A. Sulahian. 2006. Occurrence and kinetics of false-positive Aspergillus galactomannan test results following treatment with beta-lactam antibiotics in patients with hematological disorders. J. Clin. Microbiol. 44 (2): p. 389-94 4. Blijevens, N. M., J. P. Donnelly, J. F. Meis, P. E. Verweij, and B. E. De Pauw. 2002. Aspergillus galactomannan antigen levels in allogeneic haematopoietic stem cell transplant recipients given total parenteral nutrition. Transpl. Infect. Dis. 4: p. 64-65. 5. Chambon-Pautas, C., J. M. Costa, M. T. Chaumette, C. Cordonnier, and S. Bretagne. 2001. Galactomannan and polymerase chain reaction for the diagnosis of primary digestive aspergillosis in a patient with acute myeloid leukaemia. J. Infect. 43: p. 213-214. 6. de Repentigny, L., L. Kaufman, G. T. Cole, D. Kruse, J. P. Latge, and R. C. Matthews. 1994. Immunodiagnosis of Invasive Fungal Infections. J. Med. Vet. Mycol. 32: p. 239-252. 7. Denning, D. W. 1998. Invasive Aspergillosis. Clin Infect.Dis. 26: p. 781-803. 8. Dupont, B., M. Richardson, P. E. Verweij, and J. F. G. M. Meis. 2000. Invasive aspergillosis. Medical Mycology 38: p. 215-224. 9. Erjavec, Z. and P. E. Verweij. 2002. Recent progress in the diagnosis of fungal infections in the immunocompromised host. Drug Resist. Updat. 5: p. 3-10. 10. Gangneux, J. P., D. Lavarde, S. Bretagne, C. Guiguen, and V. Andemer. 2002. Transient Aspergillus antigenaemia: think of milk. Lancet 359: p. 1251. 11. Hage,C. A., J. M. Reynolds, M. Durkin, L. J. Wheat, K. S. Knox. 2007. Plasmalyte as a Cause of falsepositive results for Aspergillus galactomannan in bronchoalveolar lavage fluid. J. Clin. Microbiol. 45: p. 676-677. 12. Herbrecht, R., V. Letscher-Bru, C. Oprea, B. Lioure, J. Waller, F. Campos, O. Villard, K. L. Liu, S. Natarajan-Ame, P. Lutz, P.Dufour, J. P. Bergerat, and E. Candolfi. 2002. Aspergillus galactomannan detection in the diagnosis of Invasive Aspergillosis in cancer patients. J. Clin. Oncol. 20: p.1898-1906. 13. Herbrecht, R., D. Denning, T. Patterson, J. Bennett, R. Greene, J. Oestmann, W. Kern, K. Marr, P. Ribaud, O. Lortholary, R. Sylvester, R. Rubin, J. Wingard, P. Stark, C. Durand, D. Caillot, E. Thiel, P. Chandrasekar, M. Hodges, H. Schlamm, P. Troke, B. DePauw. 2002. Voriconazole Versus Amphotericin B for Primary Therapy of Invasive Aspergillosis. N. Engl. J. Med. 347, 6: p. 408-415. 14. Latge, J. P. 1995. Tools and trends in the detection of Aspergillus fumigatus. Curr. Top. Med. Mycol. 6: p. 245-281. 15. Latge, J. P. 1999 Aspergillus fumigatus and Aspergillosis. Clin. Microbiol. Rev. 12[2], 310-50. 16. Latge, J. P., H. Kobayashi, J. P. Debeaupuis, M. Diaquin, J. Sarfati, J. M. Wieruszeski, E. Parra, J. P. Bouchara, and B. Fournet. 1994. Chemical and immunological characterization of the extracellular galactomannan of Aspergillus fumigatus. Infect. Immun. 62: p. 5424-5433. 17. Letscher-Bru, V., A. Cavalier, E. Pernot-Marino, H. Koenig, D. Eyer, J. Waller, and E. Candolfi. 1998. Recherche d'antigène galactomannane aspergillaire circulant par Platelia Aspergillus : antigénémies positives persistantes en l'absence d'infection. J. Med. Mycol. 8: p. 112-113. 18. Maertens, J., J. Verhaegen, H. Demuynck, P. Brock, G. Verhoef, P. Vandenberghe, J. Van Eldere, L. Verbist, and M. Boogaerts. 1999. Autopsy-controlled prospective evaluation of serial screening for circulating galactomannan by a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for hematological patients at risk for invasive Aspergillosis. J. Clin. Microbiol. 37: p. 3223-3228. 15

19. Maertens, J., J. Verhaegen, K. Lagrou, J. Van Eldere, and M. Boogaerts. 2001. Screening for circulating galactomannan as a noninvasive diagnostic tool for Invasive Aspergillosis in prolonged neutropenic patients and stem cell transplantation recipients: a prospective validation. Blood 97: p. 1604-1610. 20. Marr K. A., M. Laverdiere, A. Gugel and W. Leisenring. 2005. Antifungal therapy decreases sensitivity of the Aspergillus galactomannan enzyme immunoassay. Clin. Infect. Dis. 40: p. 1762-9 21. Mattei, D., D. Rapezzi, N. Mordini, F. Cuda, C. Lo Nigro, M. Musso, A. Arnelli, S. Cagnassi, and A. Gallamini. 2004. False-positive Aspergillus galactomannan enzyme-linked immunosorbent assay results in vivo during amoxicillin-clavulanic acid treatment. J. Clin. Microbiol. 42: p. 5362-5363. 22. Mennink-Kersten M. A. S. H., D. Ruegebrink, R. Klont, A. Warris, H. J. M. Op den Camp and P. Verweij. 2005 Bifidobacterial Lipoglycan as a New Cause for False-Positive Platelia Aspergillus Enzyme Immunoabsorbent Assay Reactivity. J. Clin. Microbiol. 43(8): p. 3925-3931. 23. Nareddy, S., P. H. Chandrasekar. 2008. False-positive Aspergillus galactomannan (GM) assay in histoplasmosis. J. Infection 56: p. 80-81. 24. Racil, Z., I. Kocmanova, M. Lengerova, J. Winterova, J. Mayer. 2007. Intravenous PLASMA-LYTE as a Major Cause of False-Positive Results of Platelia Aspergillus EIA Test for Galactomannan Detection in Serum. J. Clin. Microbiol. 45(2): p. 3141-3142 25. Rimek, D., T. Zimmermann, M. Hartmann, C. Prariyachatigul, and R. Kappe. 1999. Disseminated Penicillium marneffei infection in an HIV-positive female from Thailand in Germany. Mycoses 42: p. 25-8. 26. Siemann, M., M. Koch-Dorfler, and M. Gaude. 1998. False positive results in premature infants with the Platelia Aspergillus sandwich enzyme-linked immunosorbent assay. Mycoses 41 : p. 373-7. 27. Stynen, D., A. Goris, J. Sarfati, and J. P. Latge. 1995. A new sensitive sandwich enzyme-linked immunosorbent assay to detect galactofuran in patients with Invasive Aspergillosis. J. Clin. Microbiol. 33: p. 497500. 28. Stynen, D., J. Sarfati, A. Goris, M. C. Prevost, M. Lesourd, H. Kamphuis, V. Darras, and J. P. Latge. 1992. Rat monoclonal antibodies against Aspergillus galactomannan. Infect. Immun. 60: p. 2237-2245. 29. Sulahian, A., F. Boutboul, P. Ribaud, T. Leblanc, C. Lacroix, and F. Derouin. 2001. Value of antigen detection using an enzyme immunoassay in the diagnosis and prediction of Invasive Aspergillosis in two adult and pediatric hematology units during a 4-year prospective study. Cancer 91: p. 311-318. 30. Sulahian, A., M. Tabouret, P. Ribaud, J. Sarfati, E. Gluckman, J. P. Latge, and F. Derouin. 1996. Comparison of an enzyme immunoassay and latex agglutination test for detection of galactomannan in the diagnosis of Invasive Aspergillosis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 15: p. 139-145. 31. Surmont,I., W. Stockman. 2007. Gluconate-containing intravenous solutions: Another cause of falsepositive galactomannan assay reactivity. J. Clin. Microbiol. 45: p. 1373. 32. Swanink, C. M., J. F. Meis, A. J. Rijs, J. P. Donnelly, and P. E. Verweij. 1997. Specificity of a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for detecting Aspergillus galactomannan. J. Clin. Microbiol. 35: p. 257-260. 33. Verweij, P. E., E. C. Dompeling, J. P. Donnelly, A. V. Schattenberg, and J. F. Meis. 1997. Serial monitoring of Aspergillus antigen in the early diagnosis of Invasive Aspergillosis. Preliminary investigations with two examples. Infection 25: p. 86-89. 34. Verweij, P. E. and J. F. Meis. 2000. Microbiological diagnosis of Invasive Fungal Infections in transplant recipients. Transpl.Infect.Dis. 2: p. 80-87. 35. Verweij, P. E., D. Stynen, A. J. Rijs, B. E. de Pauw, J. A. Hoogkamp -Korstanje, and J. F. Meis. 1995. Sandwich enzyme-linked immunosorbent assay compared with Pastorex latex agglutination test for diagnosing Invasive Aspergillosis in immunocompromised patients. J. Clin. Microbiol. 33: p. 1912-1914. 36. Verweij, P. E., C. M. Weemaes, J. H. Curfs, S. Bretagne, J. F. Meis. 2000. Failure to detect circulating Aspergillus markers in a patient with chronic granulomatous disease and Invasive Aspergillosis. J. Clin. Microbiol. 38: p. 3900-3901. 37. Walsh T. J., R.L. Schaufele, T. Sein, J. Gea-Banacloche, M. Bishop, N. Young, R. Childs, J. Barrett, H. L. Malech, and S.M. Holland. 2002. Reduced expression of galactomannan antigenemia in patients with Invasive Aspergillosis and chronic granulomatous disease or Job s syndrome. Abstracts of the 40th Annual Meeting of the Infectious Diseases Society of America. Arlington, VA. P. 105 ; Abstr. 345. 16

38. Wheat, L. J., E. Hackett, M. Durkin, P. Connolly, R. Petraitiene, T. J. Walsh, K. Knox, C. Hage. 2007. Histoplasmosis-associated cross-reactivity in the Bio-Rad Platelia Aspergillus enzyme immunoassay. Clin. Vaccine Immunol. 14 (5): p. 638-40. 39. Yeo, S. F. and B. Wong. 2002. Current Status of Nonculture Methods for Diagnosis of Invasive Fungal Infections. Clin. Microbiol. Rev. 15: p. 465484. Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 881045 Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33 03/2009 17