A PD-L1 IHC 22C3 pharmdx teszt olyan NSCLC-ben szenvedő páciensek azonosítására javallott, akik KEYTRUDA (pembrolizumab) kezelésben részesülhetnek.

PD-L1 IHC 22C3 pharmdx SK006 50 teszt az Autostainer Link 48 készülékkel való használatra Javasolt alkalmazás In vitro diagnosztikai használatra. A PD-L1 IHC 22C3 pharmdx egy kvalitatív immunhisztokémiai teszt, amely a Monoclonal Mouse Anti-PD-L1, Clone 22C3 monoklonális egér antitestet, az EnVision FLEX megjelenítő rendszert és az Autostainer Link 48 készüléket használja a PD-L1 protein kimutatására formalinban fixált, paraffinba ágyazott (FFPE) nem kissejtes tüdőrák (NSCLC) szövetben. A PD-L1 protein expressziója a tumorhányad pontszám (Tumor Proportion Score, TPS), tehát a részleges vagy teljes membránfestődést mutató, életképes tumorsejtek százalékos értéke segítségével határozható meg. A PD-L1 IHC 22C3 pharmdx teszt olyan NSCLC-ben szenvedő páciensek azonosítására javallott, akik KEYTRUDA (pembrolizumab) kezelésben részesülhetnek. Összegzés és magyarázat A PD-1 ligandumok (PD-L1 és PD-L2) a T-sejteken található PD-1 receptorhoz kötődve gátolják a T-sejtek proliferációját és citokintermelését. Egyes tumorokban upregulálódnak a PD-1 ligandumok, és az ezen az útvonalon történő jelátvitel hozzájárulhat a tumorok T-sejtek által végzett aktív immunfelügyeletének (surveillance) gátlásához. A KEYTRUDA egy humanizált monoklonális antitest, amely a PD-1 receptorhoz kötődve gátolja a receptor és a PD-L1 és PD-L2 ligandum közötti kölcsönhatást, és ezáltal feloldja az immunválasz PD-1 útvonal által mediált gátlását, beleértve a tumorellenes immunválaszt. Szingén egértumor modellekben a PD-1 aktivitás gátlása csökkent tumornövekedést eredményezett (1). Az eljárás elve A PD-L1 IHC 22C3 pharmdx az FFPE minták Autostainer Link 48 készüléken végzett IHC festési eljárásához optimalizált reagenseket és protokollt tartalmazza. Az elsődleges monoklonális PD-L1 antitesttel vagy a negatív kontroll reagenssel (NCR) végzett inkubálást követően a mintákat az elsődleges antitestet termelő fajra specifikus linker antitesttel, majd végül dextrán polimer vázhoz kötött másodlagos antitest molekulákból és torma-peroxidáz molekulákból álló, használatra kész megjelenítő reagenssel kell inkubálni. A következő lépésben hozzáadott kromogén enzimatikus konverziója látható reakciótermék kicsapódását eredményezi az antigén helyén. A kromogén erősítő reagens módosítja a kromogén reakció színét. Ezt követően elvégezhető a minta kontrasztfestése, majd a fedőlemez felhelyezése. Az eredményeket fénymikroszkóp segítségével kell értelmezni. Mellékelt anyagok Készletenként 19,5 ml PD-L1 elsődleges antitestet (hozzávetőlegesen 3 µg/ml proteinkoncentráció) tartalmaz, és a reagensek legfeljebb 15 különálló futtatás 50 tesztjéhez elegendők. Az alább felsorolt anyagok 50 teszt elvégzésére elegendők (50 metszetet a PD-L1 elleni elsődleges antitesttel kell inkubálni, 50 metszetet pedig a negatív kontroll reagenssel, ez összesen 100 metszet). A tesztek száma azon alapul, hogy minden reagensből 2 x 150 µl-t kell használni metszetenként, kivéve a DAB+ és a Target Retrieval Solution (antigénfeltáró oldat) reagenst. A készlet legfeljebb 15 különálló futtatáshoz elegendő anyagot tartalmaz. Mennyiség Leírás 1 x 34,5 ml Peroxidase-Blocking Reagent PEROXIDASE-BLOCKING REAGENT Hidrogén-peroxidot, felületaktív anyagot (detergens) és 0,015 mol/l nátrium azidot tartalmazó pufferelt oldat. 1 x 19,5 ml Elsődleges antitest Monoclonal Mouse Anti-PD-L1, Clone 22C3 MONOCLONAL MOUSE ANTI-PD-L1 CLONE 22C3 Monoklonális egér (IgG 1 ) PD-L1 antitest, stabilizáló proteint és 0,015 mol/l nátrium azidot tartalmazó pufferelt oldatban. 1 x 15 ml Negative Control Reagent NEGATIVE CONTROL REAGENT Monoklonális egér kontroll IgG antitest, stabilizáló proteint és 0,015 mol/l nátrium azidot tartalmazó pufferelt oldatban. 1 x 34,5 ml Mouse LINKER LINKER, ANTI-MOUSE Egér immunglobulinok elleni másodlagos nyúl antitest, stabilizáló proteint és 0,015 mol/l nátrium azidot tartalmazó pufferelt oldatban. 1 x 34,5 ml Visualization Reagent-HRP VISUALIZATION REAGENT-HRP Dextránhoz kötött peroxidáz molekulák és nyúl és egér immunglobulinok elleni kecske másodlagos antitest molekulák, stabilizáló proteint és antimikróbás szert tartalmazó pufferelt oldatban. P03928HU_03/SK00621-2/2016.11 p. 1/14

15 x 7,2 ml DAB+ Substrate Buffer DAB+ SUBSTRATE BUFFER Pufferelt oldat hidrogén-peroxiddal és antimikróbás szerrel. 1 x 5 ml DAB+ Chromogen DAB+ CHROMOGEN 3,3 -diaminobenzidin-tetrahidroklorid szerves oldószerben. 1 x 34,5 ml DAB Enhancer DAB ENHANCER Réz-szulfát vízben. 6 x 30 ml EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph, 50x EnVision FLEX TARGET RETRIEVAL SOLUTION LOW ph (50X) Pufferelt oldat, ph 6,1, felületaktív anyaggal és antimikróbás szerrel. 15 lemez PD-L1 IHC 22C3 pharmdx Control Slides CONTROL SLIDES Lemezenként két sejtvonal lecentrifugált pelletéből készített, formalinban fixált, paraffinba ágyazott metszet: az NCI-H226* sejtvonal közepes mértékű PD-L1 protein expressziót mutat, míg az MCF-7 sejtvonal nem expresszálja a PD-L1 proteint. PD-L1 IHC 22C3 pharmdx XXXXX MCF-7: PD-L1 negatív NCI-H226: PD-L1 pozitív * Ezúton szeretnénk elismerni Dr. AF Gazdar és Dr. JD Minna (NIH) hozzájárulását az NCI-H226 (ATCC Number: CRL-5826 ) sejtvonal kifejlesztéséhez (2). Megjegyzés: A reagensek kifejezetten a készlettel való használatra készültek. A teszt leírt teljesítményének megőrzése érdekében tilos bármiféle helyettesítést végezni, kivéve az EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph, 50x (kód: K8005) reagenst. A PD-L1IHC 22C3 pharmdx készlet az Autostainer Link 48 készülékkel való használatra lett kialakítva. Ha további információra van szüksége, lásd az Autostainer Link 48 és a PT Link felhasználói útmutatóját. Szükséges, de nem biztosított anyagok PT Link Pre-treatment Module (kód: PT100/PT101) (előkezelő modul) Autostainer Link 48 készülék (kód: AS480) EnVision FLEX Wash Buffer, 20x (kód: K8007) (mosópuffer) Hematoxylin (kód: K8008) Desztillált vagy ionmentes víz (reagens minőségű víz) Stopperóra Pozitív és negatív szövetek a folyamatok ellenőrzéséhez (lásd a Minőség-ellenőrzés című részt) Mikroszkópos tárgylemezek: Dako FLEX IHC Microscope Slides (kód: K8020) tárgylemezek vagy Fisherbrand Superfrost Plus pozitív töltésű tárgylemezek Fedőlemezek Tartós rögzítő közeg és segédreagensek a fedőlemezek rögzítéséhez Fénymikroszkóp (4 40x optikai nagyítás) Óvintézkedések 1. In vitro diagnosztikai használatra. 2. Foglalkozásszerű felhasználóknak. 3. A termék nátrium-azidot (NaN3) tartalmaz, amely tiszta formában nagyon mérgező vegyület. A termékben alkalmazott koncentrációkban, bár nem sorolható be veszélyes anyagként, a NaN3 reakcióba léphet az ólomból vagy rézből készült vízvezetékekkel, és erősen robbanékony fém-azidok felhalmozódásához vezethet. Kiöntéskor, a fém-azidok felhalmozódását megelőzendő, nagy mennyiségű vízzel kell leöblíteni (3). 4. Az elsődleges antitest, a negatív kontroll reagens, a linker és a megjelenítő reagens állati eredetű anyagot tartalmaz. 5. A fixálás előtt és után lévő mintákat, és a velük érintkező anyagokat potenciális fertőzéshordozóként kell kezelni, és a megfelelő óvintézkedéseket alkalmazva kell ártalmatlanítani (4). 6. A megadottól eltérő inkubálási idők, hőmérsékletek vagy módszerek hibás eredményeket adhatnak. 7. A reagensek optimális koncentrációra vannak hígítva. További hígítás az antigénfestődés elvesztését eredményezheti. 8. A megjelenítő reagens, a folyékony DAB+ kromogén és az elkészített DAB+ szubsztrát-kromogén oldat károsodhat, ha túlzottan erős fény éri. Ne tárolja a rendszer komponenseit és ne végezze a festést erős fényben, például közvetlen napfényben. 9. A paraffinmaradványok álnegatív eredményeket okozhatnak. 10. A javasolttól eltérő reagenstérfogatok használata a látható PD-L1 immunreaktivitás elvesztését okozhatja. 11. Egy kisebb vizsgálat eredményei szerint a PD-L1 expresszió dinamikus tartománya hasonló volt a párosított elsődleges és metasztatikus NSCLC mintákban. Eltérések lehetnek ugyanazon páciens elsődleges daganatainak és áttéteinek PD-L1 expressziója között. P03928HU_03/SK00621-2/2016.11 p. 2/14

12. A nagyméretű szövetmetszetek esetében elfordulhat, hogy 3 x 150 µl reagensre lesz szükség. 13. Általános szabály, hogy 18 év alatti személyek nem dolgozhatnak ezzel a termékkel. A felhasználót alaposan ki kell képezni a helyes munkavégzési eljárást, a termék veszélyes tulajdonságait és a szükséges biztonsági intézkedéseket illetően. További információért tájékozódjon a biztonsági adatlapról (Safety Data Sheet, SDS). 14. A szemmel és bőrrel való érintkezés elkerülésére viseljen megfelelő személyi védőfelszerelést. 15. A fel nem használt oldatokat a helyi, regionális és országos szabályozásnak megfelelően kell megsemmisíteni. 16. Foglalkozásszerű felhasználók részére igény esetén anyagbiztonsági adatlapot biztosítunk. Veszély DAB+ kromogén: 1 5% bifenil-3,3,4,4 -tetrailtetraammónium-tetraklorid H350 Rákot okozhat. H341 Feltehetően genetikai károsodást okoz. P201 Használat előtt ismerje meg az anyagra vonatkozó különleges utasításokat. P202 Ne használja addig, amíg az összes biztonsági óvintézkedést el nem olvasta és meg nem értette. P280 Védőkesztyű használata kötelező. Szemvédő vagy arcvédő használata kötelező. Védőruha használata kötelező. P308 + P313 Expozíció vagy annak gyanúja esetén: Orvosi ellátást kell kérni. P405 Elzárva tárolandó. P501 A tartalom és az edényzet hulladékként történő elhelyezését a helyi, regionális, országos és nemzetközi szabályozásokkal összhangban kell elvégezni. Figyelmeztetés EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x): 1-5% citromsav H319 Súlyos szemirritációt okoz. H411 Mérgező a vízi élővilágra, hosszan tartó károsodást okoz. P280 Szemvédő vagy arcvédő használata kötelező. P273 Kerülni kell az anyag környezetbe jutását. P264 A használatot követően a kezet alaposan meg kell mosni. P305 + P351 + P338 SZEMBE KERÜLÉS ESETÉN: Több percig tartó óvatos öblítés vízzel. Adott esetben a kontaktlencsék eltávolítása, ha könnyen megoldható. Az öblítés folytatása. P337 + P313 Ha a szemirritáció nem múlik el: Orvosi ellátást kell kérni. P501 A tartalom és az edényzet hulladékként történő elhelyezését a helyi, regionális, országos és nemzetközi szabályozásokkal összhangban kell elvégezni. Tárolás A PD-L1 IHC 22C3 pharmdx összetevőit, beleértve a kontroll lemezeket, sötét helyen, 2 8 C hőmérsékleten kell tárolni, amikor nincsenek használatban az Autostainer Link 48 készülékben. Ne használja a készletet a dobozon feltüntetett lejárati időn túl. Ha a reagenseket a jelen tájékoztatóban leírtaktól eltérő feltételek között tárolják, akkor a felhasználó köteles a feltételeket validálni. Nincsen nyilvánvaló jel, amely a termék instabilitására utalna, ezért a páciens mintáival egyidejűleg egy pozitív és egy negatív kontroll vizsgálatát is el kell végezni. Minták előkészítése A mintákat úgy kell kezelni, hogy a szövet alkalmas maradjon IHC festésre. A mintákat a szabványos szövetfeldolgozási módszerekkel kell feldolgozni. Paraffinba ágyazott metszetek Formalinban fixált, paraffinba ágyazott szövetek használhatók. Egyéb fixálószereket nem validáltunk, így azok hibás eredményeket adhatnak. 10% semleges pufferelt formalin (NBF) és 12 72 órás fixálási idő javasolt, de egy korlátozott számú mintán végzett vizsgálat azt mutatta, hogy 10% NBF és 4 168 órás fixálási idő használata nem változtatta meg szisztematikusan a PD-L1 kimutatását. A 3 órás vagy rövidebb fixálási idő bizonytalan PD-L1 kimutatást eredményezhet. A mintákból készített 3 vagy 4 mm vastagságú blokkot formalinnal kell fixálni, alkoholsorral vízteleníteni és xilollal mosni, majd végül olvasztott paraffinnal átitatni. A paraffin hőmérséklete ne haladja meg a 60 C-ot. Az 5 éves vagy régebbi FFPE szövetblokkok PD-L1 immunreaktivitása nem garantált. A szövetmintákat 4-5 µm-es metszetekre kell vágni. Metszetkészítés után a szöveteket Fisherbrand Superfrost Plus tárgylemezekre vagy Dako FLEX IHC mikroszkópos tárgylemezekre (kód: K8020) kell rögzíteni, majd 1 órán át 58 ± 2 C-os sütőben inkubálni. Az antigenitás megőrzése érdekében a tárgylemezre rögzített szövetmetszeteket sötét helyen, (lehetőség szerint) 2 8 C-on, vagy legfeljebb 25 C-os szobahőmérsékleten kell tárolni, és a metszéstől számított 6 hónapon belül meg kell festeni. A szövetek épségének és antigenitásának megőrzése érdekében a rögzítést követően tilos a tárgylemezeket 25 C-ot meghaladó hőmérsékleten tárolni vagy kezelni. A PD-L1 IHC 22C3 pharmdx készlet kalciummentesített szöveteken történő használatát nem validáltuk, ezért nem ajánlott. A reagens előkészítése A festés előtt a következő reagenseket kell elkészíteni: EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph, 50x Készítsen megfelelő mennyiségű 1x Target Retrieval Solution, Low ph reagenst a Target Retrieval Solution, Low ph, 50x reagens 1:50 arányú hígításával. Használjon desztillált vagy ionmentes (reagens minőségű) vizet. Az 1x Target Retrieval Solution előírt ph értéke: 6,1 ± 0,2. Amennyiben az 1x Target Retrieval Solution ph értéke nem éri el az 5,9-et, az hibás eredményekhez vezethet. A Target Retrieval Solution, Low ph, 50x, reagens egy darab 30 ml-es palackjának tartalmát 1:50 hígítva 1,5 l 1x reagens áll rendelkezésre, amelyet a PT Link tartályba töltve egy alkalommal legfeljebb 24 tárgylemez kezeléséhez elegendő. Az 1x Target Retrieval Solution reagenst három használat, illetve a hígítást követő 5. nap után meg kell semmisíteni. P03928HU_03/SK00621-2/2016.11 p. 3/14

Szükség szerint további EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph, 50x rendelhető a K8005 kódszámot használva. EnVision FLEX Wash Buffer, 20x Készítsen elő megfelelő mennyiségű Wash Buffer reagenst a Wash Buffer 20x reagens 1:20 arányú hígításával. Használjon desztillált vagy ionmentes (reagens minőségű) vizet. A fel nem használt oldatot 2 8 ºC-on legfeljebb egy hónapig lehet tárolni. Ha zavaros a puffer, semmisítse meg. További információkért tekintse meg az Autostainer Link 48 használati útmutatóját. Az EnVision FLEX Wash Buffer, 20x reagens a K8007 kódszámon rendelhető. DAB+ szubsztrát-kromogén oldat A használat előtt az oldatot alaposan fel kell keverni. Az oldatban létrejövő csapadék nem befolyásolja a festés minőségét. A DAB+ szubsztrát-kromogén oldat elkészítéséhez adjon 1 csepp folyékony DAB+ kromogén reagenst egy ml DAB+ szubsztrát puffer reagenshez, majd keverje össze. Az elkészített szubsztrát-kromogén reagens sötétben, 2 8 C hőmérsékleten történő tárolás esetén 5 napig marad stabil. Fontos megjegyzések: Ha a DAB+ szubsztrát puffer üveg teljes tartalmát használja, adjon hozzá 9 csepp DAB+ kromogént. A címke szerint az üveg tartalma 7,2 ml, ez azonban a használható tartalomra értendő, és nem foglalja magában az üveg holttérfogatát. A palackban lévő folyékony DAB+ kromogén színe átlátszótól levendula vagy lilásbarna színig változhat. Ez nem befolyásolja a termék teljesítményét. A hígítást a fenti utasításoknak megfelelően végezze el. Amennyiben túl nagy mennyiségű folyékony DAB+ kromogén reagenst ad hozzá a DAB+ szubsztrát puffer reagenshez, azzal csökkenti a pozitív jelet. Az Autostainer Link 48 készüléken végzett festési eljárás Az eljárással kapcsolatos megjegyzések A felhasználó használat előtt gondosan olvassa el az utasításokat, és ismerkedjen meg minden komponenssel és készülékkel (lásd: Óvintézkedések). Az immunfestés előtt a reagenseket hagyja szobahőmérsékletre (20 25 C) melegedni. A további inkubálásokat is szobahőmérsékleten kell végezni. Ne hagyja, hogy a festés során a szövetmetszetek kiszáradjanak. A kiszáradt metszeteken nagyobb mértékű lehet a nem specifikus festődés. A szükséges lépések és inkubációs idők előre be van programozva a Dako Link szoftverben. A programozási protokollokkal és a tárgylemezek és a reagensek behelyezésével kapcsolatos további információkért tekintse meg az Autostainer Link 48 és a PT Link használati útmutatóját. Megjegyzés: A jelen rendszerhez mellékelt reagensek és instrukciók a javasolt reagensekkel és anyagokkal történő használat esetén optimális teljesítményt biztosítanak. A reagensek további hígítása, illetve az inkubálási idő vagy a hőmérséklet megváltoztatása hibás vagy ellentmondó eredményeket adhat. Festési protokoll Válassza ki a PD-L1 IHC 22C3 pharmdx festési protokollt a Dako Link legördülő menüben található opciók közül. A szükséges lépések és inkubációs idők előre be van programozva az Autostainer Link 48 szoftverében. Ha az Ön szerverén nem találhatók meg a megfelelő PD-L1 IHC 22C3 pharmdx protokollok, hívja a helyi műszaki szervizképviseletet a protokollok eléréséhez. 1. lépés: Deparaffinizálás, rehidratálás és antigénfeltárás (3 az 1-ben) eljárás A részletekkel kapcsolatban lásd a PT Link felhasználói útmutatóját. Állítsa a PT Link (kód: PT100/PT101) Preheat (Előmelegítés) és Cool (Hűtés) értékét 65 C-ra. Állítsa be a Heat (Melegítés) értékét 97 C-ra, az időt pedig 20 percre. Töltse fel a PT Link tartályait egyenként 1,5 l Target Retrieval Solution, Low ph, 1x munkaoldattal úgy, hogy elfedje a szövetmetszeteket. Melegítse elő a Target Retrieval Solution reagenst 65 C-ra. Merítse be a rögzített FFPE szövetmetszeteket tartalmazó Autostainer állványokat az előmelegített Target Retrieval Solution, Low ph, 1x munkaoldatba a PT Link tartályban. Inkubálja 20 percig 97 C hőmérsékleten. Amikor befejeződött az antigénfeltáró inkubálás és a hőmérséklet visszahűlt 65 C-ra, távolítsa el a tárgylemezeket tartalmazó Autostainer tárgylemezállványokat a PT Link tartályából, és azonnal helyezze a tárgylemezeket tartalmazó Autostainer tárgylemezállványt a hígított, szobahőmérsékletű Wash Buffer (kód: K8007) reagenst tartalmazó tartályba (pl. PT Link Rinse Station, kód: PT109). Inkubálja a tárgylemezeket hígított, szobahőmérsékletű Wash Buffer reagensben 5 percig. 2. lépés: Festési eljárás A deparaffinizálás, rehidratálás és antigénfeltárás (3 az 1-ben) eljárást követően helyezze a tárgylemezeket tartalmazó Autostainer állványokat az Autostainer Link 48 készülékbe. A készülék a megfelelő reagens hozzáadásával elvégzi a festési eljárást, követi az inkubációs időt, és leöblíti a tárgylemezeket a reagensek között. A reagens alkalmazási időtartamai előre be vannak programozva a Dako Link szoftverében. 3. lépés: Kontrasztfestés A tárgylemezek kontrasztfestését Hematoxylin (Link) (kód: K8008) reagenssel kell végezni 5 percig. A hematoxilin inkubációs ideje előre be van programozva a protokollba. 4. lépés: Rögzítés Nem víz alapú, tartós rögzítőközeget kell használni. Megjegyzés: Némi fakulás előfordulhat a megfestett tárgylemezeken. Ez többféle tényezőtől függ, például a kontrasztfestéstől, az alkalmazott rögzítőközegektől és módszerektől, valamint a tárgylemezek tárolásának körülményeitől. A fakulás minimálisra csökkentése érdekében a lemezeket sötét helyen, szobahőmérsékleten (20 25 C között) kell tárolni. P03928HU_03/SK00621-2/2016.11 p. 4/14

Minőség-ellenőrzés A PD-L1 IHC 22C3 pharmdx készlet reagenseinek minőség-ellenőrzését a fent leírt antigénfeltárási és festési eljárásokat alkalmazó immunhisztokémiai eljárás segítségével végeztük. Amennyiben a felhasználó laboratóriuma eltér az ajánlott fixálási, feldolgozási és beágyazási eljárásoktól, az jelentős bizonytalanságot okozhat az eredményekben. Minden egyes festési futtatás esetén mellékelni kell minőségbiztosítási kontrollokat. A minőségbiztosítási kontrollokat az 1. táblázat mutatja, beleértve a következőket: egy H&E festett páciens-szövetminta; a laboratórium által biztosított negatív és pozitív kontroll szövetek; és a Dako által biztosított Kontroll tárgylemez (5). Az Egyesült Államokban további információért lásd a College of American Pathologists (CAP) immunhisztokémiai akkreditációs programjának minőség-ellenőrzési követelményeit és a CLSI immuncitokémiai minőségbiztosítás elfogadott irányelveit (5, 6, 7). A teszt igazolása A festőrendszer diagnosztikai eljárásban történő első felhasználása előtt a felhasználónak ellenőriznie kell a teszt teljesítményét. Ehhez ismert pozitív és negatív szöveteket képviselő, ismert immunhisztokémiai (IHC) teljesítményjellemzőkkel rendelkező, laboratórium által biztosított mintasorozaton kell igazolnia a tesztet. Lásd a minőség-ellenőrzési eljárásokat leíró fenti minőség-ellenőrzési részt. Ezeket a minőség-ellenőrzési eljárásokat minden új antitest-tételnél, illetve az assay paramétereinek megváltozásakor meg kell ismételni. A potenciális problémákat, azok okait és a lehetséges korrekciós intézkedéseket a 10. táblázatban ismertetjük. A pontszám értelmezése - NSCLC A PD-L1 pontszám értelmezése során a teljes tárgylemez valamennyi életképes daganatsejtjét értékelni kell és be kell vonni az értelmezésbe. Ahhoz, hogy a minta megfelelő legyen a PD-L1 értékeléshez, legalább 100 életképes daganatsejtnek kell jelen lennie a PD-L1 antitesttel megfestett lemezen. A PD-L1 IHC 22C3 pharmdx készlet segítségével megfestett minták sikeres pontozásának kritikus feltétele a megfelelő sejtek értékelése, a sejten belüli elhelyezkedés megfelelő azonosítása és a festődés intenzitásának megfelelő értelmezése. A tárgylemez kiértékelését patológusnak kell elvégeznie fénymikroszkóp segítségével. Az immunhisztokémiai festődés értelmezéséhez és értékeléséhez 10 40x nagyítású objektív használható. A daganatsejtek bármely kivehető membránfestődését figyelembe kell venni a pontozás során. Pontozni kell a részleges vagy teljes sejtmembrán-festődést ( 1+), amely elkülöníthető a citoplazma festődésétől. A citoplazma festődését nem specifikus festődésnek kell tekinteni, és nem szabad figyelembe venni a festődési intenzitás értékelése során. A normál sejteket és a daganathoz kapcsolódó immunsejteket, mint az infiltráló limfocitákat vagy makrofágokat nem szabad figyelembe venni a PD-L1 pozitivitást meghatározó pontozás során. A NCR reagenssel festett daganatmintáknak 0 specifikus festődést és 1+ háttérfestődést kell mutatniuk. A tumorhányad pontszám (Tumor Proportion Score, TPS) a részleges vagy teljes membránfestődést ( 1+) mutató, életképes tumorsejtek százalékos értéke segítségével határozható meg. A minta akkor tekinthető PD-L1 pozitívnak, ha az életképes tumorsejtek TPS 1%-a mutat bármilyen intenzitású membránfestődést (tehát 1+). A tárgylemezeket minden festési futtatás során az 1. táblázatban megadott sorrendben kell megvizsgálni a festési menet érvényességének meghatározásához és a szövetminta festődésének kiértékeléséhez. További útmutatás: lásd a PD-L1 IHC 22C3 pharmdx értelmezési kézikönyvét. További ajánlások a PD-L1 IHC 22C3 pharmdx festés értelmezéséhez 1. A membránfestődés igazolásához 10 40x-es nagyítású objektívet kell használni. 2. A nem vizsgált elemek, mint a daganathoz kapcsolódó immunsejtek (pl. makrofágok) és a stroma is pozitív PD-L1 festődést mutathatnak, de nem vehetők figyelembe a pontozás során. 1. táblázat: A tárgylemezek értékelésének javasolt sorrendje Minták Magyarázat Követelmények 1. H&E (A labor biztosítja) Első lépésként a hematoxilin és eozin (H&E) segítségével festett szövetminták kiértékelését kell elvégezni a szövettan és a prezervációs minőség felmérése érdekében. A PD-L1 IHC 22C3 pharmdx és a H&E festést a minta ugyanazon paraffinblokkjának sorozatmetszetein kell végezni. Ahhoz, hogy a minta megfelelő legyen a PD-L1 értékeléshez, legalább 100 életképes daganatsejtnek kell jelen lenni. A szövetmintáknak épnek, megfelelően prezervált állapotúnak kell lenniük, továbbá alkalmasnak kell lenniük a tumor jelenlétének megerősítésére. 2. Kontroll sejtvonalakat tartalmazó tárgylemez (A Dako biztosítja) A PD-L1 IHC 22C3 pharmdx készlet részét képező elsődleges PL-D1 antitesttel megfestett kontroll sejtvonalakat tartalmazó tárgylemezt meg kell vizsgálni a reagensek megfelelő működésének meghatározásához. A kontroll sejtvonalakat tartalmazó tárgylemezen PD-L1-pozitív sejtvonalpellet és PD-L1-negatív sejtvonalpellet található. Minden egyes festési futtatás során meg kell festeni egy kontroll sejtvonalakat tartalmazó tárgylemezt elsődleges PD-L1 antitesttel. NCI-H226 (PD-L1 pozitív kontroll sejtvonal) elfogadási kritériumai: Sejtmembrán festődés a sejtek 70%-ában, 2+ átlagos festődési intenzitás. Nem specifikus festődés intenzitása <1+. MCF-7 (PD-L1 negatív kontroll sejtvonal) elfogadási kritériumai: Nincs specifikus festődés. Nem specifikus festődés intenzitása <1+. Felhívjuk figyelmét, hogy esetenként megfigyelhető az MCF-7 sejtpellet néhány sejtjének festődése. A következő elfogadási kritériumok alkalmazandók: elfogadható, ha a jellegzetes plazmamembrán-festődést mutató sejtek összes száma 10, vagy ha az MCF-7 sejtpellet határain belül 1+ intenzitású citoplazma-festődés van jelen. Ha bármelyik kontroll sejtvonal nem felel meg a fenti kritériumoknak, akkor a páciens mintáinak összes eredményét érvénytelennek kell tekinteni. P03928HU_03/SK00621-2/2016.11 p. 5/14

3. Pozitív kontrollszöveteket tartalmazó tárgylemezek (A labor biztosítja) 4. Negatív kontrollszöveteket tartalmazó tárgylemezek (A labor biztosítja) 5. Negatív kontrollreagens használatával festett páciensszöveteket tartalmazó tárgylemez 6. Elsődleges PD-L1 antitesttel megfestett páciensszöveteket tartalmazó tárgylemez Következő lépésként az elsődleges PD-L1 antitesttel és a negatív kontroll reagenssel egyaránt megfestett pozitív kontrollszöveteket tartalmazó tárgylemezeket kell megvizsgálni. Ezek a tárgylemezek igazolják, hogy hatékony volt a fixálási módszer és az epitópfeltárási folyamat. Az ismert pozitív kontroll szöveteket kizárólag a feldolgozott szövetek és tesztreagensek megfelelő teljesítményének ellenőrzésére szabad használni, a páciensek mintáinak specifikus diagnosztizálásához NEM használhatók. A következő lépésben az elsődleges PD-L1 antitesttel és a negatív kontroll reagenssel egyaránt megfestett, negatív kontrollszöveteket tartalmazó (más néven PD-L1 negatív) tárgylemezeket kell vizsgálni annak igazolására, hogy az elsődleges antitest specifikusan jelöli a célantigént. Emellett a pozitív kontroll szövet negatív részei negatív kontroll szövetként is szolgálhatnak, de ezt a felhasználónak igazolnia kell. Vizsgálja meg a PD-L1 IHC 22C3 pharmdx készlet negatív kontroll reagensével megfestett páciensmintákat. A negatív kontroll reagens az elsődleges antitest helyett kerül alkalmazásra, mely segít az antigén helyén történő specifikus festés értelmezésében. Utolsó lépésként a PD-L1 IHC 22C3 pharmdx készletben lévő elsődleges PD-L1 antitesttel megfestett páciensmintákat tartalmazó teljes tárgylemezt vizsgálja meg. A PD-L1 IHC 22C3 pharmdx készlet immunreaktivitására vonatkozó pontos információkat lásd az Összefoglalás és magyarázat, a Korlátozások és a Teljesítményjellemzők című részekben. A kontrolloknak a páciens mintájával megegyező daganatot tartalmazó biopsziás vagy sebészeti mintának kell lenniük, a páciens mintájával vagy mintáival azonos módon, a lehető leggyorsabban fixálva, feldolgozva és beágyazva. A festődés értelmezéséhez használjon ép mintákat, mivel a nekrotikus vagy degenerált sejtek esetében gyakori a nem specifikus festődés. A pozitív kontrollként használt szöveteknek PD-L1 festés esetén gyenge vagy közepes festődést kell mutatniuk, ily módon ki tudják mutatni a teszt érzékenységének kismértékű változásait. Minden egyes festési futtatásba két pozitív kontrollszövetet tartalmazó tárgylemezt kell bevonni. PD-L1 anyaggal festett tárgylemez: Barna színű membránfestődés jelenlétét kell megfigyelni. A nem specifikus festődés legyen 1+. Negatív kontroll reagenssel festett tárgylemezek: Nincs membránfestődés. A nem specifikus festődés legyen 1+. Ha a pozitív kontroll szövetek nem mutatnak megfelelő pozitív festődést, a tesztminták eredményeit érvénytelennek kell tekinteni. A kontrolloknak a páciens mintájával megegyező daganatot tartalmazó biopsziás vagy sebészeti mintának kell lenniük, a páciens mintájával vagy mintáival azonos módon, a lehető leggyorsabban fixálva, feldolgozva és beágyazva. Minden egyes festési futtatásba két negatív kontrollszövetet tartalmazó tárgylemezt kell bevonni. PD-L1 anyaggal festett tárgylemez: A tumorsejtek esetén nincs membránfestődés. A nem specifikus festődés legyen 1+. Negatív kontroll reagenssel festett tárgylemezek: Nincs membránfestődés. A nem specifikus festődés legyen 1+. Amennyiben a negatív kontrollszöveteket tartalmazó tárgylemezeken specifikus sejtmembránfestődés figyelhető meg, a páciensminta eredményeit érvénytelennek kell tekinteni. A specifikus membránfestődés távolléte igazolja, hogy az elsődleges antitest specifikusan jelöli a célantigént. A nem specifikus festődés legyen 1+. A pozitív festődés intenzitását az ugyanahhoz a futtatáshoz tartozó negatív kontroll reagens páciens-tárgylemezen megfigyelt nem specifikus háttérfestődés figyelembe vételével kell értékelni. Mint minden immunhisztokémiai teszt esetén, itt is igaz, hogy a negatív eredmény csupán azt jelenti, hogy az antigén nem volt detektálható, és nem azt, hogy az antigén nem volt jelen a vizsgálatba bevont sejtekben/szövetekben. A PD-L1 pontszám értelmezése során a teljes PD-L1 festett páciensszövetet tartalmazó tárgylemez valamennyi életképes daganatsejtjét értékelni kell és be kell vonni az értelmezésbe. Ahhoz, hogy a minta megfelelő legyen a PD-L1 értékeléshez, legalább 100 életképes daganatsejtnek kell jelen lenni. Általánosan érvényes korlátozások 1. Az immunhisztokémia többlépcsős diagnosztikai folyamat, amely speciális képzést igényel a megfelelő reagensek kiválasztása, a szövetek kiválasztása, fixálása és feldolgozása, az immunhisztokémiai tárgylemez előkészítése és a festődési eredmények értelmezése területén. 2. A szövet festődése függ a festést megelőző kezeléstől és előkészítéstől. A nem megfelelően végzett fixálás, fagyasztás, kiolvasztás, mosás, szárítás, melegítés és metszés, illetve a más szövetekkel és folyadékokkal történő szennyezés műtermékeket, elégtelen antitestfeltárást vagy álnegatív eredményeket okozhat. Az ellentmondó eredmények oka a fixálási és beágyazási módszerek eltérései, illetve a szövetben eredendően jelen lévő szabálytalanságok lehetnek. 3. A túlzott vagy elégtelen kontrasztfestés veszélyeztetheti az eredmények megfelelő értelmezését. 4. A pozitív festődés, illetve a pozitív festődés hiányának klinikai értelmezését a klinikai tünetek, a morfológia és egyéb hisztopatológiai kritériumok figyelembe vételével kell végezni. A festődés, vagy a festődés hiányának klinikai értelmezését morfológiai vizsgálatokkal és megfelelő kontrollokkal, valamint egyéb diagnosztikai vizsgálatokkal kell kiegészíteni. A festett preparátum értelmezése az alkalmazott antitesteket, reagenseket és módszereket jól ismerő képesített patológus feladata. A festést tanúsított és engedélyezett laboratóriumban kell végezni, a festett tárgylemezek felülvizsgálatáért és a pozitív és negatív kontrollok megfelelőségének biztosításáért felelős patológus felügyelete alatt. 5. A hepatitisz B vírussal fertőzött személyektől származó, hepatitisz B felületi antigént (HBsAg) tartalmazó szövetek torma-peroxidáz alkalmazásakor nem specifikus festődést mutathatnak (7). P03928HU_03/SK00621-2/2016.11 p. 6/14

6. A reagensek váratlan reakciót adhatnak az előzőleg nem tesztelt szövettípusokon. A daganatok és más patológiás szövetek antigén-expressziójának biológiai variabilitása miatt a váratlan reakciók lehetőségét még a tesztelt szövettípusok esetében sem lehet teljesen kizárni. Értesítse a Dako technikai támogató csoportját, ha váratlan reakciókat észlel. 7. A proteinek vagy szubsztrát reakciótermékek nem immunológiai jellegű kötődése álpozitív eredményeket adhat. Ugyancsak álpozitív eredményt adhat a pszeudoperoxidáz aktivitás (eritrociták) vagy endogén peroxidáz aktivitás (citokróm C) (7). 8. A rendszerhez biztosított reagenseket és útmutatásokat optimális teljesítmény eléréséhez alakítottuk ki. A reagensek további hígítása, illetve az inkubálási idő vagy a hőmérséklet megváltoztatása hibás vagy ellentmondó eredményeket adhat. Termékspecifikus korlátozások 1. A hamis negatív eredményeket okozhatja az, hogy az antigén idővel lebomlik a szövetekben. A sötét helyen, (lehetőség szerint) 2 8 C-on vagy legfeljebb 25 C-os szobahőmérsékleten tárolt mintákat a tárgylemezre rögzítés után hat hónapon belül meg kell festeni. 2. Az optimális és reprodukálható eredmények érdekében a PD-L1 protein antigénfeltáró előkezelést igényel a szövetek rutinszerű fixálása (semleges pufferelt formalin) és paraffinba ágyazása során. 3. A reagenseket nem szabad eltérő tételszámú készletekből vagy más gyártóktól származó készletekből pótolni. Az egyetlen kivétel az EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph, 50x, amely szükség szerint a K8005 kódszámot használva rendelhető. 4. A megfestett kontroll sejtvonalak csak a festési futtatás validálására használhatók, a szövetmetszetek festődési reakciójának pontozására viszont nem. 5. A PD-L1 IHC 22C3 pharmdx használatát nem validáltuk más (nem formalin) fixálószerekkel fixált szöveteken. 6. A PD-L1 IHC 22C3 pharmdx használatát nem validáltuk vékonytű-aspirációs technikával előállított preparátumokon. A klinikai teljesítmény értékelése A PD-L1 IHC 22C3 pharmdx klinikai előnyét az előrehaladott NSCLC-ben szenvedő pácienseknél alkalmazott KEYTRUDA biztonságosságát és hatásosságát értékelő multicentrikus, nyílt címkés, randomizált klinikai vizsgálatban teszteltük (9). A páciensek egy klinikai vizsgálati teszt (CTA) szerint PD-L1 pozitívak voltak, és platina-tartalmú kemoterápiával végzett kezelést követően súlyosbodott a betegségük. Az EGFR vagy ALK genomikus tumoraberrációval rendelkező páciensek állapota az aberrációkra alkalmazott, FDA által jóváhagyott terápia mellett súlyosbodott a KEYTRUDA alkalmazása előtt. A pácienseket (1:1:1 arányban) 3 hetenként adott 2 mg/kg (n=344) vagy 10 mg/kg (n=346) KEYTRUDA-kezelésre vagy 3 hetenként adott 75 mg/m 2 docetaxel-kezelésre (n=343) randomizáltuk. 9 hetente végeztük a tumorstátusz értékelését. Az elsődleges hatásossági végpontok a szolid tumorokban a hatást mérő kritériumok 1.1-es verziója (Response Evaluation Criteria on Solid Tumors Version 1.1, RECIST 1.1) szerint, radiológusok által végzett független, vak vizsgálattal értékelt teljes túlélés (OS) és a progressziómentes túlélés (PFS) voltak. A CTA alapján összesen 1033 NSCLC pácienst randomizáltunk a vizsgálatban. A PD-L1 IHC 22C3 pharmdx klinikai hasznosságának értékeléséhez archivált klinikai vizsgálati mintákat teszteltünk retrospektív módon egy amerikai referencia laboratóriumban a PD-L1 IHC 22C3 pharmdx készlet segítségével. A 1 033 páciens közül 529 páciens daganatszövetét retrospektív módon teszteltük a PD-L1 IHC 22C3 pharmdx teszt segítségével. 413 páciens mintája pozitív PD-L1 expressziót mutatott (az életképes daganatsejtek 1%-a mutatott bármilyen intenzitású membránfestődést), 94 páciens mintája pedig negatív PD-L1 expressziót (az életképes daganatsejtek <1%-a mutatott bármilyen intenzitású membránfestődést). A pozitív PD-L1 expressziót mutató 413 páciens körében 163 páciens mintája mutatott nagyfokú PD-L1 expressziót (az életképes tumorsejtek 50%-a mutatott bármilyen intenzitású membránfestődést). A CTA és a PD-L1 IHC 22C3 pharmdx közötti egyezést a 2. táblázat mutatja. 2. táblázat: A CTA és a PD-L1 IHC 22C3 pharmdx közötti egyezés Egyezés aránya PD-L1 Határérték Negatív százalékos egyezés (95% konfidencia intervallum [KI]) Pozitív százalékos egyezés (95% konfidencia intervallum [KI]) CTA és PD-L1 IHC 22C3 pharmdx TPS 1% 94,5% [91,4 96,6%] 80,0% [76,9 82,8%] TPS 50% 98,3% [97,1 99,0%] 73,2% [67,9 77,9%] A PD-L1 IHC 22C3 pharmdx készlettel pozitív eredményt mutató, randomizált páciensek körében a demográfiai és egyéb kiindulási jellemzők kiegyenlítettek voltak a kezelési karok között. A medián életkor 63 év volt (a páciensek 44%-a volt 65 éves vagy annál idősebb). A páciensek túlnyomó része fehér (77%) férfi (58%) volt; az alapszintű ECOG teljesítménystátusz 0 (29%) vagy 1 (71%) volt. A páciensek hetvennyolc százaléka (78%) volt leszokott/aktív dohányos. A szövettani vizsgálatok szerint a páciensek huszonkét százaléka (22%) laphámsejtes, hatvankilenc százaléka (69%) nem laphámsejtes tüdőrákban szenvedett. A kiindulási és demográfiai jellemzők hasonlóképpen kiegyenlítettek voltak a teljes klinikai vizsgálat pembrolizumab és docetaxel karjai között. A hatásossági eredményeket a 3. táblázat foglalja össze. A KEYTRUDA tartós klinikai előnyt mutatott a TPS 1% értékű pozitív PD-L1 expressziót mutató NSCLC pácienseknél, és a klinikai előny további növekedést mutatott a PD-L1 IHC 22C3 pharmdx készlettel mérve nagyfokú, TPS 50% értékű pozitív PD-L1 expressziót mutató NSCLC pácienseknél. Az előny nagyságrendileg hasonló volt a teljes klinikai vizsgálatban észlelthez. A 3. táblázat összegzi a teljes PD-L1 pozitív (TPS 1%) populáció, a teljes klinikai vizsgálat nagyfokú pozitív PD-L1 (TPS 50%) expressziójú alcsoportja (PD-L1 pozitív a CTA szerint) és a PD-L1 IHC 22C3 pharmdx készlettel pozitívnak ítélt populáció legfontosabb hatásossági eredményeit. Az OS Kaplan-Meier görbéjét (TPS 1%, PD-L1 IHC 22C3 pharmdx készlettel mérve) az 1. ábra mutatja. P03928HU_03/SK00621-2/2016.11 p. 7/14

3. táblázat: A KEYTRUDA-ra adott válasz a korábban kezelt NSCLC páciensek körében: A teljes klinikai vizsgálat és a PD-L1 IHC 22C3 pharmdx teszt szerint pozitív páciensek: PD-L1 TPS 1% és TPS 50% Végpont KEYTRUDA 2 mg/kg 3 hetente Klinikai PD-L1 IHC vizsgálat 22C3 pharmdx KEYTRUDA 10 mg/kg 3 hetente Klinikai PD-L1 IHC vizsgálat 22C3 pharmdx Docetaxel 75 mg/m 2 3 hetente Klinikai PD-L1 IHC vizsgálat 22C3 pharmdx TPS 1% Páciensek száma 344 140 346 142 343 131 OS Halálozás (%) 172 (50%) 59 (42%) 156 (45%) 59 (42%) 193 (56%) 67 (51%) Kockázati arány* 0,71 0,54 0,61 0,57 (95% KI) (0,58, 0,88) (0,37, 0,78) (0,49, 0,75) (0,39, 0,82) --- --- p-érték <0,001 <0,001 <0,001 0,00115 --- --- Medián érték, hónap (95% KI) 10,4 (9,4, 11,9) 11,8 (9,6, NÉ) 12,7 (10,0, 17,3) 12,0 (8,7, NÉ) 8,5 (7,5, 9,8) 7,5 (6,3, 9,9) PFS Események (%) 266 (77%) 97 (63%) 255 (74%) 103 (73%) 257 (75%) 94 (72%) Kockázati arány* 0,88 0,68 0,79 0,79 (95% KI) (0,73, 1,04) (0,50, 0,92) (0,66, 0,94) (0,59, 1,06) --- --- p-érték 0,068 0,00578 0,005 0,05767 --- --- Medián érték, 3,9 4,9 4,0 4,0 4,0 3,8 hónap (95% KI) (3,1, 4,1) (4,1, 6,2) (2,6, 4,3) (2,2, 4,6) (3,1, 4,2) (2,2, 4,2) Általános válaszadási arány ORR % (95% KI) 18% (14, 23) 24% (17, 32) 18% (15, 23) 20% (14, 28) 9% (7, 13) 5% (2, 11) TPS 50% Páciensek száma 139 56 151 60 152 47 OS Halálozás (%) 58 (42%) 18 (32%) 60 (40%) 19 (32%) 86 (57%) 25 (53%) Kockázati arány* 0,54 0,45 0,50 0,29 (95% KI) (0,38, 0,77) (0,24, 0,84) (0,36, 0,70) (0,15, 0,56) --- --- p-érték <0,001 0,00541 <0,001 <0,001 --- --- Medián érték, hónap (95% KI) 14,9 (10,4, NÉ) Nem érte el (9,3+, NÉ) 17,3 (11,8, NÉ) Nem érte el (8,3+, NÉ) 8,2 (6,4, 10,7) 7,2 (4,4, 8,3) PFS Események (%) 89 (64%) 33 (59%) 97 (64%) 34 (57%) 118 (78%) 33 (70%) Kockázati arány* 0,58 0,47 0,59 0,41 (95% KI) (0,43, 0,77) (0,28, 0,80) (0,45, 0,78) (0,24, 0,70) --- --- p-érték <0,001 0,00221 <0,001 <0,001 --- --- Medián érték, hónap (95% KI) 5,2 (4,0, 6,5) 5,9 (4,2, 9,0) 5,2 (4,1, 8,1) 4,8 (2,8, NÉ) 4,1 (3,6, 4,3) 3,9 (2,0, 4,3) Általános válaszadási arány ORR % (95% KI) 30% (23, 39) 37% (25, 52) 29% (22, 37) 28% (18, 41) 8% (4, 13) 4% (1, 15) * Kockázati arány (KEYTRUDA docetaxelhez hasonlítva) a rétegzett Cox-féle arányos kockázati modell alapján Rétegezett log-rank próba alapján BICR értékelte a RECIST 1.1 segítségével Valamennyi válasz részleges válasz volt Az igazolt teljes vagy részleges válaszként meghatározott legjobb általános választ adó páciensek alapján P03928HU_03/SK00621-2/2016.11 p. 8/14

1. ábra: A teljes túlélés Kaplan-Meier-görbéje kezelési karonként (TPS 1% a PD-L1 IHC 22C3 pharmdx készlettel mérve, beválasztás szerinti populáció) Teljes túlélés (%) Docetaxel 75 mg/m2 Q3W MK 3475 2 mg/kg Q3W MK 3475 10 mg/kg Q3W n, kockázatnak Docetaxel 75 mg/m2 Q3W Idő, hónap MK 3475 2 mg/kg Q3W MK 3475 10 mg/kg Q3W További robusztussági elemzéseket végeztünk a pozitív PD-L1 IHC 22C3 pharmdx teszteredményt adó, de a CTA szerint esetlegesen negatív páciensek hiányzó adataiból eredő potenciális hatások felmérésére. Az ilyen teszteredményeket adó páciensek a PD-L1 IHC 22C3 pharmdx vizsgálat rendeltetésszerű használat/ diagnosztizálni kívánt (intent-to-diagnose, ITD)/ populációjába tartoznak, de a CTA szűrésen adott negatív eredményük miatt kizárásra kerültek a klinikai vizsgálatból. Ahhoz, hogy számot adhassunk a hiányzó adatokról, érzékenységi elemzést végeztünk az ITD populáció keretében a TPS 1% és TPS 50% alpopulációk PD-L1 IHC 22C3 pharmdx tesztje alapján becsült kockázati arány (HR) valószerű tartományának megállapítására, a CTA alapján bevont páciensek megfigyelt HR értékeivel való egyezés igazolása érdekében. A HR érzékenységi elemzés eredményei azt mutatták, hogy a becsült HR értékek kellően robusztusak a kezelési hatás bármely feltételezett csökkenésével szemben az ITD kereten belül. P03928HU_03/SK00621-2/2016.11 p. 9/14

A nem klinikai teljesítmény értékelése Analitikai érzékenység/specificitás A PD-L1 IHC 22C3 pharmdx analitikus érzékenységét 127 egyedi nem kissejtes tüdőrákból (NSCLC) származó FFPE mintán vizsgáltuk, melyeket egy gyártói készlet segítségével I IV. stádiumba osztályoztunk. A PD-L1 expresszió értékelése festődést mutatott a 0-100% pozitív daganatsejt és 0-3 festődési intenzitás tartományban. Normál szövetek: A 4. táblázat összegzi a monoklonális egér Anti-PD-L1, Clone 22C3 antitest immunreaktivitását a normál szöveteket tartalmazó javasolt panelen. Plazmamembrán festődést figyeltek meg immunsejteken és epitheliális eredetű sejteken. Citoplazma festődést jeleztek egyes sejttípusok esetében, de nem tekintették pozitív festődésnek. Minden szövet formalinban fixált, paraffinba ágyazott volt, és a jelen tájékoztatóban leírt utasítások szerint festették meg a PD-L1 IHC 22C3 pharmdx reagenssel. Nem figyeltünk meg váratlan eredményeket a vizsgált sejttípusokon vagy szövettípusokon. A megfigyelt festődés megfelelt a normál szövetek PD-L1 expresszióját vizsgáló IHC szakirodalomban közölteknek (10, 11). 4. táblázat: A PD-L1 IHC 22C3 pharmdx normál szöveteken mért reaktivitásának összegzése Szövettípus (vizsgált minták száma) Pozitív plazmamembránfestődés: Szövetelemek Pozitív citoplazma-festődés: Szövetelemek Agyalapi mirigy (3) 1/3 hipofízis: elülső lebeny 1/3 hipofízis: hátsó lebeny 1/3 hipofízis: elülső lebeny 1/3 hipofízis: hátsó lebeny Bőr (3) 0/3 0/3 0/3 Csecsemőmirigy (3) 3/3 medulla epithelium 0/3 0/3 Csontvelő (3) 3/3 megakariociták 3/3 megakariociták 0/3 Emlő (3) 0/3 0/3 0/3 Gyomor (3) 2/3 limfociták 1/3 gyomormirigy 0/3 1/3 gyomormirigy Hasnyálmirigy (3) 0/3 0/3 0/3 Here (3) 0/3 0/3 0/3 Kisagy (3) 0/3 0/3 0/3 Lép (3) 2/3 makrofágok 0/3 0/3 Máj (3) 1/3 makrofágok 0/3 0/3 1/3 hepatociták Mandula (3) 3/3 crypta epithelium 0/3 0/3 2/3 csíracentrum (makrofágok) Méh (3) 0/3 0/3 0/3 Méhnyak (3) 1/3 epithelium 0/3 0/3 Mellékpajzsmirigy (3) 1/3 glanduláris epithelium 0/3 0/3 Mellékvese (3) 0/3 1/3 velőállomány sejtek 0/3 Mezoteliális sejtek (2) 0/2 0/2 0/2 Nagyagy (3) 0/3 0/3 0/3 Nyálmirigy (3) 0/3 0/3 0/3 Nyelőcső (3) 0/3 0/3 0/3 Pajzsmirigy (3) 0/3 0/3 0/3 Perifériás ideg (3) 0/3 1/3 kötőszövet/erek 0/3 Petefészek (3) 0/3 0/3 0/3 Prosztata (2) 2/2 epithelium 0/2 0/2 Szívizom (3) 0/3 0/3 0/3 Tüdő (3) 3/3 alveoláris makrofágok 0/3 0/3 Vastagbél (3) 2/3 makrofágok 0/3 0/3 Vázizom (3) 0/2 0/2 0/2 Vékonybél (3) 0/3 0/3 0/3 Vese (3) 1/3 tubulus epithelium 0/3 0/3 Nem specifikus festődés 0/3 Daganatos szövetek: Az 5. táblázat összegzi a monoklonális egér Anti-PD-L1, Clone 22C3 antitest immunreaktivitását daganatos szöveteket tartalmazó panelen. Plazmamembrán festődést figyeltek meg immunsejteken és epitheliális eredetű sejteken. Citoplazma festődést jeleztek egyes sejttípusok esetében, de nem tekintették pozitív festődésnek. Minden szövet formalinban fixált, paraffinba ágyazott volt, és a jelen tájékoztatóban leírt utasítások szerint festették meg a PD-L1 IHC 22C3 pharmdx reagenssel. Nem figyeltek meg váratlan eredményeket a vizsgált daganatmintákon. A megfigyelt festődés megfelelt a daganatos szövetek PD-L1 expresszióját vizsgáló IHC szakirodalomban közölteknek (10-13). 5. táblázat: A PD-L1 IHC 22C3 pharmdx daganatos szöveteken mért reaktivitásának összegzése Tumor típusa Helyszín PD-L1 pozitív/összes N=159 Emlő, DCIS 0/2 Emlő, invazív duktális 0/7 Emlő, invazív duktális, nyirokcsomóáttét 0/1 Epehólyag 1/5 Fej és nyak, kemény szájpad 0/1 Féregnyúlvány 0/1 Adenokarcinóma Gyomor 0/6 Gyomor, mucinózus 0/1 Gyomor-bélrendszeri, tüdőáttét 0/1 Hasnyálmirigy 0/2 Hasnyálmirigy, duktális 0/3 Méh, endometrium 0/3 Méh, világossejtes 0/1 P03928HU_03/SK00621-2/2016.11 p. 10/14

Tumor típusa Helyszín PD-L1 pozitív/összes N=159 Méhnyak, endocervikális típus 0/1 Nyálmirigy/parotis 0/2 Nyelőcső 0/1 Pajzsmirigy, follikuláris 0/1 Pajzsmirigy, follikuláris-papilláris 0/1 Pajzsmirigy, papilláris 0/3 Petefészek 0/1 Petefészek, endometriális 0/1 Petefészek, mucinózus 0/1 Petefészek, szerózus 0/1 Prosztata 0/5 Tüdő 1/4 Vastagbél 0/5 Vastagbél, májáttét 0/1 Vastagbél, mucinózus 0/1 Végbél 0/4 Vékonybél 0/2 Adrenokortikális karcinóma Mellékvese 0/1 Astrocytoma Nagyagy 0/3 Átmeneti sejtes karcinóma Húgyhólyag 0/6 Vese 0/1 Basalis sejtes karcinóma Bőr 0/1 Embrionális karcinóma Here 0/1 Ependymoma Agy 0/1 Feokromocitóma Mellékvese 0/1 Glioblasztóma Agy 0/1 Hepatoblasztóma Máj 0/1 Hepatocelluláris karcinóma Máj 0/5 Interstitialoma Vastagbél 0/1 Végbél 0/1 Vékonybél 0/1 Karcinóma Nasopharyngealis, NPC 0/1 Kissejtes karcinóma Tüdő 0/1 Kondroszarkóma Csont 0/1 Kordóma Medenceüreg 0/1 Bőr 0/2 Fej és nyak 0/2 Méh 0/1 Méhnyak 2/5 Laphámsejtes karcinóma Metasztatikus nyelőcső laphámsejtes 0/1 karcinóma áttéte nyirokcsomóban Nyelőcső 0/7 Leiomyosarcoma Tüdő 1/2 Húgyhólyag 0/1 Lágyszövet, mellkasfal 0/1 Limfóma Anaplasztikus nagysejtes Nyirokcsomó 0/1 Diffúz B-sejtes Nyirokcsomó 0/4 Hodgkin Nyirokcsomó 2/2 Non-Hodgkin Nyirokcsomó 1/1 Medulláris karcinóma Pajzsmirigy 0/1 Medulloblasztóma Agy 0/1 Melanóma Orrüreg 0/1 Végbél 0/1 Meningióma Agy 0/2 Mezotelióma Peritoneum 0/1 Neuroblasztóma Retroperitoneum 0/1 Neurofibróma Lágyszövet, derék 0/1 Oszteoszarkóma Csont 0/2 Metasztatikus pecsétsejtes karcinóma Pecsétsejtes karcinóma carcinoma áttéte petefészekben 0/1 Vastagbél 0/1 Primitív neuroektodermális tumor (PNET) Retroperitoneum 0/1 Lágyszövet, embrionális 0/1 Rhabdomyosarcoma Prosztata 0/1 Retroperitoneum 0/1 Spermatocitóma Here 0/2 Synoviális szarkóma Medenceüreg 0/1 Szeminóma Here 0/2 Szigetsejttumor Hasnyálmirigy 0/1 Thymoma Mediastinum 1/1 Vesesejt karcinóma Papilláris Vese 0/1 Világossejtes Vese 0/6 P03928HU_03/SK00621-2/2016.11 p. 11/14

Ismételhetőség/Külső reprodukálhatóság A PD-L1 IHC 22C3 pharmdx ismételhetőségét és reprodukálhatóságát a Dako és három külső tesztelőhely vizsgálta. A teljesítményadatokat a 6 9. táblázat tartalmazza. A Dako által végrehajtott ismételhetőségi vizsgálatok 1% határértékre és 50% határértékre megállapított negatív százalékos egyezését (NPA), pozitív százalékos egyezését (PPA) és teljes egyezését (TE) a 6. és a 7. táblázat mutatja. Mivel az ismételhetőségi vizsgálatok 100%-os egyezést mutattak, a konfidencia intervallumokat a Wilson pontozási módszerrel számítottuk a független páros összehasonlítások száma alapján. A külső reprodukálhatósági vizsgálatok 1% határértékre és 50% határértékre megállapított átlagos negatív százalékos egyezését (ANA), átlagos pozitív százalékos egyezését (APA) és teljes százalékos egyezését (TE) az alábbi 8. és 9. táblázat mutatja. Az átlagos egyezések értékét számítottuk, mivel a reprodukálhatósági paramétereknek nincs természetes referenciája, mint a vizsgálóhely vagy megfigyelő. Az átlagos egyezések konfidencia intervallumát egy százalékos bootstrap-módszerrel számítottuk. (Felhívjuk figyelmét, hogy az ismételhetőségi vizsgálatokat nem elemeztük a bootstrap konfidencia intervallumok segítségével, mivel ezek az intervallumok nem számíthatók nulla eltérést mutató adatokból.) 6. táblázat: Az egyik vizsgálóhelyen tesztelt PD-L1 IHC 22C3 pharmdx ismételhetősége ( 1%) Ismételhetőségi vizsgálat Diagnosztikai határérték Vizsgálat elrendezése Berendezések között 1% A különféle PD-L1 IHC expressziót mutató 16 NSCLC mintát (8 PD-L1 negatív és 8 PD-L1 pozitív) hat Autostainer Link 48 készüléken teszteltük. Kezelők közötti 1% A különféle PD-L1 IHC expressziót mutató 16 NSCLC mintát (8 PD-L1 negatív és 8 PD-L1 pozitív) hat analitikus segítségével teszteltük egy Autostainer Link 48 készüléken. Napok között 1% A különféle PD-L1 IHC expressziót mutató 16 NSCLC mintát (8 PD-L1 negatív és 8 PD-L1 pozitív) hat, nem egymást követő napon teszteltük az Autostainer Link 48 készüléken. Tételek között 1% A különféle PD-L1 IHC expressziót mutató 16 NSCLC mintát (8 PD-L1 negatív és 8 PD-L1 pozitív) három példányban és háromféle készletszámú reagenskészlettel teszteltük az Autostainer Link 48 készüléken. Futtatásokon belül 1% A különféle PD-L1 IHC expressziót mutató 16 NSCLC mintát (8 PD-L1 negatív és 8 PD-L1 pozitív) egy futtatáson belül hat példányban teszteltük az Autostainer Link 48 készüléken. Napok közötti 1% A különféle PD-L1 IHC expressziót mutató 16 NSCLC mintát (8 PD-L1 negatív és 8 PD-L1 pozitív) egy napon végzett két futtatás során, három napon át teszteltük az Autostainer Link 48 készüléken. NPA= negatív százalékos egyezés; PPA= pozitív százalékos egyezés; OA=teljes egyezés 7. táblázat: Az egyik vizsgálóhelyen tesztelt PD-L1 IHC 22C3 pharmdx ismételhetősége ( 50%) Ismételhetőségi vizsgálat Diagnosztikai határérték Vizsgálat elrendezése Berendezések között 50% A különféle PD-L1 IHC expressziót mutató 16 NSCLC mintát (10 PD-L1 negatív és 6 PD-L1 pozitív) hat Autostainer Link 48 készüléken teszteltük. Kezelők közötti 50% A különféle PD-L1 IHC expressziót mutató 16 NSCLC mintát (10 PD-L1 negatív és 6 PD-L1 pozitív) hat analitikus segítségével teszteltük egy Autostainer Link 48 készüléken. Napok között 50% A különféle PD-L1 IHC expressziót mutató 16 NSCLC mintát (10 PD-L1 negatív és 6 PD-L1 pozitív) hat, nem egymást követő napon teszteltük az Autostainer Link 48 készüléken. Tételek között 50% A különféle PD-L1 IHC expressziót mutató 16 NSCLC mintát (8 PD-L1 negatív és 8 PD-L1 pozitív) három példányban és háromféle készletszámú reagenskészlettel teszteltük az Autostainer Link 48 készüléken. Futtatásokon belül 50% A különféle PD-L1 IHC expressziót mutató 16 NSCLC mintát (10 PD-L1 negatív és 6 PD-L1 pozitív) egy futtatáson belül hat példányban teszteltük az Autostainer Link 48 készüléken. Napok közötti 50% A különféle PD-L1 IHC expressziót mutató 16 NSCLC mintát (10 PD-L1 negatív és 6 PD-L1 pozitív) egy napon végzett két futtatás során, három napon át teszteltük az Autostainer Link 48 készüléken. NPA= negatív százalékos egyezés; PPA= pozitív százalékos egyezés; OA=teljes egyezés % egyezés (95%-os konfidencia-intervallum) NPA 100% (91,2-100%) PPA 100% (91,2-100%) NPA 100% (91,0-100%) PPA 100% (91,2-100%) NPA 100% (91,2-100%) PPA 100% (91,2-100%) NPA 98,6% (96,0-100%) PPA 98,6% (95,7-100%) OA 98,6% (95,8-100%) NPA 100% (91,2-100%) PPA 100% (91,2-100%) NPA 100% (91,0-100%) PPA 100% (91,2-100%) % egyezés (95%-os konfidencia-intervallum) NPA 100% (92,9-100%) PPA 100% (88,6-100%) NPA 100% (92,7-100%) PPA 100% (88,6-100%) NPA 100% (92,9-100%) PPA 100% (88,6-100%) NPA 100% (92,6-100%) PPA 100% (92,6-100%) OA 100% (96,2-100%) NPA 100% (92,9-100%) PPA 100% (88,6-100%) NPA 100% (88,3-100%) PPA 100% (82,4-100%) OA 100% (92,4-100%) P03928HU_03/SK00621-2/2016.11 p. 12/14