Vibriofischeri biolumineszcencia-gátlási teszt

Vibriofischeri biolumineszcencia-gátlási teszt Környezettoxikológia Gruiz Katalin Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék

A környezettoxikológiahelye és szerepe A környezettoxikológia (ökotoxikológia) a vegyi anyagoknak az ökológiai rendszerek szerkezetére és funkciójára gyakorolt hatását vizsgálja. Az embert az ökológiai rendszer részeként kezeli. Az ökológiai rendszereket teljes komplexitásában átfogja, a molekuláris szinttől az egyed és a közösség szintjén keresztül a teljes ökoszisztémáig. Multidiszciplináris, egy sor szakterület együttműködésére alapoz. A környezettoxikológia eredményei használhatóak egyes vegyi anyagok valamint szennyezett területek kockázatának jellemzésére, támogatják a környezetmenedzsment és környezetpolitika döntéseit. Hozzájárulnak a hatáson alapuló határértékek és más környezetminőségi kritériumok képzéséhez, monitoringrendszerek tervezéséhez, kockázatcsökkentési intézkedésekkel kapcsolatos döntésekhez.

Környezettoxikológia Vegyi anyagok tesztelése Környezeti minták tesztelése (szennyezett környezet) Vegyi anyag veszélyessége: kémiai szerkezetébıl adódó immanens tulajdonság Vegyi anyag kikerül a környezetbe KOCKÁZAT

Környezeti mintákökotoxikológiaitesztelése Környezeti minták tesztelésének problémái: Szennyezőanyagok keveréke Kölcsönhatások: szennyezőanyagok, mátrix és a biota között Vizsgált közeg: extraktum, teljes talaj Szennyezett talaj tesztelésének problémái Szennyezőanyag keverék: szinergizmus, antagonizmus Biotranszformáció: termékek hatása Biodegradáció Hozzáférhetőség: eltérő fizikai-kémiai és biológiai hozzáférhetőség Az analitikai program csak a szennyezőanyagok kis hányadát tartalmazza A környezeti minta biotikus és abiotikus tulajdonságai befolyásolják az eredményt

Környezeti mintákökotoxikológiaitesztelése Az ökotoxikológiai tesztelés megoldás a problémák egy részére Integrálja a toxikus anyagok kölcsönhatásait Integrálja a szennyezőanyag és a mátrix kölcsönhatásait A szennyezőanyag biológiailag hozzáférhető részét méri Kémiai analitikai módszerrel nem kimutatható anyagok hatását is méri Az analitikai programba be nem vett veszélyes anyagok hatását is méri Az ökotoxikológiai tesztekkel szemben támasztott követelmények Ökológiai relevancia, környezeti realitás Reprodukálhatóság Megbízhatóság Érzékenység

Környezettoxikológiaitesztek osztályozása Fajok száma szerint - Egy fajt alkalmazó teszt - Több fajt alkalmazó teszt A tesztorganizmus szerint - Baktérium - Alga - Gomba - Növény - Állat - Több faj együtt Tesztelendő ökoszisztéma - Vízi ökoszisztéma - Szárazföldi ökoszisztéma Teszt időtartama - Rövid idejű= akut - Hosszú idejű = krónikus Expozíciós szcenárió - Teljes test - Etetési kísérletek - Ismert mennyiség beinjektálása (intramuszkuláris, intravénás) - Kontrollált mennyiség gyomorba juttatása

Környezettoxikológiaitesztek osztályozása A vizsgált környezeti elemek és fázisok Víz és pórusvíz Extraktumok, eluátumok, csurgalékok, stb. Szilárd fázisú minták: teljes talaj, teljes üledék A környezettoxikológiai tesztelés célja Vegyi anyagok toxicitásának, mutagenitásának és teratogenitásának vizsgálata, Hatáson alapuló környezetminőségi kritériumok képzése Biomonitoring (integrált monitoring) Korai figyelmeztető rendszerek Környezeti minták toxicitásának, mutagenitásának és teratogenitásának vizsgálata Keverékek, hulladékok toxicitásának, mutagenitásának és teratogenitásának vizsgálata Közvetlen, hatáson alapuló döntési rendszerek

Környezettoxikológiaitesztek mérési végpontok Az ökotoxikológiai tesztek leggyakoribb mérési végpontjai - Toxicitási tesztek: növekedés (sejtszám, tömeg, gyökérhossz, klorofill tartalom), túlélés, halál, immobilizáció, légzés: O 2 fogyasztás, CO 2 termelés, enzimaktivitások, ATP termelés, szaporodás, biolumineszcencia etc. - Mutagenitásiteszt: mutánsok száma, revertánsok száma, kromoszóma hibák - Rákkeltő hatás: tumorok - Teratogenitási teszt: reproduktivitás, cytogenetikai jellemzők - Biodegradációs tesztek: O 2 fogyasztás, szubsztrátfogyás, termékképzés, CO 2 termelés - Bioakkumulációs tesztek: az akkumulált vegyi anyag kémiai analízise

Egy fajt alkalmazóökotoxikológiaitesztek Az egy fajt alkalmazó tesztek többsége laboratóriumi körülmények között könnyen elvégezhető; műszert nem igényel, így kivitelezési költségük alacsony. Hátrányuk, hogy viszonylag alacsony a környezeti realizmusuk, mivel természetes viszonyok között nem pusztán egy faj egyedei kerülnek kapcsolatba a szennyezőanyaggal, hanem különböző fajok populációi. Így a szennyezőanyagok természetes viszonyok között fellépő hatásának megállapítására, az egy fajt alkalmazó tesztek félrevezető választ adhatnak. Lényegében tehát az extrapolálás egy fajról, - a tesztorganizmusról - egy másik fajra vagy az ökoszisztéma egészére csak nagy körültekintéssel végezhető el. Az egy fajt alkalmazó tesztek közül a mikrobiális módszerek tűnnek a legalkalmasabbaknak az ökoszisztéma jellemzésére, mivel majdnem minden ökoszisztémában megtalálhatók, így a jól választott tesztorganizmus reprezentálhatja a környezeti viszonyokat. Az egy fajt alkalmazó biotesztek végpontja széles skálán mozoghat. A leggyakrabban használt végpont a tesztorganizmus túlélése. Ökológiai szempontból azonban a szubletális reakciók tanulmányozása (növekedésgátlás, szaporodás) kedvezőbb, mint a túlélésé. Sok esetben a tesztorganizmus biokémiai, fiziológiai változása használható a szennyezőanyag kimutatására.

Egy fajt alkalmazó ökotoxikológiai tesztek végpontjai Végpontként igen gyakran alkalmazzák különböző enzimek (ATPáz, dehidrogenáz, foszfatáz, észteráz, luciferáz) aktivitásának változását. Sokszor különböző anyagcsere-termék illetve valamely enzim szubsztrátjának koncentrációját használják a toxicitás vizsgálatára. A legismertebb rendszer (ATP-TOX) az ATP-szintet méri szentjánosbogár luciferáz enzimje, és D-luciferin kofaktor jelenlétében, luminométerrel. A biokémiai vizsgálatok közé tartoznak a respirációs és a mikrokalorimetriástesztek. A respirációs tesztek a tesztorganizmus légzését tanulmányozzák (pl. BOI5 teszt). A mikrokalorimetria a szennyezőanyag hatására bekövetkező hőmérséklet-fluxus változását méri. A Spirillumvolutans bakteriális mozgásképességi teszt elve, hogy szennyezőanyag hatására a tesztorganizmus mozgásképessége csökken vagy megszűnik, mivel a kemotaxis mechanizmusáért felelős enzimek valamelyike gátolt. A géntoxikológiaitesztek (Ames-teszt, SOS chromotest, Mutatox-teszt) a szennyezőanyagok mutagén hatását vizsgálják. Ebben az esetben a bioteszt végpontja a mutáció. Az Ames-teszt hisztidin auxotróf Salmonella typhimurium törzset használ, amely mutagén hatásra elveszti auxotróf jellegét, vagyis hisztidint nem tartalmazó táptalajon is képes növekedni. Az SOS chromotest alapja, hogy mutáció hatására az SOS repair mechanizmus aktiválódik. Mivel a tesztorganizmusban az SOS operon β-galaktozidáz operonnal összeépítve található, az SOS repair folyamataiért felelős enzimek szintézise együtt jár a β-galaktozidáz transzlációjával. A β-galaktozidázhoz megfelelő szubsztrátot adva színes terméket kapnak, amely kolorimetriásan meghatározható. A mutatox-teszt Vibrio fischeri sötét mutánsát használja, amely mutagén hatásra visszanyeri lumineszkáló képességét. A lumineszcencia luminométerrel detektálható.

Több fajt alkalmazó ökotoxikológiai tesztek Az egy fajt alkalmazó tesztek hátrányait igyekeznek kiküszöbölni a több fajt alkalmazó tesztek. Általában egymással kölcsönhatásban lévő és/vagy különböző trófikus szinteken lévő fajokat választanak tesztorganizmusként. A bioteszt leírása Két baktérium törzs kompetíciós tesztje. 5 napos teszt Mikrobiális préda-predátor teszt. Idıtartam: 3-5 hét. Mikrokozmosz tesztek. Idıtartam: 3-10 hét Mezokozmosz tesztek Idıtartam: 5-6 hónap Vizsgált tulajdonság A kompetíció eredménye Préda, predátor egyedszáma Egyedszám, fajössztétel, légzés, heterotrof aktivitás, Egyedszám, fajösszetétel, anyagcsere körforgalmak A mikrokozmosz a természetes környezet mesterségesen korlátozott részhalmaza, a természetes ökoszisztéma biológiai modellje. Ezen tesztek egyed feletti szinten mérik a komplex hatásokat, nagyszámú, egymással kölcsönhatásban álló fajok populációit vizsgálják egyidejűleg, laboratóriumi körülmények között. A mezokozmosztesztek átmenetet képeznek a laboratóriumi mikrokozmosz és a szabadföldi vizsgálatok között. A mezokozmoszok szabadföldön létrehozott mesterséges rendszerek (pl. mesterséges tó), amelyet a vizsgált kemikáliával szennyeznek, majd nyomon követik az ökológiai változásokat.

Szabadföldi vizsgálatok A környezetünket érő szennyezések hatását leginkább a szabadföldi vizsgálatokkal jellemezhetjük. Ebben az esetben azonban ismernünk kell a terület ökológiáját, és a folyamatban lévő természetes változásokat. A vizsgálati eredményt ugyanis sokszor meghamisíthatják a szennyezőanyagtól függetlenül bekövetkező, előre nem látható környezeti hatások, mint például, vírusfertőzés vagy klímaváltozás. A bioindikációs kísérletek a területre jellemző indikátor fajok legkülönbözőbb jellemzőit (kihalás, betelepedés, invázió, fiziológiás változások) vizsgálják. A szabadföldi vizsgálatok közé tartoznak a bioakkumulációs tesztek is, amelyek a tesztorganizmus azon tulajdonságát használják ki, hogy azok képesek felvenni és raktározni a toxikus anyagokat. A bioakkumulációs tesztek két fajtáját különböztethetjük meg: az aktív módszerek a területen élő fajokat, míg a passzív tesztek a betelepített fajokat vizsgálják. A felhasznált tesztorganizmust a behatási idő eltelte után kémiai analízisnek vetik alá, és az akkumulált szennyezőanyag mennyiségéből következtetnek a terület szennyezettségére. A szabadföldi vizsgálatok azonban költségesek, hosszú ideig tartanak, nagy szaktudást (botanika, zoológia, ökológia) és tapasztalatot igényelnek, így kevéssé alkalmasak standard módszerekként való alkalmazásra.

Koncentráció(dózis) válaszösszefüggés tesztelése A környezettoxikológiai tesztelés során a koncentráció-válasz összefüggést kísérletesen vizsgáljuk: a kérdéses vegyi anyag (vagy környezeti minta) növekvő koncentrációinak függvényében mérjük a hatást, a megfelelően megválasztott ökotoxikológiai végpontot. A mérés végpontja: a tesztorganizmuson, vagy más szinten közvetlenül mért érték (halál, enzimek aktivitása, fénykibocsátás, mozgásképtelenség stb.) A teszt kiértékelésekor kapott végpont, a számítással származtatott vizsgálati végpont. A jellemző koncentrációt a koncentráció (dózis) hatás görbéről olvassuk le: az értékelés mindig statisztikai / grafikus EC 20, EC 50 (Effective Concentration) ED 20 / ED 50 (Effective Dose) LC 20 / LC 50 (Lethal Concentration) LD 20 / LD 50 (Lethal Dose)

Koncentráció-válasz összefüggés 110 100 Fényintenzit ás-g át lás [%] 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 1 10 EC20 EC50 1 00 log Cu koncentráció [mg/k g]

Akut toxicitás -végpontok Akut toxicitás mérése esetén (rövid idejő kitettség) a koncentráció hatás görbérıl leolvashatjuk a 10, 20 50 vagy 90 %-os gátlást okozó koncentrációt. LC 10, LC 20, LC 50, LC 90 = letális koncentráció (Lethal Concentration), mely a teszt-organizmus 10, 20, 50 vagy 90 %-ának pusztulását okozza. EC 10, EC 20, EC 50, EC 90 = hatásos koncentráció (Effect Concentration), mely a mérési vagy vizsgálati végpont 10, 20, 50, 90 %-os csökkenését okozza. LD 10, LD 20, LD 50, LD 90 = letális dózis (Lethal Dose), mely a tesztorganizmus 10, 20, 50 vagy 90 %-ának pusztulását okozza. ED 10, ED 20, ED 50, ED 90 = hatásos dózis (Effect Dose), mely a végpont 10, 20, 50, 90 %-os csökkenését okozza.

Biolumineszcencia Biolumineszcencia: élő rendszer általi lumineszcens fénykibocsátás, számos környezettoxikológiai teszt alapja. Bakteriális lumineszcens fény képzésének alapegyenlete: luciferáz FMNH2 + O2 + RCHO FMN + ROOH + H2O + fény (FMNH2 a redukált míg a FMN az oxidált flavin mononukleotid) Szentjánosbogár (ez is biolumineszcencia) Vibriofischeri fluoreszkáló sejtjei

Lumineszcens baktériumok Amelyek a természetben fellelhetők, a Photobacterium nemzetség tagjai Leggyakrabban használt: Vibriofischeri, sok publikációban azonosítják a Photobacterium phosphoreum nevű baktériummal GÉNSEBÉSZET ÉS BIOLUMINESZCENCIA A bakteriális lumineszcenciában szerepet játszó enzimek ismertek és az őket kódoló géneket is feltérképezték, ezért lehetőség van genetikailag manipulált, lumineszcenciáért felelős gének beültetésével nyert baktériumok létrehozására. 1) Lee és munkatársai (1991) a szentjánosbogár luciferáz génjét ültették E. coliba. 2) Lapinen és munkatársai (1990) Vibrio harvey luciferáz génjét vitték át E. coliba. A Vibriofischeri a természetben a kurtafarkú titntahal speciális fénykibocsájtó szervében, az úgynevezett "fényszervben" él és optimális körülmények között, anyagcseréje során fényt bocsát ki. 3) Van Dyke és munkatársai (1994) azt a tulajdonságot kihasználva, hogy a hősokk fehérjék átírása szennyezőanyag jelenlétében indukálható, E.coli hősokk promoterét kapcsolták össze a Vibrio fischeri lux génjével és plazmidba inzertálták. A plazmiddal E.colit transzformáltak, így a szennyezőanyagokra rendkívül érzékeny fényemisszióval jelző baktériumot kaptak.

Vibriofischeribiolumineszcencia-gátlásiteszt BEVEZETÉS A módszer a Vibrio fischeri tengeri baktérium által emittált lumineszcens fény intenzitásának mérésén alapul. Gátló anyag jelenlétében a fényemisszió csökken, amelynek mértékét luminométerrel mérjük. A teszt elvégezhető fagyasztva szárított vagy frissen átoltott tenyészettel. Ebben az esetben a tesztorganizmus érzékenységét folyamatosan ellenőrizni szükséges. A TESZT TÍPUSA egy fajt alkalmazó, laboratóriumi, bakteriális, akut toxicitási teszt ALKALMAS pórusvízre, talajkivonatra és teljes talaj szuszpenziójának vizsgálatára (iszapállag) TESZTORGANIZMUS Photobacterium phosphoreum, másnéven Vibrio fischeri az EPA és DIN szabványokhoz liofilezett formában kapható, de mikrobiológiai laboratóriumban is könnyen fenntartható. VÉGPONT lumineszcencia intenzitáscsökkenése, a minta hígítási sorából EC20 (ED20) és EC50 (ED50) határozható meg. SZÜKSÉGES MŰSZER luminométer TESZTELÉS IDŐTARTAMA 5-30 perc SZABVÁNYMÓDSZEREK US EPA Microtox DIN 38412 Teljes talajra adaptált és direkt kontaktra kidolgozott változat: BME-ABÉT ALKALMAZÁS TERÜLETE előzetes és részletes állapotfelmérés, kockázatfelmérés, remediáció követése, ellenőrzése, utómonitoring MEGJEGYZÉS jól reprodukálható, viszonylag érzékeny teszt

Kísérleti körülmények OZMÓZISNYOMÁS Tengeri baktérium, ezért 2-3 % NaCl koncentráció fenntartása szükséges. Na + -ion jelenléte a mérés során feltétlenül szükséges, mivel a lumineszcencia intenzitása így alig változik. ph Erősen befolyásolja a nehézfém-formák átalakulását, és ezáltal a fémek hozzáférhetőségét. Ahogy fémek hozzáférhetőségét a ph, a szerves anyagok felvehetőségét a hidrofób szennyezőanyagok jelenléte megváltoztathatja, ezáltal a mért toxicitás is módosulhat. Ozmózisnyomás: ha a sejten kívül alacsonyabb lenne az oldott anyag koncentrációja, mint benne, a sejt szétpukkadna, épp mint eső után az érett gyümölcs.

Folyadékfázisúminták vizsgálata Inokulumkészítés A Vibrio fischeri törzset folyékony tápoldatban, hűtőben tartjuk fenn, folyamatos átoltással. A vizsgálathoz frissen átoltott tenyészetet használunk. 24 órás, 28 o C-on Vibrio fischeri tápoldatban történő rázatás után a sejtszuszpenzió használható mérésre. A mérés érzékenysége függ az inokulum kezdeti beütésszámától. Előzetes mérések alapján, LUMAC luminométer használata esetén, ha a beütésszámot 600 000 felett van, célszerű a sejtszuszpenziót hígítani. Az inokulum hígítása 2 %-os NaCl-oldattal történik. A beütésszám 30 perces állás után állandósul, így a felhígított inokulum használható mérésre. Vizsgálatokhoz használt Cu-oldat Mivel a mérés érzékenysége erősen függ a kezdeti beütésszámtól, illetve a hőmérséklettől, a minták mellé standard Cu-sor lumineszcencia gátlását is mérjük. A különböző mérési sorozatok eredményét mindig az aktuális Cu-sorra viszonyítjuk. Cu-standardok koncentrációja: 25, 50, 100, 200 és 400 ppm. A felhasznált Cu-só: CuSO 4.5H 2 O. A standardok készítéséhez 2%-os NaCl-oldatot használunk. A mérés kontrolljaként nehézfémet nem tartalmazó 2%-os sóoldat szolgál. LÉPÉSEK 1. A mérőműszer mintatartóiba 0,2-0,2 cm 3 inokulumot mérünk. 2. A minta hozzáadása nélkül megmérjük a lumineszcencia intenzitását. (I 0 ) 3. Az inokulumhoz 0,05 cm 3 -t mérünk a minták felkevert hígításaiból. A standard Cu-sor tagjaiból ugyancsak 0,05 cm 3 -t mérünk be. A kontroll mintához 0,05 cm 3 2%-os NaCloldatot mérünk. 4. 30 perces kontaktidő leteltével megmérjük a lumineszcencia intenzitását. (I 30 ) Környezeti vízminták esetén a hígítási sor elkészítése előtt érdemes megmérni a hígítatlan minta lumineszcencia gátlását, ez ugyanis sok esetben szükségtelenné teszi a hígítást (nem toxikus a minta).

Folyadékfázisúminták vizsgálata A mérés kiértékelése Mért és számolt paraméterek Az összegzett gátlás mértékének kifejezése rézegyenértékben ( Cu ) I 0 - A mintatartóba mért inokulum kezdeti lumineszcencia intenzitása I 30-30 perccel a minta hozzáadása után mért lumineszcencia intenzitás f = I 30k /I 0k -A kontroll minta 30. illetve 0. percben mért lumineszcencia intenzitásának hányadosa I szám = f*i0 -Azon lumineszcencia intenzitás, amelyet a vizsgált minta venne fel 30 perces behatási idő után, ha toxikus anyag nem lenne jelen. H% = 100*(I szám -I 30 )/I szám -a vizsgált minta okozta %-os lumineszcencia intenzitás-csökkenés A végeredmény megadása Cu-re vonatkoztatva történik a következő módon: Cu 20=Összegzett gátlás 20= (EC20Cu/EC20minta )*10 6 Cu 50=Összegzett gátlás 50= (EC50Cu/EC50minta )*10 6 Mértékegység: [mg Cu/dm 3 minta] 120 100 AZ EC20 és EC50 értékek grafikus meghatározása A kiszámolt adatok segítségével egy H% -log bemért anyag [szennnyezőanyag koncentráció vagy ml eredeti minta] görbét szerkesztünk, amelyről leolvassuk a 20%-os illetve az 50%-os fényintenzitás csökkenéshez tartozó koncentrációértéket. Ezeket EC20 illetve EC50 értékként kezeljük. Cu-sor esetén ugyancsak megszerkesztjük a H%- log(bemért Cu) diagramot, és az EC20Cu illetve EC50Cu értékeket leolvassuk. H% - fényintenzitás-gátlás [%] 80 60 40 20 0-20 1 10 EC 20 EC 50 koncentráció [mg/l] Koncentráció-válasz összefüggés vizsgálata EC20 és EC50 grafikus meghatározása

Szilárd fázisúminták vizsgálata Bevezetés A folyadékfázisú mintákkal szemben a szilárdfázisú Vibrio fischeri teszt számos problémát vet fel. Ha a talaj vagy üledékminták toxikológiai vizsgálata azok kivonataiból történik, a nagyfokú hígulás miatt érzékenységcsökkenéssel kell számolni. Ugyanakkor számos a talaj ill. üledék szempontjából fontos kölcsönhatási formát, - szennyezőanyag-talajszemcse, tesztorganizmus-talajszemcse, tesztorganizmustalajszemcse-szennyezőanyag - nem veszünk figyelembe. A minták és a tesztorganizmus direkt érintkeztetése esetén azonban méréstechnikai problémákkal kell számolni. A minta jellegétől függően ugyanis a mintaszuszpenzió zavarossága (fényáteresztő, elnyelő tulajdonsága) különböző lehet. Ez befolyásolja a luminométer fotoelektron-sokszorozójába érkező fény intenzitását. Megoldást jelenthet egy olyan kontroll minta, amely fizikai-kémiai, biológiai jellegét tekintve azonos (nagyon hasonló) a vizsgált talajjal illetve üledékkel, de toxikus anyagot nem tartalmaz. Ez modellkísérletek esetén megvalósítható, egyébként csak ritkán áll rendelkezésre szennyezetlen kontroll. Szilárd fázisú minták esetén is problémát okoz, hogy a teszt érzékenysége erősen függ a sejtszuszpenzió által emittált fény intenzitásától. Ezért minden méréssorozathoz egy standard Cu-sor adagolása szükséges, amelynek segítségével a végeredmény Cuegyenértékben adható meg, így a különböző méréssorozatok eredményei egymással összehasonlíthatók. Ez a kalibrációs eljárás, melynek segítségével a tesztek eredményét rézekvivalensben adjuk meg, segíti az környezettoxikológiai eredmények összehasonlíthatóságát, a hatáson alapuló határértékekhez, a remediáció célértékéhez való viszonyíthatóságát. A toxicitás ekvivalens lényege az, hogy akkora hatásról van szó, amekkorát a kalibráláshoz felhasznált, ugyanakkora gátlásnál leolvasott rézvegyület koncentráció okozott volna. Mintaelőkészítés A mintákat szobahőmérsékleten szárítjuk, majd dörzsmozsárban aprítjuk. Inokulumkészítés, vizsgálatokhoz használt Cu-oldat Ugyanúgy zajlik, mint a folyadékfázisú minták esetében. A minták hígítási sorának készítése A hígítás 2%-os NaCl-oldattal, rendszeres keverés mellett történik. A mérés kezdete előtt 30 percig állni hagyjuk a hígítási sor tagjait.

Szilárd fázisúminták vizsgálata LÉPÉSEK 1. A mérőműszer mintatartóiba 0,2-0,2 cm 3 inokulumot mérünk. 2. A minta hozzáadása nélkül megmérjük a lumineszcencia intenzitását. (I0) 3. Az inokulumhoz 0,05 cm 3 -t mérünk a minták felkevert hígításaiból. A standard Cu-sor tagjaiból ugyancsak 0,05 cm 3 -t mérünk be. A kontroll mintához 0,05 cm 3 2%-os NaCl- oldatot mérünk. A mérés kiértékelése Mind a kiértékeléshez szükséges paraméterek meghatározása, mind az EC20 és EC50 értékek meghatározása a mintára és a standard Cu-sorra vonatkozóan ugyanúgy zajlik, mint folyadék fázisú minták esetében. Az eredményt is hasonlóképpen, rézegyenértékben ( Cu ) adjuk meg. 3.a. Nem rendelkezünk szennyezetlen kontroll mintával A minta hozzáadása után azonnal mérjük a lumineszcencia intenzitását (I 1 ). Az I 1 az adott minta kontrolljaként szolgál, feltételezve azt, hogy a hozzáadás pillanatában a minta még nem fejt ki gátló hatást. Bizonyos esetekben a feltételezés nem helyes, mivel a toxikus anyag pillanatszerűen fejti ki hatását, amit a kiértékeléskor figyelembe kell venni. 3.b. Rendelkezünk szennyezetlen kontroll mintával Az inokulumhoz a vizsgálandó minta hígításai mellé a szennyezetlen kontroll ugyanolyan módon készült hígításait mérjük. Ebben az esetben nincs szükség azonnali mérésre. 30 perces kontaktidő leteltével megmérjük a lumineszcencia intenzitását. (I 30 ) luminométer

Rövidítések, jelölések EC20, EC50, hatásos koncentráció (Effective Concentration), mely a mérési végpont 20, illetve 50%-os csökkenését okozza ED20, ED50 hatásos dózis (Effective Dose), mely a mérési végpont 20, illetve 50%-os csökkenését okozza H% gátlási százalék (a vizsgált minta okozta %-os lumineszcencia intenzitás-csökkenés) Σ Cu rézegyenérték; toxicitás-ekvivalens az összegzett gátlás mértékének kifejezésére I0 az inokulum kezdeti lumineszcencia intenzitása (a minta hozzáadása előtt) I1 a lumineszcencia intenzitása közvetlenül a minta hozzáadása után I30 a lumineszcencia intenzitása 30 perccel a minta hozzáadása után

Irodalom Gruiz Katalin, Horváth Beáta és Molnár Mónika (2001)Környezettoxikológia. Vegyi anyagok hatása az ökoszisztémára, Műegyetemi Kiadó