Tananyag címe: Transzaminázok vizsgálata Szerző: Dr. Mótyán János András, egyetemi tanársegéd Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet Általános Orvostudományi Kar Debreceni Egyetem Készült: 2014.12.01-2015.01.31. A tananyag elkészítését "Az élettudományi- klinikai felsőoktatás gyakorlatorientált és hallgatóbarát korszerűsítése a vidéki képzőhelyek nemzetközi versenyképességének erősítésére" TÁMOP 4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 számú projekt támogatta. A projekt az Európai Unió támogatásával, az Európai Szociális Alap társfinanszírozásával valósult meg. Jegyzőkönyv 1
JEGYZŐKÖNYV A transzamináz-reakció megfordíthatóságának vizsgálata Írja le a kísérlet célját: Írja le a szérum GOT és GPT mérésének klinikai jelentőségét! Írja le a röviden a kísérlet kivitelezésének lépéseit! 1.. 2.. 3.. 4. 5.. Rajzolja le a glutamát-piruvát transzamináz (GPT) által katalizált reakciót képletekkel! 2
Írja le a kísérlet során felhasznált anyagok szerepét! Enzimpreparátum:... -Ketoglutarát:... Na-piruvát:... Na-glutamát:... Alanin:... Eredmények: - Rajzolja le a kísérlet eredményét berajzolva a startvonal helyét, a minták felviteli sorrendjét és helyét, a vándorlás irányát és az aminosavakat! - Az aminosavak futási sorrendje a felcseppentési ponttól: Glu, Ala. 3
Értékelés: - Azonosítsa be a megjelenő aminosav foltokat a standard aminosav keverék segítségével! - Válaszolja meg a következő kérdéseket: - Melyik minta volt a vak minta? Hogyan készítette el? Miért használható vak mintaként? - Elemezze a kapott eredményeket és értékelje, hogy mennyiben sikerült bizonyítani a megfordíthatóságot? Válaszát indokolja meg! - Mely, a GPT által katalizált reakcióban szereplő szubsztrátok és/vagy termékek látszanak a kromatogramon és miért? 4
A kísérlet célja: JEGYZŐKÖNYV Szérum GOT és GPT aktivitásának meghatározása optikai teszttel Írja le a Warburg-féle optikai teszt elméleti hátterét! Rajzolja le GPT és a GOT méréshez használt segédenzimek által katalizált reakciókat képletekkel (kivéve NAD és NADH)! Írja le a röviden a kísérlet kivitelezésének lépéseit! 1.. 2.. 3.. 4. 5.. 5
Eredmények és számítások: Töltse ki a táblázatot a mért értékekkel, számítsa ki a percenkénti abszorbancia-változást! Szérum GOT Szérum GPT idő (perc) A 366 ΔA 366 / perc A 366 ΔA 366 / perc 0 - - 1 2 3 Számítsa ki a percentkénti abszorbancia-változás átlagát: Átlag ΔA 366 / perc Szérum GOT Szérum GPT Számítsa ki a szérum GOT és GPT aktivitás értékeket az alábbi egyenlet alapján: V * 10 9 * (ΔA 366 / perc) Ɛ * d * 60 * v = nkat / l V * 10 9 = 30303 Ɛ * d * 60 * v V - reakcióelegy végtérfogata (1,5 ml) 10 9 - a literre és a nmol-ra történő átszámítás faktora ΔA/min - az 1 perc alatt mért extinkcióváltozás Ɛ - a NADH moláris extinkciós koefficiense (366 nm-nél 3300 mol -1.L.cm -1 ) d - a fényút hossza a küvettában (1 cm) 60 - a percről másodpercre történő átszámítás faktora v - a vizsgálandó minta bemért térfogata (0,25 ml) A vizsgált minták térfogataktivitása (nkat/l) = 30303 * Átlag ΔA 366 / perc (1 U = 1/60 μkatal = 16,67 nkatal) GOT:... nkat/l GPT:... nkat/l =... U/L =... U/L 6
Értékelés: - Hasonlítsa a kapott eredményeket a megadott normál értékekhez! - Ha eltérés van milyen diagnózis állítható fel? - Válaszolja meg az alábbi kérdéseket: - Mik azok az intracelluláris enzimek? - Hogyan kerülhetnek ezek az enzimek a szérumba? - Van klinikai jelentősége a szérumból történő aktivitásmérésüknek? 7
JEGYZŐKÖNYV Szérum és vizelet aminosav-tartalmának vizsgálata vékonyrétegű ioncserélő kromatográfiával A kísérlet célja: Írja le a fenilketonúria kialakulásának lehetséges okait és tüneteit! Írja le a kísérlet során felhasznált anyagok szerepét! Szérum, vizelet:... TCA:... aminosav standard:... ninhidrin:... 8
Írja le a röviden a kísérlet kivitelezésének lépéseit! 1.. 2.. 3.. 4. 5.. 6.. 7.. 8.. 9.. 10.... Eredmények: - Rajzolja le a kísérlet eredményét berajzolva a startvonal helyét, a minták felviteli sorrendjét és helyét, a vándorlás irányát és az aminosavakat! - Az aminosavak futási sorrendje a felcseppentési ponttól (a standardban): Arg, His, Lys, Phe, Tyr, Leu, Val, Gly. 9
Értékelés: - Azonosítsa be a megjelenő aminosav foltokat a standard aminosav keverék segítségével! - Keresse meg a Tyr és Phe aminosavakat! Figyelje meg melyik szérumban és vizeletben szaporodott fel (normál vagy patológiás)! - Értékelje a látottakat a szövegesen! 10